KR102635212B1 - 중간엽 줄기 세포를 위한 세포 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 우태아혈청 무함유 세포 배양 동안 세포 증식을 촉진하는 방법, 세포 배양 배지 및 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS) 무함유(free) 세포 배양 동안 줄기 세포 증식을 촉진하는 방법, 세포 배양 배지 및 조성물에 관한 것이다.
다능성 중간엽 줄기 세포(MSC)는 그들의 높은 증식 및 분화능 및 면역조절 및 기타 유익한 특성 때문에 치료적 응용을 위한 매력적인 후보로 제안되어 있다(문헌[Caplan AI (2007) J. Cell Physiol., 213, 341-347]; 문헌[Prockop DJ (2007) Clin Pharmacol Ther., 82, 241-243]). 중간엽 줄기 세포(MSC)의 희박한 집단의 생체외 증식은 치료적 응용을 위해 적합한 수의 생성을 위해 종종 필요하다.
MSC의 분리 및 증식을 위해 사용되는 통상의 배지는 그의 높은 함량의 자극성 성장 인자로 인하여 우태아혈청이 보충된 정의된 기본 배지(예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM) 또는 α-변형된 최소 필수 배지(α-MEM))로 이루어져 있다. 이들 배지가 일반적으로 다수의 계대에 있어서 MSC의 증식을 지지하는 것으로 보고되어 있지만, 우태아혈청과 관련된 잠재적인 위험으로 인하여 관심이 제기되었다(문헌[Dimarakis & Levicar (2006) Stem Cells., 24, 1407-1408]; 문헌[Mannello & Tonti (2007) Stem Cells., 25, 1603-1609]). 특히, 우태아혈청은 유해한 오염물질, 예를 들어, 프리온, 바이러스 및 사람동물공통감염 물질을 함유할 수 있으며, 면역 반응을 유도할 수 있다. 더욱이, 불량하게 정의되는 우태아혈청의 성질 및 그의 높은 뱃치-대-뱃치 변이의 정도는 배지의 성장-지지 특성의 불일치를 야기하고, 이에 따라 세포 생성 과정의 표준화를 어렵게 만들 수 있다.
인간 기원 보충물, 예를 들어, 인간 혈청 및 혈소판 용해물은 우태아혈청에 대한 대체물로 연구되어 왔다. 인간 혈청은 일반적으로 그의 이용가능성의 결여 및 일관되지 않은 성장-촉진 능력으로 인하여, 적합한 대체물로 여겨지지 않는다. 인간 혈소판-유래 보충물, 예를 들어, 혈소판 용해물(hPL) 및 혈소판-풍부 혈장은 뛰어난 대체물로서 최근에 제안되었다(문헌[Doucet et al. (2005) J Cell Physiol., 205, 228-236]; 문헌[Muller et al. (2006), Cytotherapy., 8, 437-444]; 문헌[Capelli et al. (2007) Bone Marrow Transplant., 40, 785-91]; 문헌[Lange et al. (2007) J Cell Physiol., 213, 18-26]; 문헌[Reinisch et al. (2007) Regen Med., 2, 371-82]). 이들 연구에 의해, 풀링된 인간 혈소판 유도물질의 상당한 성장-촉진 특성이 입증되었지만, MSC 성장에 대한 그들의 영향은 일관되지 않는다(문헌[Bieback et al. (2008) Transfus Med Hemother., 35, 286-294]). 추가로, 이들 hPL 제형의 고비용은 상업적 세포 배양을 위하여 터무니없을 수 있다.
따라서, 우태아혈청 무함유 세포 배양에서 MSC의 분리 및 신속한 증식 둘 모두를 지지하는 비용 효율적인 방법을 위한 필요가 여전히 충족되지 않고 있다.
본 발명자들은 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor: PDGF)가 우태아혈청 무함유 배양 조건에서 MSC 증식을 위해 필요한 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 섬유아세포 성장 인자 2(fibroblast growth factor 2: FGF2) 및 PDGF가 우태아혈청 무함유 배양 조건에서 MSC 증식을 상승적으로 촉진하는 것을 발견하였다. 놀랍게도, FGF2가 매우 낮은 수준으로 존재하는 경우에 이러한 상승 효과가 유지된다. 따라서, 본 발명자들은 그들이 특정 성장 인자의 조합을 사용하여 우태아혈청 무함유 배양 조건에서 시험관내 줄기 세포 증식을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 이들 관찰에 의해, 본 발명의 방법, 배양 배지 및 조성물이 또한 줄기 세포 배양의 효율을 증가시키기에 적합할 수 있는 적합한, 비용 효율적인 혈청에 대한 대체물을 제공할 수 있음이 뒷받침된다.
따라서, 일례에 있어서, 본 발명은 시험관내 줄기 세포 증식의 촉진 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 PDGF 및 FGF2를 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지에서 중간엽 계통 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다. 다른 예에 있어서, 본 발명은 시험관내 중간엽 계통 전구 세포 증식의 촉진 방법에 관한 것이다. 다른 예에 있어서, 본 발명은 시험관내 중간엽 줄기 세포 증식의 촉진 방법에 관한 것이다.
PDGF, FGF2 및 임의의 다른 배양 배지 구성성분은 본 발명의 방법에 사용하기 위해 줄기 세포 배양 배지에 또는 줄기 세포 배양 배지로의 첨가를 위한 조성물에 제공될 수 있다. 따라서, 다른 예에 있어서, 본 발명은 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지를 제공하며, 당해 세포 배양 배지는,
기본 배지;
혈소판 유래 성장 인자(PDGF);
섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하되;
배양 배지 중 FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다.
다른 예에 있어서, 배양 배지 중 FGF2의 수준은 약 2 pg/㎖ 내지 40 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, 배양 배지 중 FGF2의 수준은 약 20 pg/㎖이다.
