CN101658576B - 化橘红总黄酮在制备治疗酒精性肝损伤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了化橘红在制备防治酒精性肝损伤的药物或保健品中的新用途。

Description

化橘红总黄酮在制备治疗酒精性肝损伤的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种中药提取物的新用途，特别涉及一种化橘红提取物的新用途。

背景技术

酗酒是一个严重危害人类健康的行为。大量饮酒可引起急性酒精中毒。长期过量饮酒会引发精神障碍、胃肠道损伤、酒精性肝损伤，严重者甚至可以导致死亡。酒精性肝损伤是常见的慢性肝病，迄今临床缺乏理想的药物防治手段。在欧美国家，酒精性肝损伤是中青年死亡的主要原因之一，是主要肝脏疾病和研究重点。在我国，随着生活方式的改变，近年来酒精性肝损伤也有增加的趋势。因此，积极减轻酒精对人体的危害，防治酒精性肝损伤具有重要的意义。

研究已经证实，酒精作为一种肝脏毒性剂，可削弱正常肝细胞的代谢及肝细胞末的稳定性，损伤线粒体功能等。乙醇进入体内后通过胃肠道吸收，仅有2％～10％由呼吸道、尿道和汗腺以原形排出，其余90％在肝脏代谢。经肝脏代谢的乙醇经过肝乙醇脱氢酶(ADH)、过氧化氢分解酶(CAT)和肝微粒体乙醇氧化酶系统(MEOS)三条途径氧化为乙醛，乙醛再经过乙醛脱氢酶(ALDH)转化为乙酸，后者以乙酰化的形式进入三羧酸循环，氧化成二氧化碳和水。乙醇在代谢过程可使肝内耗氧增加，肝细胞氧化还原反应增高，自由基产生增多，使肝细胞的新陈代谢受到影响。此外，乙醛对于肝脏有直接毒性作用，可使肝细胞内线粒体受损，造成肝细胞损伤及坏死。

化橘红是芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟干燥外层果皮。前者习称“毛橘红”，后者习称“光橘红”，化橘红富含黄酮类成分，其中柚皮苷、野漆树苷均为活性成分。化橘红主产于广东化州，是特产道地药材，具有散寒、燥湿、利气、消痰的功能，用于风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤酒、呕吐痞闷。《本草纲目拾遗》中就有化橘红“……醒酒宽中……”的记载，在清代早期著名医家叶天士等就已普遍应用，林群莲等报道叶天士在治胃脘痛中对“胃痛引胁，肝郁化火犯胃者，……以半夏、化橘红苦辛散结，疏肝理气……”。然而对于化橘红或化橘红的有效成分用于酒精性肝损伤的防治或其防治酒精性肝病的机理，目前为止，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够防治酒精性肝损伤的天然中药，具体而言，本发明提供了天然中药化橘红新的药用用途，特别涉及化橘红在防治酒精性肝损伤药物中的用途。

本申请的发明人经过大量的试验表明，本发明所述的化橘红总黄酮，能够防治酒精性肝损伤：降低酒精性肝损伤患者的死亡率；抑制肝脏肿胀的作用；恢复酒精造成的肝功能损害，降低酒精性肝损伤患者ALT和AST含量；促进肝脏蛋白的生成；促进肝内脂肪代谢作用；化橘红总黄酮还具有抗氧化作用，能降低肝组织SOD活力，升高MDA含量；化橘红总黄酮还可以抗肝脂肪变性的作用、减轻肝细胞炎症反应和降低细胞水肿；降低肝细胞凋亡率；降低酒精性肝损伤细胞炎症因子，例如可以降低TNF-α、TGF-β1和IL-6的含量。

根据本发明，所用的的化橘红优选毛橘红，更优选毛橘红的提取物，最优选毛橘红总黄酮。

化橘红总黄酮，是指从中药化橘红中提取分离得到的一种有效化学部位，其中总黄酮的含量不低于80％，化学成分主要是黄酮和二氢黄酮，外观为黄色固体粉末，易溶于水，可溶于甲醇。

总黄酮可以按照本领域常规的或常用的提取黄酮的方法制备而成，例如水提醇沉法，也可以按照其他现有技术的方法制备而成，例如中国专利申请(毛橘红总黄酮及其提取方法和用途)200410051224.1所述的方法，优选地，本发明的总黄酮可以按照包括如下步骤的方法得到：

(1)化橘红药材经水提取、浓缩；

(2)加乙醇至重量浓度为80％；

(3)滤过，滤液浓缩；

(4)加水，调PH值至1.5，冷藏72小时，分取沉淀，蒸馏水洗涤沉淀，60℃烘干。

本发明化橘红总黄酮，可以作为药物活性成分制备成的药物组合物，本发明的药物组合物，根据需要该组合物还可以加入药物可接受的载体。

本发明的组合物，是单位剂量的药物制剂形式，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。

本发明的组合物其中的有效组分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。

本发明的组合物，通过将上述有效组分和药物可接受的载体混合制备得到。

本发明的组合物，其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明的组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。

本发明提供的化橘红总黄酮对酒精性肝损伤保护作用，以下为药理实验的数据：

以下实验以五子衍宗丸作为对照药。有研究表明，五子衍宗丸能明显防止乙醇性肝损伤大鼠模型的血清总胆固醇的降低及血清和肝内甘油三醋的升高，肝脂变及肝组织坏死明显减轻等药理作用，能较好防治酒精性肝损伤。([1]李育浩，邓响潮，吴清和，等.五子衍宗丸对乙醇性肝损伤大鼠脂质代谢的影响.中国中药杂志，1994；19(5)：300-303.[2]黄顺玲，谢晃君，文体端，等.抗脂肪肝冲剂对大鼠乙醇性肝损伤防治的实验研究.中西医结合肝病杂志，2001；11(6)：343-344.)

试验例1化橘红总黄酮对酒精性肝损伤保护作用的实验研究

1.实验药物

五子衍宗丸(安阳路德药业有限责任公司，批号：050901)；化橘红总黄酮(按照实施例1的方法自制，批号：061129)；红星二锅头(55度，北京红星酒业技术发展公司)。

2.实验动物及环境

2.1动物来源SPF级雄性SD大鼠，体重280-320g，由广东省医学实验动物中心提供(合格证号SCXK(粤)2006A015)。

2.2饲养条件饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物实验室，环境设施合格证(NO：SYXK粤2003-002)，室温25±2℃，湿度60±10％，自由饮水、进食。颗粒饲料由广东省医学实验动物中心提供。

3.方法

SD大鼠93只，雄性，随机分为6个组，空白对照组10只，模型组15只，阳性组(五子衍宗丸)15只，每天给药剂量为0.182g/kg，相当于60kg人临床剂量；化橘红提取物总黄酮低剂量组19只，每天给药剂量为0.108g/kg，相当于60kg人临床剂量；中剂量组17只，每天给药剂量为0.217g/kg，相当于60kg人临床剂量的2倍；高剂量组17只，每天给药剂量为0.433g/kg，相当于60kg人临床剂量的4倍；每6只大鼠共饲于一个饲养笼内。

适应性饲养一周后，每天灌胃给药一次，除了空白对照组外，各组动物每日药后5小时加灌55度红星二锅头2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂饲料喂饲，试验起、始即试验过程中按常规每周称体重一次。

4.结果

4.1化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型一般情况及肝功能指标的影响

4.1.1仪器与试剂

4.1.1.1仪器全自动生化检测仪(意大利LOGOTECH公司产品，S/N：2003E1007113)；UV-2800型紫外可见分光光度计(尤尼卡仪器有限公司，SQ0403010)；组织匀浆仪(上海金达生化仪器有限公司，产品批号：XHF-1)；数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司，型号：HH-4)。

4.1.1.2试剂ALT测定试剂盒(上海复旦张江生物医药股份有限公司，批号：060901)；AST测定试剂盒(上海复旦张江生物医药股份有限公司，批号：060701)；TC测定试剂盒(上海复旦江生物医药股份有限公司，批号：060801)；TG测定试剂盒(上海复旦江生物医药股份有限公司，批号：0601101)；HDL-C测定试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司，批号：2006040145)。

