CN108531406A - 一种猴头菌的培养基、百合生物转化菌丝体、百合生物转化菌丝体的提取物及其用途 - Google Patents

一种猴头菌的培养基、百合生物转化菌丝体、百合生物转化菌丝体的提取物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猴头菌的培养基、百合生物转化菌丝体、百合生物转化菌丝体的提取物及其用途。该猴头菌的培养基是在基础培养基中加入中药百合，包括基础培养基和百合，每100份培养基中包括基础培养基50～30份，百合50～70份；基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸450～200份，玉米粉100～80份，谷糠50～30份，水600～300份。该百合生物转化菌丝体是将猴头菌接入上述培养基经菌丝转化培养所得的产物。该百合生物转化菌丝体的提取物是经水提后再减压浓缩，最后真空冷冻干燥制备出来的。该百合生物转化菌丝体的提取物具有降血糖作用，作用明显优于猴头菌丝体或百合，可用于制备降血糖药物或保健品。

Description

一种猴头菌的培养基、百合生物转化菌丝体、百合生物转化菌 丝体的提取物及其用途
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种猴头菌的培养基、百合生物转化菌丝体、百合生物转化菌丝体的提取物及其用途。
背景技术
《中国药典》记载了猴头菌丝体(参见2015年版一部的第1614-1615页)，本发明的猴头菌丝体就是该标准记载的猴头菌丝体。猴头菌丝体中的活性物质最重要的是多糖及糖蛋白，目前国内外对猴头菌多糖的研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖、抗凝血、抗血栓、抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。
猴头菌是一种猴头菌科蘑菇(真菌)，在中药用于治疗胃肠道疾病已经超过2000年的历史了，一系列小分子化合物如erinacines，被认为具有神经再生，并且可以透过血脑屏障修复受损神经组织。猴头菌还有抗溃疡，抗炎，抗微生物，免疫调节，提高肝功能，抗衰老，降低血糖和血脂，提高抗缺氧能力，增加心脏输出、和改善备注循环等作用，包含猴头菌的医用制剂在中国广泛使用。
百合为百合科植物卷丹、百合或细叶百合的干燥肉质鳞叶。主产于湖南、湖北、江苏、浙江、安徽。秋季采挖，生用或蜜炙用。性甘、寒，归心、肺经，主要功效是养阴润肺，清心安神。百合主要含甾体皂苷车梦幻粉、百合皂苷、去酰百合皂苷等，还含有糖及少量秋水仙碱。
生品和蜜炙百合水提液均有镇咳和祛痰作用；百合水体液有镇静、抗缺氧和抗疲劳作用；百合多糖能抗氧化，降血糖，提高免疫功能，降低四氧嘧啶致高血糖模型小鼠的血糖；百合乙醇提取物、乙酸乙酯提取物抑制藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黄霉菌、粪肠球菌、绿脓杆菌；百合鳞茎提取物抑制革兰阳性菌活性高于革兰阴性菌。
生物转化“菌丝体”是指利用菌丝体(包括真菌)的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。以适宜的培养基为营养，通过菌丝体的生长代谢和生命活动产生丰富的次生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药作为部分培养基进行菌丝体转化，不同菌株诱变“次生”代谢不同的生物活性成分，再实行“定向培养、双向转化”生物转化工艺，可获得不同生物活性物质原料，目的是增强功效或者降低药物毒副作用。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，跨学科创新，结合微生物学、中药学等多学科，提供一种新原料(百合)作为猴头菌的培养基成分，即本发明的目的在于提供一种猴头菌的培养基、百合生物转化菌丝体、百合生物转化菌丝体的提取物及其用途。所述百合生物转化菌丝体的提取物的制备方法简单，成本较低，提取物用于制备降血糖药物。
基于上述目的，本发明的内容包括一种猴头菌的培养基，包括基础培养基和百合，每100份的培养基中包括基础培养基50～30份，百合50～70份；所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸450～200份，玉米粉100～80份，谷糠50～30份，水600～300份。
优选的，所述基础培养基包括如下重量份的各组分：麦麸280份，玉米粉80，谷糠40份，水300份。