다른 예에 있어서, PDGF는 PDGF-BB 또는 PDGF-AB이다. 일례에 있어서, PDGF는 PDGF-BB이다. 다른 예에 있어서, 배양 배지 중 PDGF-BB의 수준은 약 3.0 ng/㎖ 내지 약 120 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, 배양 배지 중 PDGF-BB의 수준은 약 9 ng/㎖ 내지 약 60 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, 배양 배지 중 PDGF-BB의 수준은 적어도 약 30 ng/㎖이다.
또한, 본 발명자들은 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)가 다른 성장 인자와 상승적으로 작용하여, MSC 증식을 촉진시키는 것을 발견하였다. 따라서, 이들 성장 인자는 또한 본 발명의 방법, 세포 배양 배지 및 조성물에 사용될 수 있다. 일례에 있어서, 세포 배양 배지는 상피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF)를 추가로 포함한다. 일례에 있어서, 세포 배양 배지 중 EGF의 수준은 약 0.08 ng/㎖ 내지 약 7 ng/㎖이다. 예를 들어, 세포 배양 배지 중 EGF의 수준은 적어도 약 5 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지 중 EGF의 수준은 약 0.2 ng/㎖ 내지 약 3.2 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지 중 EGF의 수준은 약 0.4 ng/㎖ 내지 약 1.6 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.8 ng/㎖이다.
다른 예에 있어서, 배지는 중간엽 줄기 세포의 배양을 위한 것이다. 다른 예에 있어서, 배지는 중간엽 계통 전구 세포의 배양을 위한 것이다.
일례에 있어서, 기본 배지는 알파-최소 필수 배지 또는 우태아혈청 무함유 증식 배지, 예를 들어, 스템스팬(StemSpan)(상표명)이다.
다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지한다.
다른 예에 있어서, 본 발명은 우태아혈청 무함유 줄기 세포 배양 배지로의 첨가를 위한 조성물에 관한 것이며, 당해 조성물은,
혈소판 유래 성장 인자(PDGF);
섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하되;
FGF2는 약 6 ng/㎖ 미만의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 다른 예에 있어서, FGF2는 약 5 pg/㎖ 내지 40 pg/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 다른 예에 있어서, FGF2는 약 20 pg/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다.
다른 예에 있어서, 조성물 중 PDGF는 PDGF-BB 또는 PDGF-AB이다. 일례에 있어서, 조성물 중 PDGF는 PDGF-BB이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB는 약 7.5 ng/㎖ 내지 약 120 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB는 약 15 ng/㎖ 내지 약 60 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB는 적어도 약 30 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다.
다른 예에 있어서, 세포 조성물은 상피 성장 인자(EGF)를 추가로 포함한다. 일례에 있어서, EGF는 약 0.1 ng/㎖ 내지 약 7 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 예를 들어, EGF는 약 5 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재할 수 있다. 일례에 있어서, EGF는 약 0.2 ng/㎖ 내지 약 3.2 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 다른 예에 있어서, EGF는 약 0.4 ng/㎖ 내지 약 1.6 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다. 다른 예에 있어서, EGF는 적어도 약 0.8 ng/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 조성물에 존재한다.
다른 예에 있어서, 조성물은 중간엽 계통 전구 세포의 배양에 적합한 배지에 첨가된다. 다른 예에 있어서, 조성물은 중간엽 줄기 세포의 배양에 적합한 배지에 첨가된다. 다른 예에 있어서, 조성물은 중간엽 계통 전구 세포의 배양에 적합한 배지에 첨가된다.
다른 예에 있어서, 조성물은 알파-최소 필수 배지 또는 우태아혈청 무함유 증식 배지, 예를 들어, 스템스팬(상표명)에 첨가된다.
도 1: MPC 증식에서의 혈소판 용해물 백분율의 효과.
도 2: MPC 증식에서의 성장 인자의 항체 중화의 효과.
도 3: MPC 증식에서의 성장 인자의 조합된 항체 중화의 효과.
도 4: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 이글 알파(Eagles Alpha) MEM을 사용한 조직 배양 플라스틱에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 5: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 이글 알파 MEM을 사용한 피브로넥틴에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 6: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 이글 알파 MEM을 사용한 3% hPL에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 7: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 스템스팬(상표명)을 사용한 조직 배양 플라스틱에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 8: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 스템스팬(상표명)을 사용한 피브로넥틴에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 9: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 스템스팬(상표명)을 사용한 3% hPL에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 10: PDGF(P), FGF(F), EGF(E) 또는 그들의 조합(PEF)을 포함하는 배지에서의 세포 증식.
도 11: 세포 증식 후의 세포 배양 배지 중 사이토카인 수준.
도 2: MPC 증식에서의 성장 인자의 항체 중화의 효과.
도 3: MPC 증식에서의 성장 인자의 조합된 항체 중화의 효과.
도 4: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 이글 알파(Eagles Alpha) MEM을 사용한 조직 배양 플라스틱에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 5: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 이글 알파 MEM을 사용한 피브로넥틴에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 6: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 이글 알파 MEM을 사용한 3% hPL에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 7: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 스템스팬(상표명)을 사용한 조직 배양 플라스틱에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 8: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 스템스팬(상표명)을 사용한 피브로넥틴에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 9: 다양한 농도의 PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 보충된 스템스팬(상표명)을 사용한 3% hPL에서의 세포 배양 후의 MPC 증식.
도 10: PDGF(P), FGF(F), EGF(E) 또는 그들의 조합(PEF)을 포함하는 배지에서의 세포 증식.
도 11: 세포 증식 후의 세포 배양 배지 중 사이토카인 수준.
