CN110982868A - 一种提高灵芝三萜含量的共培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高灵芝三萜含量的共培养方法及应用，该方法采用蛹虫草‑灵芝液体发酵太子参，包括蛹虫草B1528和灵芝菌B1.4活化、蛹虫草种子液制备、灵芝种子液制备、太子参药性培养基的配制和太子参药性基质的接种及发酵培养等步骤，本发明提高了发酵产物中有效成分灵芝三萜的含量，其工艺简单、成本低，具有良好的应用前景和较好经济价值和社会价值。

Description

一种提高灵芝三萜含量的共培养方法及应用

技术领域

本发明涉及一种提高灵芝三萜含量的共培养方法及应用，属于微生物发酵技术和生物转化的技术领域。

背景技术

灵芝在我国常作为中药材使用，首载于2000多年前的中医四大经典之一《神农本草经》，并被列为上品，其甘、平。归心、肺、肝、肾经。主治：补气安神、止咳平喘。用于心神不宁，失眠心悸、肺虚咳喘、虚劳气短，不思饮食。

灵芝三萜是灵芝中发现的一类三萜类化合物，学名灵芝总三萜，是灵芝的主要药理成分，是灵芝发挥抗炎、镇痛、镇静、抗衰老、毒杀肿瘤细胞、抗缺氧等作用的主要功效成分。灵芝三萜作为灵芝中的关键活性成分，提高其在灵芝子实体中的含量已成为灵芝研究的重要内容，但目前采用的提高灵芝三萜含量方法大多工艺复杂，栽培时间长，成本高，效果不理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种提高灵芝三萜含量的共培养方法及应用，该方法成本低、工艺简单、具有良好的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种提高灵芝三萜含量的共培养方法，该方法采用蛹虫草-灵芝共培养液体发酵太子参，包括以下步骤：

(1)将蛹虫草B1528和灵芝菌B1.4进行活化：取斜面保存的灵芝菌种和蛹虫草菌种，用接种针接在改良PDA培养基上，写上编号、标记及接种日期，用封口胶密封，倒置培养皿，放20℃人工气候培养箱内培养，待菌丝长满培养皿即可；

(2)蛹虫草种子液制备：用接种针向含200mL改良马铃薯液体培养基的500mL三角瓶中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿蛹虫草菌种，置摇床上，于200r/min，温度25℃±1℃，避光培养5-7d，至培养液澄清、粘稠、含有大量大小均一的菌丝、且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜，即可；

(3)灵芝种子液制备：用接种环向含1000mL改良马铃薯液体培养基的3000mL三角瓶中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿灵芝菌种，于120r/min摇床上，温度28℃±1℃，振荡避光培养12h，然后静止避光培养12h，共培养5-7d，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶瓶壁上出现一圈白色菌膜，即可；

(4)太子参药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎，药典七号筛，往培养瓶中加入30％体积的大米，浸泡过夜，然后称取20％体积的太子参粉末于其中，加水适量，使整个培养基含水量达20-30％，混合均匀，写上编号、标记及日期，灭菌条件：12l℃，90min；

(5)太子参药性基质的接种及发酵培养：将高压灭菌90min的太子参药性培养基冷却至室温后，将蛹虫草种子液和灵芝种子液按1:1 比例接入太子参药性基质中进行培养，接入体积/质量比为太子参药性基质的80％-100％，温度25℃，静置避光培养15d，光照培养15d，共 30d。

上述的提高灵芝三萜含量的共培养方法中，所述的灵芝菌B1.4 保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019790，分类命名为：灵芝b1.4Ganoderma lucidumb1.4，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，保藏单位代码：CCTCC-中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年10月9日。

所述的蛹虫草B1528保藏在中国典型培养物保藏中心，其分类命名为：蛹虫草Cordyceps militaris B1528，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，保藏单位代码：CCTCC- 中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年10月9日，保藏编号： CCTCC M 2019789。

灵芝菌B1.4和蛹虫草B1528接种比例为1:1。

上述的提高灵芝三萜含量的共培养方法中，选优的方案，所述改良PDA培养基按以下方法配制：在常规配方上加1％蛋白胨进行配制；配制好后高压灭菌。灭菌条件：12l℃，30min。

前述的提高灵芝三萜含量的共培养方法中，选优的方案，所述改良液体马铃薯培养基按以下方法配制：操作同改良PDA的配制，但是配方中不加入2％琼脂，其余药品均不变。

前述的提高灵芝三萜含量的共培养方法中，选优的方案，所述太子参药性培养基按以下方法配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎，药典七号筛，往培养瓶中加入30％体积的大米，浸泡过夜，然后称取20％体积的太子参粉末于其中，加水适量，使整个培养基含水量达20-30％，混合均匀，写上编号、标记及日期，灭菌条件：12l℃， 90min。

