CN107496475A - 一种五指山参提取物的制备方法和应用 - Google Patents

一种五指山参提取物的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种五指山参提取物的制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：(1)清洗；(2)切片；(3)提取；(4)搅拌；(5)浓缩；(6)萃取；(7)干燥。冷浸或渗漉或温浸法提取是为了让五指山参在有机溶剂中溶解出更多的有效成分，也避免有效成分在加热过程中被破坏，提取效率高，采用低极性萃取剂充分萃取，使得五指山参的活性物质富集，具有良好的抗肿瘤应用效果，发挥治疗的药效，易于操作。

Description

一种五指山参提取物的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药材加工技术领域，特别涉及一种五指山参提取物的制备方法和应用。
背景技术
五指山参为锦葵科秋葵属植物箭叶秋葵(Abelmoschus Sagittifolius(Kurz)Merr.)的根茎，其别名红花马宁，一年生或多年生亚灌木状草本植物，主要分布于越南、缅甸、泰国、老挝以及中国的海南、广西等地，是海南特色黎药，收录于《黎族药志》。黎族民间称其为“五指山参”(黎话为“紫哈”)，是海南岛黎族常用黎药，多野生或种植于黎族聚集地的山边田地、山坡林下及林缘较为阴湿地带。因其根形似人参，故称五指山参，可入药，其性微温味甘淡，长期服用无毒副作用，可以提神醒脑，滋养强身，也可以治疗神经衰弱、头晕、胃痛、腰腿痛、腹泻等，外用作祛瘀消肿、跌打扭伤和接骨药，越南北部以根作止痢和滋补药。
本发明通过研究五指山参的提取步骤以及不同极性部位萃取物进行抗肿瘤活性检测，旨在获得显效的有效部位或活性组分，并为五指山参的化学成分与生物活性研究奠定基础，为更好的研究、开发、利用五指山参植物资源提供基础。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种五指山参提取物，实现了充分提取出五指山参的活性成分和抑制肿瘤的效果。
本发明的技术方案是这样实现的：一种五指山参提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)清洗切片：取新鲜五指山参根茎，用水洗净除泥沙，烘干，切片；
(2)提取：将五指山参切片用有机溶液进行冷浸或温浸或渗漉提取；
(3)搅拌：在提取过程中每隔2～4h搅拌一次，过滤得五指山参提取液；
(4)浓缩：将五指山参提取液减压浓缩至流体膏状物；
(5)萃取：将流体膏状物分散于水中，再用萃取剂进行萃取，分散的流体膏状物和萃取剂的重量比为1:3～1:6，萃取液减压浓缩得膏状物；
(6)干燥：将膏状物进行干燥，干燥温度为-60～-20℃，得干粉。
优选地，所述步骤(2)中，所述有机溶液为丙酮、二氯甲烷、石油醚、甲醇、乙醇、己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丁醇中的一种。
优选地，所述步骤(2)中，所述五指山参切片和有机溶液的重量比为1:5～1:10。
优选地，所述步骤(2)中，所述冷浸温度为15～30℃；所述温浸温度为35～80℃；提取时间为1～3天。
优选地，所述渗漉速度为100～1000mL/min，所述渗漉提取3～5次，每次补充有机溶液，有机溶液与五指山参切片的重量比为3～10：1。
优选地，所述步骤(4)中，在压力为-0.08～-0.1Mpa下浓缩至相对密度为0.8～1.2的流体膏状物。
优选地，所述步骤(5)中，所述流体膏状物与水的重量比为1:3～1:6。
优选地，所述步骤(5)中，萃取过程中萃取剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、己烷、乙醚、丁醇中的一种。
优选地，所述步骤(6)中，所述干燥为真空冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、微波干燥中的一种。
本发明还包括一种五指山参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，将五指山参提取物制成片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、注射液、口服液剂型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
冷浸或温浸或渗漉法提取是为了让五指山参在有机溶液中溶解出有效成分，将五指山参进行提取可以避免有效成分在加热提取过程中被破坏，有效成分的溶出率较高，提取效率高；在提取过程中搅拌是为了加速溶媒将五指山参中的有效成分提取出来；而采用低极性萃取剂充分萃取，使得五指山参的活性物质富集；最后进行冻干，确保五指山参的活性成分不易损失，存储时间长。
