CN113425762B - 一种桑葚发酵产物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种桑葚发酵产物，属于生物发酵技术领域。本发明以桑葚为原料，利用植物乳杆菌CICC24202(LactobacillusplantarumCICC24202)和短乳杆菌YM1301(LactobacillusbrerisYM1301)这两种益生菌混合悬液对桑葚匀浆进行发酵处理，得到桑葚发酵产物。本发明得到的桑葚发酵产物对2型糖尿病具有明显改善作用，能够有效降低血糖，增加葡萄糖耐受能力，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，降低2型糖尿病小鼠的脂肪蓄积，一定程度上改善肾功能，缓解或治疗2型糖尿病并发症，并且安全性高、生产容易、质量稳定性高。

Description

一种桑葚发酵产物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种桑葚发酵产物及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于体内胰岛素绝对或相对不足，或外周组织对胰岛素的敏感性降低从而导致体内糖和脂质代谢紊乱的慢性疾病。随着经济和人民生活水平的逐步提高，糖尿病已经成为危害人类健康的第三大非传染性疾病。
根据DM不同发病病因和机理将其分为1型糖尿病(Type 1Diabetes Mellitus，T1DM)、2型糖尿病(Type 2Diabetes Mellitus，T2DM)、妊娠糖尿病(Gestational DiabetesMellitus，GDM)和其他特定类型的糖尿病。 T1DM是在多种因素影响下，自身免疫系统出现异常，产生胰岛β细胞特异性抗体，永久性破坏胰岛β细胞从而导致胰岛素绝对缺乏；T2DM是体内胰岛素分泌水平正常，但机体对胰岛素的敏感性降低产生胰岛素抵抗效应，导致胰岛素生成水平降低，胰岛素分泌不足，无法有效降低机体血糖值，这是造成2型糖尿病发病主要的原因，约有90％的糖尿病患者为T2DM患者。长期的高血糖或者胰岛素抵抗也会诱发糖尿病肾病、糖尿病眼病等并发症，糖尿病相关并发病是导致糖尿病患者生活质量下降的主要因素。
治疗2型糖尿病的主要办法是饮食疗法、药物疗法等，其治疗的中心思想是减少糖的摄入以及通过各种方法以提升外周器官对胰岛素的敏感性而达到治疗的目的。但目前常用的治疗方法都存在着一定弊端，临床上治疗糖尿病的口服药物患者长期服用易引起低血糖、乳酸性酸中毒、肠胃不适等不良反应，因此开发高效、低毒的抗糖尿病药物仍是医药领域研究的热点，以日常食品为主要原料的抗糖尿病产品的开发具有安全性好的优点，是预防和改善糖尿病症状，降低糖尿病并发症发生的重要途径。
桑葚(Mori Fructus)始记于《唐·新修本草》中，是桑科植物桑的成熟果实，具有滋阴补血、治阴虚津少之效，是我国传统的药食同源药材品种。 2015版药典中记录其功能主治有滋阴补血，生津润燥。用于肝肾阴虚，眩晕耳鸣，心悸失眠，津伤口渴，内热消渴。桑葚对生长环境要求使其具有天然、无污染的优点，有“民间圣果”“中华圣果”之称。桑葚含有丰富的营养价值，含有多种微量元素、花色苷、生物碱、糖类等多种活性成分。桑葚中含有的黄酮、多酚、多糖等成分经研究发现都具有良好的降糖效果，也是很多降糖中药方剂中的主要组分，但桑葚果实中小分子糖含量较高，不宜于糖尿病人长期服用。因此，如何提高桑葚的药理价值，便于糖尿病人服用，且具有较好的降血糖效益是本领域需要解决的一个技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑葚发酵产物，有效降低桑葚中小分子糖含量，对2型糖尿病具有明显改善作用，可以明显降低血糖，提升糖耐受力，改善胰岛素抵抗，减少脂肪蓄积，改善肾脏功能。
本发明提供了一种桑葚发酵产物，由混合益生菌悬液发酵桑葚原浆得到，所述混合益生菌悬液由短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202按 1:0.1～10混合得到。
优选的，所述桑葚原浆由桑葚粉与水按照1g：4～6mL配制得到。
优选的，所述桑葚匀浆pH值为5.5～6.5。
本发明还提供了上述桑葚发酵产物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：桑葚原浆灭菌，冷却至室温后，接种混合益生菌悬液，发酵培养。
优选的，所述混合益生菌悬液的接种量为桑葚原浆体积的8～12％。
优选的，所述发酵条件为：36～38℃恒温培养96～120h。
优选的，所述发酵后的桑葚原浆于低温环境下迅速冻结后，冻干、粉碎得到发酵桑葚冻干粉。
本发明还提供了上述桑葚发酵产物在制备食品、保健品中的应用。
本发明还提供了上述桑葚发酵产物在制备缓解或治疗2型糖尿病的药品中的应用。