优选的，每100份的培养基中包括基础培养基40份，百合60份；所述基础培养基包括如下重量百分数的各组分：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％。
本发明还提供了一种百合生物转化菌丝体，将猴头菌类菌株接种至如权利要求1-3任一项所述的培养基中，在20～27℃下，培育40～50天，取出菌丝体，烘干，即得百合生物转化菌丝体。
优选的，所述猴头菌类菌株为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.exFr.)Pers。
优选的，所述百合生物转化菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.exFr.)Pers.的菌丝体与其附生含有百合成份的固体培养基的干燥混合物。
本发明还提供了一种百合生物转化菌丝体的提取物，所述提取物通过以下步骤制备得到：
(1)将所述的百合生物转化菌丝体进行水提，40-60℃下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5小时，水的重量为百合生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；
(2)将步骤(1)中的提取液50℃减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液冷冻干燥，即得百合生物转化菌丝体的提取物。
优选的，步骤(1)中用水浸泡的温度为50℃。
步骤(2)中所述冷冻干燥的工艺为，-40℃冷冻3-5小时，-10℃一次升华3-6小时，0℃二次升华5-10小时，30℃三次升华24-36小时。
优选的，所述冷冻干燥的工艺为：-40℃冷冻4小时，-10℃一次升华5小时，0℃二次升华7小时，30℃三次升华30小时。
本发明还提供了一种所述的百合生物转化菌丝体的提取物在制备降血糖保健品或药物中的用途。
本发明的有益效果有：
(1)本发明的百合生物转化菌丝体的提取物采用简单的处理工艺制备得到，其降血糖效果就达到预料不到的技术效果，经生物转化的“菌丝体”的降血糖效果好于所有的天然植物来源的中药材，如果进一步分离纯化富集有效成分，其降血糖效果将更好，可用于制备降血糖药物。
(2)猴头菌是一种药用真菌，能很好地吸收培养基中营养，彻底转化培养基，产生新的活性物质及代谢物，为此，本发明将中药百合加入到猴头菌的基础培养基中，作为猴头菌的培养基成分之一，并对中药材百合掺入猴头菌的培养基的比率进行调配，最终选择中药材百合最佳掺入的比率为60％，百合占60％比率时，菌丝体生长情况较好，百合多糖含量较高。
(3)猴头菌对百合进行中药菌丝体转化，得到新的菌丝体，本发明对所得的百合生物转化菌丝体进行提取，得到的百合生物转化菌丝体的提取物进行了动物试验，试验结果表明：百合生物转化菌丝体的提取物降血糖作用明显，降血糖作用由强到弱为：百合生物转化菌丝体>百合药材>猴头菌丝体，该百合生物转化菌丝体的提取物降血糖作用明显优于猴头菌丝体或百合的降血糖作用，这说明猴头菌中丰富的酶系通过结构修饰或降解作用，把百合中的活性成分转化成活性更强的成分，或增强了百合中的活性成分(百合多糖)的产量，或把非活性成分转化成活性成分，活性成分相互促进达到增强降血糖作用的目的。因此，百合生物转化菌丝体的提取物可用于制备降血糖药物或保健品。
(4)本发明先用醇提百合生物转化菌丝体，除去醇溶性杂质；后水提，保证多糖的溶出效率，为了不影响有关活性物质，本发明优选采用60℃条件下抽真空干燥。
具体实施方式
实施例1
一种百合生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)取百合600g、麦麸280g、玉米粉80g、谷糠40g，混匀，加入300g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在27℃条件下转化培养约40天，取出菌丝体，烘干，即得百合生物转化菌丝体；
(2)将百合生物转化菌丝体进行水提，40℃下用水浸泡2次，每次浸泡5小时，水的重量为百合生物转化菌丝体重量的6倍，得到提取液；
(3)将上述提取液50℃减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液真空冷冻干燥，-40℃冷冻4小时，-10℃一次升华2小时，0℃二次升华10小时，30℃三次升华24小时，即得百合生物转化菌丝体的提取物(代号：HB-6)。
实施例2