附图说明
图1为五指山参丙酮提取物对肿瘤的抑制率图表；
图2为五指山参丙酮提取物对肿瘤的抑制效果图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种五指山参提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)清洗切片：取新鲜五指山参根茎，用水洗净除泥沙，烘干，切片至长度为1～3cm。
(2)提取：将五指山参切片用有机溶液丙酮进行冷浸提取，所述五指山参切片和有机溶液的重量比为1:5，所述冷浸温度为25℃，提取时间为2天。
(3)搅拌：在提取过程中每隔3h搅拌一次，过滤得五指山参提取液。
(4)浓缩：将五指山参提取液在压力为-0.08Mpa下减压浓缩至相对密度为0.8的流体膏状物。
(5)萃取：将流体膏状物分散于水中，所述流体膏状物与水的重量比为1:3，再用萃取剂石油醚进行萃取，分散的流体膏状物和萃取剂的重量比为1:3，萃取液减压浓缩得膏状物。
(6)干燥：将膏状物进行真空冷冻干燥干燥温度为-60～-20℃，得干粉，将干粉制成片剂。
实施例2
一种五指山参提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)清洗切片：取新鲜五指山参根茎，用水洗净除泥沙，烘干，切片至长度为1～3cm。
(2)提取：将五指山参切片用有机溶液乙酸乙酯进行温浸提取，所述五指山参切片和有机溶液的重量比为1:10，所述温浸温度为40℃，提取时间为2天。
(3)搅拌：在提取过程中每隔3h搅拌一次，过滤得五指山参提取液。
(4)浓缩：将五指山参提取液在压力为-0.1Mpa下减压浓缩至相对密度为1.2的流体膏状物。
(5)萃取：将流体膏状物分散于水中，所述流体膏状物与水的重量比为1：6，再用萃取剂石油醚进行萃取，分散的流体膏状物和萃取剂的重量比为1:6，萃取液减压浓缩得膏状物。
(6)干燥：将膏状物进行喷雾干燥，干燥温度为-60～-20℃，得干粉，将干粉制成胶囊。
实施例3
一种五指山参提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)清洗切片：取新鲜五指山参根茎，用水洗净除泥沙，烘干，切片至长度为1～3cm。
(2)提取：将五指山参切片用有机溶液丙酮进行渗漉提取，所述五指山参切片和有机溶液的重量比为1:8，所述渗漉速度为550mL/min，所述渗漉提取4次，每次补充有机溶液，有机溶液与五指山参切片的重量比为6：1。
(3)搅拌：在提取过程中每隔3h搅拌一次，过滤得五指山参提取液。
(4)浓缩：将五指山参提取液在压力为-0.09Mpa下减压浓缩至相对密度为1.0的流体膏状物。
(5)萃取：将流体膏状物分散于水中，所述流体膏状物与水的重量比为1:5，再用萃取剂石油醚进行萃取，分散的流体膏状物和萃取剂的重量比为1:5，萃取液减压浓缩得膏状物。
(6)干燥：将膏状物进行真空冷冻干燥，干燥温度为-60～-20℃，得干粉，将干粉制成口服液剂型。
其中，所述有机溶液为丙酮、二氯甲烷、石油醚、甲醇、乙醇、己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丁醇中的一种。所述萃取剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、己烷、乙醚、丁醇中的一种。所述干燥为真空冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、微波干燥中的一种。冷浸、温浸和渗漉法提取是为了让五指山参在有机溶液中溶解出有效成分，将五指山参进行提取可以避免有效成分在加热过程中被破坏，五指山参切片和有机溶液具有一定的比例，使得有效成分的溶出率较高。在提取过程中每隔2～4h搅拌是为了加速溶媒将五指山参中的有效成分提取出来。采用低极性萃取剂充分萃取，使得五指山参的活性物质富集。最后进行冻干，确保五指山参的活性成分不易损失，存储时间长。所述五指山参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，五指山参具有重要的营养价值和药用价值，其提取物中含有的倍半萜-类活性物质，对预防和治疗肿瘤疾病药物中具有重要的用途，将五指山参提取物制成片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、注射液、口服液剂型进行应用。
一、五指山参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用