4.1.1.3方法在整个实验过程观察各组动物的死亡率。给二锅头后第28天，动物末次给药2小时后(即禁食不禁水16小时后)，各组大鼠称重，腹腔注射2％戊巴比妥钠45mg/kg，腹主动脉采血后处死。剪取各组动物肝组织，称重，计算肝脏指数。采血30min后3000r/min离心，分离血清，供测定血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量。

4.1.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠一般状态的影响

空白对照组大鼠毛发亮泽，动作灵活，食欲和大便正常，无溏便，无死亡；模型组及给药组大鼠在初期灌服酒精后均有流涎，体态呆板，嗜睡，精神萎靡，食欲减退，行动迟缓等现象，一般需要经过6小时后才开始苏醒，16小时后完全清醒，并表现为毛发光泽度差，体重增长缓慢，多数大鼠的大便较为稀烂。而药物组大鼠在灌食酒精后醒酒时间较前者早，食欲较前者佳，实验后期上述表现减轻。具体统计结果见表1、表2、表3。

表1 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠体重增长的影响

表1 续化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠体重增长的影响

注：与对照组比较，“△”P＜0.05和“△△”P＜0.01；与模型组比较，“*”P＜0.05和“**”P＜0.01。

表2 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠饲料消耗量的影响

表3 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠饮水量的影响

注：其中表1中N指每组大鼠的例数；表2和表3中N是指盒数。

实验过程中总共有22只大鼠死亡，其中模型组有2只大鼠、阳性组有1只大鼠、高剂量组有1只大鼠因误入气管或胃穿孔，即时死亡；剩余死亡大鼠是灌酒后第二天发现死亡的，解剖未发现胸腔有瘀血或胃穿孔，死因不明，死前均表现为步履蹒跚、烦躁不安及阵发性抽搐等现象，各组大鼠死亡率统计见表4。

表4 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠的死亡率的影响

实验结果表明，模型组动物死亡率约为53％，而化橘红总黄酮高、中、低剂量药物死亡率分别为18％、24％和21％，可有效地降低酒精性肝损伤大鼠的死亡率。

4.1.3化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝脏指数的影响

各组大鼠处死后剪取各组动物肝组织，并称重，计算肝脏指数(肝湿质量/体质量)，统计结果见表5。

表5 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝脏指数的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)。

实验结果表明，模型组大鼠的肝脏指数为(4.63±0.47)与对照组(3.43±0.38)比较，肝脏指数明显升高，统计学表明具有显著性差异(p＜0.01)，说明模型组动物的肝脏具有肿大的现象。化橘红总黄酮低、中、高剂量组动物的肝脏指数分别为(4.13±0.33)、(3.76±0.59)和(3.99±0.69)，与模型组比较，肝脏指数明显减少，统计学表明具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有抑制肝脏肿胀的作用。

4.1.4化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清中ALT和AST的影响

腹动脉取血后分离血清，按试剂盒说明测定血清中的ALT、AST的含量(表6)。

表6 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清中ALT和AST的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)。

实验结果表明，模型组血清中的ALT明显升高，与对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01)，说明模型组动物肝功能已经受到损害，提示造模成功。化橘红总黄酮低、中、高剂量组动物血清中ALT与模型组比较，都有不同程度的恢复，且均接近正常组水平，尤其以中剂量为明显。结果提示化橘红总黄酮对酒精造成的ALT异常具有一定的保护作用。

各组动物血清AST的变化与ALT基本相同。实验结果表明，模型组动物AST明显升高，与空白组相比，差异具有显著性(P＜0.01)。而各用药组的AST与模型组相比都有不同程度的恢复，其中化橘红总黄酮组以高剂量效果为佳，基本接近至正常对照组水平。以上结果提示，化橘红总黄酮可恢复酒精造成的动物肝功能，使受损的肝功能有所恢复，并逐渐接近正常水平。

本研究中主要采用给予大鼠灌胃55度红星二锅头2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂饲料喂饲，共灌酒精4周。实验结果表明，该模型组动物死亡率高达53％，另外动物肝脏指数明显增加，血清ALT与AST含量明显增加，与空白对照组相比，差异有统计学意义，提示该模型制作成功，由于该方法简便，易于操作，可重复性强，因此可认为该模型为制作慢性酒精性肝损伤的理想方法之一。

本研究结果表明，化橘红总黄酮可改善酒精性肝损伤动物的死亡率，与模型组53％的死亡率相比较，化橘红三个剂量组分别为21％、24％和18％。另外化橘红总黄酮使肿大的肝脏指数明显减少，具有抑制肝脏肿胀的作用。实验结果还表明，化橘红总黄酮可降低酒精性肝损伤动物ALT和AST含量，与模型组相比，差异具有显著性。

4.1.6小结

4.1.5.1采用给予大鼠灌胃55度红星二锅头2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂饲料喂饲，共灌酒精4周。模型组大鼠与该正常组相比ALT、AST、TC升高均有统计学差异或显著性差异，说明本方法是较为理想的制作慢性酒精性肝损伤模型的方法，具有操作简便，时程短的优点。

4.1.5.2化橘红总黄酮对慢性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。可改善酒精性肝损伤模型大鼠一般情况，降低死亡率，抑制肝肿胀，降低血清降低酒精性肝损伤动物ALT和AST含量，与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)或显著性差异(p＜0.01)。

4.2对酒精性肝损伤大鼠模型肝蛋白、肝糖原及脂质过氧化氧化指标的影响

4.2.1仪器、试药与方法

4.2.1.1仪器UV-2800型紫外可见分光光度计(尤尼卡仪器有限公司，SQ0403010)；组织匀浆仪(上海金达生化仪器有限公司，产品批号：XHF-1)；数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司，型号：HH-4)。

4.2.1.2试剂SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20070108)；MDA测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20070108)；糖原测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20070108)；蛋白质测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20070105)。

4.2.1.3方法给二锅头后第28天，动物末次给药2小时后(即禁食不禁水16小时后)，各组大鼠称重，腹腔注射2％戊巴比妥钠45mg/kg，腹主动脉采血后处死。剪取各组动物肝组织，制备肝组织匀浆，检测肝组织中肝蛋白含量，肝糖原含量，MDA含量及SOD含量。

4.2.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠的影响实验中各大鼠肝蛋白的测定

4.2.2.1考马斯亮兰贮备液：60mL×1瓶。临用时按所需量用蒸馏水1∶4稀释，配成应用液，4℃保存。

4.2.2.2蛋白标准：0.615g/L蛋白标准液1mL×1支。-20℃冷冻保存20天。

4.2.2.3测定方法：

取新鲜肝脏，用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称取0.2g左右的肝脏组织，按照重量体积比加生理盐水制备成10％的组织匀浆，2000转离心10min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水按1∶9稀释成10％组织匀浆。测定管：取0.05mL样品，加3.0mL考马斯亮兰显色剂；标准管：取0.05mL 0.615g/L标准液，加3.0mL考马斯亮兰显色剂。混匀，静置10min，于595nm处测定各管的OD值。

蛋白含量(g/L)＝测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度(g/L)

4.2.2.4将测定后肝蛋白含量进行统计，结果见表8。

表8 化橘红对酒精性肝损伤大鼠肝中蛋白含量的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)。

实验结果表明，化橘红总黄酮各剂量组动物肝脏中蛋白含量与模型组相比，具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有促进大鼠肝脏蛋白的生成。

