CN112961259A - 一种瘤背石磺多糖制备方法及在改善肠道功能领域的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种瘤背石磺多糖制备方法及在调节肠道功能领域的应用，以瘤背石磺为原料，去除内脏，洗净切片，石油醚浸泡脱脂，过滤后再用乙醇浸泡脱色，自然晾干，磨成粗粉。取一定量瘤背石磺粉末，加入蒸馏水，浸泡，微波辅助提取，合并提取液，浓缩、离心、滤液除蛋白、醇沉、复溶、透析、冷冻干燥得瘤背石磺多糖。本发明制备的瘤背石磺多糖结构稳定、活性高，具有较好的调节肠道功能活性，能够调节肠道菌群水平，能够用于制备调节肠道功能产品，同时制备方法工艺温和、操作简单、产率高、利于工业化生产。

Description

一种瘤背石磺多糖制备方法及在改善肠道功能领域的应用

技术领域

本发明涉及多糖领域，具体涉及一种瘤背石磺多糖制备方法及在改善肠道功能领域的应用。

背景技术

在人体的肠道中特别是大肠中，栖息着数以亿计的肠道细菌，统称为肠道微生物，这些肠道微生物构成了复杂的微生物生态系统，与机体健康有着十分密切的联系。人体健康的关键是我们与微生物系统保持友好“共生关系”,而“肠道细菌发酵膳食纤维为宿主提供短链脂肪酸”最能体现这种“人-菌”共生的关系。近年来，随着新一代高通量测序技术和大数据生物信息学的发展，人们不断发现肠道菌群和疾病之间的密切联系，这些疾病包括代谢综合征、直肠癌、心血管疾病、炎症性肠病、肥胖、糖尿病等。多糖作为人们日常膳食，因其分子量大、结构复杂，一般不能被人体消化系统直接消化吸收，从而进入人体大肠，并与大肠肠道菌群发生相互作用。一方面，肠道菌群能够转化多糖，发生新陈代谢生成短链脂肪酸(SCFAs)等代谢产物；另一方面，多糖由于发生了代谢，从而改变肠道微生物的组成。

研究表明，海洋来源的动植物是开发改善肠道功能保健食品的重要宝库，其含有的多糖具有免疫调节、改善肠道菌群等多种活性，且毒性低，多靶点、对并发症有一定预防、控制作用，因此，逐步受到大家的广泛关注和重视。

瘤背石磺(Onchidium struma)别名海癞子、土海参，是软体动物门，腹足纲，肺螺亚纲，柄眼目，石磺科的一种雌雄同体的进化贝类。身体柔软无壳，主要生长在江苏、上海、浙江等地沿海咸淡水交汇处的芦苇丛里，以泥滩里的单细胞藻类和有机物质为食物。瘤背石磺富含多糖、蛋白质等营养成分，具有较高的生理活性，属于高档海鲜滋补保健品。程知庆等人研究了瘤背石磺多糖的抗氧化活性，宋佩林等人研究了瘤背石磺多糖的对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。但是，对于瘤背石磺多糖在调节肠道功能中的研究却并未见相关报道。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种瘤背石磺多糖制备方法及在调节肠道功能领域的应用，制备方法工艺温和、操作简单、产率高、利于工业化生产，其制得的瘤背石磺多糖，其结构稳定、活性高，且具有改变肠道菌群结构，调节肠道功能，能够应用于改善肠道功能产品中的制备。

本发明通过下述技术方案实现：

一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)用溶剂对瘤背石磺进行浸泡，然后过滤除去溶剂，滤渣自然晾干，磨成粗粉待用；2)以蒸馏水为提取剂，加入瘤背石磺粉末，浸泡2-3h，煮沸80-90℃，微波辅助提取，提取次数3-4次，将提取得到的提取液合并；3)将提取液进行浓缩、离心、滤液除蛋白、醇沉、复溶、透析、冷冻干燥得瘤背石磺多糖。

步骤1)中先采用石油醚以料液比为1:30-40(g/mL)进行浸泡10h，然后再用醇或醇的水溶液以料液比为1:30-40(g/mL)进行浸泡5h。

瘤背石磺粉末和蒸馏水的料液比为1:30-40(g/mL)。

步骤2)中微波功率600-800W，微波提取时间8-10min。

滤液除蛋白具体步骤如下：采用Sevag法，除蛋白次数8-10次，所得水溶液旋转蒸发5-10min。

醇沉具体步骤如下：向除蛋白后的水溶液中加入无水乙醇进行醇沉，溶液和无水乙醇的体积比为1:3，控制醇沉体系中乙醇浓度为75％，在4℃过夜，离心得到醇沉物。

复溶、透析、冷冻干燥的具体步骤如下：向醇沉后的醇沉物中加入蒸馏水，复溶，经截留分子量为8000-14000Da透析袋进行得到截留液，截留液在60-70℃条件下进行旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥得到瘤背石磺多糖。