活性测试：本实验分别检测了五指山参不同浓度萃取物对人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞SK-HEP-1、人肝癌细胞HuH-7、人肝癌细胞BEL-7402、小鼠肝癌细胞H22、小鼠肉瘤细胞S180、人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞AGS、人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810的细胞毒性。
1、实验方法：
(1)细胞培养于75cm2培养瓶中，密度超过80％，使用胰酶消化细胞，获得细胞悬液，加培养基稀释到每毫升3×104个细胞，接种于96孔板中，每孔200μL，即每孔6000个细胞。
(2)背景对照孔不接种细胞。
(3)培养箱中培养24h，细胞融合率达70％以上，吸出培养基，加入含有不同浓度药物(100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56μg/mL)的无血清培养基100μL，每个浓度设置3个复空。背景对照孔加不含药物无血清培养基。孵育24h后，每孔加入20μL MTT溶液(20mg/mL)，继续孵育4h，于570nm处测定吸光度。
(4)按照下公式计算各孔细胞存活率：细胞存活率＝(加药孔OD值-背景孔OD值)/(空白对照孔OD值-背景孔OD值)×100％，所述细胞抑制百分率＝1-细胞存活率。
2、实验结果
2.1在提取中利用五指山参不同浓度的丙酮提取物对人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞SK-HEP-1、人肝癌细胞HuH-7、人肝癌细胞BEL-7402、小鼠肝癌细胞H22、小鼠肉瘤细胞S180、人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞AGS、人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810的细胞毒性的MTT检测结果如下表1所示：
由上表可知，五指山参丙酮提取物对各供试肿瘤细胞株均具有一定的抑制作用，当药物浓度达到100μg/mL时，除对HuH-7细胞株的抑制作用较弱外(26.2％)，对其它肿瘤细胞的抑制率均达到70％以上，且对BEL-7402肿瘤细胞的抑制率达到94.88％，对S180肿瘤细胞的抑制率达到99.63％。
2.2五指山参不同浓度的石油醚萃取物对人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞SK-HEP-1、人肝癌细胞HuH-7、人肝癌细胞BEL-7402、小鼠肝癌细胞H22、小鼠肉瘤细胞S180、人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人胃癌细胞AGS、人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810的细胞毒性的MTT检测结果如下表2所示：
五指山参不同浓度石油醚萃取物对供试肿瘤细胞株均具有明显的抑制作用，当药物浓度达到50μg/mL时，其抑制率均达到50％以上；当药物浓度达到100μg/mL时，其抑制率均达到90％以上(除MCF-7和AGS细胞株)。
2.3、不同浓度二氯甲烷萃取物对各肿瘤细胞作用的MTT检测结果如下表3所示：
五指山参二氯甲烷萃取物对BEL-7402，H22和S180三种肿瘤细胞株表现出明显活性，当药物浓度达到100μg/mL时，对其抑制率分别达到94.72％，102.06％和100.18％。
由上表1～3可知，本产品五指山参通过制备工艺获得石油醚萃取物对肿瘤细胞具有广谱的抑制作用，可抑制上述人胶质瘤细胞U251、对人胃癌细胞AGS、人肝癌细胞HuH-7、BEL-7402、人肺癌细胞NCI-H460、人肺癌细胞HCCC-9810、人肺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549等肿瘤细胞，表明了对人体肿瘤具有很好抑制的疗效。而二氯甲烷萃取物对BEL-7402，H22和S180三种肿瘤细胞株具有较好的抑制作用。同时，有机溶液丙酮总提取物对HuH-7细胞株抑制作用较差外，对其他供试肿瘤细胞株均具有较好的抑制作用，但与石油醚萃取物的抑制作用略差，而二氯甲烷的萃取物对个别的肿瘤细胞株具有较好的抑制效果。本发明通过有机溶液将有效成分提取出，再利用低极性的石油醚萃取剂进行萃取纯化，使得有效活性成分富集。当萃取剂为二氯甲烷时，虽然总体较丙酮总提取物和石油醚萃取物的效果差，但是对各别肿瘤细胞的抑制效果好。
二、本发明还研究了五指山参的丙酮提取物对小鼠肝癌细胞H22的抑制效果对比实验。