4.2.3化橘红总黄酮对酒精性大鼠肝脏中糖原的影响

4.2.3.1测定方法

碱溶液40mL×1瓶，室温保存。

1mg/mL葡萄糖标准液5mL×1支，室温保存。配制方法：葡萄糖标准液∶蒸馏水＝1∶99，配成0.01mg/mL葡萄糖标准应用液，现用现配，保存一天。

显色剂：粉剂×6支，用时每支加25Ml98％浓硫酸，混匀，现用现配，室温保存。

取新鲜肝脏，用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称取75mg左右的肝脏组织，放进玻璃试管中，按照重量体积比1∶3加入试剂盒里的碱溶液，用保鲜膜将管口扎起，以防水分蒸发，同时在膜上用针头扎一小孔，以便气体热胀冷缩。在沸水中煎煮20min进行水解，然后用流水冷却。冷却后往试管里加入7.2mL(75mg×96＝7200uL＝7.2mL)的蒸馏水稀释成1％肝糖元检测液。测定管：取0.1mL1％肝糖元检测液，加入0.9mL的蒸馏水和2mL的显色液；标准管取1.0mL 0.01mg/mL葡萄糖标准应用液和2mL显色剂。混匀后置沸水中煮5min中，冷却后于620nm波长，测定OD值。

4.2.3.2计算公式：

糖元量(mg/g组织)＝(测定管OD值/标准管OD值)×标准管含量(0.01mg)×样本测试前稀释倍数(100)×10(测试过程中的稀释倍数)/1.11(葡萄糖换算成糖原含量的系数)

4.2.3.3测定后统计分析肝脏中肝糖原的含量，结果见表9。

表9 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝脏中肝糖原的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)。

实验结果表明，模型组动物中的肝糖原与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。化橘红总黄酮低剂量组和高剂量组动物的肝糖原与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有一定的促进肝内脂肪代谢的作用。

4.2.4化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝组织中MDA含量的影响

4.2.4.1测定方法：

试剂一：液体20mL×1瓶，室温保存。

试剂二：液体12mL×1瓶，用时每瓶加340mL双蒸水混匀，4℃冷藏。

试剂三：粉剂×1支，用时将粉剂加入到90～100℃的热双蒸水60mL中，充分溶解后用双蒸水补足至60mL再加冷醋酸60mL，混匀，配好的试剂避光冷藏。

标准品：10nmol/mL四乙氧基丙烷5mL×1瓶，4℃冷藏。

取新鲜肝脏，用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称取0.2g左右的肝脏组织，按照重量体积比加生理盐水制备成10％的组织匀浆，2000转离心10min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水稀释成5％组织匀浆，按照试剂盒操作要求依次加入试剂，旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后3500转/min，离心10min，取上清液，532nm处，测定各管的吸光度。

4.2.4.2计算公式

肝组织中MDA含量计算公式：

组织中MDA含量(nmol/mgprot)＝[(定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)]×标准品浓度(10nmol/mL)÷蛋白含量(mgprot/ml)。

4.2.4.3测定后统计分析肝组织中MDA的含量，结果见表10。

表10 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝组织中MDA含量的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)。

实验结果表明，模型动物肝脏中MDA的含量与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。化橘红总黄酮各剂量组动物肝脏中MDA的含量与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有抗氧化的作用。

4.2.5化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝脏中SOD的影响

4.2.5.1测定方法：

试剂一：贮备液：10mL×1瓶(天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用)；试剂一应用液的配制：用时每瓶加蒸馏水稀释至100mL，4℃保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4-10℃保存。

试剂三：液体10mL×1瓶，4-10℃保存。

试剂四：液体350uL×2支，4℃保存，不可冷冻；4号稀释液10mL×1瓶，4℃保存。用时二者按1∶14稀释，可以一次稀释，也可以分次稀释。配好的试剂四4℃保存，不可冷冻。配好后可保存2-3个月。注：所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。

试剂五：粉剂×1支，用时加70-80℃热双蒸水75mL溶解后备用，若加热过程中水分蒸发了，此时必须用双蒸水补充至75mL，配好后的试剂避光4℃冷藏。

试剂六：粉剂×1支，用时加蒸馏水75mL溶解后备用，配好后的试剂避光4℃冷藏。

显色剂的配制：按照试剂五∶试剂六∶冰醋酸＝3∶3∶2的体积比配成显色剂，4℃避光冷藏。

取新鲜肝脏，用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称取0.2g左右的肝脏组织，按照重量体积比加生理盐水制备成10％的组织匀浆，2000转离心10min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水稀释成1％组织匀浆，作为测试样品。按照试剂盒要求加入试剂及显色剂后混匀，室温放置10分钟，于550nm处比色，测定OD值。

4.2.5.2计算公式：

组织匀浆中SOD活力(U/mgprot)＝(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度÷50％×{反应液总体积/取样量(mL)}÷组织中蛋白含量(mgprot/ml)。

4.2.5.3测定后统计分析肝组织中SOD含的含量，结果见表11。

表11 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝脏中SOD的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)。

实验结果表明，模型组大鼠肝脏中SOD含量与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。化橘红总黄酮各剂量组动物肝脏中SOD的含量与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，并存在一定的剂量依赖关系，说明化橘红总黄酮可能具有一定的抗氧化能力。

本实验研究结果表明，化橘红总黄酮可明显升高酒精性肝损伤大鼠肝脏蛋白含量、降低肝糖元含量，改善受损的肝功能，推测其作用机理可能与以上提到的因素有关。本研究中模型大鼠肝组织SOD活力明显降低，MDA含量明显升高，说明氧化应激已参与到慢性酒精肝的发病过程中。而化橘红总黄酮可有效增加酒精性肝损伤动物模型的SOD活力，并抑制肝组织MDA含量，结果提示化橘红总黄酮的药物作用机理可能与发挥抗氧化应激有关。

4.2.6小结

4.2.6.1化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝内蛋白质含量和肝糖原的影响

实验结果表明，模型组动物中的肝蛋白质含量和肝糖原含量与对照组比较，具有显著性差异(P＜O.05)。化橘红总黄酮低剂量组和高剂量组动物的肝糖原与模型组比较，具有显著性差异(P＜O.05)，说明化橘红总黄酮可能具有一定的促进肝内脂肪代谢的作用。

4.2.5.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝脏中SOD和MDA含量的影响

实验结果表明，模型动物肝脏中MDA的含量、SOD的含量与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。化橘红总黄酮各剂量组动物肝脏中MDA的含量、SOD的含量与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有抗氧化的作用。

4.3化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝组织病理的影响

4.3.1仪器与试药

4.3.1.1仪器Leica TB1020切片机；Leica RM2135脱水机；OLYMPUS CX21显微镜。

4.3.1.2试剂10福尔马林；2％伊红染液；苏木素染液；酒精。

4.3.1.3.实验方法

给二锅头后第28天，动物末次给药2小时后(即禁食不禁水16小时后)，各组大鼠称重，腹腔注射2％戊巴比妥钠45mg/kg，腹主动脉采血后处死。于肝右叶切取0.2cm×0.2cm×0.5cm肝组织1块，固定于4％的多聚甲醛中(固定时间大于48h)，用于制作石蜡切片。经HE染色、脱水、透明、封片，普通光学显微镜下观察。

4.3.1.4肝脏病理检测标准，见表12。

表12 肝脏病理检测标准

4.3.2结果

4.3.2.1空白对照组肝脏病理检测结果(图1)。

图1是空白对照组肝脏病理切片图。

由图1可见：

12例肝组织标本镜下均可见肝小叶结构清晰，界板平滑，肝细胞索排列规则，窦内皮细胞、储脂细胞及枯否氏细胞未见增生。肝细胞胞浆红染，核居中。汇管区结构清晰，胆管未见明显增生，纤维结缔组织未见增生。

4.3.2.2模型组肝脏病理检测结果(图2)。

由图2可见：

7例肝组织中均可见中至重度脂肪变性，以中央静脉中央区和中间区为主。其中6例为重度脂肪变性，伴局部肝细胞胞浆疏松化。另1例为弥漫性肝细胞水肿(胞浆疏松化为主，部分可见气球样变)，伴局部肝细胞内细小脂滴。