本发明还提供了上述桑葚发酵产物在制备缓解或治疗2型糖尿病并发症的药品中的应用，所述并发症包括血脂异常、肥胖、糖尿病肾病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202混合得到的混合益生菌悬液发酵桑葚，可以除去桑葚中小分子糖类如蔗糖、果糖等，降低桑葚的小分子糖含量，便于糖尿病人服用，并且得到的桑葚发酵产物酸甜适中，有明显桑葚香味和发酵特有的风味，口感良好。
本发明得到的桑葚发酵产物对2型糖尿病具有明显改善作用，可以明显降低血糖，提升糖耐受力，改善胰岛素抵抗，缓解脂肪蓄积和肾功能，在制备缓解或治疗2型糖尿病及其相关并发症的药物中有重要意义。
附图说明
图1为发酵过程中桑葚原浆酸度值的变化；
图2为发酵过程中桑葚原浆pH值的变化；
图3为发酵过程中桑葚发酵物中的葡萄糖含量的变化；
图4为发酵过程中桑葚发酵物中的还原糖含量的变化；
图5为发酵过程中桑葚发酵物感官风味的变化；
图6为各组实验对2型糖尿病小鼠体重、进食量、饮水量的影响；
图7为各组实验对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响；
图8为各组实验对2型糖尿病小鼠OGTT、AUC的影响；
图9为各组实验对2型糖尿病小鼠ITT、AUC的影响；
图10为各组实验对2型糖尿病小鼠FINS、HOMA-IR的影响；
图11为各组实验对2型糖尿病小鼠GHb的影响；
图12为各组实验对2型糖尿病小鼠肝糖原和肌糖原的影响；
图13为各组实验对2型糖尿病小鼠GLP-1的影响；
图14为各组实验对2型糖尿病小鼠TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C水平的影响；
图15为各组实验对2型糖尿病小鼠BUN的影响；
图16为各组实验对2型糖尿病小鼠Scr的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种桑葚发酵产物，由混合益生菌悬液发酵桑葚原浆得到，所述混合益生菌悬液由短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202按 1:0.1～10混合得到。
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)为乳杆菌目、乳杆菌科、短乳杆菌属，分离自牛奶、酸乳酒、干酪、酸泡菜等物，菌种为粗长杆状，两端钝圆，在生长繁殖过程中可产生有机酸、氨基酸、多糖等多种产物。短乳杆菌YM 1301 经本发明检测，具有较好的产氨基丁酸能力，十分适合作为功能健康产品用发酵菌株。
植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)是常见的发酵菌株，活菌数高，能大量产酸，可缓解乳糖不耐症。植物乳杆菌CICC 24202为植物乳杆菌中的一类菌株，好氧，菌落为微小圆形白色菌落，凸起，边缘整齐；细胞杆状，短链状，无芽胞，革兰氏阳性。植物乳杆菌CICC 24202耐热、耐酸性好，是适合植物材料作为培养基质的菌株。
本发明发现植物乳杆菌CICC 24202(Lactobacillus plantarum CICC 24202)适合用于植物来源的材料发酵，耐酸性好；短乳杆菌YM 1301 (Lactobacillus breris YM1301)经过本发明筛选证实，可以高产氨基丁酸，利用上述两种菌株对桑葚进行发酵，可以有效地除去桑葚里的小分子糖类，同时发酵物里含有的高活性益生菌也可以带来一定的健康效应，使得桑葚与益生菌产生协同效应。
本发明选择短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202作为益生菌发酵桑葚，两菌株混合发酵桑葚具有协同增效作用，可显著降低桑葚中小分子糖的的含量，同时由于两菌株的代谢活动提高了产物中的γ-氨基丁酸和多糖含量，可有效提高机体GLP-1分泌水平，从而起到有效缓解糖尿病的作用。本发明对短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202的具体来源不作限定。
在本发明中，混合益生菌悬液由短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202按1:0.1～10混合得到，优选为1:0.5～2，更优选为1:1。本发明通过该比例的混合益生菌悬液发酵桑葚，得到的两菌株代谢产物含量适中，与桑葚中含有的药理活性物质间产生了协同作用，进一步提高了桑葚发酵产物的降血糖效应。
本发明中桑葚匀浆由桑葚粉与水按照1g：4～6mL配制得到，料液比优选为1g：5mL。作为一种可选的实施方式，本发明将采购得到的桑葚用清水洗净，自然条件下晾干、粉碎，按照1g:5mL(m/V)的比例用蒸馏水配制发酵桑葚原浆。本发明中桑葚匀浆也可以由新鲜桑葚直接研磨得到，无需添加溶液，直接用于后续发酵。本发明对桑葚的具体来源以及清洗、晾干、粉碎方式不作限定。