일반 기술 및 정의
특별히 달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 해당 분야(예를 들어, 세포 배양, 분자 생물학, 줄기 세포 배양, 단백질 화학 및 생화학에서)의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 받아들여야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용되는 세포 배양 기법 및 분석법은 해당 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 표준 절차이다. 이러한 기법은 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], 문헌[T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], 문헌[D.M. Glover and B.D. Hames (editors), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 개정판이 포함됨)], 문헌[Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)] 및 문헌[J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 모든 개정판이 포함됨)]과 같은 출처의 문헌을 통해 기술되고 설명되어 있다.
용어 "및/또는" 예를 들어 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 의미 둘 다 또는 의미 중 어느 하나에 대한 분명한 지지를 제공하는 것으로 받아들여야 한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약"은, 반대로 언급되지 않은 한, 지정된 값의 +/-10%, 더 바람직하게는 +/-5%를 의미한다.
용어 "수준"은 본 발명의 세포 배양 배지 및 조성물에 존재하는 특정 물질의 양을 정의하기 위하여 사용된다. 예를 들어, 특정 농도, 중량, 백분율(예를 들어, v/v%) 또는 비를 사용하여 특정 물질의 수준을 정의할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "충분한"은 줄기 세포 배양 배지 중에 용해되는 경우 특정 농도를 제공하는 양을 정의하기 위해 사용된다. "충분한 양"은 필요한 배양 배지의 부피에 의해 좌우된다. 예를 들어, 줄기 세포 배양 배지 중 필요한 FGF2의 농도가 약 10 pg/㎖이고, 500㎖의 세포 배양 배지가 필요하다면, 충분한 양은 약 5 ng일 것이다.
본 명세서에 걸쳐, 단어 "포함한다" 또는 변형어, 예컨대 "포함" 또는 "포함하는"은, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것이 아니라, 기재된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 포함하는 것을 시사하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않은 한 또는 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹의 언급은 하나 및 복수(즉, 하나 이상)의 그들 단계, 물질의 조성물, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물의 그룹을 포함하는 것으로 받아들여야 한다.
당해 분야의 숙련자는 본 명세서에 기재된 본 발명이 구체적으로 기재된 것들 이외로 변경 및 변형되기 쉬운 것을 이해할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변경 및 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집합적으로, 본 명세서에서 언급되거나 표기된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 2개 이상의 상기 단계 또는 특징을 또한 포함한다.
본 발명은 오직 예시의 목적을 위해 의도되는 본원에 기재된 구체적인 실시형태에 의해 범주가 제한되지 않는다. 기능상 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백하게 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위 이내이다.
본원에 개시된 임의의 예는, 달리 구체적으로 언급되지 않은 한, 임의의 다른 예에 필요 부분만 수정하여 적용되는 것으로 받아들여야 한다.
중간엽
계통 전구 세포
본원에 사용되는 용어 "중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포"는 다능성을 유지하면서 자가 재생 능력을 가지며, 중간엽 기원, 예를 들어, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 기질 세포, 섬유아세포 및 힘줄, 또는 비-중간엽 기원, 예를 들어, 간세포, 신경 세포 및 상피 세포 중 어느 하나의 다수의 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는 미분화 다능성 세포를 지칭한다. 의혹을 피하기 위하여, "중간엽 계통 전구 세포"는 중간엽 세포, 예를 들어, 골, 연골, 근육 및 지방 세포 및 섬유성 연결 조직으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다.
용어 "중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포"는 모 세포 및 그들의 미분화 자손 둘 모두를 포함한다. 또한, 상기 용어는 중간엽 전구 세포, 다능성 기질 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 혈관주위 중간엽 전구 세포 및 그들의 미분화 자손을 포함한다.
중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 자가, 이종, 동계(syngenic) 또는 동질유전자(isogenic)일 수 있다. 자가 세포는 그들이 재이식될 동일한 개체로부터 분리된다. 동종이계 세포는 동일한 종의 공여자로부터 분리된다. 이종 세포는 다른 종의 공여자로부터 분리된다. 동계 또는 동질유전자 세포는 유전적으로 동일한 유기체, 예를 들어, 쌍둥이, 클론 또는 고도의 동계교배(inbred) 연구 동물 모델로부터 분리된다.
중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 주로 골수에 존재하지만, 또한 예를 들어, 제대혈 및 탯줄, 성인 말초 혈액, 지방 조직, 소주골 및 치수를 포함하는 다양한 숙주 조직에 존재하는 것으로 나타났다.
일례에 있어서, 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 STRO-1+ 중간엽 전구 세포이다. 본원에 사용되는 어구 "STRO-1+ 다능성 세포"는 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있는 STRO-1+ 및/또는 TNAP+ 선조 세포를 의미하는 것으로 받아들여야 한다.
STRO-1+ 다능성 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모공, 장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 힘줄, 골격근, 진피 및 골막에서 관찰되는 세포이며; 생식 계열, 예를 들어, 중배엽 및/또는 내배엽 및/또는 외배엽으로 분화할 수 있다. 따라서, STRO-1+ 다능성 세포는 비제한적으로 지방, 골, 연골, 탄성, 근육 및 섬유성 연결 조직을 포함하는 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. 이들 세포가 진입하는 특정한 계통-수임 및 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생물활성 인자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립되는 국소 미세환경 조건으로부터의 다양한 영향에 의해 달라진다.
중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 숙주 조직으로부터 분리될 수 있으며, STRO-1+ 세포의 선택에 의해 농축될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 골수 흡인물을 STRO-1 또는 TNAP에 대한 항체로 추가로 처리하여, 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포의 선택을 가능하게 할 수 있다. 일례에 있어서, 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 문헌(Simmons & Torok-Storb, 1991)에 기재된 STRO-1 항체를 사용함으로써 농축될 수 있다.