7例肝组织中均见肝血窦及汇管区轻度炎细胞浸润(中性粒细胞、淋巴细胞单核细胞为主)，均见小胆管有不同程度的增生，其中2例见肝血窦明显扩张充血，2例见肝血窦局部扩张，3例肝组织内可见散在分布的多处小坏死灶。

4.3.2.3阳性组肝脏病理检测结果(图3)。

由图3可见：

6例肝组织中可见轻至中度脂肪变性，以小叶周边区多见，肝细胞内脂肪滴细小，以弥漫泡沫细胞为主要表现，其中2例中度脂肪变性，并可见散在点状、小灶性肝细胞坏死。4例轻度脂肪变性。2例肝组织未见明显脂肪变性。偶见部分肝细胞胞浆疏松化。

8例肝组织小胆管均有不同程度的增生，肝血窦及汇管区轻度炎细胞浸润(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞为主)。

4.3.2.4化橘红总黄酮低剂量组肝脏病理检测结果(图4)。

由图4可见：

8例肝组织中可见轻至重度脂肪变性，以小叶周边区多见。其中2例重度脂肪变性，见大范围肝细胞内脂肪空泡；3例中度脂肪变性，肝细胞内脂肪滴细小，以弥漫泡沫细胞为主要表现；3例轻度脂肪变性，见部分肝细胞内散在小脂肪空泡。7例肝组织中可见不同程度的部分肝细胞胞浆疏松化，其中2例仅见少数中央静脉周围肝细胞胞浆疏松化，2例见肝血窦明显扩张充血，4例见部分肝血窦扩张。

其中9例肝组织均见血窦及汇管区炎细胞浸润(中性粒细胞、淋巴细胞为主)，伴散在分布的点状、小灶性坏死和小胆管增生。1例除局部血窦扩张外，未见明显异常改变。

4.3.2.5化橘红总黄酮中剂量组肝脏病理检测结果(图5)。

由图5可见：

6例肝组织中可见轻至中度脂肪变性。其中2例中度脂肪变性，见大范围肝细胞内大小不等的脂肪空泡；4例轻度脂肪变性，见部分肝细胞内散在细小脂肪空泡，以弥漫泡沫细胞为主要表现。6例肝组织中可见不同程度的部分肝细胞胞浆疏松化，其中3例见部分肝血窦扩张。

其中7例均见血窦及汇管区炎细胞浸润(中性粒细胞、淋巴细胞为主)，伴小胆管增生，有1例还可见增生的纤维组织围绕小胆管。5例肝组织可见少量散在分布的点状、小灶性肝细胞坏死。

4.3.2.6化橘红总黄酮高剂量组肝脏病理检测结果(图6)。

由图6可见：

10例肝组织中可见轻至中度脂肪变性。其中2例中度脂肪变性，见部分肝细胞内较多小脂肪空泡，以弥漫泡沫细胞为主要表现；7例轻度脂肪变性，见肝细胞内散在细小脂肪空泡。

8例肝组织中可见不同程度的部分肝细胞胞浆疏松化，其中1例比较严重，余累积范围较小。

9例均见血窦及汇管区炎细胞浸润(中性粒细胞、淋巴细胞为主)，伴小胆管增生。

7例肝组织可见点状、灶性肝细胞坏死。其中2例可见多处较大的坏死灶，5例仅见散在分布的点状、小灶性坏死。

4.3.2.7实验各组病理检查结果汇总

对以上各组病理检查结果进行汇总分析化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠的病理影响(表13)。

表13 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠的影响实验肝脏病理检查结果

本研究中采用55度北京红星二锅头灌胃4周，合喂以高脂饲料制作慢性酒精性肝损伤模型。光镜下显示：正常组肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐，肝细胞无明显病变，核结构清晰；实验组肝细胞则出现广泛性的空泡性变性，表现为细胞体积增大，胞浆疏松、浅染，乃至清亮、透明，部分肝细胞呈典型的气球样变，证明所造大鼠ALD模型比较成功。研究结果提示化橘红总黄酮对慢性酒精性肝损伤的病理改变有明显的影响，使动物脂肪变性病变减轻，表明药物有明显的抗肝脂肪变性的作用。

4.3.3小结

4.3.3.1模型组各例肝组织均可见中至重度脂肪变性等病变，提示酒精性肝损伤模型组复制成功。

4.3.3.2阳性组、化橘红总黄酮各剂量组动物在降低肝细胞脂肪变性、减轻肝细胞炎症反应和降低细胞水肿，且存在一定的剂量依赖关系，提示化橘红总黄酮具有一定的护肝作用。

4.4化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝细胞凋亡的影响

4.4.1仪器与试药

4.4.1.1仪器电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号PB203-N)；离心机(上海安亭科学仪器厂，型号TDL-5-A)；无菌超净台(苏州净化有限公司，型号：SW-CJ-2FD)；流式细胞仪(美国BD公司，型号：FACSCalibur)。

4.4.1.2试剂Annexin V-FITC(美国Biovision)。

4.4.1.3方法

给二锅头后第28天，动物末次给药2小时后(即禁食不禁水16小时后)，各组大鼠称重，腹腔注射2％戊巴比妥钠45mg/kg，腹主动脉采血后处死。于肝小叶切取200mg肝组织1块，磨碎，200目筛网过滤，制成肝细胞悬液。

1500rpm/min离心5分钟，弃上清，Hank’s液洗两次，每次1500rpm/min离心5分钟。加入预冷的1ml PBS重悬细胞，轻轻震荡使细胞悬浮。计数，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取0.5ml细胞悬液，离心，弃上清。加500μl Binding Buffer，混匀后加5μl Annexin V-FITC和5μl PI，室温避光保存5min。空白对照组多制备一管，加500μl Binding Buffer，以不加Annexin V-FITC及PI，作为阴性对照。Ex＝488nm，Em＝530nm，FITC使用FL1通道，PI使用FL3通道，上流式细胞仪(FCM)测定肝细胞凋亡率。

4.4.2结果

各组实验动物肝细胞凋亡图见图13-18。对各组肝细胞凋亡率进行统计，分析化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡率的影响(表14)。

由图中可见，每个图由一个大方框构成。每个大方框中又由两条相垂直的线，将大方框分为4个象限，都可看到1、2、3、4，这4个数字分别表示4个区域。PI标记的是死细胞，FITC标记的是凋亡的细胞。FITC使用FL1通道，PI使用FL3通道。图中，1区域表示PI表达阳性的，就是表示死的细胞，2区域应表示PI和FITC表达双阳性的，3区域表示，PI和FITC都是阴性的，都不表达的，4区域表示FITC表达阳性的，就是凋亡的细胞。所以，本实验中凋亡细胞即是指4区域，数字越大，表示凋亡的越多。

表14 化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡率的影响

注：“*”与模型组比较，p＜0.01。

表14显示：模型组大鼠肝细胞凋亡率明显增加，凋亡率达到16.34±11.58，与对照组(5.0±0.77)相比较，具有显著性差异(p＜0.01)，说明酒精性肝损伤模型制作较为成功。五子衍宗丸组、高剂量组大鼠肝组织的凋亡率分别为(4.84±0.29)和(5.22±0.90)，与模型组比较，肝细胞的凋亡率有明显下降，统计学分析表明各组间具有显著性差异(p＜0.01)，说明五子衍宗丸、化橘红总黄酮高剂量可减少酒精性肝损伤的肝细胞凋亡，具有保护肝组织的作用。化橘红总黄酮低剂量组和中剂量组凋亡率分别为(10.16±3.91)和(7.96±1.74)，尽管和模型组相比，统计学无差异，但也提示药物组具有使酒精性肝损伤肝细胞凋亡率下降的趋势。

4.4.3.小结

4.4.3.1在慢性酒精性肝损伤大鼠中可观察到肝细胞凋亡明显增加，说明细胞凋亡在酒精性肝病的致病过程中具有重要的意义。

4.4.3.2化橘红总黄酮高剂量组可明显降低酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡率，提示药物可能通过抑制模型动物肝细胞凋亡而起到对抗肝损伤的治疗作用。