本发明调节桑葚原浆pH值为5.5～6.5，优选为6.0。本发明由桑葚粉或新鲜桑葚制备的桑葚匀浆的pH值略低。本发明添加碱性物质调节桑葚匀浆的pH值，通过控制桑葚原浆的pH值，保证桑葚原浆为混合益生菌悬液发酵的最适pH值，可有效提高桑葚发酵效果，保证发酵产物的降糖效应。本发明对具体的pH调节方式不作限定。
本发明对上述得到的桑葚原浆进行灭菌处理，作为一种可选的实施方式，本发明将桑葚原浆于121℃灭菌20～25min。本发明对具体的灭菌方式不作限定。灭菌后的桑葚原浆冷却至室温备用。
本发明在无菌环境中，将益生菌悬液接种入桑葚原浆中，进行发酵培养。所述益生菌悬液的接种量为桑葚原浆体积的8～12％，优选为9～11％，更优选为10％。本发明发现，该接种量可以有效降解桑葚中的小分子糖，同时得到的桑葚发酵物中益生菌活菌数含量较高，可达2.28×105CFU/g以上，与桑葚发酵产物中降血糖活性成分具有协同作用，增加了发酵产物对2型糖尿病的缓解作用。
本发明所述的发酵培养条件为36～38℃恒温培养96～120h，进一步优选为37℃恒温培养110～115h。本发明发现，该发酵时间得到的桑葚发酵产物酸度值较高，同时，发酵96h后葡萄糖、果糖含量下降趋于稳定，可被消耗分解产生酸性物质，所得发酵产物的风味和口感更佳。
本发明可将发酵得到的桑葚发酵产物于低温环境下迅速冻结后，冻干、粉碎得到发酵桑葚冻干粉。作为一种可选的实施方式，本发明将桑葚原浆先于-20～-25℃冻结成块，然后置于-80℃冷冻干燥机冻干，冻干后粉碎处理，即为桑葚冻干粉。本发明对桑葚冻干粉的具体制备方法不作限定。
本发明得到的桑葚原浆或桑葚冻干粉可用于制备食品或保健品。本发明得到的桑葚原浆或桑葚冻干粉具有明显的桑葚香味和桑葚发酵特有的风味，酸甜适中，口感纯正，可用于制备桑葚味压片糖果、桑葚风味饮品等具有桑葚风味的食品。本发明得到的桑葚原浆或桑葚冻干粉中含有大量的桑葚多糖、γ-氨基丁酸和益生菌等，可用于制备辅助糖尿病治疗的保健品、调理肠胃菌群的食品或保健品。
本发明得到的桑葚原浆或桑葚冻干粉可用于制备缓解或治疗2型糖尿病的药品。本发明得到的桑葚发酵产物中葡萄糖和还原糖含量明显降低，但总多糖含量高于未发酵的桑葚，并且发酵产物中γ-氨基丁酸和益生菌含量增多，可有效提高机体GLP-1(胰高血糖肽样因子)分泌水平，调节肠道微生物，降低血糖，提升糖耐受力，改善胰岛素抵抗，从而起到有效缓解糖尿病的作用。
本发明得到的桑葚原浆或桑葚冻干粉可用于制备缓解或治疗2型糖尿病并发症的药品，所述并发症包括血脂异常、肥胖、糖尿病肾病。
本发明得到的桑葚发酵产物可显著降低长期高脂喂养小鼠血清中的TG (甘油三酯)、T-CHO(总胆固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白)和HDL-C (高密度脂蛋白)水平，可以显著降低糖尿病小鼠附睾周围脂肪重量(EAM) 和附睾周围脂肪指数(EAMI)。表明桑葚发酵物在降低2型糖尿病患者血糖的同时可以改善血脂异常，减少脂肪的蓄积，对于2型糖尿病患者减肥减脂有一定作用。
本发明得到的桑葚发酵产物可显著降低糖尿病小鼠的肾脏重量和肾脏指数，降低糖尿病小鼠血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)的血清含量水平。同时桑葚发酵产物中含有的益生菌对糖尿病小鼠肾功能有正向调节作用。表明桑葚发酵物可以在一定程度上改善2型糖尿病患者的肾功能。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中，桑葚购自新疆维吾尔自治区吐鲁番市；植物乳杆菌 CICC 24202(Lactobacillus plantarum CICC 24202，简称Lp)，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；短乳杆菌YM 1301(Lactobacillus breris YM 1301，简称Lb)，保存于云南省微生物研究所。
实施例1
本实施例提供了桑葚发酵产物的制备方法：
(1)发酵菌液制备
将MRS固体培养基于121℃灭菌25min，斜面放置冷却至室温，在超净工作台中操作划线，分别接入实验室已有的Lp和Lb菌液，并于培养箱中 37℃恒温培养36h，重复活化2-3次。
将100mL MRS液体培养基倒至250mL的锥形瓶中并于121℃灭菌 25min，待液体培养基冷却至室温，选取固体培养基中生长良好的单菌落，接种至液体培养基中培养。根据菌液的生长周期，选取生长至对数期的菌液，离心取其沉淀，并加入等体积的无菌生理盐水，得到菌种悬浮液。
(2)发酵桑葚前处理
桑葚采用清水洗净，晾干后粉碎处理，按照1g:5mL(m/V)的比例在桑葚粉中加入蒸馏水，配制得到发酵桑葚原浆。桑葚原浆的pH值控制在6.0 ±0.5，并于121℃灭菌25min。
(3)发酵接种菌种悬浮液
将灭菌的发酵桑葚原浆冷却至室温，于无菌环境中接入10％的菌种悬浮液(Lb：Lp＝1：1)，混合均匀后于37℃培养箱中发酵120h。