용어 "농축된", "농축" 또는 그의 변이형은 미처리 세포의 집단(예를 들어, 그들의 고유 환경에서의 세포)과 비교하는 경우, 하나의 특정 세포 유형의 비 또는 다수의 특정 세포 유형의 비가 증가되는 세포의 집단을 설명하기 위하여 본원에 사용된다. 일례에 있어서, STRO-1+ 세포에 대하여 농축된 집단은 적어도 약 0.1% 또는 0.5% 또는 1% 또는 2% 또는 5% 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75%의 STRO-1+ 세포를 포함한다. 이와 관련하여, 용어 "STRO-1+ 세포에 대하여 농축된 세포의 집단"은 용어 "X%의 STRO-1+ 세포를 포함하는 세포의 집단"에 대한 분명한 지지를 제공하기 위하여 받아들여질 것이며, 여기서 X%는 본 명세서에서 언급된 바와 같은 백분율이다. STRO-1+ 세포는 몇몇 예에서 클론형성 콜로니를 형성할 수 있고, 예를 들어 CFU-F(섬유아세포) 또는 그의 하위세트(예를 들어, 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95%)는 이러한 활성을 가질 수 있다.
일례에 있어서, 세포의 집단은 선택 가능한 형태로 STRO-1+ 세포를 포함하는 세포 제제로부터 농축된다. 이와 관련하여, 용어 "선택 가능한 형태"는 세포가 STRO-1+ 세포의 선택을 허용하는 마커(예를 들어, 세포 표면 마커)를 발현하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 마커는 STRO-1일 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 예를 들어, STRO-2 및/또는 STRO-3(TNAP) 및/또는 STRO-4 및/또는 VCAM-1 및/또는 CD146 및/또는 3G5를 발현하는 세포(예를 들어, 중간엽 전구 세포)는 또한 STRO-1을 발현한다(그리고 STRO-1 bright일 수 있다). 따라서, 세포가 STRO-1+이라는 표시는 세포가 STRO-1 발현에 의해 선택되는 것을 의미하지 않는다. 일례에 있어서, 세포는 적어도 STRO-3 발현에 기초하여 선택되고, 예를 들어 그들은 STRO-3+(TNAP+)이다.
세포 또는 그의 집단의 선택의 언급은 반드시 특정 조직 공급원으로부터의 선택을 요하지 않는다. 본원에 기재된 바와 같이, STRO-1+ 세포는 매우 다양한 공급원으로부터 선택되거나 분리되거나 농축될 수 있다. 그렇긴 하지만, 몇몇 예에서, 이들 용어는 STRO-1+ 세포(예를 들어, 중간엽 전구 세포)를 포함하는 임의의 조직, 또는 혈관화 조직, 또는 혈관주위세포(예를 들어, STRO-1+ 혈관주위세포)를 포함하는 조직, 또는 본원에 열거된 임의의 하나 이상의 조직으로부터의 선택을 위한 지지를 제공한다.
일례에 있어서, 본 발명에서 사용되는 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+(HSP-90β), CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 그들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 또는 집합적으로 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
용어 "개별적으로"의 사용은 본 발명이 별개로 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 포함하고, 개별 마커 또는 마커의 그룹이 본원에 별개로 기재되지 않을 수 있더라도, 첨부된 청구범위는 각각으로부터 별개로 그리고 분할하여 이러한 마커 또는 마커의 그룹을 한정할 수 있는 것을 의미한다.
용어 "집합적으로"의 사용은 본 발명이 임의의 수 또는 조합의 언급된 마커 또는 마커의 그룹을 포함하고, 이러한 수 또는 조합의 마커 또는 마커의 그룹이 본원에서 구체적으로 기재되지 않을 수 있더라도, 첨부된 청구범위는 마커 또는 마커의 그룹의 임의의 다른 조합으로부터 별개로 그리고 분할하여 이러한 조합 또는 하위조합을 한정할 수 있는 것을 의미한다.
일례에 있어서, STRO-1+ 세포는 STRO-1bright(동의어 STRO-1bri)이다. 다른 예에 있어서, STRO-1bri 세포는 STRO-1dim 또는 STRO-1intermediate 세포에 비하여 우선적으로 농축된다. 다른 예에 있어서, STRO-1bri 세포는 추가로 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+(HSP-90β) 및/또는 CD146+ 중 하나 이상이다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 상기 마커에 대하여 선택되고/거나, 하나 이상의 상기 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 마커를 발현하는 것으로 나타난 세포를 특별히 시험할 필요가 없고, 오히려 이전에 농축되거나 분리된 세포를 시험하고, 후속하여 사용할 수 있거나, 분리되거나 농축된 세포를 또한 동일한 마커를 발현하는 것으로 합리적으로 추정할 수 있다.
일례에 있어서, 중간엽 전구 세포는 혈관주위 마커 3G5의 존재를 특징으로 하는 WO 2004/85630호에 정의된 바와 같은 혈관주위 중간엽 전구 세포이다.
주어진 마커에 대하여 "양성"이라고 지칭되는 세포는 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 수준의 마커를 발현할 수 있으며, 여기서 상기 용어는 세포의 분류 과정에서 사용되는 형광 또는 다른 마커의 세기에 관한 것이다. lo(또는 dim 또는 dull)와 bri의 차이는 분류되는 특정한 세포 집단에서 사용되는 마커의 맥락에서 이해될 것이다. 주어진 마커에 대해 "음성"인 것으로 지칭되는 세포는 반드시 그 세포로부터 완전히 부재하지는 않는다. 이 용어는 마커가 그 세포에 의해 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되고, 그것이 검출 가능하게 표지되는 경우 매우 낮은 신호를 생성하거나, 백그라운드 수준, 예를 들어 아이소타입 대조군 항체를 사용하여 검출되는 수준을 초과하여 검출 가능하지 않다는 것을 의미하다.