蛹虫草-灵芝共培养发酵太子参的发酵产物在制备药品和保健品中的应用。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明采用灵芝、蛹虫草共培养发酵转化中药太子参的液体发酵方法制备得到具有增强免疫，保肺、养胃、益肾等功效的发酵产物，并且提高了发酵产物中有效成分灵芝三萜的含量，其工艺简单、成本低，具有良好的应用前景和较好经济价值和社会价值。

共培养(co-culture)是在一个培养容器中一起培养两种或多种微生物的方法。它的策略是通过模拟自然生态来构建人工的微生物群落。共培养可导致现有天然产物积累的增加，或由于微生物串扰和化学防御而触发沉默基因或基因簇的表达，产生新的化合物。

在传统中药发酵法的基础上，结合微生物共培养发酵技术对中药开发利用是中药现代化和创新的重要途径。这种共培养发酵技术充分利用了中药的药性和微生物的代谢，其产物可以实现增效、扩用、减毒、产生新的有效成分等作用。

太子参，味甘、微苦、性平，具有益气生津、补肺健脾之功效,功用与人参相仿,但以“清补”见长,特点为益气但不升提,生津但不助湿,扶正却不恋邪,补虚又不峻猛。主治脾虚体倦,食欲不振,病后虚弱,气阴不足,自汗口渴,肺燥干咳,心悸不眠,虚热汗多。

蛹虫草，味甘，性平。具有益肺肾、补精髓，止血化痰的作用。药理实验及临床实践证明，蛹虫草具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、降血糖、保护肝肾功能等多种药理活性。

本发明利用蛹虫草-灵芝液体发酵太子参，提高发酵产物中有效成分的含量(灵芝三萜等)，提供具有增强免疫，保肺益肾等功效的发酵产物及其制备方法，具有较好经济和社会价值。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

实施例1：提高灵芝三萜含量的共培养方法，包括以下步骤：

(1)将蛹虫草B1528和灵芝菌B1.4进行活化。灵芝菌B1.4保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019790。蛹虫草B1528 保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019789。其活化步骤为：取斜面保存的灵芝菌种和蛹虫草菌种，用接种针接在改良PDA培养基上，灵芝菌B1.4和蛹虫草B1528接种比例为1:1，写上编号、标记及接种日期，用封口胶密封，倒置培养皿，放20℃人工气候培养箱内培养，待菌丝长满培养皿即可；所述改良PDA培养基的配制方法如下：在常规配方上加1％蛋白胨进行配制；配制好后高压灭菌，灭菌条件：12l℃，30min。

(2)蛹虫草种子液制备：用接种针向含200mL改良马铃薯液体培养基的500mL三角瓶中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿蛹虫草菌种，置摇床上，于200r/min，温度25℃±1℃，避光培养5-7d，至培养液澄清、粘稠、含有大量大小均一的菌丝、且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜，即可；所述改良液体马铃薯培养基的配制：操作同改良PDA的配制，但是配方中不加入2％琼脂，其余药品均不变。

(3)灵芝种子液制备：用接种环向含1000mL改良马铃薯液体培养基的3000mL三角瓶中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿灵芝菌种，于120r/min摇床上，温度28℃±1℃，振荡避光培养12h，然后静止避光培养12h，共培养5-7d，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶瓶壁上出现一圈白色菌膜，即可；

(4)太子参药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎，药典七号筛，往培养瓶中加入30％体积的大米，浸泡过夜，然后称取20％体积的太子参粉末于其中，加水适量，使整个培养基含水量达20-30％，混合均匀，写上编号、标记及日期，灭菌条件：12l℃，90min。

(5)太子参药性基质的接种及发酵培养：将高压灭菌90min的太子参药性培养基冷却至室温后，将蛹虫草种子液和灵芝种子液按1:1 比例接入太子参药性基质中进行培养，接入体积/质量比为太子参药性基质的80％-100％，温度25℃，静置避光培养15d，光照培养15d，共30d。

本发明的实验过程如下：

1.用具、仪器与试剂

1.1用具

标签纸、剪刀、漂浮板、酒精灯、纱布、量筒、玻璃棒、接种针、培养瓶、培养皿、烧杯、称量纸、容量瓶、使馆、药匙、计时器、离心管、石英比色皿、微孔滤膜、一次性注射器、高液小瓶、一次性胶头滴管等。

1.2实验仪器与设备

1.2.1高效液相色谱仪系统

表1.1高效液相色谱仪系统

1.2.2其他

表1.2其他仪器

1.3实验试剂与药品

表1.3试验试剂与药品

1.4材料

1.4.1菌种来源

灵芝菌B1.4保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019790。蛹虫草B1528保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019789。

