CN115044542B - Sj000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用 - Google Patents

Sj000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用。本发明SJ000291942为小分子化合物，分子式为C16H15FN2O4，具有易获得、结构可控、降低成本等特点，可以体外促进脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞等多种间充质干细胞的成骨分化。间充质干细胞经含有SJ000291942的培养基成骨诱导分化18～28d后，可以获得具有数量优势的骨组织工程细胞，缩短了间充质干细胞成骨分化时间，提高了分化效率。

Description

SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。然而，干细胞在体内外不定向分化的特性可导致非所需细胞的形成，甚至存在一定的致瘤性，这对干细胞治疗骨缺损的临床应用带来了挑战。因此，需要在原有基础上进一步提升干细胞的定向成骨分化效率，从而缩短干细胞治疗周期，提高治疗效果。
在诱导干细胞成骨分化的众多方法中，利用天然小分子化合物促进干细胞分化具有明显的优势。天然小分子化合物不仅来源广、种类多、数量足、易获得、结构可控，而且可以高效、可逆、定向和准确地诱导细胞分化，乃至实现体细胞重编程和转分化。这些优点为干细胞组织工程疗法的大规模应用提供了可能。目前，已经公开的可以诱导MSCs成骨分化的天然小分子化合物包括槲皮素、葛根素、白藜芦醇、姜黄素、EGCG、小檗碱、人参皂苷Rg 1、齐墩果酸、虫草素等(王怡晴等.天然小分子化合物诱导间充质干细胞向成骨分化的研究进展[J].中草药,2019(11))。SJ000291942是一种小分子化合物，目前未见其在间充质干细胞领域的活性报导。
发明内容
本发明的目的在于提供SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用，高效、定向诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，缩短间充质干细胞成骨分化时间，提高分化效率。
本发明提供了SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化中的应用。
本发明还提供了SJ000291942在制备体外诱导间充质干细胞成骨分化的培养基中的应用。
优选的，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞中的一种或多种。
优选的，所述培养基中SJ000291942的浓度为10～25μM。
本发明还提供了一种诱导间充质干细胞成骨分化的培养基，包括前期培养基和后期培养基；所述前期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包括SJ000291942、FBS、β-巯基乙醇、维生素C磷酸酯钠和β-甘油磷酸钠；所述SJ000291942的浓度为10～25μM；
所述后期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包括SJ000291942、FBS、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠和磷酸二氢钾；所述SJ000291942的浓度为10～25μM。
优选的，所述前期培养基中各成分的浓度为：FBS 2％～3％、β-巯基乙醇5×10-5mol/L、维生素C磷酸酯钠100μmol/L和β-甘油磷酸钠10mmol/L。
优选的，所述后期培养基中各成分的浓度为：FBS 2％～3％、地塞米松10-8mol/L、维生素C 100μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L和磷酸二氢钾1.8mmol/L。
本发明还提供了一种提高间充质干细胞成骨分化效率的方法，利用上述技术方案所述前期培养基培养间充质干细胞7d后，更换所述后期培养基继续培养14～28d。
优选的，利用所述前期培养基培养过程中更换2次所述前期培养基。
优选的，利用所述后期培养基培养过程中每隔2～3d更换一次所述后期培养基。
本发明提供了SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用。本发明所述SJ000291942为小分子化合物，分子式为C16H15FN2O4，具有易获得、结构可控、降低成本等特点，可以体外促进脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞等多种间充质干细胞的成骨分化。脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞经含有SJ000291942的培养基成骨诱导分化18～28d后，可以获得具有数量优势的骨组织工程细胞，缩短了间充质干细胞成骨分化时间，提高了分化效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为不同SJ000291942浓度的培养基诱导间充质干细胞成骨分化的茜素红染色结果；