본원에 사용되는 용어 "bright" 또는 "bri"는 검출 가능하게 표지되는 경우 비교적 높은 신호를 생성하는 세포 표면상의 마커를 지칭한다. 이론에 구속되고자 하지 않으면서, "bright" 세포가 시료에서의 다른 세포보다 더 많은 표적 마커 단백질(예를 들어, STRO-1에 의해 인식되는 항원)을 발현한다는 것을 제안한다. 예를 들면, STRO-1bri 세포는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting: FACS) 분석에 의해 결정되는 바와 같이 FITC-컨쥬게이트된 STRO-1 항체로 표지되는 경우 비-bright 세포(STRO-1dull /dim)보다 더 높은 형광 신호를 생성한다. 일례에 있어서, "bright" 세포는 시작 시료에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포의 적어도 약 0.1%를 구성한다. 다른 예에 있어서, "bright" 세포는 시작 시료에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포의 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5% 또는 적어도 약 2%를 구성한다. 일례에 있어서, STRO-1bright 세포는 "백그라운드", 즉 STRO-1-인 세포에 비해 STRO-1 표면 발현의 2 log 더 높은 크기의 발현을 가진다. 그에 비해, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현의 2 log 미만으로 더 높은 크기의 발현, 통상적으로 약 1 log 또는 "백그라운드" 미만을 가진다.
본원에 사용되는 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타제의 모든 아이소형을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 상기 용어는 간 아이소형(LAP), 골 아이소형(BAP) 및 신장 아이소형(KAP)을 포함한다. 일례에 있어서, TNAP는 BAP이다. 일례에 있어서, 본원에 사용되는 TNAP는 수탁 번호 PTA-7282하에 부다페스트 조약의 조항하에 2005년 12월 19일에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.
추가로, 일례에 있어서, STRO-1+ 세포는 클론원성 CFU-F를 초래할 수 있다.
일례에 있어서, 유의미한 비의 STRO-1+ 다능성 세포는 적어도 2개의 상이한 생식 계열로 분화할 수 있다. 다능성 세포가 수임될 수 있는 계통의 비제한적인 예에는 골 전구 세포; 담관 상피 세포 및 간세포에 다능성인 간세포 선구체; 희소돌기교세포 및 성상세포로 진행하는 신경교세포 전구체를 생성할 수 있는 신경 제한 세포; 뉴런으로 진행하는 뉴런 전구체; 심장 근육 및 심근세포에 대한 전구체, 포도당-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주가 포함된다. 다른 계통에는 상아아세포, 상아질 생성 세포 및 연골세포, 및 하기의 전구 세포가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다: 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 피부 세포, 예컨대 각질세포, 수지상 세포, 모공 세포, 신장관 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 선조체, 혈관 내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 기질, 심장 근육, 평활근, 골격근, 혈관주위세포, 혈관, 상피, 신경교, 뉴런, 성상세포 및 희소돌기교세포.
본 발명의 일 양태에 있어서, 본 발명에 기재되는 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 MSC이다. MSC는 균질한 조성물이거나, MSC가 풍부한 혼합된 세포 집단일 수 있다. 균질한 MSC 세포 조성물은 유착 골수 또는 골막 세포를 배양함으로써 얻어질 수 있고, MSC는 독특한 모노클로널 항체로 확인된 특정 세포 표면 마커에 의해 확인될 수 있다. MSC가 풍부한 세포 집단을 수득하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,486,359호에 기재되어 있다. MSC를 위한 대안적인 공급원에는 혈액, 피부, 제대혈, 근육, 지방, 골 및 연골막이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 예에 있어서, 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 CD29+, CD54+, CD73+, CD90+, CD102+, CD105+, CD106+, CD166+, MHC1+ MSC(예를 들면 레메스템셀(remestemcel)-L)이다.
분리되거나 또는 농축된 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 배양에 의해 시험관 내에서 증식될 수 있다. 분리되거나 또는 농축된 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 동결보존되고, 해동되고, 이후에 배양에 의해 시험관 내에서 증식될 수 있다.
일례에 있어서, 분리되거나 또는 농축된 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포를 배양 배지(무혈청 또는 혈청-보충), 예를 들면 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서 50,000개의 생존가능한 세포/㎠로 씨딩하고, 37℃, 20% O2에서 밤새 배양 용기에 부착되게 한다. 배양 배지를 이후 교체하고/거나 필요한 바와 같이 변경하고, 세포를 37℃, 5% O2에서 추가로 68 내지 72시간 동안 배양한다.
해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 배양된 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 생체 내 세포와 표현형이 상이하다. 예를 들면, 일 실시형태에 있어서, 그들은 하기 마커 CD44, NG2, DC146 및 CD140b 중 하나 이상을 발현한다. 배양된 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 또한 생체 내 세포와 생물학적으로 상이하고, 대개 생체 내에서 비-순환(휴지기) 세포와 비교하여 더 높은 증식 속도를 가진다.
본 발명의 방법을 사용하여 배양되는 중간엽 계통 전구 또는 줄기 세포는 또한 동결보존될 수 있다.
세포 증식의 촉진
본 발명의 일 양태는 시험관내 세포 배양에서의 줄기 세포 증식의 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "촉진시킨다" 또는 "촉진하는"은 세포 증식의 증가 또는 가속화를 정의하기 위해 사용된다.
증가되고/거나 가속화된 세포 증식의 다양한 확인 방법은 해당 분야의 숙련자에게 이용가능하다. 예를 들어, 세포 증식의 증가 또는 가속화는 예를 들어, 일상적으로 이용가능한 세포 증식 분석법, 예를 들어, MTT 분석법, 브로모데옥시우리딘(BrdU) 혼입 분석법 또는 실시간 증식 분석법, 예를 들어, 로슈(Roch) 사의 xCELLigence(상표명) 시스템을 사용하여 시간에 걸쳐 생성되는 세포의 수에 기초하여 측정될 수 있다.