(4)冻干粉的制备
将发酵桑葚浆于-20℃迅速冻结后，放置于-80℃冷冻干燥机冻干，粉碎处理得到发酵桑葚冻干粉。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：步骤(2)发酵桑葚前处理中，按照1 g:6mL(m/V)的比例在桑葚粉中加入蒸馏水，配制得到发酵桑葚原浆。桑葚原浆的pH值控制在6.0±0.5，并于121℃灭菌25min。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：步骤(3)发酵接种菌种悬浮液中，于无菌环境中接入10％的菌种悬浮液(Lb：Lp＝1：2)，混合均匀后于37℃培养箱中发酵120h。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于：步骤(3)发酵接种菌种悬浮液中，于无菌环境中接入12％的菌种悬浮液(Lb：Lp＝1：1)，混合均匀后于37℃培养箱中发酵120h。
实施例5
本实施例对实施例1益生菌发酵桑葚过程中的酸度进行测定。
分别取步骤(3)发酵过程中0h，24h，48h，72h，96h，120h的桑葚原浆，稀释10倍到100mL容量瓶中加水稀释至刻度线，于室温下混合均匀，静置30min。蒸馏水作为对照液。精密吸取待测液10mL于烧杯中，将复合电极浸入待测液的适当位置。用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，当pH计显示8.3±0.1时为滴定终点，记录消耗碱液的体积V1。总酸以每100mL样品中醋酸的质量表示，按下式计算：
C总酸＝(C×(V1-V2)×K)×100/(V×M/100)。
式中：C总酸—样品中总酸的含量(以醋酸计，g/100mL)；C—氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)；V1—滴定消耗碱液的体积(mL)；V2—对照液消耗碱液体积 (mL)；V—滴定时吸取待测液的体积(mL)；M—样品质量或体积(g或mL)； K—换算的酸系数，用乙酸表示，K＝0.060。
酸度值可反映出益生菌发酵桑葚样品中的有效酸度，是反映样品酸度和发酵程度的重要指标。本实施例测定的桑葚原浆的酸度值结果见图1。由图 1可知，随着发酵时间的延长，酸度值呈上升趋势，但发酵96h后酸度值的上升基本趋于稳定。故而96-120h为较优的发酵时间。
实施例6
本实施例对实施例1益生菌发酵桑葚过程中的pH进行测定。
分别取步骤(3)发酵过程中0h，24h，48h，72h，96h，120h的桑葚原浆，使用pH计测定其pH值，结果见图2。pH值可反映出益生菌发酵桑葚样品中的有效酸度，其中pH值表示样品中H+的活度，是反映样品酸度和发酵程度的重要指标。由图2可知，随着发酵时间的延长，桑葚原浆pH 值呈下降趋势，但发酵96h后pH的下降趋于稳定。故而96h-120h为较优的发酵时间。
实施例7
本实施例对实施例1益生菌发酵桑葚过程中葡萄糖含量进行测定。
分别取实施例1步骤(3)发酵过程中0h，24h，48h，72h，96h，120 h的桑葚原浆，按实施例1步骤(4)制备得到桑葚冻干粉，测定不同时间梯度桑葚冻干粉中葡萄糖含量。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法，用分光光度计测定：
(1)待测液的制备：将不同时间段发酵桑葚样品用蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的溶液，离心取上清。
(2)工作液的制备：试剂1(苯酚)与试剂2(磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、4-氨基安替比林、POD、NaN3、GOD)等体积均匀混合。
(3)设置空白管、校准管和样本管，每管加入1mL工作液以及10mL 相对应的溶液。充分混匀，37℃水浴15min。在505nm波长处，以空白调零，测定校准管和各样本管的吸光度值(A)。
(4)计算公式：葡萄糖浓度c(mg/mL)＝[样本管吸光度(A)/校准管吸光度(A)×校准液浓度(5.550)]×180/1000计算出样本中葡萄糖浓度，样本中葡萄糖含量W(％)＝葡萄糖浓度(c)/样本浓度(C)×100％。
葡萄糖含量测定结果见图3。由图3可知，在发酵过程中，随着发酵时间的增加，桑葚发酵物中葡萄糖含量会呈下降趋势，但发酵96h后葡萄糖含量下降趋于稳定。故而96h-120h为较优的发酵时间。
实施例8
本实施例对实施例1益生菌发酵桑葚过程中的还原糖含量进行测定。
分别取实施例1步骤(3)发酵过程中0h，24h，48h，72h，96h，120 h的桑葚原浆，按实施例1步骤(4)制备得到桑葚冻干粉，测定不同时间梯度桑葚冻干粉中还原糖含量。采用二硝基水杨酸法(DNS法)，在520nm 波长下测定：
(1)还原糖标准曲线的制作