4.5化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型血清细胞因子含量的影响

4.5.1.仪器与试药

4.5.1.1仪器BIO-RAD550微板酶标仪(美国BIO-RAD公司)；EPPENDORF 5415D离心机(德国EPPENDORF公司)；IKR-1型微型振荡器(德国IKR公司)。

4.5.1.2试剂大鼠TNFαELISA试剂盒(购自深圳晶美生物工程有限公司，批号：FRK0003)；RAT TGF-β1ELISA试剂盒(购自奥地利Bender medsystems公司，批号：BMS623)；RAT IL-6ELISA试剂盒(购自奥地利Bender medsystems公司，批号：BMS625)。

4.5.1.3方法

给二锅头后第28天，动物末次给药2小时后(即禁食不禁水16小时后)，各组大鼠称重，腹腔注射2％戊巴比妥钠45mg/kg，腹主动脉采血后处死。采血30min后3000r/min离心，分离血清，供测定血清中的TNF-α、TGF-β1、IL-6含量。

4.5.2结果

4.5.2.1化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TNF-α含量的影响按试剂盒要求的操作步骤进行大鼠血清TNF-α的含量测定，得如下结果。

4.5.2.1.1大鼠血清TNF-α含量ELISA检测标准曲线的制定(图7)

由图7可以看出，大鼠血清TNF-α含量与450nm吸光度值成正相关。线性方程式为：y＝0.0016x+0.242；线性相关指数R²＝0.9779。各组样品根据该线性方程换算含量。

4.5.2.1.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TNF-α含量的影响(图8)

化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TNF-α含量的影响见图8。由结果可知，模型组血消TNF-α含量明显增高，与空白组相比，差异具有统计学意义(p＜0.01)。化橘红总黄酮三个剂量组TNF-α含量与模型组相比，均有不同程度的降低，与模型组相比，有明显的统计学差异(p＜0.01)。阳性药组也可降低酒精性肝损伤大鼠的血清TNF-α含量，与模型组相比，差异也具有统计学意义(p＜0.01)。

4.5.2.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TGF-β1含量的影响

按试剂盒要求的操作步骤进行大鼠血清TGF-β1的含量测定，得如下结果。

4.5.2.2.1大鼠血清TGF-β1含量ELISA检测标准曲线的测定(图9)

由图9可以看出，大鼠血清TGF-β1含量与450nm吸光度值成正相关。线性方程式为：y＝0.0184x-0.005；线性相关指数R²＝0.9792。各组样品根据该线性方程换算含量。

4.5.2.2.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TGF-β1含量的影响(图10)

化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TGF-β1含量的影响见图10。由结果可知，模型组血清TGF-β1含量明显增加，与空白组相比，差异具有统计学意义(p＜0.01)。化橘红总黄酮三个剂量组TGF-β1含量与模型组相比，均有不同程度的减弱，其中以中剂量组为明显，与模型组相比，差异具有统计学意义(p＜0.01)，阳性药五予衍宗丸组也呈明显的减少酒精性肝损伤模型大鼠TGF-β1含量的趋势，与模型组相比，差异具有统计学意义(p＜0.01)。

4.5.2.3化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清IL-6含量的影响

按试剂盒要求的操作步骤进行大鼠血清IL-6的含量测定，得如下结果。

4.5.2.3.1大鼠血清含量IL-6ELISA检测标准曲线的测定见图11。

由图11可以看出，大鼠血清IL-6含量与450nm吸光度值成正相关。线性方程式为：y＝0.0003x+0.0409；线性相关指数R²＝0.9996。各组样品根据该线性方程换算含量。

4.5.2.3.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清IL-6含量的影响(图12)

化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清IL-6含量的影响见图12。由结果可知，模型组血清IL-6含量与空白组相比，有明显增加的趋势，但并未表现出统计学的差异(p＞0.05)。化橘红总黄酮三个剂量组IL-6含量与模型组相比，均有不同程度的减弱，其中以低剂量组为明显，与模型组相比，差异具有统计学意义(p＜0.01)。阳性药五子衍宗丸组也呈明显的减少酒精性肝损伤模型大鼠IL-6含量的作用，与模型组相比，差异具有统计学意义(p＜0.01)。

本课题研究结果表明，酒精性肝损伤模型动物的血清TNF-α、TGF-β1、IL-6含量明显升高，提示在造模4周后，有可能肝损伤已经转变为纤维化。而采用化橘红总黄酮治疗后，血清TNF-α、TGF-β1、IL-6含量降低，与模型组比较大部分有显著性差异(P＜0.01)或有差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮有可能通过减少肿瘤坏死因子含量、抑制TGF-β1含量、降低IL-6含量，从而减轻肝脏炎症、扭转肝纤维化趋势、改善肝脏病理等，控制肝损伤的进一步发展，从而达到治疗酒精性肝损伤的治疗目的。

4.5.3小结

4.5.3.1采用55度红星二锅头灌胃4周，配以高脂饲料，制作的慢性酒精性肝损伤模型，动物血清进行ELISA检测发现血清中TNF-α、TGF-β1和IL-6含量明显增加。说明在慢性酒精性肝损伤过程中细胞炎症因子含量增加，导致多种细胞炎症介质释放，使肝组织损伤加重，同时有可能使肝损伤进一步加重为肝纤维化。

4.5.3.2采用化橘红总黄酮治疗后，可减低模型动物的细胞因子含量，使肝脏炎症减轻，肝功能恢复，同时有可能逆转肝脏病理改变。

5讨论

由酗酒所导致的肝脏疾病，目前已经成为欧美青年的主要死因^[1]，随着我国居民生活方式、膳食结构的改变和酒类产量的增加，人群中嗜酒者比例呈上升趋势。1996年流行病学调查显示，我国12亿人口中酒民约3亿，东北地区酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的发病率高达20％。ALD已成为我国仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾患^[2]。目前西医治疗该疾病以戒酒、对症支持治疗为主，而中医在防治该病方面有独到之处。积极开展中医药防治ALD的研究，已成为肝病领域的新课题。化橘红为广东化州特产药材，除用于化痰止咳外，清.赵学敏还提出该药材具有“解酒宽同”作用，本研究主要考察了化橘红主要有效部位总黄酮对酒精性肝损伤的防治作用，并对其机理进行探讨。

5.1化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型一般情况及肝功能指标的影响

5.1.1酒精性肝损伤模型的选择

目前对酒精性肝病发病机制的了解很大程度上取决于动物模型的可靠性和可重复性，以及模型与人类酒精性肝病的相似性。酒精性肝损伤的造模根据发病的病理过程分为急性肝损伤和慢性肝损伤两种类型。

急性酒精性肝损伤多为小鼠或大鼠以50至60度白酒或体积分数为50-60的乙醇一次或多次经口灌胃4.0～6.0g/kg，给予乙醇的时间通常为1周以内，末次给予乙醇4～24h内处死动物，检查肝功、肝组织的病理变化及脂质过氧化等有关指标^[3-4]。

慢性酒精性肝损伤动物模型也是以给予酒精为主进行。Liber等用狒狒为实验动物，通过液体食料饲喂酒精的方法造模，6个月可出现肝小叶中央静脉周围纤维化，2～3年后，1/3的动物发生肝硬化。该模型与人类酒精性肝硬化极其相似，但由于动物来源有限，价格昂贵，造模周期长，难以推广应用^[112]。李舒丹等^[5]、范建高等^[6]、李东良等^[7]、冯志强等^[8]采用不同方式给动物灌服酒精，均成功地建立了酒精性肝损伤模型。

本研究中主要采用给予大鼠灌胃55度红星二锅头2ml/100g的方法。除灌二锅头外，每日仍以充足的水分和高脂饲料喂饲，共灌二锅头4周。实验结果表明，该模型组动物肝脏指数明显增加，血清ALT与AST含量明显增加，与空白对照组相比，差异有统计学意义，提示该模型制作成功，由于该方法简便，易于操作，可重复性强，因此可认为该模型为制作慢性酒精性肝损伤的理想方法之一。