一种具有调节肠道功能的瘤背石磺多糖，采用上述方法制得。

瘤背石磺多糖在调节肠道功能领域中的应用，用于制备调节肠道功能产品中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明一种瘤背石磺的制备方法，此制备方法工艺温和、操作简单、产率高、利于工业化生产；

2、本发明一种瘤背石磺多糖，其结构稳定、活性高，具有调节肠道功能活性；

3、本发明瘤背石磺多糖在调节肠道功能领域中的应用，用于制备调节肠道功能产品。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明实施例1提供的瘤背石磺多糖红外光谱图；

图2为本发明实施例4提供的小鼠肠道菌群PCA图；

图3为本发明实施例4提供的属水平上Lactobacillus丰度图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一种具有调节肠道功能活性的瘤背石磺多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)瘤背石磺去除内脏，洗净切片，加入石油醚，料液比为1:30(g/mL)，浸泡10h。过滤后再用90％的乙醇浸泡5h，料液比为1:30(g/mL)，去除色素、多酚及其他杂质，自然晾干，磨成粗粉；

(2)用蒸馏水于80-90℃提取瘤背石磺多糖，料液比为1:30(g/mL)，微波功率600W，微波提取时间8min，提取次数3次，合并提取液，浓缩，离心；

(3)采用Sevag法除蛋白，次数8次，所得溶液旋转蒸发5-10min；

(4)在水溶液中加入无水乙醇进行醇沉，控制醇沉体系中乙醇浓度为75％，在4℃过夜，离心得到醇沉物；

(5)向醇沉物中加入蒸馏水，复溶。经截留分子量为8000-14000Da透析袋进行透析5天，得到截留液。截留液在60-70℃条件下进行旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥得到瘤背石磺多糖。

实施例2

一种具有调节肠道功能活性的瘤背石磺多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)瘤背石磺去除内脏，洗净切片，加入石油醚，料液比为1:35(g/mL)，浸泡10h。过滤后再用90％的乙醇浸泡5h，料液比为1:35(g/mL)，去除色素、多酚及其他杂质，自然晾干，磨成粗粉；

(2)用蒸馏水于80-90℃提取瘤背石磺多糖，料液比为1:35(g/mL)，微波功率700W，微波提取时间9min，提取次数4次，合并提取液，浓缩，离心；

(3)采用Sevag法除蛋白，次数9次，所得溶液旋转蒸发5-10min；

(4)在水溶液中加入无水乙醇进行醇沉，控制醇沉体系中乙醇浓度为70％，在4℃过夜，离心得到醇沉物；

(5)向醇沉物中加入蒸馏水，复溶。经截留分子量为8000-14000Da透析袋进行透析4天，得到截留液。截留液在60-70℃条件下进行旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥得到瘤背石磺多糖。

实施例3

一种具有调节肠道功能活性的瘤背石磺多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)瘤背石磺去除内脏，洗净切片，加入石油醚，料液比为1:40(g/mL)，浸泡10h。过滤后再用90％的乙醇浸泡5h，料液比为1:40(g/mL)，去除色素、多酚及其他杂质，自然晾干，磨成粗粉；

(2)用蒸馏水于80-90℃提取瘤背石磺多糖，料液比为1:40(g/mL)，微波功率800W，微波提取时间10min，提取次数5次，合并提取液，浓缩，离心；

(3)采用Sevag法除蛋白，次数10次，所得溶液旋转蒸发5-10min；

(4)在水溶液中加入无水乙醇进行醇沉，控制醇沉体系中乙醇浓度为65％，在4℃过夜，离心得到醇沉物；

(5)向醇沉物中加入蒸馏水，复溶。经截留分子量为8000-14000Da透析袋进行透析3天，得到截留液。截留液在60-70℃条件下进行旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥得到瘤背石磺多糖。

如图1所示为瘤背石磺多糖的红外光谱图。3447.82cm^-1处出现强烈的吸收峰，是O-H官能团伸缩振动；2933.23cm^-1处的吸收峰为C-H官能团的伸缩振动；1636.87cm^-1处的吸收峰为C＝O的振动吸收峰；1404.36cm^-1处为C-H的弯曲振动吸收峰；1244.44cm^-1处为C-H的变角振动吸收峰；1080.38cm^-1附近存在吡喃型糖环，这些吸收峰均为多糖的特征吸收峰。