准确称取干燥葡萄糖标准品30mg，用蒸馏水配制成浓度为0.30mg/mL 的标准品；将标准品稀释为0mg/mL、0.05mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、 0.25mg/mL、0.3mg/mL的标准品溶液，将溶液各吸取1.0mL于6支10mL具塞试管中，向各组加入2.0mLDNS溶液，充分振荡混匀，于90℃水浴5min，室温冷却20min后，测定520nm波长处的吸光值。以检测到的吸光度A作为横坐标轴，标品溶液浓度C(mg/mL)作纵坐标轴，得到葡萄糖标准曲线：葡萄糖标准曲线为Y＝0.0805*X-0.0305，R2＝0.9989。
(2)样品还原糖的测定
精密称取干燥的桑葚粉末和发酵桑葚粉末各300mg于20mL具塞试管中，分别加入10.0mL蒸馏水，所得上清液稀释至0.3mg/mL，作为还原糖含量测定的样品液。精确吸取1.0mL待测样液于3支10mL具塞试管中，之后向各组中加2.0mLDNS溶液，充分振荡混匀，于90℃水浴5min，室温冷却 20min后，测定520nm波长处的吸光值。
根据标准曲线计算得到不同样品的还原糖含量，样品还原糖含量W(％)＝样品中还原糖浓度(c)/样品浓度(C)×100％。
还原糖测定结果见图4。发酵过程中，植物乳杆菌和短乳杆菌将葡萄糖、果糖等单糖消耗分解产生酸性物质。由图4可知，在发酵过程中，随着发酵时间的增加，桑葚发酵物中还原糖含量会呈下降趋势，但发酵120h时还原糖含量略微有所上升，故而96h-115h为较优的发酵时间。
实施例9
本实施例对实施例1益生菌发酵桑葚过程中的产物进行感官评价。
分别取实施例1步骤(3)发酵过程中0h，24h，48h，72h，96h，120 h的桑葚原浆，按实施例1步骤(4)制备得到桑葚冻干粉，选取10名符合感官评定的同学(无特殊口味偏好)组成评价小组，按照表1中所列标准评价不同时间梯度桑葚冻干粉的感官(满分为10分)。
表1益生菌发酵桑葚的感官评价标准
Figure BDA0003184780590000111
收集评价结果，进行均一化处理，结果见图5。桑葚发酵物的感官评价主要从风味和口感两个因素考虑，其中酸味是口感的考察与评价中的重要指标。由图5可知，感官分值随着发酵时间的增加呈先上升后略下降趋势，随着发酵时间的延长桑葚的益生菌发酵风味和酸味逐渐上升而甜味逐步下降，当发酵时间超过96h，桑葚益生菌发酵风味和甜味无明显变化，酸味略有增加，因而72-96h为较合理的发酵时间。
实施例10
分别对实施例1得到的桑葚发酵产物和桑葚中的多糖含量进行测定。
采用苯酚-硫酸法测定多糖含量：
(1)葡萄糖标准曲线绘制
准确称取干燥葡萄糖标准品10mg，用蒸馏水配制成浓度为0.10mg/mL 的标准品；将标准品稀释为0mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、 0.08mg/mL、0.1mg/mL的标准品溶液，将溶液各吸取1.0mL于6支10mL具塞试管中，向各组加入1.0mL5％苯酚溶液，再缓慢加入5mL浓硫酸，充分振荡混匀，于90℃水浴20min，室温冷却30min后，于测定490nm波长处的吸光值。以检测到的吸光度A作为横坐标轴，标品溶液浓度C(mg/mL) 作纵坐标轴，得到葡萄糖标准曲线：Y＝0.2014*X-0.122，R2＝0.9913。
(2)桑葚和桑葚发酵物多糖含量测定
称取干燥桑葚桑葚发酵物粉末各1.0g加入20倍量的蒸馏水溶解于50 mL锥形瓶中，沸水浴加热提取2h，重复提取3次，合并浓缩提取液，向滤液中加入4倍体积的95％乙醇，静置过夜，弃上清，下层部分再用95％乙醇反复醇沉，离心后，将沉淀冷冻干燥即得桑葚多糖(MPP)和桑葚发酵物多糖(FMPP)。
精密称取MPP和FMPP各50mg，用蒸馏水配成0.1mg/mL的MPP和 FMPP待测液。吸取1.0mL待测样液于10mL具塞试管中，向各试管中加 1.0mL 5％苯酚溶液，再缓慢加入5.0mL浓硫酸，充分振荡混匀，沸水浴中加热20min，室温冷却30min后，于490nmnm处测定吸光值。依据标准曲线计算出样品中的多糖浓度(mg/mL)，则样品中多糖含量W(％)＝样品中多糖浓度(c)/样品浓度(C)×100％。
将测得样品的吸光度代入标准曲线中计算其多糖含量，结果见表2。
表2桑葚和桑葚发酵物中的多糖含量(
Figure BDA0003184780590000121
n＝3)
Figure BDA0003184780590000122
注：字母a、b表示两者之间经t检验，差异有显著性意义(p<0.01)。
由表2可知，桑葚中的多糖含量35.09％，经益生菌发酵后桑葚发酵物中多糖的含量为63.09％，两组数据的差异具有极显著性(p<0.01)。表明发酵处理的桑葚中多糖含量增加，可能是由于桑葚中小分子糖类被益生菌消耗从而多糖含量相对增加，也可能为发酵过程中产生的多糖。
实施例11
分别对实施例1得到的桑葚发酵产物和桑葚中的花色苷含量进行测定。
