CN103638057A - 络新妇属蜘蛛提取物抗肿瘤部位的制备方法及医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种络新妇属蜘蛛提取物抗肿瘤部位的制备方法及医药用途。具体而言，本发明的络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位由蜘蛛目络新妇亚科络新妇属（Nephila）虫体鲜品于低温下研磨成匀浆，经有机溶剂直接浸泡提取，减压浓缩精制而成，本发明得到的络新妇属蜘蛛有效部位提取物具有明显的细胞毒性，可以预期用于制备治疗抗肿瘤药物或防止肿瘤疾病的保健品和保健食品。

Description

络新妇属蜘蛛提取物抗肿瘤部位的制备方法及医药用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一种具有细胞毒因而可期待作为抗肿瘤药物用途的络新妇属蜘蛛有效部位提取物及其制备方法和医药用途。

技术背景

络新妇蛛，Nephila,silk spider，属节肢动物门（Arthropoda）蛛型纲（Arachnida）络新妇科络新妇属昆虫，云贵高原广泛分布。结大型金黄色网，网的直径可达一公尺以上，以拉丝悬于树间；生活在温暖地区。约60种，云南省分布有四种。该属蛛体色艳丽，雌成蛛个体较大，雄蛛小数倍。

蜘蛛入药在我国早已有之。《唐本草》云：“主蛇毒，温疟，霍乱，止呕逆”；《日华子本草》云：“冷，无毒；斑蜘蛛治疟疾，疔肿”；《长沙药解》云：“炒枯存性研细用；破瘀消肿”；《本草纲目》云：“主口，脱肛，疔肿，胡臭”；《吉林中草药》云：“治瘰疬，疔疮，蜂、蝎蜇伤”；《中药大辞典》云：“祛风，消肿，解毒。治狐疝偏坠，中风口，小儿慢惊、口噤。疳积；疔肿，瘰疬，疮疡，蜈蚣、蜂、蝎蜇伤”。以上历史记录表明其体内必应具有某些特殊的物质和其特有的作用机制。

近期，随着对生物资源和动物药源的开发越来越取得进展，伴随着中药现代化的进程加快，我国加大对传统中医药资源研究开发的力度，越来越多的动物类药物得到开发和利用。例如以大理学院主持研发的美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效。从美洲大蠊醇提物中纯化精制而成的“心脉龙注射液”，具强心升压，改善微循环，兴奋呼吸，利尿，增加心、脑、肺、肾的血流量。“心脉龙注射液”主治：右心衰，也可治急慢性心衰，失血性休克，低血压，室性早博，病窦性综合症，心脑缺血性疾病，为2004年通过国家食品药品监督管理总局（SFDA）审批的国家二类新药（中药）。上述几只新药均已上市，现每年为国家创造了超过15亿元的年产值。大理学院云南省药用昆虫和蛛形类资源开发工程实验室进一步用美洲大蠊中提取分离得到有效部位证实有强效抗肿瘤作用，并已经获得2项授权国家发明专利(刘光明、赵昱、何正春、李树楠、彭芳、王晓雨、胡明辉、宋丽艳、施贵荣、董光平，一种用聚酰胺富集美洲大蠊抗肿瘤有效部位的制备方法，ZL200710067706.X；王晓雨、刘光明、宋丽艳、杨雷香、何正春、巫秀美、彭芳、董光平、朱孝慈、赵昱，美洲大蠊有效部位的用途，ZL200810060885.9)。基于上述成果的启发，在对云贵高原的药用昆虫抗肿瘤活性系列研究过程中，我们对蛛型纲络新妇属进行了综合采集、种属鉴定和细胞毒活性药效学研究。

根据相关文献，在针对药物应用方面，“蜘蛛”多为复方中的一味，公开资料中几乎没有蜘蛛作为单方应用于抗肿瘤的报导。“一种治疗癌症的中药制剂”（ZL200610048898.5，李明忠），是用草蜘蛛、地龙、王不留行、马钱子、制乳香、制没药、麻黄等七位药材组成的复方；“一种治疗肝癌的药物”（ZL200510044573.5，崔明浩），是由壁虎、蟾蜍、灵芝等11味药物组成的大复方；其中蜘蛛仅作为配伍用的小量辅助性用药而已。在已经公开的另一个发明专利（CN101422489A，鲍新业，“一种治疗腺癌的中药制剂”），也是由五种动物类药材组成的复方制剂。唯一的一个单体化合物公开于专利CN101759779A（崔景柏，严天华，“一种蜘蛛活性多肽及其制备方法与应用”），其描述了从蜘蛛毒液中分到的一种微量活性多肽用于治疗肿瘤性疾病的用途。而然，该发明未充分公开蜘蛛种类及蜘蛛毒素之来源，因而无法判断其物质基础的类型；而且此类极其微量的天然纯化多肽不利于工业化生产，因而难以进一步开发成为抗肿瘤药物。