图2为不同FBS浓度的培养基诱导间充质干细胞成骨分化的茜素红染色结果；
图3-1为含SJ000291942小分子化合物或Kartogenin小分子化合物的培养基诱导间充质干细胞成骨分化的茜素红染色结果；
图3-2为含SJ000291942小分子化合物或Methyl Vanillate小分子化合物的培养基诱导间充质干细胞成骨分化的茜素红染色结果；
图3-3为含SJ000291942小分子化合物或Purmorphamine小分子化合物的培养基诱导间充质干细胞成骨分化的茜素红染色结果；
图4为实施例1后期培养基诱导人脐带间充质干细胞成骨分化21d的茜素红染色结果；
图5为实施例1后期培养基诱导人脂肪间充质干细胞成骨分化21d的茜素红染色结果；
图6为实施例1后期培养基诱导人iPSC衍生间充质干细胞成骨分化21d的茜素红染色结果；
图7为实施例1培养基诱导人脐带间充质干细胞成骨分化染色原图、4倍放大图和20倍放大图；
图8为对比例18商品化成骨分化培养基诱导人脐带间充质干细胞成骨分化染色原图、4倍放大图和20倍放大图。
具体实施方式
本发明提供了SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化方面的应用，具体的：SJ000291942在诱导间充质干细胞成骨分化中的应用，以及SJ000291942在制备体外诱导间充质干细胞成骨分化的培养基中的应用。
在本发明中，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞中的一种或多种。
在本发明中，所述体外诱导间充质干细胞成骨分化的培养基中SJ000291942的浓度优选为10～25μM，进一步优选为15～20μM。
本发明所述SJ000291942为小分子化合物，分子式为C16H15FN2O4，具有易获得、结构可控、降低成本等特点，可以体外促进脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞等多种间充质干细胞的成骨分化。间充质干细胞成骨分化的过程可分为两个阶段：第一个阶段由未分化的间充质干细胞定向分化为成骨细胞的前体细胞；第二个阶段是由前体细胞转化为成熟的成骨细胞。SJ000291942是经典骨形态发生蛋白(BMP)信号传导途径的激活剂。BMP作用于未分化的间充质干细胞表面受体，在诱导分化的条件下，诱导间充质细胞分化为成骨细胞。实施例结果表明，脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞经含有SJ000291942的培养基成骨诱导分化18d后，可以获得具有数量优势的骨组织工程细胞，缩短了间充质干细胞成骨分化时间，提高了分化效率。
本发明对SJ000291942的来源没有严格要求，可以采用人工合成的方式或者购买获得。本发明具体实施过程中，使用的SJ000291942购买自Selleck.cn，货号S0153。
本发明还提供了一种诱导间充质干细胞成骨分化的培养基，包括前期培养基和后期培养基；所述前期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包括SJ000291942、FBS、β-巯基乙醇、维生素C磷酸酯钠和β-甘油磷酸钠；所述SJ000291942的浓度为10～25μM，优选为15～20μM；
所述后期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包括SJ000291942、FBS、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠和磷酸二氢钾；所述SJ000291942的浓度为10～25μM，优选为15～20μM。
在本发明中，所述前期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，优选包括：SJ000291942 10～25μM、FBS 2％～3％(v/v)、β-巯基乙醇5×10-5mol/L、维生素C磷酸酯钠100μmol/L和β-甘油磷酸钠10mmol/L；其中FBS的浓度更优选为3％。本发明在α-MEM基础培养基中添加FBS、β-巯基乙醇、维生素C磷酸酯钠和β-甘油磷酸钠能够促进地塞米松对间充质干细胞的成骨分化。实施例结果表明，在α-MEM基础培养基中添加FBS浓度在2％～3％(v/v)时，间充质干细胞成骨分化培养基效率最高。