一种百合生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)取百合500g、麦麸350g、玉米粉100g、谷糠50g，混匀，加入500g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在27℃条件下转化培养约40天，取出菌丝体，烘干，即得百合生物转化菌丝体；
(2)将百合生物转化菌丝体进行水提，50℃下用水浸泡2次，每次浸泡4小时，水的重量为百合生物转化菌丝体重量的8倍，得到提取液；
(3)将上述提取液50℃减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液真空冷冻干燥，-40℃冷冻5小时，-10℃一次升华3小时，0℃二次升华6小时，30℃三次升华30小时，即得百合生物转化菌丝体的提取物(代号：HB-5)。
实施例3
一种百合生物转化菌丝体的提取物，其制备方法包括如下步骤：
(1)取百合700g、麦麸210g、玉米粉60g、谷糠30g，混匀，加入700g水拌匀，即得猴头菌的培养基；再装瓶、灭菌，接入猴头菌，在27℃条件下转化培养约40天，取出菌丝体，烘干，即得百合生物转化菌丝体；
(2)将百合生物转化菌丝体进行水提，60℃下用水浸泡3次，每次浸泡2小时，水的重量为百合生物转化菌丝体重量的10倍，得到提取液；
(3)将上述提取液50℃减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液真空冷冻干燥，-40℃冷冻6小时，-10℃一次升华5小时，0℃二次升华5小时，30℃三次升华36小时，即得百合生物转化菌丝体的提取物(代号：HB-7)。
实施例4 百合掺入比例试验
培养基百合的比率分别占60％、50％、70％，设计实验方案，总投料5000g，分别按上述实施例1、实施例2、实施例3配制培养基，加水混匀、灭菌、接种、培养，平行对照，培养条件完全一致，培养过程中观察菌丝体生长状况、生长周期、污染情况、生长速度，挖瓶后烘干称重计算收率，检测样品中的纤维素酶、麦角甾醇含量(考察转化是否彻底)、多糖含量、总黄酮含量和总皂苷含量，干燥后的样品分别标注为HB-6、HB-5、HB-7。
参考申请号为201410393488.9的发明专利《一种猴头菌丝体及其培育方法》，同样灭菌、接种、培养，平行对照，培养条件完全一致，得到猴头菌丝体，将样品标注为HTJ。试验结果统计如下表1所示。
表1
试验结果表示：百合占50％或70％时污染率高、生长速度慢、生长周期长，纤维素酶与麦角甾醇的含量低，生物转化不彻底；而百合占60％比率时最为合适，生长速度较快、生长周期短，且多糖和百合皂苷含量高，菌丝体生长情况较好，兼顾各优势，为最佳比率。
此外，与HTJ组相比，百合占60％比率时的HB-6组的污染率低于HTJ组，且生长周期相对较短，生长速度快，麦角甾醇、多糖、总黄酮以及百合皂苷的含量也都高于HTJ组。由于多糖对降血糖有良好的作用，所以本发明在培养基中加入百合成分，使所得生物转化菌丝体的提取物可用于制备降血糖药物或保健品。
实施例5 百合多糖降血糖试验
1.试验材料
1.1 供试品
样品编号：HTJ表示猴头菌丝体，BH表示百合中药材，HTJ+BH表示40％的猴头菌丝体+60％百合中药材的百合生物转化物，HB-6、HB-5、HB-7分别表示猴头菌的培养基中黄精掺入比例为60％、50％、70％的百合生物转化菌丝体。上述样品平行操作进行如下处理：取百合生物转化菌丝体，进行醇提，醇的重量为百合生物转化菌丝体重量的600倍，加热提取2h，去掉醇提液，得到醇提后的药渣；药渣加600倍水加热提取2h，得到水提液，分别编号为HTJ，BH，HTJ+BH，HB-6、HB-5、HB-7。
1.2 实验动物
18～22g，雌雄各半，100只，昆明种小白鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境B区实验室饲养，实验动物质量合格证号：NO43004700004931，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2010-0008。实验期间环境温度20℃～26℃，湿度40％～70％。
1.3 主要试剂
四氧嘧啶，由西格玛奥德里奇贸易有限公司(Sigma-Aldrich)提供。
1.4 主要仪器
自动生化分析仪(荷兰威图科学公司)，TGL-16G台式高速离心机(强生有限公司)，血糖试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)，DL-50型超级恒温器，756MC型紫外可见分光光度计。
2.试验方法