根据《中药大辞典》，其基元是指园网蛛科大腹园网蛛等全虫。动物分类学中，将此属归为圆蛛总科络新妇亚科络新妇属，是云南省优势资源。为明确云贵高原药源广泛分布的络新妇属蜘蛛是否具有抗肿瘤活性，及其抗肿瘤有效部位，指导进一步弄清其中起主要药理作用的物质结构基础，从分子药理学基础上阐明络新妇属蜘蛛多种生物活性的作用机制，发明人对民间习用的络新妇属进行了综合采集和药效学活性研究。本发明使用不同溶剂系统，对该生药材的提取物进行了细胞毒性比较；并采用对三株人体肿瘤细胞株：人口腔上皮癌细胞株（KB）、人肺癌细胞（A549）和白血病细胞（HL-60）的生长抑制试验进行检测，寻找到具有细胞毒活性的抗肿瘤有效部位。络新妇属昆虫在云南有3个种，斑络新妇（Nephila pilipes Fabricius）、棒络新妇（Nephila clavata L.Koch）、马拉近络新妇（Nephilamalabarensis Walckenaer）。我们采集了该3种蜘蛛并分别进行提取和细胞毒活性实验。最终发现：络新妇属蜘蛛经醇水混合溶剂及酮水混合体系提取后得到的某些部位表现出明显的细胞毒活性，从而构成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物，其特征是络新妇属蜘蛛虫体于低温下研磨成匀浆，经有机溶剂直接浸泡提取，得到的抑制肿瘤细胞生长之有效部位经减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥，得产品。其中络新妇属蜘蛛虫体可以是干品或鲜品，优选鲜品。

本发明的另一目的是提供了一种络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物的制备方法，其特征是络新妇属蜘蛛虫体用有机溶剂直接浸泡，其虫体直接于低温下研磨成匀浆，该匀浆再以有机溶剂提取，过滤，与原浸泡之有机溶剂合并，减压浓缩，得到浓缩后的具有细胞毒性的有效部位提取物用于制备抗肿瘤药物。其中：

用有机溶剂提取经匀浆粉碎的虫体时，提取时间为1小时至72小时，可以反复提取1-5次，每次用1-8倍量体积的溶剂；

研磨虫体时温度不超过25℃，蜘蛛虫体有机溶剂减压浓缩时的温度不超过100℃，干燥是指真空减压干燥或冷冻干燥；

制备方法中的有机溶剂是指极性溶剂，优选醇类、醇水混合溶液、酮类、酮水混合溶液中的一种或多种；其中醇类优选甲醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种，酮类优选丙酮；

制备有效部位提取物的动物药材络新妇属蜘蛛可以是鲜品或干品，优选新鲜采集的虫体。

本发明的另一目的是提供了将络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物用于制备防治肺癌、口腔上皮癌、白血病等肿瘤药物的用途。

本发明的另一目的是提供了一种含有络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物用于制备防治肿瘤的药物组合物。

本发明中的动物药材可以是络新妇属蜘蛛的任一部位，也可以是它们的混合物，优选全虫。更优选未经干燥的活体全虫或活体全虫的某一部位。

根据《中药大辞典》，对于园网蛛科大腹园网蛛等地全虫作为基元的蜘蛛在采集时均为“入沸水烫死，取出，晒干或烘干”。炮制时更是“炒焙为主”。考虑到生物活性体内的蛋白质或者活性多肽在活虫体内构型构象状态和焙干、晒干后有较大差异；我们对于云南采集的三种络新妇属蜘蛛采用了创新的新鲜虫体酒浸后直接磨碎提取有效成分的“湿法提取工艺”，以期最大限度保证虫体内蛋白质或者活性多肽的原始构型。此外，本提取方法比“干法提取工艺”得率高，细胞毒活性也比相应的干法提取得到的提取物强。