在本发明中，所述后期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，优选包括SJ000291942 10～25μM、FBS 2％～3％(v/v)、地塞米松10-8mol/L、维生素C 100μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L和磷酸二氢钾1.8mmol/L；其中FBS的体积百分含量更优选为3％。本发明在α-MEM基础培养基中添加FBS、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠和磷酸二氢钾，可提高间充质干细胞向成骨形成早期相关转录因子(ALP、RUNX2、OSX)的表达。地塞米松可以激活位于干细胞表面的糖皮质激素受体，显著增加碱性磷酸酶的活性；维生素C对成骨分化的促进作用，主要是通过增加胶原的累积；β-甘油磷酸钠可以为成骨分化提供磷酸离子，同时促进钙盐的沉积和钙化；磷酸二氢钾作为一种磷酸根无机盐，能够释放磷酸根离子可促进细胞向成骨分化，成骨分化早期有一定促进作用。
实施例结果表明，在α-MEM基础培养基中添加的FBS浓度在2％～3％(v/v)时，间充质干细胞成骨分化培养基效率最高。
本发明所述基础培养基α-MEM(试剂名称：MEM Alpha basic(1x)；品牌：Gibco；C12571500BT)。本发明对所述培养基中的具体组分的来源没有严格要求，常规购买即可。
本发明还提供了一种提高间充质干细胞成骨分化效率的方法，利用上述技术方案所述前期培养基培养间充质干细胞7d后，更换所述后期培养基继续培养14～28d。
本发明利用所述前期培养基进行培养时，优选还包括7d内每隔2～3d更换一次所述前期培养基。利用所述后期培养基培养过程中每隔2～3d更换一次所述后期培养基。本发明利用所述前期培养基进行培养时，优选使用37℃5％二氧化碳培养箱。本发明所述后期培养基培养的时间优选为15～25d，进一步优选为18～20d。本发明利用所述后期培养基进行培养时，优选使用37℃5％二氧化碳培养箱。
间充质干细胞在本发明所述前期培养基的作用下细胞发生形态改变，从梭形演变成椭圆形，体积增大，细胞表面分泌出颗粒状物质；所述后期培养基能将经过前期培养的间充质干细胞成钙素表达增强，钙磷沉积，骨结节形成，大量的钙盐和矿物质沉积，表现出成骨细胞形成的特征。利用本发明所述的方法能够提高间充质干细胞成骨分化效率，实施例结果表明本培养基为细胞成骨分化提供了有利的化学环境，可提高细胞的分化、矿化或钙磷沉积的能力，缩短分化周期，增强分化能力。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.培养基的制备
1.1试剂分装
(1)胎牛血清(FBS)，品牌Gibco，货号10091148
①将FBS从-20℃移至4℃冰箱，过夜，解冻；
②分装：准备50mL离心管，标记分装时间、试剂名称、有效期等信息；
③留1管FBS至4℃冰箱备用，其余移至-20℃冰箱冻存。
(2)SJ000291942，品牌Selleck.cn，货号S0153
①取出试剂，放置在生物安全柜中，常温解冻；
②分装：准备1.5mL EP管，标记分装时间、试剂名称、有效期等信息；
③用DMSO溶解稀释，终浓度：50mM；
④留1支至4℃冰箱备用，其余移至-20℃冰箱冻存。
(3)地塞米松，品牌Sigma，货号D1756-25MG
①取出试剂，放置在生物安全柜中；
②分装：准备1.5mL EP管，标记分装时间、试剂名称、有效期等信息；
③用DMSO溶解稀释，终浓度：20mM；
④留1支至4℃冰箱备用，其余移至-20℃冰箱冻存。
(4)β-甘油磷酸钠，品牌Sigma，货号G9422-10G
①用天平称取2.0g，移至生物安全柜，倒入50mL离心管中；
②加9.23mL平衡盐溶液(PBS)溶解，终浓度：1M；
③分装：准备1.5mLEP管，标记分装时间、试剂名称、有效期等信息；
④留1支至4℃冰箱备用，其余移至-20℃冰箱冻存。
(5)抗坏血酸/维生素C，品牌Sigma，货号A7506-25G
①用天平称取2.0g，移至生物安全柜，倒入50mL离心管中；
②加11.36mL平衡盐溶液(PBS)溶解，终浓度：1M；
③分装：准备1.5mLEP管，标记分装时间、试剂名称、有效期等信息；
④留1支至4℃冰箱备用，其余移至-20℃冰箱冻存。
(6)磷酸二氢钾KH2P04，品牌：沪试，货号：10017608
①用天平称取1.0g，移至生物安全柜，倒入50mL离心管中；
②加7.4mL平衡盐溶液(PBS)溶解，终浓度：1M；
③分装：准备1.5mL EP管，标记分装时间、试剂名称、有效期等信息；
④留1支至4℃冰箱备用，其余移至-20℃冰箱冻存。
(7)含5％UltraGRo-Advanced的MEM培养基的配置
①MEM Alpha basic(1x)，品牌：Gibco，货号：C12571500BT；
②UltraGROTM-Advanced，品牌：helios，货号：HPCFDCGL50；
③去25mLUltraGROTM-Advanced，加入MEM培养基，混匀，制成含5％UltraGRo-Advanced的MEM培养基；
④标记分装时间、试剂名称、有效期等信息，放置至4℃冰箱备用。
1.2.前期培养基的制备，按照表1组分和浓度将步骤1.1分装好的试剂混合配制前期培养基。
表1前期培养基各组浓度
试剂名称 终浓度