따라서, 해당 분야의 숙련자는 해당 분야에 알려져 있는 일상적인 증식 분석법을 수행함으로써 본 발명의 방법을 사용하여 세포 증식이 촉진되는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다.
세포 증식이 촉진되는지 여부의 확인의 일례에 있어서, 세포의 집단을 본 발명에 따른 세포 배양 배지 또는 PDGF 및 FGF2가 존재하지 않는 동등한 대조군 배지(즉, 0 pg/㎖의 PDGF 및 FGF2가 있는 본 발명의 배지)에서 배양할 수 있다. 각 배양 배지에서의 세포 증식을 매일, 배양 중에 소정의 기간(예를 들어, 7일)에 걸쳐 평가하거나, 실시간으로 추적할 수 있다. 제0일과 제7일 사이의 증가된 세포 수 또는 가속화된 세포 증식은 세포 증식이 촉진된 것을 나타낸다.
세포 유도의 촉진
줄기 세포는 비대칭적으로 분열하여 2개의 별개의 딸 세포를 야기한다: 하나의 카피의 원래의 줄기 세포 및 비-줄기 세포 운명으로 분화하도록 예정된 제2 딸 세포. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 분열하여, 하나의 카피의 원래의 줄기 세포 및 중간엽 세포 유형으로 분화하도록 예정된 중간엽 계통 전구 세포를 생성할 수 있다.
본 발명은 또한, 시험관내 세포 배양에서의 줄기 세포 유도의 촉진 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 만능 줄기 세포로부터 중간엽 계통 전구 세포의 유도를 촉진시킬 수 있다. 세포 유도의 촉진의 맥락에서, 용어 "촉진한다" 또는 "촉진하는"은 줄기 세포 유도의 증가 또는 가속화를 정의하기 위해 사용된다.
본 발명의 일 양태는 시험관내 줄기 세포 유도의 촉진 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 줄기 세포의 집단을 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다.
예를 들어, 본 발명의 방법은 시험관내 중간엽 계통 줄기 세포 유도의 촉진 방법에 관한 것이며, 당해 방법은 만능 줄기 세포의 집단을 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다.
다른 예에 있어서, 본 발명의 방법을 사용하여 만능 줄기 세포로부터 중간엽 계통 전구 세포 유도를 촉진시키고, 후속하여 유도되는 중간엽 계통 전구 세포 집단의 증식을 촉진시킬 수 있다.
증가되고/거나 가속화된 줄기 세포 유도의 다양한 확인 방법은 해당 분야의 숙련자에게 이용가능하다. 예를 들어, 증가되거나 가속화된 중간엽 계통 전구 세포 유도를 시간이 지남에 따라 만능 줄기 세포로부터 생성되는 중간엽 계통 전구 세포의 수에 기초하여 측정할 수 있다. 중간엽 계통 전구 세포는 특정 표면 마커를 특징으로 하며, 그의 발현은 그들의 분리 및 면역선택에 의한 정제를 용이하게 한다. 이들 마커의 예에는 STRO-1+, TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+(HSP-90β), CD146+, 3G5+ 또는 그들의 조합이 포함된다. 따라서, 해당 분야의 숙련자는 면역선택을 이용하여, 집단에서 중간엽 계통 전구 세포를 정제하고 계수할 수 있다. 세포 수를 사용하여, 시간이 지남에 따라 생성되는 중간엽 계통 전구 세포의 수를 확인하고, 중간엽 계통 전구 세포 유도가 증가되거나 가속화되는지 여부를 결정할 수 있다.
세포 유도가 촉진되는지 여부의 결정의 다른 예에 있어서, 만능 줄기 세포의 집단을 본 발명에 따른 세포 배양 배지 또는 PDGF 및 FGF2가 존재하지 않는 동등한 대조군 배지(즉, 0 pg/㎖의 PDGF 및 FGF2가 있는 본 발명의 배지)에서 배양할 수 있다. 각 배양 배지에서 중간엽 계통 전구 세포의 유도를 세포 배양으로부터 중간엽 계통 전구 세포를 면역선택하고, 생성되는 세포의 수를 결정함으로써 배양 중 소정의 기간(예를 들어, 7일)에 걸쳐 또는 매일 평가할 수 있다. 대조군 세포 수에 비한 제0일과 제7일 사이의 증가된 중간엽 계통 전구 세포 수는 세포 유도가 촉진되었음을 나타낸다.
세포 배양 배지
본 발명은 MSC 증식을 촉진시키는 성장 인자를 포함하는 우태아혈청 무함유 줄기 세포 배양 배지를 제공한다. 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 우태아혈청 무함유 줄기 세포 배양 배지에 관한 것이며, 세포 배양 배지는
기본 배지;
혈소판 유래 성장 인자(PDGF);
섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "배지" 또는 "배지들"은 세포 주변의 환경의 구성성분을 포함한다. 배지는 세포가 성장되게 하기에 적합한 조건에 기여하고/하거나 이를 제공한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지, 및 세포 성장을 지속시키지 않는 액체 배지를 포함할 수 있다. 배지는 또한 젤라틴성 배지, 예컨대 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 예시적인 기체 배지는 페트리 접시에서 성장하는 세포 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체가 노출되는 기체 상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한 그것이 아직 세포와 접촉하지 않았더라도 세포 배양에서 사용되도록 의도되는 물질을 지칭한다.