本发明人发现，本发明得到的络新妇属蜘蛛经有机溶剂提取物具有重要的生物活性，体外对人口腔上皮癌细胞株（KB）、人肺癌细胞（A549）和白血病细胞（HL-60）的细胞毒活性试验表明：此类络新妇属蜘蛛经有机溶剂提取物对体外培养的人体肿瘤细胞生长具有显著抑制作用。说明此类络新妇属蜘蛛经有机溶剂提取物或其混合物有可能发展成为新的防治肿瘤药物。

络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物或其混合物可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有肿瘤细胞生长抑制活性从而可以用于防治肿瘤的药物组合物。上述各类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。

本发明的络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物或其混合物可以与现已上市的抗肿瘤药物如铂类药物顺铂（DDP）、喜树碱类药物伊立替康（Irinatecan，CPT-11）、长春花碱类药物失碳长春花碱（Vinorebine，NVB诺维本）、脱氧胞昔类药物吉西他滨(Gemcitabine，Gemzar，健择)、足叶乙甙（Etoposide）、紫杉醇（Paclitaxel）等联合使用，制备得到具有肿瘤生长抑制活性的细胞毒性组合物，可用于治疗肿瘤疾病。该类药物组合物可以采用注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于治疗肿瘤疾病、延缓肿瘤恶化、延长肿瘤病人生存时间等用途。

至今为止，以往文献中并未发现有以本发明的工艺对络新妇属蜘蛛进行提取的文献报道，本制备方法具有意想不到的新的效果。并且，迄今为止，中外文献并无针对云南采集到的络新妇属蜘蛛进行针对人体细胞毒活性研究的报道，本针对性的研究尚属首次，其具有显著的抑制体外培养人体肿瘤细胞生长的活性也属于意想不到的结果，因而可以预期进一步开发成为治疗肿瘤疾病的药物或药物组合物。由此完成了本发明。

本发明的有益之处在于：络新妇属蜘蛛提取物具有强效抑制人口腔上皮癌细胞株（KB）、人肺癌细胞（A549）、和白血病细胞（HL-60）生长的活性，显示该提取物可以预期应用于制备治疗新的抗肿瘤药物，对于开发新的创新型抗癌药物提供了新的物质基础。本发明中采用的“湿法提取工艺”也最大限度地保证了虫体内活性物质的原始天然状态，也是优点之一。本发明再一特点是：该属蜘蛛生长繁殖能力旺盛，在云贵高原广泛分布，便于养殖，每头雌蛛每年可以孵育600-800只子代，有利于成为稳定的生物药物资源，同时也有利于贫困山区农民街养殖此类药源性动物达到脱贫目的。具有潜在的巨大社会效益和经济效益。该药物原料来源于天然养殖，制备步骤简便，成本低，污染小，利于大规模生产。

具体实施方案

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用该类络新妇属蜘蛛提取物对三种肿瘤细胞株生长的抑制作用实验结果，说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。

必须说明的是：本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：斑络新妇甲醇水溶液提取物对口腔上皮癌细胞（KB）的细胞毒试验

1.1斑络新妇甲醇水溶液提取物的制备

新鲜捕捉到的斑络新妇蜘蛛50头（采自思茅地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为斑络新妇Nephila pilipes），先浸入温度为5℃的90%甲醇水溶液中半小时，取出在组织匀浆机下匀浆，虫体匀浆以75％甲醇水溶液150毫升，于10℃下浸泡提取3次，每次4小时。过滤出提取液，合并提取液，在10℃下减压浓缩至干，真空冷冻干燥，即得斑络新妇甲醇水溶液提取物。

1.2细胞毒性试验

KB（口腔上皮癌）细胞用RPMI1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔5×10³的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。细胞存活率的测定用改良MTT法。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的斑络新妇甲醇水溶液提取物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中斑络新妇甲醇水溶液提取物最终浓度分别为1000、333.3、111.1和37.0微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT（5毫克/毫升）的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的MTT，每孔中加入200微升二甲亚砜，以溶解还原的MTT晶体甲臜（formazan），所形成的formazan用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品相对于对照品的比值计算。其中斑络新妇甲醇水溶液提取物对KB细胞半抑制浓度（IC₅₀）由剂量效应曲线得到。