采用pH示差法测定花色苷含量：
称取待测样品100mg，用蒸馏水使桑葚和桑葚发酵物充分溶解得到 10mg/mL的待测溶液，将待测溶液吸取1mL分成3份，分别用pH1.0、pH4.5 的缓冲液定容至10mL。80min后达到平衡，分别于510nm和700nm处测定吸光值。测得吸光值代入下式计算即得花色苷含量，花色苷含量＝(A510nmph1.0 -A700nmph1.0)-(A510nmph4.5-A700nmph4.5)，结果见表3。
表3桑葚和桑葚发酵物中的花色苷含量(
Figure BDA0003184780590000131
n＝3)
Figure BDA0003184780590000132
注：字母A、B表示两者之间经t检验，差异有极显著意义(p<0.01)
由表3可知，桑葚中含有花色苷36.74％，经发酵处理得到桑葚发酵物中花色苷含量为25.04％，两组数据具有极显著差异，说明桑葚经发酵处理后花色苷含量减少。
实施例12
本实施例对实施例1得到的桑葚发酵产物的降血糖效果进行试验。
(1)造模：雄性昆明小鼠50只，体重18g±2g，饲养于洁净级动物房，保持室内恒温24±1℃，相对湿度50-70％，12h光照，标准实验饲料和自由饮水，适应性饲养一周后开始实验。将小鼠随机分成2组：正常对照组 (N.control)和造模组，正常对照组(10只)给予普通饲料，造模组(40 只)给予高脂饲料喂养。
第5周开始运用高脂饲料喂养联合多次小剂量STZ(70mg/kg)腹腔注射方法诱导T2DM小鼠模型(STZ溶于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液， pH4.4，配制成浓度为1％的溶液，现配现用)。正常对照组注射相应体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
每次注射STZ 72h后用血糖仪测定空腹血糖，空腹血糖≥11.1mmol/L 并且3周后空腹血糖仍≥11.1mmol/L的小鼠认为造模成功的T2DM模型小鼠。
(2)对照实验：将造模成功的小鼠随机分成4组：模型组(Model)、阳性药组(P.control)、桑葚组(MP)、桑葚发酵物组(FMPH)。第9周开始每组小鼠灌胃，正常对照组给予普通饲料，正常饮食饮水，每日灌胃0.2ml 生理盐水；模型组给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃0.2ml生理盐水；阳性药组给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃盐酸二甲双胍150mg/kg，用生理盐水配成混悬液；桑葚组给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃桑葚粉1.0g/kg，用生理盐水配成混悬液；桑葚发酵组给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃桑葚发酵物冻干粉1.0g/kg，用生理盐水配成混悬液。试验期间定时记录小鼠体重变化及饮水摄食量。
(3)小鼠活体相关指标的检测
①小鼠体重及饮水摄食量：试验期间，固定时间测量并记录小鼠体重及饮水摄食量，见图6。
由图6可知，给药前N.control组小鼠体重较其余模型四组体重略高，数据具有极显著差异(p<0.01)，经过4周给药治疗，模型组小鼠体重仍下降趋势，其余四组小鼠体重均略有增加，且治疗期间可以明显看到模型组小鼠的食量和饮水量与其他组相比略大，行为上表现日常较不活跃，反应较慢，蜷卧拱背，毛发略有发汗且皮毛松软；而其他给药组小鼠上述症状均有所减轻，小鼠较为活跃，毛发光滑，无明显皮毛发汗现象。
②空腹血糖的测定：小鼠分别于给药前和给药4周结束后，禁食不禁水 12h，血糖仪测其尾静脉血空腹血糖值，结果见图7。
由图7可知，给药前血糖值除N.control组外，其余四组均达到 11.0mmol/L，治疗4周后，Model组小鼠的空腹血糖较治疗前有所上升，而其余各治疗组的小鼠空腹血糖均有明显下降。给药治疗四周后空腹血糖值与模型组相比其余四组具有极显著性差异(p<0.01)，其中MP和FMPH两组与模型组相比较，具有明显的降血糖效果，通过对比各给药组治疗前后空腹血糖值的变化，可知P.control组和FMPH组治疗前后空腹血糖值数据差异较大，且数据差异均有极显著性(p<0.01)。
③口服葡萄糖耐量试验：小鼠处死前1周进行口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)。试验前禁食不禁水12h，以2g/kg的剂量灌胃葡萄糖。血糖采血点为空腹、糖负荷后30min、60min和120min，血糖仪测定尾静脉血血糖值，各个时间点的血糖值记为G0、G30、G60、G120，根据检测结果绘制葡萄糖耐量曲线图，并计算曲线下面积(AUC)。计算公式为： AUC(mmol/L)＝(1/2×G0+G30+G60+1/2×G120)/2。结果见图8。