본 발명의 배양 배지는 기본 배양 배지를 사용함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "기본 배양 배지"는 세포, 예를 들어, MSC로의 노출에 적합한 비보충된 배지를 지칭한다. 기본 배양 배지에는 예를 들어, 이글 최소 필수(MEM) 배양 배지, 알파 변형된 MEM 배양 배지, 스템스팬(상표명) 및 그의 혼합된 배양 배지가 포함되며, 그것이 줄기 세포의 배양에 사용될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
추가로, 본 발명의 세포 배양 배지는 임의의 구성성분, 예컨대 지방산 또는 지질, 비타민, 사이토카인, 항산화제, 완충제, 무기염 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 세포 배양 배지는 모든 필수 아미노산을 함유하고, 비필수 아미노산을 또한 함유할 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 필수 아미노산(Thr, Met, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Lys, His) 및 비-필수 아미노산(Gly, Ala, Ser, Cys, Gln, Asn, Asp, Tyr, Arg, Pro)으로 분류된다.
해당 분야의 숙련자는 최적의 결과를 위하여, 기본 배지가 세포 증식을 증진시키기에 적당한 수준으로 이용가능한 주요 영양소와 함께, 관심 세포주에 적절해야 하는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 에너지원이 고갈되고 이에 따라 세포 증식을 제한하는 것으로 관찰된다면, 기본 배지에서 글루코스(또는 다른 에너지원)의 수준을 증가시키거나, 배양 과정 동안 글루코스(또는 다른 에너지원)를 첨가하는 것이 필요할 수 있다.
일례에 있어서, 본 발명의 세포 배양 배지는 인간 유래 첨가제를 함유한다. 예를 들어, 인간 혈청 및 인간 혈소판 세포 용해물을 본 발명의 방법에 사용되는 세포 배양 배지에 첨가할 수 있다.
일례에 있어서, 본 발명의 세포 배양 배지는 오직 인간 유래의 첨가제만을 함유한다. 따라서, 일례에 있어서, 세포 배양 배지는 이종-무함유(xeno-free)이다.
아스코르브산
아스코르브산은 배양에서 다양한 종류의 세포의 성장 및 분화를 위한 필수 보충제이다. 특정 아스코르브산 유도체는 특히 중성 pH 및 37℃의 일반 세포 배양 조건하에 용액 중에 안정하지 않으므로 "단기 작용성"인 것이 이제 이해된다. 이들 단기 작용성 유도체는 옥살산 또는 트레온산으로 신속히 산화된다. 37℃에서의 배양 배지(pH 7)에서, 산화는 이들 단기 작용성 아스코르브산 유도체의 수준을 24시간에 대략 80 내지 90% 감소시킨다. 따라서, 단기 작용성 아스코르브산 유도체는 다양한 세포 유형의 통상적인 세포 배양에서 더 안정한 "장기 작용성" 아스코르브산 유도체로 대체된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "단기 작용성"은 중성 pH 및 37℃의 배양 조건하에 24시간의 세포 배양 후 대략 80 내지 90%로 산화되는 아스코르브산 유도체를 포함한다. 일례에 있어서, 단기 작용성 L-아스코르브산 유도체는 L-아스코르브산 염이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, L-아스코르브산 나트륨염은 "단기 작용성" 아스코르브산 유도체이다.
대조적으로, 용어 "장기 작용성"은 중성 pH 및 37℃의 배양 조건하에 24시간의 세포 배양 후 대략 80 내지 90%로 산화되지 않는 아스코르브산 유도체를 포함한다. 일례에 있어서, 본 발명의 맥락에서, L-아스코르브산-2-포스페이트는 "장기 작용성" 아스코르브산 유도체이다. 장기 작용성 아스코르브산 유도체의 다른 예에는 테트라헥실데실 아스코르베이트 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 및 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산이 포함된다. 본 발명의 세포 배양 배지는 단기 작용성 아스코르브산 유도체, 장기 작용성 아스코르브산 유도체 또는 그들의 혼합물을 함유할 수 있다.
혈청
통상적으로, 줄기 세포는 적어도 약 10 내지 15 v/v%의 혈청, 일반적으로 송아지 태아 혈청(FCS)으로도 알려져 있는 우태아혈청(FBS)이 보충된 배지를 사용하여 세포 배양에서 유지된다. 본 발명의 세포 배양 배지는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지이다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 세포 배양 배지는 비-태아 혈청이 보충된다. 예를 들어, 배양 배지는 신생아 또는 성인 혈청이 보충될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 세포 배양 배지는 인간 혈청이 보충된다. 일례에 있어서, 세포 배양 배지는 인간 비-태아 혈청이 보충될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1 v/v%, 적어도 약 2 v/v%, 적어도 약 3 v/v%, 적어도 약 4 v/v%, 적어도 약 5 v/v%, 적어도 약 6 v/v%, 적어도 약 7 v/v%, 적어도 약 8 v/v%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25 v/v%의 인간 비-태아 혈청이 보충될 수 있다.
다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 인간 신생아 혈청이 보충될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1 v/v%, 적어도 약 2 v/v%, 적어도 약 3 v/v%, 적어도 약 4 v/v%, 적어도 약 5 v/v%, 적어도 약 6 v/v%, 적어도 약 7 v/v%, 적어도 약 8 v/v%, 적어도 약 9 v/v%의 인간 신생아 혈청이 보충될 수 있다. 일례에 있어서, 인간 신생아 혈청은 제대혈 "탯줄 혈액"으로부터 수득된다.
다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 인간 성인 혈청이 보충될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지는 적어도 약 1 v/v%, 적어도 약 2 v/v%, 적어도 약 3 v/v%, 적어도 약 4 v/v%, 적어도 약 5 v/v%, 적어도 약 6 v/v%, 적어도 약 7 v/v%, 적어도 약 8 v/v%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23%, 적어도 약 24%, 적어도 약 25 v/v%의 인간 성인 혈청이 보충될 수 있다.
일례에 있어서, 인간 성인 혈청은 인간 AB 혈청이다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1 v/v%, 적어도 약 2 v/v%, 적어도 약 3 v/v%, 적어도 약 4 v/v%, 적어도 약 5 v/v%, 적어도 약 6 v/v%, 적어도 약 7 v/v%, 적어도 약 8 v/v%, 적어도 약 9 v/v%의 인간 AB 혈청이 보충될 수 있다. 일례에 있어서, 세포 배양 배지는 적어도 약 3%의 인간 AB 혈청이 보충된다.
