CN115093974B - 一种深海枝孢菌及其发酵物在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种深海真菌枝孢菌及其发酵物在制备抗菌药物中的应用。本发明提供的深海枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)170056的保藏编号为CCTCCM2020614，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月21日，其发酵物能够强力杀灭副溶血弧菌，提高虾抗弧菌感染的能力，在抗副溶血弧菌药物的开发应用上具有潜力，在抗菌药物的研究方面具有良好的应用前景。

Description

一种深海枝孢菌及其发酵物在制备抗菌药物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物、药物化合物技术领域，具体涉及一种深海枝孢菌及其发酵物在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
弧菌的革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛存在于靠近河流以及海水的地区。由病原弧菌感染所引起的鱼、虾、贝类等的弧菌病是水产养殖动物最主要的细菌性疾病。目前，已发现有27种弧菌可引起弧菌病，其中以副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)最为常见。进食含有该菌的食物可致食物中毒，引起急性起病、腹痛、呕吐、腹泻等。副溶血性弧菌给人和各种生物带来了潜在的危害。因此，有效防治副溶血弧菌病将是水产动物健康养殖的关键一环，寻找防治副溶血弧菌的药物显得尤为重要。
微生物的次级代谢产物是天然产物的重要组成部分，是药物以及前体药物的重要来源之一。近年来，新型疾病和耐药性致病菌的出现，使已有抗生素药物的临床疗效不断减弱，开发作用机制新颖或活性显著的药物显得愈发重要。
发明内容
针对上述背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种深海枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056，及其发酵物在抗菌药物中的应用。本发明提供的来自深海枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056的发酵物，可以有效的抑制副溶血弧菌的生长，明显抑制虾体内的副溶血的生长，在抗副溶血弧菌药物的开发上具有潜力和应用前景。
本发明第一方面，提供一种深海来源的枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056，保藏编号为CCTCC M 2020614，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月21日。
本发明第二方面，提供一种枝孢菌的发酵提取物的制备方法，所述发酵提取物分离自深海枝孢菌的发酵液中，所述枝孢菌是保藏编号为CCTCC M 2020614的枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056。
在其中一些实施方案中，上述制备方法具体包括以下步骤：
S1、将深海枝孢菌进行发酵培养，得到发酵液；
S2、将步骤S1得到的发酵液进行离心，上清液加入乙酸乙酯萃取，将萃取液低压浓缩得到深海枝孢菌发酵粗提物；
S3、将步骤S2得到的发酵粗体物进行分离纯化，得到发酵提取物。
在其中一些实施方案中，上述步骤S1中的发酵培养具体方法为：
1)将深海枝孢菌在PDA平板上于28℃培养3～4天，获得深海枝孢菌菌丝体；
2)将深海枝孢菌菌丝体接到含有PDB的培养液中，经培养获得种子液；
3)将所述种子液接种到发酵培养基中，于28℃摇床培养11天，得到发酵液；
所述发酵培养基包括20mg/L甘露醇，3mg/L酵母提取粉，5mg/L味精，10mg/L葡萄糖，3mg/L麦芽糖，5mg/L大豆蛋白胨。
在其中一些实施方案中，上述步骤S3中发酵粗体物的分离纯化具体方法为：
1)将发酵粗提物用反相ODS柱色谱进行分离，用甲醇-水体系进行梯度洗脱，依次得到8个馏分：Fr.1～Fr.8；
2)将步骤1)得到的馏分Fr.4使用葡聚糖凝胶柱色谱进行分离，得到馏分Fr.4-1；
3)将步骤2)得到的馏分Fr.4-1使用正相硅胶柱色谱进行分离，用石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱，得到发酵提取物。
在其中一些实施方案中，所述反相ODS柱色谱所用流动相为甲醇-水，甲醇的浓度梯度为5％→100％。
在其中一些实施方案中，所述葡聚糖凝胶柱所用流动相为甲醇。
在其中一些实施方案中，所述正相柱色谱所用流动相石油醚-乙酸乙酯的浓度梯度为10:1→3:1。
