CN107375338A - 一种瘤背石磺提取物的制备方法和应用 - Google Patents

一种瘤背石磺提取物的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种瘤背石磺提取物的制备方法和应用,其制备方法包括以下步骤:(1)清洗;(2)刺激处理;(3)第一次除杂;(4)冷浸;(5)第二次除杂;(6)浓缩;(7)萃取;(8)干燥。通过以上步骤充分提取瘤背石磺的活性物质,使得活性物质具有良好的抗肿瘤应用效果,发挥治疗的药效,易于操作。

Description

一种瘤背石磺提取物的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及海洋动物加工技术领域,特别涉及一种瘤背石磺提取物的制备方法和应用。
背景技术
石磺科(Onchidiidae)隶属软体动物门(Mollusca),腹足纲(Gastropoda),肺螺亚纲(Pulmonata),缩眼目(Systellommatophora),石磺总科(Onchidiidae);该贝类雌雄同体,身体柔软无贝壳,广泛分布于印度-太平洋沿岸的河口海域,大多栖息于浅海、潮间带或高潮带的岩礁、红树林、芦苇丛、大米草滩等沿岸湿地及潮上带,少种生活在热带雨林和淡水中,是界于海洋和陆地过渡带的无脊椎且能用肺呼吸的两栖类贝类。因此,石磺具有独特的生活习性和进化史,是海洋独一无二的特色资源。该科下辖6属,分别为:Peronia、Platevindex、Paraoncidium、Onchidium、Onchidina、Onchidella,有具体科学报道和得到承认的种类大约30种,东南亚的种类多达20种。
目前我国水产市场销售的主要有瘤背石磺,瘤背石磺俗称土海参,又名海癞子、土鸡、土鲍、涂龟等,主要分布于我国海南、广东、广西、江苏、浙江、福建、香港、上海沿海咸淡水交汇处的潮间带高潮区,澳大利亚、新西兰及越南、泰国等国家沿海也有分布;成体全身裸露无壳,体表呈青兰色,灰色并夹杂绿色、褐色,密布多数瘤状突起,有自由生活幼虫期,被认为是一种进化程度很高的贝类,是一种具有重要营养价值和药用价值的经济贝类。在《中国海洋药物辞典》中有如下记载:石磺别名土海参,四季捕捞,捕后洗净,除去内脏,取肉鲜用;肉入药;有滋补强壮之功效;主治肝硬化、久病体虚等症状。
国外仅见少量文献报道石磺的活性物质,具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗疟、抗炎、抗血栓、抗癌和抗动脉粥样硬化等多种生物活性,尤其以它的抗肿瘤活性最为显著,显示石磺其体内含有丰富的抗肿瘤活性物质。
发明内容
鉴以此,本发明提出一种瘤背石磺提取物,实现了瘤背石磺活性成分的富集和抑制肿瘤的效果。
本发明的技术方案是这样实现的:一种瘤背石磺提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜瘤背石磺,用水洗净除泥沙;
(2)刺激处理:将清洗后的活体瘤背石磺进行低温刺激处理或超声刺激处理或有机试剂刺激处理;
(3)第一次除杂:将刺激处理后的瘤背石磺取出,除去内脏和腺体;
(4)冷浸:将除杂后的瘤背石磺切碎,用混合液进行冷浸提取,所述混合液为甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿中的一种或两种;
(5)第二次除杂:在冷浸提取过程中搅拌,除去上浮的泡沫;
(6)浓缩:过滤得瘤背石磺提取液,减压浓缩至膏状物;
(7)萃取:将膏状物分散于水中,进行萃取,萃取液减压浓缩得油状物;
(8)干燥:将油状物进行真空冷冻干燥,得干粉。
优选地,所述步骤(2)中,将清洗后的活体瘤背石磺在温度为-20℃~10℃下进行低温刺激处理或在5KHz~20KHz下进行超声刺激处理5min~10min或在有机试剂下进行刺激处理,所述有机试剂为丙酮或二氯甲烷或甲醇。
优选地,所述步骤(4)中,所述瘤背石磺与混合液的重量比为1:10~20。
优选地,所述步骤(5)中,通过60~200目筛除去上浮的泡沫。
优选地,所述步骤(6)中,在压力为-0.08Mpa~-0.1Mpa下浓缩至相对密度为0.8~1.2的膏状物。
优选地,所述步骤(7)中,将膏状物分散于蒸馏水或纯净水中,所述膏状物与蒸馏水或纯净水的重量比为1:4~1:8。
优选地,所述步骤(7)中,萃取过程中萃取剂为石油醚或二氯甲烷或乙酸乙酯。
优选地,所述步骤(8)中,冷冻温度为-60℃~-20℃。
本发明提供的一种瘤背石磺提取物在制备抗肝肿瘤药物中的应用。
优选地,所述瘤背石磺提取物在制备抗人体胶质瘤细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