MEM Alpha basic(1x) 50mL
胎牛血清(FBS) 2％(1mL)
SJ000291942 10μM
β-甘油磷酸钠 10mmol/L
β-巯基乙醇 5×10-5mol/L
维生素C磷酸酯钠 100μmol/L
1.3.后期培养基的制备，按照表2组分和浓度将步骤1.1分装好的试剂混合配制后期培养基。
表2后期培养基各组浓度
试剂名称 终浓度
MEM Alpha basic(1x) 50mL
胎牛血清(FBS) 2％(1mL)
SJ000291942 10μM
β-甘油磷酸钠 10mmol/L
地塞米松 10-8mol/L
维生素C 100μmol/L
磷酸二氢钾KH2PO4 1.8mmol/L
2.培养过程
2.1取4.5×105个P5代人脐带间充质干细胞接种到含有2mLα-MEM培养基(培养基中含有5％V/V UltraGRo-Advanced)的6孔板中，接种完毕，即将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中培养；
2.2细胞诱导：待细胞长到基本融合的时候，吸去6孔板中的α-MEM培养基，并加入2mL步骤1.2前期培养基培养1周，培养过程中更换2次培养基；第二周起利用步骤1.3后期培养基进行后续培养，每隔2d直接吸出6孔板中的培养基，添加等体积的新鲜后期培养基；
2.3细胞染色：后期培养基培养11d以后，用茜素红染料进行染色，具体的：
(1)吸走6孔板中的后期培养基，用1×PBS冲洗1～2次。每孔加入1mL 4％多聚甲醛溶液，固定30min。
(2)吸走4％多聚甲醛溶液，用2mL 1×PBS冲洗2次。每孔中加入1mL茜素红染液染色3-5min。
(3)吸走茜素红染液，用2mL 1×PBS冲洗2～3次。
实施例2～5
同实施例1，区别在于按照实施例1的方式制备前期培养基和后期培养基，其中实施例2～4前期培养基和后期培养基的配方与实施例1相同，区别在于SJ000291942的终浓度不同，实施例5前期培养基和后期培养基的配方与实施例1相同，区别在于FBS的终浓度不同，具体列于表3中。
表3实施例1～6培养基组成和终浓度
实施例5
同实施例1，区别在后期培养基培养时间为21d。
实施例6
同实施例5，区别在于对人脂肪间充质干细胞进行诱导分化。
实施例7
同实施例5，区别在于对人iPSC衍生间充质干细胞进行诱导分化。
对比例1～12
同实施例3，区别在于按照实施例3的方式制备前期培养基和后期培养基，其中对比例1～4前期培养基和后期培养基的配方中以Kartogenin替换实施例3中的SJ000291942(具体列于表4中)；对比例5～8前期培养基和后期培养基的配方中以Methyl Vanillate替换实施例3中的SJ000291942(具体列于表5中)；对比例9～12前期培养基和后期培养基的配方中以Purmorphamine替换实施例3中的SJ000291942(具体列于表6中)。
表4实施例3和对比例1～4培养基组成和终浓度
表5实施例3和对比例5～8培养基组成和终浓度
表6实施例3和对比例9～12培养基组成和终浓度
对比例13～14
同实施例1，区别在于按照实施例1的方式制备前期培养基和后期培养基，其中对比例13～14前期培养基和后期培养基的配方与实施例1相同，区别在于SJ000291942的终浓度不同，具体列于表7中。
表7实施例1和对比例13～14培养基组成和终浓度
对比例15～17
同实施例1，区别在于按照实施例1的方式制备前期培养基和后期培养基，其中对比例15～17前期培养基和后期培养基的配方与实施例1相同，区别在于FBS的终浓度不同，具体列于表8中。
表8实施例1和对比例15～17培养基组成和终浓度
对比例18
同实施例1，区别在于前期培养和后期培养过程中使用成骨分化的商品试剂(MesenCultTM Osteogenic Differentiation Medium；品牌：Stemcell；货号：05465)，培养时间为21d。
测试例1
SJ000291942浓度的选择
实施例1～4和对比例13～14染色5min后，观察茜素红染色结果，结果如图1所示，其中，图1从左到右依次对应对比例13、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和对比例14对应的技术方案，根据图1的检测结果可以看出，小分子(SJ000291942)添加浓度在10～25μM范围内，间充质干细胞能够实现成骨分化，并且分化效率高，小分子(SJ000291942)添加浓度为30μM时，染色着色面积不大，成小片状，不连续分布，分化率不高。
测试例2
FBS浓度的选择
实施例1、实施例5和对比例15～17染色5min后，观察茜素红染色结果，结果如图2所示，其中，图2从左到右依次对应对比例15、实施例1、实施例5、对比例16和对比例17对应的技术方案，根据图2的检测结果可以看出，FBS添加浓度在2～3％的范围内，间充质干细胞能够实现成骨分化，高浓度或低浓度FBS不能实现间充质干细胞能够实现成骨分化。
测试例3
小分子化合物种类的选择