在其中一些实施方案中，所述深海枝孢菌是保藏编号为CCTCC M 2020614的深海枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056。
本发明的第三方面，提供一种抗弧菌组合物，包含上述的制备方法得到的深海枝孢菌的发酵液、发酵粗体物或发酵提取物中的任一种形式的组分。
在其中一些实施方案中，所述抗弧菌组合物为药物组合物或食品组合物。
优选的，所述食品组合物的食用对象是动物，包括鱼、虾、贝类。
本发明的第四方面，提供抗弧菌药物组合物在制备预防和/或治疗弧菌感染性疾病的药物中的应用。
在其中一些实施方案中，所述弧菌为副溶血性弧菌。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种深海来源的真菌，保藏编号为CCTCC M 2020614的深海枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056。本发明还提供了深海枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)170056的发酵液及发酵提取物的制备方法，该制备方法具有环保、步骤简单等优点。本发明通过纸片法实验以及虾体内的攻毒实验证明了所述发酵提取物对耐土霉素等抗生素的副溶血弧菌具有很强的抑制作用。本发明提供的深海枝孢菌提取物在制备抗菌药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明实施例2深海枝孢菌的发酵提取物对副溶血弧菌的抑制效果图；
本发明提供的深海来源的枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056，已于2020年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2020614。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1枝孢菌的发酵液的制备
(1)将枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056接种到PDA平板上，于
25℃培养3天；
(2)将新鲜的菌丝体接到含有PDB的培养液中培养24h；
(3)取10mL种子液接种到1L的三角烧瓶中，每瓶中有400毫升的发酵培养基，在28℃摇床(150rmp)上培养11天，得到发酵液。
所述发酵培养基的成分为：20mg/L甘露醇、3mg/L酵母提取粉、5mg/L味精、10mg/L葡萄糖、3mg/L麦芽糖和5mg/L大豆蛋白胨。
实施例2枝孢菌的发酵提取物的制备
(1)将由实施例1中得到的发酵液用乙酸乙酯萃取三次，减压蒸发掉有机溶剂，得到有机萃取物；
(2)将步骤(1)得到的有机萃取物经反相ODS柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱和正相硅胶柱色谱进行分离，获得发酵提取物。
对发酵提取物进行核磁检测分析，核磁结果见表1。经文献比较，确定其结构为：10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸(10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid)。
表1发酵提取物的1H,13C NMR核磁数据
实施例3发酵提取物对副溶血弧菌活性的抑制效果
1.实验内容
采用纸片法来检测枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056的发酵提取
物抑制副溶血弧菌的生长效果。
分组及给药：本实施例分别设有阴性对照组A(二甲基亚砜，5μL)、阳性对照组B(抗菌肽制剂，5μL)、低剂量组C(5μL发酵提取物，5mg/mL)、中剂量组D(5μL发酵提取物，10mg/mL)、剂量组E(5μL发酵提取物，20mg/mL)。
实验方法：
1)将副溶血弧菌在液体LB培养基(胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl10.0g/L，pH8.6)中进行振荡培养，35℃，150rpm，培养12-18h，得到指示菌菌液；
2)将灭菌的含琼脂的LB培养基放至水浴锅中恒温加热到50℃使之融化，立即取回超净台，每100mL含琼脂的LB培养基加入1mL指示菌菌液，轻轻摇匀后倒平板，冷却备用；
3)6cm滤纸片经灭菌烘干后备用。将滤纸放置在指示菌平板表面，轻轻按压，使纸片完全接触培养基，将A、B、C、D、E各组物质缓慢的滴加在滤纸片上，使其充分吸收。密封培养皿，35℃静置培养18～20h，观察各组抑菌圈大小。抑菌圈的大小表示抑菌活性的强弱。
2.实验结果
结果如图1所示，当不同的体积的发酵提取物加入到副溶血弧菌指示平板后，72h抑菌圈达到最大，即72h该药物的抑菌活性最强；其中加入20mg/mL提取物5μL时，抑菌圈达到了31mm，而抗菌肽的抑菌圈为13cm。说明本发明提供的发酵提取物能够有效的抑制副溶血弧菌的生长，并且这种抑制活性表现出很好的浓度依赖性。