冷冻刺激处理或超声刺激处理或有机试剂刺激处理是为了让石磺在恶劣环境条件下刺激产生更多的次级代谢产物,可大大提高石磺中抗肿瘤细胞活性药效成分的提取;将瘤背石磺进行冷浸提取可以避免有效成分在加热过程中被破坏,有效成分的溶出率较高,提取效率高;除杂是为了将浸泡过程中产生的杂质除去,使得有效成分含量高;且采用低极性萃取剂充分萃取,使得瘤背石磺的活性物质富集;最后进行真空冷冻干燥,确保瘤背石磺的活性成分不易损失,存储时间长。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种瘤背石磺提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜瘤背石磺,用水洗净除泥沙。
(2)刺激处理:将清洗后的活体瘤背石磺在温度为-20℃下进行低温刺激处理。
(3)第一次除杂:将刺激处理后的瘤背石磺取出,除去内脏和腺体。
(4)冷浸:将除杂后的瘤背石磺切碎,用甲醇的混合液进行冷浸提取2次,所述瘤背石磺与混合液的重量比为1:10。
(5)第二次除杂:在冷浸提取过程中搅拌,通过80目筛除去上浮的泡沫。
(6)浓缩:过滤得瘤背石磺提取液,在压力为-0.08Mpa下减压浓缩至相对密度为0.8的膏状物。
(7)萃取:将膏状物分散于蒸馏水或纯净水中,进行萃取,萃取剂为石油醚,萃取液减压浓缩得油状物,所述膏状物与蒸馏水或纯净水的重量比为1:4。
(8)干燥:将油状物在冷冻温度为-60℃进行真空冷冻干燥,得干粉。
实施例2
一种瘤背石磺提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜瘤背石磺,用水洗净除泥沙。
(2)刺激处理:将清洗后的活体瘤背石磺在温度为10℃下进行低温刺激处理。
(3)第一次除杂:将刺激处理后的瘤背石磺取出,除去内脏和腺体。
(4)冷浸:将除杂后的瘤背石磺切碎,用甲醇与二氯甲烷的混合液进行冷浸提取3次,所述瘤背石磺与混合液的重量比为20:1。
(5)第二次除杂:在冷浸提取过程中搅拌,通过160目筛除去上浮的泡沫。
(6)浓缩:过滤得瘤背石磺提取液,在压力为-0.1Mpa下减压浓缩至相对密度为1.2的膏状物。
(7)萃取:将膏状物分散于蒸馏水或纯净水中,进行萃取,萃取剂为石油醚,萃取液减压浓缩得油状物,所述膏状物与蒸馏水或纯净水的重量比为1:20。
(8)干燥:将油状物在冷冻温度为-20℃进行真空冷冻干燥,得干粉。
实施例3
一种瘤背石磺提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜瘤背石磺,用水洗净除泥沙.
(2)刺激处理:将清洗后的活体瘤背石磺在温度为-5℃下进行低温刺激处理。
(3)第一次除杂:将刺激处理后的瘤背石磺取出,除去内脏和腺体。
(4)冷浸:将除杂后的瘤背石磺切碎,用甲醇与氯仿的混合液进行冷浸提取3次,所述瘤背石磺与混合液的重量比为1:15。
(5)第二次除杂:在冷浸提取过程中搅拌,通过130目筛除去上浮的泡沫。
(6)浓缩:过滤得瘤背石磺提取液,在压力为-0.09Mpa下减压浓缩至相对密度为1.0的膏状物。
(7)萃取:将膏状物分散于蒸馏水或纯净水中,进行萃取,萃取剂为石油醚,萃取液减压浓缩得油状物,所述膏状物与蒸馏水或纯净水的重量比为1:6。
(8)干燥:将油状物在冷冻温度为-40℃进行真空冷冻干燥,得干粉。
将清洗后的活体瘤背石磺也可在5KHz~20KHz下进行超声刺激处理5min~10min或在有机试剂下进行刺激处理,所述有机试剂为丙酮或二氯甲烷或甲醇。所述混合液为甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿中的一种或两种。所述萃取剂为石油醚或二氯甲烷或乙酸乙酯。
为了进一步验证本发明的有益效果,做了以下实验:
瘤背石磺具有重要的营养价值和药用价值,瘤背石磺的提取物中含有聚丙酸酯类的活性物质,对预防和治疗肿瘤疾病药物中具有重要的用途。
瘤背石磺提取物在制备抗肝肿瘤药物中的应用
活性测试:本实验分别检测了瘤背石磺石油醚萃取物对人胶质瘤细胞U251,人胃癌细胞AGS,人肝癌细胞HuH-7,人肝癌细胞BEL-7402,人肺癌细胞NCI-H460人肺癌细胞HCCC-9810、人肺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549的细胞毒性。
1、实验方法:
(1)细胞培养于75cm2培养瓶中,密度超过80%,使用胰酶消化细胞,获得细胞悬液,加培养基稀释到每毫升3×104个细胞,接种于96孔板中,每孔200μL,即每孔6000个细胞。
(2)背景对照孔不接种细胞。
(3)培养箱中培养24h,细胞融合率达70%以上,吸出培养基,加入含有不同浓度药物(100,50,25,12.5,6.25,3.12,1.56μg/mL)的无血清培养基100μL,每个浓度设置3个复空。背景对照孔加不含药物无血清培养基。孵育24h后,每孔加入20μL MTT溶液(20mg/mL),继续孵育4h,于570nm处测定吸光度。