方法：H22荷瘤小鼠模型的复制：H22在小鼠腹腔中传代3次之后，取腹水加生理盐水分别稀释获得1×106和1×107个·mL-1的细胞悬液。H22接种于右前肢腋下，剂量均为0.2mL。造模后，小鼠随机分为6组，分别为阳对药1Norcantharidin去甲斑蝥素组(4mg·kg-1)、阳对药2Huaier Granule槐耳颗粒组(8g·kg-1)、五指山参丙酮提取物H-dose高、M-dose中、L-dose低剂量组(2.4、1.2、0.6g·kg-1)、模型组(水20mL·kg-1)，每组10只，次日开始，连续给药10d。
给药结束后，H22荷瘤小鼠称量体重后处死，分离肿瘤称重。按照下列公式计算抑瘤率：抑瘤率＝(模型组平均肿瘤重量-给药组平均肿瘤重量)÷模型组平均肿瘤重量×100％。
结果见下图1和图2，本发明的提取物较槐耳颗粒组的抑制率高；而高、中剂量组较甲斑蝥素组的抑制率高，表明本发明丙酮提取物具有抑制肿瘤的效果，而丙酮提取物后利用石油醚纯化，其抑制效果更好。
综上所述，采用本发明所提供的一种五指山参提取物，冷浸或温浸或渗漉法提取是为了让五指山参在有机溶液中溶解出有效成分，将五指山参进行提取可以避免有效成分在加热回流提取过程中被破坏，有效成分的溶出率较高，提取效率高；在提取过程中搅拌是为了加速溶媒将五指山参中的有效成分提取出来；而采用低极性萃取剂充分萃取，使得五指山参的活性物质富集；最后进行冻干，确保五指山参的活性成分不易损失，存储时间长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)清洗切片：取新鲜五指山参根茎，用水洗净除泥沙，烘干，切片；
(2)提取：将五指山参切片用有机溶液进行冷浸或温浸或渗漉提取；
(3)搅拌：在提取过程中每隔2～4h搅拌一次，过滤得五指山参提取液；
(4)浓缩：将五指山参提取液减压浓缩至流体膏状物；
(5)萃取：将流体膏状物分散于水中，所述流体膏状物与水的重量比为1:3～1：6，再用萃取剂进行萃取，分散的流体膏状物和萃取剂的重量比为1:3～1:6，萃取液减压浓缩得膏状物；
(6)干燥：将膏状物进行干燥，干燥温度为-60～-20℃，得干粉。
2.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述有机溶液为丙酮、二氯甲烷、石油醚、甲醇、乙醇、己烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚、丁醇中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述五指山参切片和有机溶液的重量比为1:5～1:10。
4.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述冷浸温度为15～30℃；所述温浸温度为35～80℃；提取时间为1～3天。
5.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述渗漉速度为100～1000mL/min，所述渗漉提取3～5次，每次补充有机溶液，有机溶液与五指山参切片的重量比为3～10：1。
6.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，在压力为-0.08～-0.1Mpa下浓缩至相对密度为0.8～1.2的流体膏状物。
7.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，萃取过程中萃取剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、己烷、乙醚、丁醇中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种五指山参提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所述干燥为真空冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥、微波干燥中的一种。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种五指山参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的五指山参提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将五指山参提取物制成片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、注射液、口服液剂型。
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