由图8可知，Model组小鼠口服葡萄糖后不能很快恢复血糖至起始水平，其余四组给药治疗后，糖耐量受损均有不同程度的缓解。其中FMPH葡萄糖曲线下面积(AUC)与Model组和MP组之间均存在极显著性差异(p<0.01)，表明高剂量的桑葚发酵物具有较好治疗效果。
④小鼠胰岛素耐量试验：小鼠处死前3天进行胰岛素耐量试验(ITT)。试验前禁食2h，测定0min尾静脉血血糖值并立即腹腔注射0.75IU/kg(超短效)胰岛素，注射后30min、60min、120min分别测定尾静脉血血糖值，各个时间点的血糖值记为G0、G30、G60、G120，根据检测结果绘制胰岛素耐量曲线图，并计算曲线下面积(AUC)。计算公式为：AUC(mmol/L)＝(1/2× G0+G30+G60+1/2×G120)/2。结果见图9。
由图9可知，模型组小鼠与其他组小鼠相比较注射胰岛素时血糖下降缓慢，出现明显的胰岛素抵抗现象，其余四组注射胰岛素30min后血糖开始下降到120min后缓慢上升。其中FMPH组血糖值与MP组血糖值具有显著性差异，FMPH胰岛素曲线下面积(AUC)与模型组和桑葚组之间均存在显著性差异，表明高剂量的桑葚发酵物具有较好治疗效果。此外，MP组血糖值回升最多最为明显，但综合来看高剂量发酵桑葚物的治疗效果优于桑葚。
(4)小鼠相关生化指标检测
①小鼠血清胰岛素(INS)水平及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)检测：小鼠禁食12h后，测量空腹血糖，眼眶静脉丛取血，离心取血清，分装后于 -20℃保存备用；胰岛素含量使用小鼠胰岛素(INS)ELISA检测试剂盒，按试剂盒说明书操作。计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR＝空腹血糖(FPG)×空腹胰岛素(FINS)/22.5，结果见图10。
由图10可知，Model组小鼠与N.Control组小鼠相比FINS水平和 HOMA-IR水平明显升高且数据具有极差异性，其余三个给药治疗与模型组相比FINS水平和HOMA-IR水平均不同程度降低。其中，FMPH组和MP 组与Model组FINS水平和HOMA-IR水平具有极显著性差异，FMPH组与 MP组FINS水平和HOMA-IR水平具有显著性差异，表明高剂量的桑葚发酵物缓解2型糖尿病胰岛素抵抗的效果较好。综合各项结果说明，桑葚发酵物可以提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，且效果较未发酵好。
②小鼠血清糖化血红蛋白(GHb)测定：使用小鼠GHb ELISA检测试剂盒，按试剂盒说明书操作，结果见图11。
由图11可知，Model组小鼠与其他组小鼠相比较GHb明显增高，其余四组GHb与模型组相比均不同程度降低。其中N.Control组与Model组GHb 含量具有极显著性差异，FMPH组与MP组GHb含量具有显著性差异，表明高剂量的桑葚发酵物在长期控制血糖方面的效果较好。
③小鼠空腹肝糖原和肌糖原的测定：按照糖原测定试剂盒说明操作，结果见图12。
由图12可知，Model组小鼠与N.control组小鼠相比肝糖原明显升高，其余三个给药治疗与模型组相比肝糖原均不同程度降低，这是由于Model 组小鼠在禁食后，肝脏中储存的糖原未被分解利用或由于葡萄糖转变为肝糖原，从而刺激胰岛素分泌，而Model组小鼠肝糖原增加可能与FINS的升高或胰岛素敏感性相关。小鼠空腹肌糖原含量在N.control组和Model组无明显差异。
④小鼠胰高血糖素样肽1(GLP-1)测定：使用小鼠胰高血糖素样肽1 (GLP-1)ELISA检测试剂盒，根据试剂盒说明书操作，结果见图13。
由图13可知，Model组小鼠与N.control组小鼠相比GLP-1水平明显降低且数据具有极显著性差异，其余三个给药治疗与模型组相比GLP-1水平均不同程度升高；其中MP组以及FMPH组与Model组GLP-1水平有显著差异或极显著差异，说明桑葚发酵产物能够有效地促进细胞分泌GLP-1。
实施例13
本实施例对实施例1得到的桑葚发酵产物对T2DM小鼠血脂效应进行试验。
(1)对实施例12中各组实验小鼠血清中总胆固醇(T-CHO)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 含量测定，均按照试剂盒说明书进行操作，结果见图14。