(4)按照下公式计算各孔细胞存活率:细胞存活率=(加药孔OD值-背景孔OD值)/(空白对照孔OD值-背景孔OD值)×100%,所述细胞抑制百分率=1-细胞存活率。
2、实验结果
不同浓度瘤背石磺石油醚萃取物对人胶质瘤细胞U251作用、对人胃癌细胞AGS作用、人肝癌细胞HuH-7作用、人肝癌细胞BEL-7402作用的MTT检测结果如下表2所示:
由上表可知,瘤背石磺不同浓度石油醚萃取物对供试肿瘤细胞株均具有明显的抑制作用,当药物浓度达到50μg/mL时,对人胃癌细胞AGS、人肝癌细胞HuH-7、人肝癌细胞BEL-7402的抑制率均达到60%以上;当药物浓度达到100μg/mL时,对BEL-7402的抑制率均达到97%。
不同浓度瘤背石磺石油醚萃取物对人肺癌细胞NCI-H460作用、人肺癌细胞HCCC-9810作用、人肺癌细胞MCF-7作用、人肺癌细胞A549作用的MTT检测结果如下表3所示:
由上表可知,瘤背石磺不同浓度石油醚萃取物对供试肿瘤细胞株均具有明显的抑制作用,当药物浓度达到50μg/mL时,对人肺癌细胞NCI-H460、人肺癌细胞HCCC-9810具有良好的抑制作用;当药物浓度达到100μg/mL时,对NCI-H460、HCCC-9810、MCF-7的抑制率好。
由上表2、3可知,本产品瘤背石磺通过制备工艺石油醚提取物可抑制上述人胶质瘤细胞U251、对人胃癌细胞AGS、人肝癌细胞HuH-7、BEL-7402、人肺癌细胞NCI-H460、人肺癌细胞HCCC-9810、人肺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549等肿瘤细胞,表明了人体肿瘤具有抑制的疗效。
综上所述,采用本发明所提供的一种瘤背石磺提取物,冷冻刺激处理是为了让石磺产生更多的次级代谢产物,可大大提高石磺中抗肿瘤细胞活性药效成分的提取;将瘤背石磺进行冷浸提取可以避免有效成分在加热过程中被破坏,有效成分的溶出率较高,提取效率高;除杂是为了将浸泡过程中产生的杂质除去,使得有效成分含量高;且采用低极性石油醚等萃取剂充分萃取,使得瘤背石磺的活性物质富集;最后进行真空冷冻干燥,确保瘤背石磺的活性成分不易损失,存储时间长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜瘤背石磺,用水洗净除泥沙;
(2)刺激处理:将清洗后的活体瘤背石磺进行低温刺激处理或超声刺激处理或有机试剂刺激处理;
(3)第一次除杂:将刺激处理后的瘤背石磺取出,除去内脏和腺体;
(4)冷浸:将除杂后的瘤背石磺切碎,用混合液进行冷浸提取,所述混合液为甲醇、丙酮、二氯甲烷、氯仿中的一种或两种;
(5)第二次除杂:在冷浸提取过程中搅拌,除去上浮的泡沫;
(6)浓缩:过滤得瘤背石磺提取液,减压浓缩至膏状物;
(7)萃取:将膏状物分散于水中,进行萃取,萃取液减压浓缩得油状物;
(8)干燥:将油状物进行真空冷冻干燥,得干粉。
2.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,将清洗后的活体瘤背石磺在温度为-20℃~10℃下进行低温刺激处理或在5KHz~20KHz下进行超声刺激处理5min~10min或在有机试剂下进行刺激处理,所述有机试剂为丙酮或二氯甲烷或甲醇。
3.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)中,所述瘤背石磺与混合液的重量比为1:10~20。
4.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)中,通过60~200目筛除去上浮的泡沫。
5.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)中,在压力为-0.08Mpa~-0.1Mpa下浓缩至相对密度为0.8~1.2的膏状物。
6.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(7)中,将膏状物分散于蒸馏水或纯净水中,所述膏状物与蒸馏水或纯净水的重量比为1:4~1:8。
7.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(7)中,萃取过程中萃取剂为石油醚或二氯甲烷或乙酸乙酯。
8.根据权利要求1所述的一种瘤背石磺提取物的制备方法,其特征在于:所述步骤(8)中,冷冻温度为-60℃~-20℃。
9.根据权利要求1~8任一项所述的一种瘤背石磺提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种瘤背石磺提取物在制备抗人体胶质瘤细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞药物中的应用。
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