2.1 糖尿病模型的建立
使昆明种小白鼠适应实验环境4d，禁食12h后，经腹腔一次性注射四氧嘧啶，剂量为150mg/(kg·bw)，3d后禁食6h，测定空腹血糖。选择70只空腹血糖在10mmol/L以上者，作为糖尿病小鼠。
2.2 实验分组及处理
将昆明种小鼠分为7组，即正常对照组、百合中药材组(BH)、猴头菌丝体组(HTJ)、猴头菌丝体加百合即百合转化物组(HTJ+BH)，生物转化HB-6、HB-5、HB-7组，每组10只小鼠。正常对照组灌胃等量的蒸馏水，每日1次，连续给药30d。分别对小鼠空腹血糖进行测定。小鼠耐糖量的检测在实验结束时进行，将空腹6h后的小鼠用葡萄糖以25g/(kg·bw)的剂量灌胃处理后，分别测定小鼠口服葡萄糖后0min、60min和120min的血糖值。
2.3 测定指标和方法
采集小鼠眼眶内眦静脉血，取血清用葡萄糖氧化酶-过氧化酶法进行血糖的测定，空腹血糖采集禁食6h后的小鼠静脉血。
2.4 统计分析
实验数据用SPSS 11.5软件进行处理，结果用t检验，以均数±标准差表示。
3 百合多糖对正常小鼠和糖尿病小鼠血糖的影响结果
造型前各组小鼠空腹血糖值均无明显差异(P>0.05)，给药前除空白对照组外，各组小鼠血糖明显升高(P<0.01)。给药后，除空白组外，各组给药后小鼠血糖值明显降低。
表2
与造型前比较**P＜0.01，与给药前比较##P＜0.01
从表2中可以看出，降血糖能力由强到弱为：百合生物转化菌丝体＞百合中药材+猴头菌丝体＞百合药材＞猴头菌丝体。结合实施例4的结果说明猴头菌中丰富的酶系可能通过结构修饰或降解作用，把百合中的活性成分转化成活性更强的成分，或增强了百合中的活性成分(如多糖)的产量，或把非活性成分转化成活性成分，活性成分相互促进达到增强降血糖功效的目的。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猴头菌的培养基，其特征在于，包括基础培养基和百合，每100份的培养基中包括基础培养基50～30份，百合50～70份；所述基础培养基包括如下重量份的各组分：
麦麸450～200份，玉米粉100～80份，谷糠50～30份，水600～300份。
2.根据权利要求1所述的猴头菌的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括如下重量份的各组分：
麦麸280份，玉米粉80，谷糠40份，水300份。
3.根据权利要求1所述的猴头菌的培养基，其特征在于，每100份的培养基中包括基础培养基40份，百合60份；所述基础培养基包括如下重量百分数的各组分：麦麸70％、玉米粉20％、谷糠10％。
4.一种百合生物转化菌丝体，其特征在于，将猴头菌类菌株接种至如权利要求1-3任一项所述的培养基中，在20～27℃下，培育40～50天，取出菌丝体，烘干，即得百合生物转化菌丝体。
5.根据权利要求4所述的百合生物转化菌丝体，其特征在于，所述猴头菌类菌株为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers。
6.根据权利要求5所述的百合生物转化菌丝体，其特征在于，所述百合生物转化菌丝体为猴头菌科真菌猴头菌Hericium erinaceum(Bull.ex Fr.)Pers.的菌丝体与其附生含有百合成份的固体培养基的干燥混合物。
7.一种百合生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述提取物通过以下步骤制备得到：
(1)将如权利要求4-6任一项所述的百合生物转化菌丝体进行水提，40-60℃下用水浸泡2-3次，每次浸泡2-5小时，水的重量为百合生物转化菌丝体重量的6～10倍，得到提取液；
(2)将步骤(1)中的提取液50℃减压浓缩，将减压浓缩所得的浓缩液冷冻干燥，即得百合生物转化菌丝体的提取物。
8.根据权利要求7所述的百合生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述冷冻干燥的工艺为，-40℃冷冻3-5小时，-10℃一次升华3-6小时，0℃二次升华5-10小时，30℃三次升华24-36小时。
9.根据权利要求7或8所述的百合生物转化菌丝体的提取物，其特征在于，所述冷冻干燥的工艺为：-40℃冷冻4小时，-10℃一次升华5小时，0℃二次升华7小时，30℃三次升华30小时。
10.一种如权利要求7-9任意一项所述的百合生物转化菌丝体的提取物在制备降血糖保健品或药物中的用途。
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