由图14可知，Model组与N.control组小鼠相比其血脂(TG、T-CHO、 LDL-C以及HDL-C)水平均较高，表明长期高脂喂养导致小鼠脂代谢紊乱，与N.control组比较，Model组小鼠血清T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C水平均明显升高且具有极显著性差异，其余三个给药治疗与Model组相比 T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C水平均不同程度降低；其中，P.control组、 MP组以及FMPH组与Model组相比T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C水平均具有极显著差异。MP组和FMPH组相比在T-CHO、TG水平具有极显著或显著差异，表明MP和FMPH均可降低血清中TG、T-CHO、LDL-C和 HDL-C的水平，而MP组与FMPH组相比的HDL-C水平较高，表明FMPH 具有较好的降血脂效果。
(2)附睾周围脂肪重量和附睾周围脂肪指数测定
解剖小鼠并分离出附睾周围脂肪重量(EAM)称重。根据公式计算附睾周围脂肪指数(EAMI)：附睾脂肪指数＝(附睾脂肪重量/体重)×100％。结果见表4。
表4 MP和FMPH对2型糖尿病小鼠EAM和EAMI的影响(
Figure BDA0003184780590000171
n＝10)
Figure BDA0003184780590000172
注：*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较。
由表4可知，MP组和FMPH组可减少小鼠附睾周围脂肪蓄积，三个给药治疗与Model组相比小鼠的EAM和EAMI均不同程度降低；其中，MP 组以及FMPH组与Model组相比小鼠的EAM和EAMI均具有显著性差异 (p<0.05)。表明桑葚发酵物在降低2型糖尿病患者血糖的同时可以减少脂肪的蓄积，对于减肥减脂也有一定作用。
实施例14
本实施例对实施例1得到的桑葚发酵产物对T2DM小鼠肾功能的影响进行试验。
糖尿病常见的并发症是糖尿病肾病，肾功能的改变主要体现在尿液的生成过程中对相关成分的滤过作用，其中血尿素氮水平和血清肌酐水平代表了肾脏滤过功能的变化，肾脏病变时，血尿素氮水平和血清肌酐水平都会升高。本实验中，与模型组相比较，给予桑葚发酵物组的血尿素氮水平和血清肌酐水平均有明县下降，其中血尿素氮水平下降更为明显。
(1)小鼠血尿素氮(BUN)测定：使用小鼠尿素氮(BUN)ELISA检测试剂盒，根据试剂盒说明书操作，结果见图15。
由图15可知，Model组小鼠与N.control组小鼠相比BUN水平明显升高且数据具有极差异性(p<0.01)，其余三个给药治疗与模型组相比BUN水平均不同程度降低；其中，P.control组、MP组以及FMPH组与Model组BUN 水平极显著差异(p<0.01)；FMPH组较MP组的BUN表达水平更低，且数据具有极显著性差异(p<0.01)。FMPH组BUN值最低为2.20mmol/L，而Model组BUN含量为4.61mmol/L，表明桑葚发酵产物可显著降低小鼠 BUN。
(2)小鼠血清肌酐(Scr)测定：使用小鼠尿素氮(Scr)ELISA检测试剂盒，根据试剂盒说明书操作，结果见图16。
由图16可知，Model组小鼠与N.control组小鼠相比Scr水平明显升高且数据具有极差异性(p<0.01)，P.control组以及FMPH组与模型组相比Scr 水平均降低；其中，P.control组、以及FMPH组与Model组Scr水平有极显著差异(p<0.01)；MP组与Model组相比Scr表达水平略有降低，但其差异无统计学意义(p>0.05)；FMH组MP组与相比Scr表达水平降低，且具有极显著性差异(p<0.01)。Model组Scr含量为19.88ng/mL，FMPH组为 17.81ng/mL，表明桑葚发酵产物可显著降低小鼠Scr。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种缓解或治疗2型糖尿病的桑葚发酵产物，其特征在于，由混合益生菌悬液发酵桑葚原浆得到，所述混合益生菌悬液由短乳杆菌YM 1301和植物乳杆菌CICC 24202按1:0.1～10混合得到；
所述桑葚原浆由桑葚粉与水按照1g：4～6mL配制得到；
所述桑葚原浆pH值为5.5～6.5；
所述混合益生菌悬液的接种量为桑葚原浆体积的8～12％；
所述发酵条件为：36～38℃恒温培养96～120h。
2.如权利要求1所述的桑葚发酵产物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：桑葚原浆灭菌，冷却至室温后，接种混合益生菌悬液，发酵培养。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵后的桑葚原浆于低温环境下迅速冻结后，冻干、粉碎得到发酵桑葚冻干粉。
4.如权利要求1所述的桑葚发酵产物在制备食品、保健品中的应用。
5.如权利要求1所述的桑葚发酵产物在制备缓解或治疗2型糖尿病的药品中的应用。
6.如权利要求1所述的桑葚发酵产物在制备缓解或治疗2型糖尿病并发症的药品中的应用，其特征在于，所述并发症包括血脂异常、肥胖、糖尿病肾病。
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