5.1.2酒精性肝损伤的中医病机认识

酒精性肝病在中医古文献中无确切病名记载，在各文献中以“酒疸”、“胁痛”、“伤酒”、“酒癖”、“酒胀”、“酒鼓”等病名称之。

长期大量饮酒造成酒毒湿热之邪内蕴不解。酒毒之邪伤人，壅塞中焦，酿痰生湿，痰阻气机，而成肝郁之证。湿热之邪，灼伤阴液，导致肝肾阴虚。总之，本病由于脾胃、肝、肾功能相互失调，终至气、湿、痰、水、血内停腹中，形成本虚表实，虚实夹杂之证^[9-11]。

5.1.3化橘红总黄酮对酒精性肝损伤的保护作用

化橘红具有化痰活血的作用，可能使停积在腹中的积痰和瘀血得以消除，使酒精肝的病因得消，病位得去，因此，从中药的主要功能来看，化橘红应当具有治疗酒精肝的作用，这也与《本草纲目拾遗》所载相吻合。

本研究结果表明，化橘红总黄酮可改善酒精性肝损伤动物的死亡率，与模型组53％的死亡率相比较，化橘红三个剂量组分别为21％、24％和18％。另外化橘红总黄酮使肿大的肝脏指数明显减少，具有抑制肝脏肿胀的作用。实验结果还表明，化橘红总黄酮可降低酒精性肝损伤动物ALT和AST含量，与模型组相比，差异具有显著性。

5.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝蛋白、肝糖原及脂质过氧化指标的影响

5.2.1酒精性肝损伤的发病机制研究

ALD的致病因素单一，即长期大量的酒精摄入，但其发病机制较为复杂，目前尚不完全清楚。可能与酒精及其代谢产物对肝脏的毒性作用、氧化应激、免疫介导和细胞因子、细胞凋亡、内毒素、遗传多态性、与病毒的叠加作用等多种因素有关。

机体摄入的酒精90％以上在肝脏代谢。经过肝细胞内(ADH)、微粒体乙醇氧化酶系统(MEOS)和过氧化酶(Catalase)氧化成乙醛，进而氧化为乙酸。在对乙醇氧化的过程中引起氧化型的辅酶I(NAD)向还原型辅酶I(NADH)转变.导致NADH/NAD比例增加，进而影响NAD依赖的代谢过程，如枸椽酸循环、氨基酸氧化和脂肪酸的氧化代谢。NADH也抑制草酰乙酸、丙酮酸、磷酸二羟丙酮和糖原合成酶的活性，进而干扰糖原异生过程，导致患者低血糖症。氧化还原状态的改变和代谢紊乱是酒精代谢过程中的急性改变，戒酒后可以逆转^[12]。

大量研究已经显示乙醛在活体生理状态下能与多种蛋白发生共价结合，形成稳定的和不稳定的乙醛蛋白加合物(APA)^[13]，其形成不但改变了蛋白质的结构，而且造成了蛋白质功能异常，如蛋白酶失活、DNA修复蛋白功能障碍、GSH耗竭、线粒体损伤、氧利用障碍和胶原蛋白合成增加，乙醛诱导的蛋白质损伤是ALD肝细胞气球样变的根本机制。而且可作为抗原诱导免疫反应，产生相应抗体，引起肝细胞炎症、坏死及纤维组织增生^[14]。

生理情况下，细胞内存在着自由基的清除剂即抗氧化剂，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、维生素E等，可以随时清除不断生成的有害自由基，使自由基的生成与降解处于动态平衡，病理情况下，由于活性氧生成过多或机体抗氧化能力不足，可引发氧化应激(oxidative stresss)反应。自由基可与生物膜内多价不饱和脂肪酸作用，形成脂质自由基和过氧化物，从而破坏生物膜的正常结构和间接抑制膜蛋白功能、促进自由基及其他代谢反应、影响线粒体功能和促进肝细胞脂肪变性等，最终促进炎症反应、导致线粒体功能异常、干扰脂肪酸氧化、ATP生成减少，导致脂肪在肝细胞内沉积。Sampey等^[13]认为酒精诱导的脂质过氧化发生在肝损伤的早期，脂质过氧化可使机体对醛类毒性作用敏感性增强以及导致促炎和促纤维化的作用。

5.2.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤的保护作用

本实验研究结果表明，化橘红总黄酮可明显升高酒精性肝损伤大鼠肝脏蛋白含量及肝糖元含量，改善受损的肝功能，推测其作用机理可能与以上提到的因素有关。

研究中发现，在慢性酒精性肝损伤中，大鼠肝组织SOD活力明显降低，MDA含量明显升高，说明氧化应激已参与到慢性酒精肝的发病过程中。而化橘红总黄酮可有效增加酒精性肝损伤动物模型的SOD活力，并抑制肝组织MDA含量，结果提示化橘红总黄酮的药物作用机理可能与发挥抗氧化应激有关。

5.3化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝组织病理的影响

5.3.1酒精性肝损伤所致的肝组织病理改变

乙醇进人肝脏后，先氧化为乙醛，再氧化为乙酸，最后转变为二氧化碳和水排出体外。过量饮酒，大量乙醛对肝细胞有明显的毒害作用，可直接或间接导致肝细胞变性、坏死及纤维化，同时还有肝非实质细胞的改变。肝细胞脂肪变性是酒精性肝损伤最早和最常出现的损伤形式。酗酒者约90％肝穿可见脂肪变性，主要表现为肝细胞胞浆内见明显脂滴。酒精性肝损伤时肝细胞肿大，胞浆疏松，淡染，呈水样变性，若细胞进一步肿大则呈气球样变性。常规病理切片可见胞浆内有圆形空泡，因为脂滴的主要成分为三酰甘油，在石蜡切片制片过程中被脂溶剂二甲苯溶掉，故在切片中仅留下圆形空泡，主要分布在小叶中央静脉周围。此外，酒精性肝损伤时肝细胞肿大，胞浆疏松，淡染，呈水样变性；若细胞进一步肿大则呈气球样变性，上述改变多位于小叶中心带，呈灶状分布^[16]。

5.3.2慢性酒精性肝损伤模型的复制

本实验采用55度北京红星二锅头灌胃4周，合喂以高脂饲料制作慢性酒精性肝损伤模型。光镜下显示：正常组肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐，肝细胞无明显病变，核结构清晰；实验组肝细胞则出现广泛性的空泡性变性，表现为细胞体积增大，胞浆疏松、浅染，乃至清亮、透明，部分肝细胞呈典型的气球样变。以上结果均与文献报道相一致^[17-18]。以上结果证明，我们所造大鼠ALD模型比较成功，同时，本实验所造酒精性肝病动物模型与以往模型相比，更接近于人类该疾病的发生过程，故该模型能够应用于人类对酒精性肝病的研究。

5.3.3化橘红总黄酮对大鼠慢性酒精性肝损伤病理形态的影响

化橘红总黄酮用药后，动物肝脏病理学检查可见，小胆管明显增生，散在脂肪空泡明显增加，脂肪变性明显减弱，细胞重度水肿的例数明显减少，细胞炎症状态有所改善。研究结果提示化橘红总黄酮对慢性酒精性肝损伤的病理改变有明显的影响，使动物脂肪变性病变减轻，提示药物有明显的抗肝脂肪变性的作用。

5.4化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝细胞凋亡的影响

细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞死亡过程。凋亡是正常细胞现象，但也可被许多外部因素激发，提示激活调亡控制基因的机制可以不同。肝细胞凋亡发生在肝发育和成人肝的肝细胞更新时，也发生在各种病毒性、免疫、肿瘤和药物引起的肝脏疾病。