实施例3和对比例1～12染色5min后，观察茜素红染色结果，结果如图3-1、3-2和3-3所示，其中，图3-1从左到右依次对应实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4对应的技术方案；图3-2从左到右依次对应实施例3、对比例5、对比例6、对比例7和对比例8对应的技术方案；图3-3从左到右依次对应实施例3、对比例9、对比例10、对比例11和对比例12对应的技术方案。
根据图3-1、图3-2和图3-3的检测结果可以看出，低浓度还是高浓度小分子Kartogenin、Methyl Vanillate或Purmorphamine均不能实现间充质干细胞能够实现成骨分化。
测试例4
实施例5～7染色5min后，观察茜素红染色结果，结果如图4～6所示，其中，图4从左到右依次为实施例5人脐带间充质干细胞染色原图、4倍放大图和20倍放大图；图5从左到右依次为实施例6人脂肪间充质干细胞染色原图、4倍放大图和20倍放大图；图6从左到右依次为实施例7人iPSC衍生间充质干细胞染色原图、4倍放大图和20倍放大图。
根据图4～6可以看出，本发明培养基能够实现人脐带间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人iPSC衍生间充质干细胞等多种现间充质干细胞能够的成骨分化。
测试例5
实施例1和对比例18染色5min后，观察茜素红染色结果，结果如图7和图8所示，其中，图7从左到右依次为实施例1人脐带间充质干细胞染色原图、4倍放大图和20倍放大图；图8从左到右依次为对比例18人脐带间充质干细胞染色原图、4倍放大图和20倍放大图。
根据图7～8可以看出，本发明培养基诱导18d后的效果显著高于对比例18商品化培养基诱导21d的效果，说明本发明培养基在实现诱导间充质干细胞成骨分化的同时，缩短了诱导时间，提高了诱导效率。
本发明SJ000291942可以体外促进脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞等多种间充质干细胞的成骨分化。间充质干细胞经含有SJ000291942的培养基成骨诱导分化18d后，可以获得具有数量优势的骨组织工程细胞，缩短了间充质干细胞成骨分化时间，提高了分化效率。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.SJ000291942在制备体外诱导间充质干细胞成骨分化的培养基中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和iPSC衍生间充质干细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养基中SJ000291942的浓度为10～25μM。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基中SJ000291942的浓度为15～20μM。
5.一种诱导间充质干细胞成骨分化的培养基，其特征在于，包括前期培养基和后期培养基；所述前期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包括SJ000291942、FBS、β-巯基乙醇、维生素C磷酸酯钠和β-甘油磷酸钠；所述SJ000291942的浓度为10～25μM；
所述后期培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包括SJ000291942、FBS、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠和磷酸二氢钾；所述SJ000291942的浓度为10～25μM。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述前期培养基中各成分的浓度为：FBS2％～3％、β-巯基乙醇5×10-5mol/L、维生素C磷酸酯钠100μmol/L和β-甘油磷酸钠10mmol/L。
7.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述后期培养基中各成分的浓度为：FBS2％～3％、地塞米松10-8mol/L、维生素C100μmol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L和磷酸二氢钾1.8mmol/L。
8.一种提高间充质干细胞成骨分化效率的方法，其特征在于，利用权利要求5～7任一项所述前期培养基培养间充质干细胞7d后，更换所述后期培养基继续培养11～21d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用所述前期培养基培养过程中更换2次所述前期培养基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用所述后期培养基培养过程中每隔2～3d更换一次所述后期培养基。
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