实施例4发酵提取物对虾抗感染弧菌感染的作用效果
1.实验内容
分组及给药：本实施例设置空白对照组(注射10μL生理盐水+等量饲料)、模型组(注射10μL副溶血弧菌菌液)、低剂量给药组(注射10μL副溶血弧菌菌液+0.5％提取物)、高剂量给药组(注射10μL副溶血弧菌菌液+1.0％提取物)。
实验方法：
1)取得28只5～10cm虾，随机分四组，每组7只虾；
2)养殖管理：一日三餐，日投喂量为虾体8％，记录虾死亡日期；
3)分别在实验第1、3、5天从各桶中随机取一只虾，测量虾体弧菌含量。
2.实验结果
统计虾死亡率，实验结果如表2所示。可以看出，模型组的虾连续4天都有死亡发生，而给药组未出现虾死亡的情况。低剂量注射给药组都能有效维持虾的生存，说明该深海枝孢菌发酵提取物治疗对虾感染副溶血弧菌有明显作用。
表2虾死亡率统计结果
从表3可以看出，深海枝孢菌发酵提取物对虾体内的副溶血弧菌含量明显低于模型组。
表3深海枝孢菌产物对虾体内的副溶血弧菌含量影响
综上，深海枝孢菌发酵提取物可以明显抑制虾体内的副溶血的生长，有明显的抗弧菌感染效果，显著提高虾的生存率。
实施例5最小抑菌浓度(MIC值)检测
1.实验内容
采用的是微量肉汤法来检测发酵提取物的最小抑菌浓度。
分组及给药：本实施例设置阴性对照组(二甲基亚砜DMSO)、阳性对照组(氟苯尼考制剂和土霉素制剂)、给药组(发酵提取物)。
实验方法：
(1)将乙酸乙酯提取物及其发酵提取物分别用DMSO溶解，配制浓度为5mg/mL母液，配好的抗菌药物贮藏于-20℃的冰箱。
(2)将副溶血弧菌在LB培养基中进行摇床培养(12～18h，35℃)，得到指示菌菌液，取部分菌液，将其稀释至0.01OD600/mL,备用。
(3)取无菌96孔板，将副溶血弧菌菌液加入各孔中，其中阴性对照组加入100μL的DMSO，阳性对照组加入100μL不同浓度的氟苯尼考制剂和土霉素，给药组则分别加入2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、19.53、9.77和4.88μg/mL等不同浓度的发酵提取物。
(4)将接种好的96孔板放置在35℃培养箱中进行培养，24h观察菌液生长情况。
2.实验结果
能明显抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度即为药物的最小抑菌浓度。培养24h后通过肉眼观察菌液生长情况，发现发酵提取物的最小抑菌浓度为156.25μg/mL，而氟苯尼考制剂和土霉素均为5mg/mL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种深海枝孢菌的发酵提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、将深海枝孢菌进行发酵培养，得到发酵液；所述深海枝孢菌是保藏编号为CCTCCM2020614的枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)170056；
S2、将步骤S1得到的所述发酵液进行离心，上清液加入乙酸乙酯萃取，将萃取液低压浓缩得到深海枝孢菌发酵粗提物；
S3、将步骤S2得到的所述发酵粗体物进行分离纯化，具体方法为：
1)将所述发酵粗提物用反相ODS柱色谱进行分离，用甲醇-水体系进行梯度洗脱，所述甲醇浓度梯度为5％→100％，依次得到8个馏分：Fr.1～Fr.8；
2)将得到的馏分Fr.4使用葡聚糖凝胶柱色谱进行分离，所述葡聚糖凝胶柱所用流动相为甲醇，得到馏分Fr.4-1；
3)将得到的馏分Fr.4-1使用正相硅胶柱色谱进行分离，用石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱，所述石油醚-乙酸乙酯的浓度梯度为10:1→3:1，得到发酵提取物，所述发酵提取物为10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸。
2.如权利要求1所述深海枝孢菌的发酵提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的发酵培养具体方法为：
1)将所述深海枝孢菌在PDA平板上于28℃培养3～4天，获得深海枝孢菌菌丝体；
2)将所述深海枝孢菌菌丝体接到含有PDB的培养液中，经培养获得种子液；
3)将所述获得的种子液接种到发酵培养基中，于28℃摇床培养11天，得到发酵液；
所述发酵培养基包括20mg/L甘露醇、3mg/L酵母提取粉、5mg/L味精、10mg/L葡萄糖、3mg/L麦芽糖、5mg/L大豆蛋白胨。
3.通过权利要求1或2所述的制备方法得到的深海枝孢菌的发酵提取物在制备预防和/或治疗副溶血性弧菌感染性疾病的药物中应用。
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