1.4.2培养基的种类

本实验采用改良液体马铃薯培养基、改良PDA培养基和太子参药性培养基三种。

2.试验方法

本实验主要流程为：将蛹虫草和灵芝菌进行活化，然后做兼容性实验及两菌种子液的培养；接着将两菌种子液按比例接入太子参药性基质和对照组中进行培养；培养完成后，拍照、60℃干燥、打粉、提取、测定，最后计算获得培养物中灵芝三萜等有效成分的含量。

2.1培养基的配制

(1)改良PDA培养基的配制：在常规配方上加1％蛋白胨进行配制；配制好后高压灭菌。灭菌条件：12l℃，30min。

(2)改良液体马铃薯培养基的配制：操作同改良PDA的配制，但是配方中不加入2％琼脂，其余药品均不变。

(3)太子参药性培养基的配制:将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎，药典七号筛。往培养瓶中称取适量大米，浸泡过夜，然后称取一定比例太子参粉末于其中，加水适量(使含水量达20-30％，标准为手抓一把调配好的培养料，用手握紧，指缝渗水而不滴下)，混合均匀，写上编号、标记及日期。灭菌条件：12l℃，90min。

2.2菌种的活化与种子液配制

2.2.1菌种的活化

取斜面保存中灵芝菌种和蛹虫草菌种，用接种环接在改良PDA 培养基上，写上编号、标记及接种日期，用封口胶密封，倒置培养皿，放20℃人工气候培养箱内培养。待菌丝长满培养皿，备用。

2.2.2蛹虫草种子液的制备

用接种针向500mL三角瓶(含200mL改良马铃薯液体培养基)中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿蛹虫草菌种，置摇床上，于200r/min，(25±1)℃，避光培养5-7d，至培养液澄清、粘稠、含有大量大小均一的菌丝、且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜，即可使用。

2.2.3灵芝种子液的制备

用接种环向3000mL三角瓶(含1000mL改良马铃薯液体培养基) 中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿灵芝菌种，于 120r/min摇床上，温度：(28±1)℃，振荡避光培养12h，然后静止避光培养12h，共培养5-7d，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶瓶壁上出现一圈白色菌膜，即可使用。

2.3流动相配备及色谱条件(测量虫草素)

A相(水相)：纯水，0.22μm滤膜滤过，超声15min；

B相(有机相)：色谱甲醇，0.45μm滤膜滤过，超声15min；

A相：B相＝80:20(V/V)，当日配备当日使用。

色谱条件：见表2.1色谱条件

表2.1色谱条件

2.4 5％香草醛-冰醋酸溶液的配备

精密称取香草醛0.5g于10mL棕色容量瓶，加入冰醋酸使其溶解，并贴上标签，注意应当天配备当天使用。

2.5太子参药性基质的接种及发酵培养

将高压灭菌90min的太子参药性培养基冷却至室温后，于无菌操作台内接入蛹虫草、灵芝摇瓶种子液或两菌混合的种子液，接入体积为太子参药性基质的80％至100％(v/m)，即保证培养瓶中水分恰当；温度25℃，静置避光培养15d，光照培养15d，共30d。

2.6蛹虫草、灵芝菌OD值的确定

将离心管灭菌干燥，于无菌操作台内将蛹虫草摇瓶种子液用胶头滴管吸入离心管中，用离心机4000r/min离心10min、取出、缓慢轻轻地吸取上清液于石英比色皿中，比色皿事先润洗(去离子水三遍—待测溶液三遍)，然后在600nm的波长处，以相应培养基作为空白对照，测定OD值，灵芝菌类似。

2.7兼容性试验

将活化的菌株B1.4与B1528，以点接入同一改良PDA培养基平板上，平行接三个以上平板，于25℃避光培养14d，每天观察平板上两个菌落的生长情况、形态、是否存在拮抗反应等形态特征，为进行混菌发酵奠提供参考。

2.8不同条件对发酵产物中活性成分含量的影响

2.8.1培养基太子参含量

将培养瓶中加入30g培养料，其中设太子参浓度梯度为20％、 30％、40％及对照(培养瓶中加入同一菌丝量的B1.4、B1528及不加入种子液三种对照)，平行样为3瓶；然后往培养瓶中加入B1.4： B1528＝1:1的种子液在同一条件下培养。

2.8.2发酵时间

在2.8.1、2.8.2、2.8.3的基础上，设立培养天数为30、35、40d，即避光培养15d，光照培养15d、20d、25d。

3.实验结果

3.1兼容性实验结果

实验结果表明蛹虫草-灵芝菌未见明显的影响，并未见明显的拮抗线。

3.2不同条件对发酵产物中活性成分含量的影响结果与分析

3.2.1培养基太子参含量的多少对活性成分含量的影响

根据预实验可知：纯太子参的培养基黏度过大、不均质、且接入的菌种生长缓慢，15d后才开始生长；因此往太子参中加入大米，既充当碳源又调节培养料黏度，当加入10％、20％的大米黏度还是过于大，加入30％的大米时黏度逐渐减小适中；使整个培养基含水量达 20％～30％，考虑使接入的菌种生长速度加快，应以较大比例的大米混合少量太子参。因此最终以0％、20％、30％、40％太子参为梯度设计实验，其余因素均不改变。发酵条件为：温度25℃、接种比例： B1.4:B1528＝1:1、避光培养15d、光照培养15d。