实施例4

1、实验动物：

雄性小鼠，购自福州吴氏动物中心，四周龄。所有小鼠于恒温室内(25℃，12h/12h正常光照/黑暗循环)自由饮食饮水适应一周。

2、2型糖尿病造模：

随机选择10只小鼠作为Normal组以鼠粮喂养，其余30只小鼠用高糖高脂饲料喂养(15％猪油，15％蔗糖，1％胆固醇，10％蛋黄，0.2％脱氧胆酸钠和58.8％普通饲料)来诱导2型糖尿病。四周后，30只小鼠腹腔注射45mg/kg STZ溶液(溶解于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲溶液，pH 4.5)。Normal组小鼠腹腔注射柠檬酸钠缓冲溶液，每隔一天注射一次，共注射三次。最后一次注射后隔48h测空腹血糖值。若空腹血糖值高于11.1mmol/L则认为造模成功。

3、分组及处理方法：

将2型糖尿病小鼠随机分为3组，每组10只。分别是Model组，瘤背石磺组(OsPs，300mg/kg.d)，盐酸二甲双胍组(MH，100mg/kg.d)，进行四周灌胃。Normal组和Model组用纯净水灌胃(100mg/kg.d)。实验结束后，按照伦理准则处死小鼠，所有动物实验均符合《福建农林大学实验动物护理与使用伦理指南》

4、肠道菌群各组PCA分析

使用QIAamp-DNA试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从盲肠内容物中提取宏基因组DNA。引物为341F“5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′”和806R“5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′”用聚合酶链式反应进行扩增，扩增区域为S5-16SV34，测序策略为单端测序SE600，测序平台为Thermofisher的Ion S5TMXL。基于RStudio软件绘制脂代谢指标与肠道菌群科水平上热图。结果如图2所示，灌胃4周后，与模型组相比，Normal组，OsPs组和MH组的菌群种类都已出现显著差异，说明经过灌胃处理后，2型糖尿病小鼠的肠道菌群发生变化。

5、肠道菌群属水平Lactobacillus分析

将小鼠盲肠内容物测序后，对属水平上具有代表性的菌群进行作图分析。结果如图3所示,在属水平上，相比于Model组，OsPs和MH组中Lactobacillus的丰度显著增加，此外，OsPs组中Lactobacillus的丰度显著高于MH组。Lactobacillus是一类有益菌属，其以乳糖和葡萄糖为营养进行繁殖，通过发酵产生乳酸，可以保持肠道内的酸性环境，维持肠道平衡。以上结果说明，OsPs能够显著调节2型糖尿病小鼠的肠道菌群结构与种类，此外，还能将2型糖尿病小鼠肠道中有益菌Lactobacillus的丰度显著提高，改善肠道微环境，达到调节肠道菌群的目的。

综上所述，本发明实施例的瘤背石磺多糖具有稳定的活性结构，能够显著调节肠道菌群结构，能够应用于制备调节肠道功能的功能产品，同时其制备方法简单，工艺条件温和、易操作，制备过程绿色环保，适合规模化生产。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)用溶剂对瘤背石磺进行浸泡，然后过滤除去溶剂，滤渣自然晾干，磨成粗粉待用；2)以蒸馏水为提取剂，加入瘤背石磺粉末，浸泡2-3h，煮沸80-90℃，微波辅助提取，提取次数3-4次，将提取得到的提取液合并；3)将提取液进行浓缩、离心、滤液除蛋白、醇沉、复溶、透析、冷冻干燥得瘤背石磺多糖。

2.根据权利要求1所述一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)中先采用石油醚以料液比为1:30-40(g/mL)进行浸泡10h，然后再用醇或醇的水溶液以料液比为1:30-40(g/mL)进行浸泡5h。

3.根据权利要求1所述一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，瘤背石磺粉末和蒸馏水的料液比为1:30-40(g/mL)。

4.根据权利要求1所述一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中微波功率600-800W，微波提取时间8-10min。

5.根据权利要求1所述一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，滤液除蛋白具体步骤如下：采用Sevag法，除蛋白次数8-10次，所得水溶液旋转蒸发5-10min。

6.根据权利要求1所述一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，醇沉具体步骤如下：向除蛋白后的水溶液中加入无水乙醇进行醇沉，溶液和无水乙醇的体积比为1:3，控制醇沉体系中乙醇浓度为75％，在4℃过夜，离心得到醇沉物。

7.根据权利要求1所述一种瘤背石磺多糖的制备方法，其特征在于，复溶、透析、冷冻干燥的具体步骤如下：向醇沉后的醇沉物中加入蒸馏水，复溶，经截留分子量为8000-14000Da透析袋进行得到截留液，截留液在60-70℃条件下进行旋转蒸发浓缩，浓缩液冷冻干燥得到瘤背石磺多糖。

8.一种具有调节肠道功能的瘤背石磺多糖，其特征在于，采用权利要求1-7所述方法制得。

9.瘤背石磺多糖在改善肠道功能领域中的应用，其特征在于，用于制备改善肠道功能产品中的应用。

Images