1.3结果：

实验结果见表1。结果表明，斑络新妇甲醇水溶液提取物对口腔上皮癌细胞（KB）具有显著细胞毒活性。

表1斑络新妇甲醇水溶液提取物对口腔上皮癌细胞（KB）的细胞毒试验

1.4实验结论：

KB细胞是测试化合物对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明斑络新妇甲醇水溶液提取物对KB细胞具有确切的细胞毒性，有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的具有抗多种肿瘤作用的药物。

实施例2：斑络新妇水提取物对口腔上皮癌细胞（KB）的细胞毒试验

2.1斑络新妇水提取物的制备

将捕捉到的斑络新妇蜘蛛50头以传统方式现用沸水烫死，之后晒干，研钵磨粉，虫体粉按照传统提取方法以蒸馏水150毫升，于100℃下煮沸提取3次，每次4小时。过滤出提取液，合并提取液，在10℃下减压浓缩至干，真空冷冻干燥，即得斑络新妇水提取物。2.2细胞毒性试验

KB（口腔上皮癌）细胞孵育及细胞存活率的测定同实施例1。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的斑络新妇水提取物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中斑络新妇水提取物最终浓度分别为1000、333.3、111.1和37.0微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT（5毫克/毫升）的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的MTT，每孔中加入200微升二甲亚砜，以溶解还原的MTT晶体甲臜（formazan），所形成的formazan用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品相对于对照品的比值计算。其中斑络新妇水提取物对KB细胞半抑制浓度（IC₅₀）由剂量效应曲线得到。

2.3结果：

实验结果见表2。结果表明，斑络新妇斑络新妇水提取物对口腔上皮癌细胞（KB）具有显著细胞毒活性。

表2斑络新妇水提取物对口腔上皮癌细胞（KB）的细胞毒试验

2.4实验结论：

KB细胞是测试化合物对肿瘤细胞的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明斑络新妇水提取物对KB细胞具有显著的细胞毒性，有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的具有抗多种肿瘤作用的药物。此外，本实验还表明，用有机溶剂“湿法”提取络新妇蛛细胞毒性有效部位抑制KB细胞生长活性比传统“干法”水提物强。

实施例3：棒络新妇乙醇水溶液提取物对A549（人肺癌细胞）的细胞毒试验

3.1棒络新妇乙醇水溶液提取物的制备

新鲜捕捉到的棒络新妇蜘蛛30头（采自大理地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为棒络新妇Nephila clavata），先浸入温度为5℃的75%乙醇水溶液中半小时，取出在组织匀浆机下匀浆，虫体匀浆以75％乙醇水溶液110毫升，于10℃下浸泡提取3次，每次4小时。过滤出提取液，合并提取液，在10℃下减压浓缩至干，真空冷冻干燥，即得斑络新妇乙醇水溶液提取物。

3.2细胞毒性试验

A549（人肺癌细胞）用RPMI1640培养基培养，培养基中含10％的胎牛血清，100U/毫升的青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔5×10³的浓度加入到96孔板中，在37℃含5％CO2潮湿空气的培养箱中培养24小时。细胞存活率的测定用改良MTT法，具体方法如实施例1。细胞经过24小时的孵育后，分别将新配的斑络新妇水提取物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中棒络新妇乙醇水溶液提取物最终浓度分别为1000、333.3、111.1和37.0微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT（5毫克/毫升）的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的MTT，每孔中加入200微升二甲亚砜，以溶解还原的MTT晶体甲臜（formazan），所形成的formazan用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品相对于对照品的比值计算。其中棒络新妇乙醇水溶液提取物对A549细胞半抑制浓度（IC₅₀）由剂量效应曲线得到。

3.3结果：

实验结果见表3。结果表明，棒络新妇乙醇水溶液提取物对A549（人肺癌细胞）具有显著细胞毒活性。

表3棒络新妇乙醇水溶液提取物对A549（人肺癌细胞）的细胞毒试验

3.4实验结论：A549细胞是测试化合物对人肺癌的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明棒络新妇乙醇水溶液提取物对A549细胞具有显著的细胞毒性，有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的具有抗肺癌作用的络新妇蛛细胞毒类药物。