实验结果如表3.1所示：

表3.1太子参含量的确定及各个指标计算结果

依据上述实验结果，最佳因素20％太子参混菌发酵与单菌发酵对比试验如下，结果见表3.2。

表3.2发酵与对照试验结果比较

由以上试验可知：当培养基中含有20％的太子参时，共培养发酵产物中总三萜和甾醇的含量高达37.6mg/g，是灵芝单独发酵产物中含量的2.2倍。此外，发酵产物中虫草素含量也明显提高。

3.2.2发酵时间对产物含量的影响

使用3个不同的发酵时间来考察其对产物含量的影响，结果如下表3.3，分别为避光培养15d，光照培养15d、20d、25d。

表3.3培养天数的确定及三个指标实验结果的计算

从表可以知，其最发酵30d时总三萜和甾醇的含量高达116.9mg/g。与对照试验的实验结果比较，与表3.2结果类似。进一步说明了，在发酵30天能显著提高发酵产物中三萜的含量。

本发明的实施方式不限于上述实施例，在不脱离本发明宗旨的前提下做出的各种变化均属于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种提高灵芝三萜含量的共培养方法，其特征在于：该方法采用蛹虫草-灵芝液体共培养发酵太子参，包括以下步骤：

（1）将蛹虫草B1528和灵芝菌B1.4进行活化：取斜面保存的灵芝菌种和蛹虫草菌种，用接种针接在改良PDA培养基上，写上编号、标记及接种日期，用封口胶密封，倒置培养皿，放20℃人工气候培养箱内培养，待菌丝长满培养皿即可；

（2）蛹虫草种子液制备：用接种针向含200mL改良马铃薯液体培养基的500mL三角瓶中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿蛹虫草菌种，置摇床上，于200r/min，温度25℃±1℃，避光培养5-7d，至培养液澄清、粘稠、含有大量大小均一的菌丝、且三角瓶的瓶壁上出现外圈为白、内圈为淡黄色的菌膜，即可；

（3）灵芝种子液制备：用接种环向含1000mL改良马铃薯液体培养基的3000mL三角瓶中接入大小均匀的5-7块/100mL块待用的培养皿灵芝菌种，于120r/min摇床上，温度28℃±1℃，振荡避光培养12h，然后静止避光培养12h，共培养5-7d，直至培养液澄清、含有大量细小星芒状菌球、大小均匀，且三角瓶瓶壁上出现一圈白色菌膜，即可；

（4）太子参药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎，药典七号筛，往培养瓶中加入30%体积的大米，浸泡过夜，然后称取20%体积的太子参粉末于其中，加水适量，使整个培养基含水量达20-30%，混合均匀，写上编号、标记及日期，灭菌条件：12l℃，90min；

（5）太子参药性基质的接种及发酵培养：将高压灭菌90min的太子参药性培养基冷却至室温后，将蛹虫草种子液和灵芝种子液按1:1比例接入太子参药性基质中进行培养，接入体积/质量比为太子参药性基质的80%-100%，温度25℃，静置避光培养15d，光照培养15d，共30d。

2.根据权利要求1所述提高灵芝三萜含量的共培养方法，其特征在于：所述的灵芝菌B1.4保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019790，所述的蛹虫草B1528保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2019789；灵芝菌B1.4和蛹虫草B1528接种比例为1:1。

3.根据权利要求1所述提高灵芝三萜含量的共培养方法，其特征在于：所述改良PDA培养基的配制：在常规配方上加1%蛋白胨进行配制；配制好后高压灭菌，灭菌条件：12l℃，30min。

4.根据权利要求1所述提高灵芝三萜含量的共培养方法，其特征在于：所述改良液体马铃薯培养基的配制：操作同改良PDA的配制，但是配方中不加入2%琼脂，其余药品均不变。

5.根据权利要求1所述提高灵芝三萜含量的共培养方法，其特征在于：所述太子参药性培养基的配制：将太子参药材，60℃热风干燥，粉碎，药典七号筛，往培养瓶中加入30%体积的大米，浸泡过夜，然后称取20%体积的太子参粉末于其中，加水适量，使整个培养基含水量达20-30%，混合均匀，写上编号、标记及日期，灭菌条件：12l℃，90min。

6.蛹虫草-灵芝共培养发酵太子参的发酵产物在制备药品和保健品中的应用。