5.4.1细胞凋亡与酒精性肝损伤

在ALD患者肝活检中发现Mallory小体和调亡标志物同时出现在同一肝细胞内，提示含Mallory小体的肝细胞可能以凋亡的方式被清除。Zhao^[19]等用末端核什酸转移酶(Tdr)脱氧三磷酸卡复苷酸(dNTP)缺口末端标记(TUNEL)法检测，43例ALD患者肝活检标本中的肝细胞凋亡率为4％～5.3％。长期给小鼠酒精饮食后可见鼠肝细胞中凋亡小体明显增多，并伴有不同程度的肝损伤，如脂肪肝、炎症等，表明在人类、动物酒精诱发肝损伤的过程中确有肝细胞凋亡的发生。在大鼠ALD的逐渐发展过程中，不仅凋亡的肝细胞不断增加，而且肝细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)阳性率也随之上升。提示在ALD中肝细胞凋亡现象及其再生修复同时存在。Zoil^[20]等认为，肝细胞凋亡在ALD的发生发展中起重要作用，ALD肝细胞凋亡代表在肝细胞增殖的刺激下肝脏的重塑，以维持肝脏的正常形态。在这种情况下肝细胞凋亡与肝损伤再生密切相关，以保持细胞凋亡，细胞增殖平衡。为证实肝细胞凋亡在ALD中的作用，在Ziol^[20]等的临床研究中，ALD患者肝活检中均可见肝细胞调亡，凋亡率在0.3％-28％，平均凋亡率为6.2％，并且肝细胞气球样变性与凋亡、中性粒细胞浸润无关，表明凋亡是ALD肝细胞死亡的主要形式。Natori等^[21]认为，细胞凋亡是ALD的重要病理特征，在他们的研究中AH组肝细胞凋亡率是正常对照组的6倍[(0.33±0.04)-(2.0±0.31)]，ALD组caspase表达强阳性，对照组则为阴性，并且肝细胞凋亡率与肝损伤的生化指标(如：AST、TBIL)及组织病损程度相关，进一步证实凋亡在ALD的发病机制中起着重要作用。

5.4.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝细胞凋亡的影响

本项研究发现，在酒精性肝损伤大鼠模型组肝细胞凋亡率明显升高，说明细胞凋亡是该模型中肝细胞损伤的主要形式，与Ziol等人的研究结果相一致。化橘红总黄酮高剂量组可明显降低模型动物肝细胞凋亡率，提示药物治疗可能通过抑制细胞凋亡率而达到减少肝细胞死亡的效果。化橘红总黄酮中低剂量组虽然未表现出明显的降低模型动物肝细胞凋亡率的作用，但也表现出明显的降低趋势，推测与药物使用的剂量有关。化橘红总黄酮抑制酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡的机制还需进一步研究。

5.5化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型血清细胞因子含量的影响

5.5.1TNF-α与酒精性肝损伤

肿瘤坏死因子(TNF)还称为恶液素，这是因为它能引起急性或慢性感染动物的恶液质状态。TNFα的生物学活性非常复杂，包括对造血、免疫和炎症的调节；对血管和凝血的影响和对多种器官的作用等。TNF-α对不同的细胞有不同的作用：杀伤细胞，诱导敏感细胞凋亡，快速、强烈、不可逆的抑制红细胞系前体和红系、粒系肿瘤细胞的生长等。ALD病人循环中TNF-α水平增高，且TNF-α与酒精性肝损伤的生化指数相关。TNF-α在酒精性肝病的发生发展中也占有重要地位，它在肝脏主要由激活的Kuffer细胞产生，并作为一个关键因子参与各种肝脏疾病的发生发展。TNF-α被普遍认为是酒精相关性肝坏死性炎症发病机制中的最后共同通路。

研究认为，酒精诱导的细胞因子在肝脏的炎症中发挥作用，ALD患者血浆和肝脏促炎细胞因子增多2～4倍。75％的患者IL-1β、IL-8(中性粒细胞趋化因子)、TNF-α、TGF-β水平增高，而IL-4水平下降，肝细胞通过与TNF-α结合后通过信号转导引起肝细胞坏死和凋亡^[22]。ALD病人循环中TNF-α水平增高，且TNF-α与酒精性肝损伤的生化指数相关。应用逆转录聚合酶链反应在大鼠ALD模型的研究中发现，肝内TNF-αmRNA增高的水平与肝脏病理损伤的程度相关。赵世义^[23]的研究发现，不论是哪一种类型的酒精性肝病，所测血清中TNF-α的水平均高于对照组，这与Kamimura^[24]发现在大鼠慢性饮酒模型中大鼠血清TNF-α仅的水平升高相一致。目前，认为TNF-α在ALD发病机制中的作用有^[25]：(1)介导肝细胞凋亡；(2)触发炎症反应；(3)促进肝纤维化；(4)导致血流动力学紊乱；(5)与ALD发病的性别差异有关；(6)与氧化应激有关。

本课题研究结果表明，酒精性肝损伤模型动物的血清TNF-α含量明显升高，与张维丽^[26]、洪钟淑^[27]、陈克河^[28]等人的研究结果一致。而采用化橘红总黄酮治疗后，血清TNF-α含量明显降低。说明药物有可能通过减少肿瘤坏死因子含量，从而减轻肝脏炎症，控制肝损伤的进一步发展，从而达到治疗酒精性肝损伤的治疗目的。

5.5.2TGF-β与酒精性肝损伤

TGF-β(转化生长因子)是近年公认的促胶原合成因子，具多功能的调节作用，在全身各脏器尤其是肝脏纤维化疾病中起着关键性的作用。TGF-β在肝损伤中的作用机制为促进肝脏细胞外基质(ECM)的合成与沉积^[29]，抑制ECM的降解^[30]。研究表明，慢性乙型肝炎及肝硬变患者血清TGF-β水平明显升高^[31]，并按慢性乙型肝炎轻、中、重度、肝硬变依次升高；TGF-β与血清PCNA、LN、HA水平呈正相关并随肝组织纤维化程度的加重而增加。秋水仙碱、活血软肝丹处理后的动物血清及肝组织TGF-β水平均较模型组明显下降，而活血软肝丹作用更明显，这可能是活血化瘀、软坚散结方药的作用机制之一。

本研究结果表明，酒精性肝损伤大鼠血清TGF-β1含量较空白对照组明显增加，提示在造模4周后，有可能肝损伤已经转变为纤维化，而TGF-β1是其中的主要标志。采用化橘红总黄酮治疗后，中剂量组可明显降低血清TGF-β1含量，说明药物可能通过抑制TGF-β1含量，扭转肝纤维化趋势，改善肝脏病理。

5.5.3IL-6和酒精性肝损伤

在酒精性肝病中，IL-6(白介素-6)活性改变越明显，纤维化的程度越重，其病情越重，预后越差。IL-6的活性改变与酒精性肝病的肝纤维化呈正相关。

IL-6作为肝细胞刺激因子，可直接刺激肝细胞增生分泌胶原；刺激储脂细胞增生并合成胶原、层粘蛋白和蛋白多糖；刺激肝细胞、储脂细胞和枯否细胞分泌多种细胞因子，引起这些细胞因子的致纤维作用；也可促进α2-巨球蛋白表达，抑制胶原酶活性，减少胶原蛋白降解使胶原沉积，促使肝纤维化形成^[32]。在酒精性肝病中，IL-6活性改变越明显，HA、LN、PC-IlI、IVC的水平越高，纤维化的程度越重，其病情越重，预后越差。IL-6的活性改变与酒精性肝病的肝纤维化呈正相关。王瑞科^[33]等的研究发现，酒精性肝病患者血清IL-6含量较正常组明显增加。

本研究结果表明，酒精性肝损伤大鼠血清IL-6含量增高，采用化橘红总黄酮治疗后，低剂量组可明显降低血清IL-6含量，说明药物治疗组有可能通过减少炎症细胞因子的含量，从而减轻肝脏炎症，改善肝功能。