实施例4：马拉近络新妇丙酮水溶液提取物对HL-60（人原髓细胞白血病细胞）的细胞毒试验

4.1马拉近络新妇丙酮水溶液提取物的制备

新鲜捕捉到的马拉近络新妇蜘蛛36头（采自大理地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为马拉近络新妇Nephilamalabarensis Walckenaer），先浸入温度为5℃的85%分析纯丙酮水溶液中半小时，取出在组织匀浆机下匀浆，虫体匀浆以85％丙酮水溶液120毫升，于15℃下浸泡提取4次，每次3小时。过滤出提取液，合并提取液，在20℃下减压浓缩至干，真空冷冻干燥，即得马拉近络新妇丙酮水溶液提取物。

4.2细胞毒性试验

HL-60细胞（人原髓细胞白血病细胞）用RPMI1640培养基培养，培养基中含10％小牛血清，100U/毫升的青霉素和100U/毫升的链霉素。细胞以每孔1×10⁴个密度接种到96孔板中，在37℃、5%CO₂潮湿空气的培养箱中培养24小时。细胞存活率的测定用改良MTT法，具体方法如实施例1。分别将新配的马拉近络新妇丙酮水溶液提取物的二甲亚砜溶液以浓度梯度加入到各孔中，使孔中马拉近络新妇丙酮水溶液提取物最终浓度分别为1000、333.3、111.1和37.0微克/毫升。72小时后，加入10微升MTT（5毫克/毫升）的磷酸盐缓冲液，再继续在37℃培养4小时后，离心5分钟除去未转化的MTT，每孔中加入200微升二甲亚砜，以溶解还原的MTT晶体甲臜（formazan），所形成的formazan用酶标仪在570nm波长下比色，细胞存活率由样品相对于对照品的比值计算。其中马拉近络新妇丙酮水溶液提取物对HL-60细胞半抑制浓度（IC₅₀）由剂量效应曲线得到。

4.3结果：

实验结果见表4。结果表明，马拉近络新妇丙酮水溶液提取物对HL-60细胞(人原髓细胞白血病细胞)具有显著细胞毒活性。

表4马拉近络新妇丙酮水溶液提取物对HL-60细胞株的细胞毒试验

4.4实验结论：

HL-60细胞（人原髓细胞白血病细胞）是测试化合物对人白血病的细胞毒性的有效工具和评价指标。本实验表明马拉近络新妇丙酮水溶液提取物对HL-60细胞具有显著的细胞毒性，有可能经过进一步发掘优化而发展成为新的具有抗白血病作用的络新妇蛛细胞毒类药物。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (10)

1.一种络新妇属蜘蛛具细胞毒性的有效部位提取物，其特征为改有效部位是络新妇属蜘蛛虫体于低温下研磨成匀浆，经有机溶剂直接浸泡提取，得到的抑制肿瘤细胞生长之有效部位经减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥而得。

2.一种络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物用于制备抗肿瘤药物的用途。

3.根据权利要求2的用途，其特征是所述肿瘤是指鼻咽癌、肺癌和/或白血病。

4.一种络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物的制备方法，其特征是络新妇属蜘蛛虫体用有机溶剂直接浸泡，其虫体直接于低温下研磨成匀浆，该匀浆再以有机溶剂提取，过滤，与原浸泡之有机溶剂合并，减压浓缩，得到浓缩后的具有细胞毒性的有效部位提取物。

5.根据权利要求4的制备方法，其特征为：用有机溶剂提取虫体匀浆，其提取时间为1小时至72小时，提取次数为1-5次，每次用1-8倍量体积的溶剂。

6.根据权利要求4的制备方法，其特征为：研磨虫体时温度不超过25℃，减压浓缩时的温度不超过100℃，干燥是指真空减压干燥或冷冻干燥。

7.根据权利要求4的制备方法，其特征为：所述有机溶剂是指醇类、醇水混合溶液，丙酮、酮水混合溶液中的一种或多种，其中醇类是指甲醇、乙醇、乙二醇中的一种或多种。

8.一种具有细胞毒作用的抗肿瘤药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1所述的络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物和可药用载体。

9.根据权利要求8的药物组合物，其是片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射剂、滴丸、透皮贴剂、外用搽剂或气雾剂。

10.根据权利要求1-8任一所述的络新妇属蜘蛛具有细胞毒性的有效部位提取物，其特征为所述有效部位提取的动物药材选自络新妇属蜘蛛鲜品，其是新鲜采集的络新妇属蜘蛛虫体的任一部位，或是虫体不同部位的混合物，或是全虫。