6结论

本文从动物整体、组织、细胞、分子等不同水平进行了化橘红总黄酮抗酒清性肝损伤研究，化橘红总黄酮表现出较好的肝脏保护作用，对酒精性肝损伤有较好的预防作用。这与《本草纲目拾遗》中“化橘红……醒酒宽中……”的记载相一致，亦验证了《中华人民共和国药典》2005版中“化橘红用于……食积伤酒……”的功能。

6.1化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型一般情况及肝功能指标的影响：采用给予大鼠灌胃55度红星二锅头2ml/100g。除灌酒精外，每日仍以充足的水分和高脂饲料喂饲，共灌酒精4周。该方法是较为理想的制作慢性酒精性肝损伤模型的方法，具有操作简便，时程短的优点。

化橘红总黄酮对慢性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。可改善酒精性肝损伤模型大鼠一般情况，降低死亡率，抑制肝肿胀。

6.2化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝蛋白、肝糖原及脂质过氧化氧化指标的影响：模型组动物中的肝蛋白质含量和肝糖元含量与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。化橘红总黄酮低剂量组和高剂量组动物的肝糖原与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有一定的促进肝内脂肪代谢的作用。

模型动物肝脏中MDA的含量、SOD的含量与对照组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。化橘红总黄酮各剂量组动物肝脏中MDA的含量、SOD的含量与模型组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，说明化橘红总黄酮可能具有抗氧化的作用。

6.3化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝组织病理的影响：模型组各例肝组织均可见中至重度脂肪变性等病变，提示酒精性肝损伤模型组复制成功；中药提取物的各治疗组脂肪变性病变有明显减轻，提示中药提取物有明显的抗肝脂肪变作用。

6.4化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型肝细胞凋亡的影响：在慢性酒精性肝损伤大鼠中可观察到肝细胞凋亡明显增加，说明细胞凋亡在酒精性肝病的致病过程中具有重要的意义；化橘红总黄酮高剂量组可明显降低酒精性肝损伤大鼠肝细胞凋亡率，提示药物可能通过抑制模型动物肝细胞凋亡而起到对抗肝损伤的治疗作用。

6.5化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠模型血清细胞因子含量的影响：采用56度红星二锅头灌胃4周，配以高脂饲料，制作的慢性酒精性肝损伤模型，动物血清进行ELISA检测发现血清中TNF-α、TGF-β1和IL-6含量明显增加。说明在慢性酒精性肝损伤过程中细胞炎症因子含量增加，导致多种细胞炎症介质释放，使肝组织损伤加重，同时有可能使肝损伤进一步加重为肝纤维化。采用化橘红总黄酮治疗后，可减低模型动物的细胞因子含量，使肝脏炎症减轻，肝功能恢复，同时有可能逆转肝脏病理改变。

附图说明

图1是空白对照组肝脏病理切片图

图2模型组肝脏病理切片图

图3五子衍宗丸组肝脏病理切片图

图4化橘红总黄酮低剂量组肝脏病理切片图

图5化橘红总黄酮中剂量组肝脏病理切片图

图6化橘红总黄酮高剂量组肝脏病理切片图

图7大鼠血清TNF-α含量ELISA检测标准曲线

图8化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠TNF-α含量的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)

图9大鼠血清TGF-β1含量ELISA检测标准曲线

图10化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清TGF-β1含量的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)

图11大鼠血清IL-6含量ELISA检测标准曲线

图12化橘红总黄酮对酒精性肝损伤大鼠血清IL-6含量的影响

注：*表示与模型组相比，统计学有差异(p＜0.05)；**表示与模型组相比，统计学有显著差异(p＜0.01)

图13是空白对照组细胞凋亡图

图14是模型组细胞凋亡图

图15是五子衍宗丸组细胞凋亡图

图16是化橘红总黄酮低剂量组细胞凋亡图

图17是化橘红总黄酮中剂量组细胞凋亡图

图18是化橘红总黄酮高剂量组细胞凋亡图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

化橘红总黄酮的制备

毛橘红药材加水提取，浓缩至药材1g/ml，加乙醇至重量浓度为80％，滤过，滤液浓缩至药材2g/ml，加水至生药浓度为0.4g/ml，调PH值至1.5，冷藏72小时，分取沉淀，蒸馏水洗涤沉淀，60℃烘干即可。

总黄酮的测定方法和结果：采用高效液相色谱(HPLC)法制备总黄酮的指纹图谱，化学成分主要是黄酮和二氢黄酮，其中柚皮苷与野漆树苷含量较高，以其中柚皮苷与野漆树苷为指标成分进行测定，合计占总黄酮的85％以上。

实施例2

化橘红总黄酮的制备

取毛橘红粉末(过四号筛)2g，加石油醚500ml，超声波提取45min，弃去石油醚液，待样品中残存的石油醚全部挥去后，加甲醇500ml超声波提取30min，过滤，即得。

总黄酮的测定方法和结果：采用高效液相色谱(HPLC)法制备总黄酮的指纹图谱，化学成分主要是黄酮和二氢黄酮，其中柚皮苷与野漆树苷含量较高，以其中柚皮苷与野漆树苷为指标成分进行测定，合计占总黄酮的83％以上。

实施例3

化橘红总黄酮的制备

取毛橘红粉末(过四号筛)，用70％乙醇提取3次，每次加6倍溶剂、提取1.5h，提取物经大孔树脂吸附处理后喷雾干燥，所得总黄酮。

总黄酮的测定方法和结果：采用高效液相色谱(HPLC)法制备总黄酮的指纹图谱，化学成分主要是黄酮和二氢黄酮，其中柚皮苷与野漆树苷含量较高，以其中柚皮苷与野漆树苷为指标成分进行测定，合计占总黄酮的86％以上。

实施例4

化橘红总黄酮分散片的制备

化橘红总黄酮34.25％，MCC34.25％，CMS-NA20.55％，PVPP8.22％，硬脂酸镁0.68％，十二烷基磺酸钠0.68％，微粉硅胶1.37％，各原辅料分别过100目筛后，将毛橘红总黄酮粉末与MCC、CMS-N混匀，加入0.5％PVP水溶液制成软才，30目制粒后，加入其他辅料，压制成片剂，控制片剂硬度在4.5kg力左右，即得淡黄色分散片。

实施例5

化橘红总黄酮滴丸的制备

取化橘红总黄酮30g及聚乙二醇-6000 60g，水浴溶化，化匀后，移至滴丸机中，制成1000粒滴丸。

实施例6

化橘红总黄酮片剂的制备

取化橘红总黄酮30g，蔗糖100g和糊精30g，按照常规方法制成片剂200片。

实施例7

化橘红总黄酮颗粒剂的制备

取化橘红总黄酮30g，蔗糖100g和糊精30g，按照常规方法制成颗粒剂125袋。

实施例8

化橘红总黄酮胶囊的制备

取化橘红总黄酮30g，蔗糖100g和糊精30g，按照常规方法灌制胶囊。

英文缩写的中文全称：

ADH：乙醇脱氢酶；CAT：过氧化氢分解酶；MEOS：肝微粒体乙醇氧化酶系；ALDH：乙醛脱氢酶。

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Claims (7)

1.化橘红总黄酮在制备防治酒精性肝损伤的药物或保健品中的用途。

2.如权利要求1的应用，其中化橘红总黄酮用于降低酒精性肝损伤患者的死亡率。

3.如权利要求1的应用，其中化橘红总黄酮用于抑制肝脏肿胀的作用。

4.如权利要求1的应用，其中化橘红总黄酮用于恢复酒精造成的肝功能损害。

5.如权利要求1的应用，其中化橘红总黄酮用于促进肝脏蛋白的生成。

6.如权利要求1的应用，其中化橘红总黄酮用于促进肝内脂肪代谢作用。

7.如权利要求1～6中任一权利要求的应用，其中化橘红总黄酮是按照包括如下步骤的方法得到的：

(1)化橘红药材经水提取、浓缩；

(2)加乙醇至重量浓度为80％；

(3)滤过，滤液浓缩；

(4)加水，调PH值至1.5，冷藏72小时，分取沉淀，蒸馏水洗涤沉淀，60℃烘干。

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