본 발명의 세포 배양 배지는 또한 알려져 있는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들어, 알부민(예를 들어, 지질-풍부 알부민), 트랜스페린, 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올 또는 3'-티올 글리세롤, 혈소판 용해물, 혈소판-풍부 혈장 또는 혈청 등가물을 적절하게 함유하는 것들일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들어, 국제 공개 WO 93/30679호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 구매가능한 제품도 또한 사용될 수 있다.
분열촉진 인자
본 발명자들은 PDGF 및 FGF2가 시험관내 우태아혈청 무함유 세포 배양에서 줄기 세포 증식을 상승적으로 촉진하는 것을 발견하였다.
PDGF는 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR)에 결합하는 세포 성장 및 분열의 조절제이다. 화학 용어에서, PDGF는 2개의 A(-AA) 또는 2개의 B(-BB) 사슬 또는 둘(-AB)의 조합으로 이루어진 이량체 당단백질이다. PDGF-AB는 PDGF 알파 및 베타 수용체 서브유닛에 결합하여, PDGF 알파 베타 및 알파 알파 수용체 이량체를 형성하는 것으로 보인다. 본 발명의 맥락에서, PDGF는 PDGF-BB 및 PDGF-AB를 포함한다.
BFGF, FGFB, HBGF-2로도 알려져 있는 기본 섬유아세포 성장 인자(FGF2)는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 과의 구성원이다. 또한, FGF2는 세포 성장 및 분열의 조절제이다. PDGF 및 FGF2는 둘 모두 그들이 세포가 세포 분열을 시작하도록 조장한다는 점에서 미토겐(mitogen)으로 분류될 수 있다.
일례에 있어서, 본 발명의 방법은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서, FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다. 예를 들어, FGF2 수준은 약 5 ng/㎖ 미만, 약 4 ng/㎖ 미만, 약 3 ng/㎖ 미만, 약 2 ng/㎖ 미만, 약 1 ng/㎖ 미만일 수 있다. 다른 예에 있어서, FGF2 수준은 약 0.9 ng/㎖ 미만, 약 0.8 ng/㎖ 미만, 약 0.7 ng/㎖ 미만, 약 0.6 ng/㎖ 미만, 약 0.5 ng/㎖ 미만, 약 0.4 ng/㎖ 미만, 약 0.3 ng/㎖ 미만, 약 0.2 ng/㎖ 미만이다.
다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 약 1 pg/㎖ 내지 100 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 약 5 pg/㎖ 내지 80 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 약 10 pg/㎖ 내지 40 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 10 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 11 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 12 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 13 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 14 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 15 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 16 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 17 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 18 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 19 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 20 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 21 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 22 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 23 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 24 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 25 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 26 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 27 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 28 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 29 pg/㎖이다. 다른 예에 있어서, FGF2의 수준은 적어도 약 30 pg/㎖이다.
일례에 있어서, PDGF는 PDGF-BB이다. 일례에 있어서, PDGF-BB의 수준은 약 1 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 약 7.5 ng/㎖ 내지 120 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 약 15 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 10 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 15 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 20 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 21 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 22 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 23 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 24 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 25 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 26 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 27 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 28 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 29 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 30 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 31 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 32 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 33 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 34 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 35 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 36 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 37 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 38 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 39 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 40 ng/㎖이다.
다른 예에 있어서, PDGF는 PDGF-AB이다. 일례에 있어서, PDGF-AB의 수준은 약 1 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 약 7.5 ng/㎖ 내지 120 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 약 15 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 10 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 15 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 20 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 21 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 22 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 23 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 24 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 25 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 26 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 27 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 28 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 29 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 30 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 31 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 32 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 33 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 34 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 35 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 36 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 37 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 38 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 39 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB의 수준은 적어도 약 40 ng/㎖이다.
본 발명자들은 또한, 다른 인자를 본 발명의 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 증식을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 일례에 있어서, 본 발명의 방법은 EGF를 추가로 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지에서 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계를 포함한다. EGF는 그의 수용체 EGFR로의 결합에 의해 세포 증식을 자극하는 성장 인자이다. 일례에 있어서, 본 발명의 방법은 줄기 세포의 집단을 EGF를 추가로 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일례에 있어서, EGF의 수준은 약 0.1 내지 7 ng/㎖이다. 예를 들어, EGF의 수준은 적어도 약 5 ng/㎖일 수 있다.
다른 예에 있어서, EGF의 수준은 약 0.2 ng/㎖ 내지 3.2 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 약 0.4 ng/㎖ 내지 1.6 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 약 0.2 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.3 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.4 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.5 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.6 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.7 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.8 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 0.9 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 1.0 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 1.1 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 1.2 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 1.3 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, EGF의 수준은 적어도 약 1.4 ng/㎖이다.
일례에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 3.2 ng/㎖이고, EGF의 수준은 적어도 약 0.8 ng/㎖이고, FGF2의 수준은 적어도 약 0.002 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 9.6 ng/㎖이고, EGF의 수준은 적어도 약 0.24 ng/㎖이고, FGF2의 수준은 적어도 약 0.006 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 16 ng/㎖이고, EGF의 수준은 적어도 약 0.40 ng/㎖이고, FGF2의 수준은 적어도 약 0.01 ng/㎖이다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB의 수준은 적어도 약 32 ng/㎖이고, EGF의 수준은 적어도 약 0.80 ng/㎖이고, FGF2의 수준은 적어도 약 0.01 ng/㎖이다.
본 발명은 또한, PDGF 및 FGF2를 포함하는 세포 배양 배지를 포함하며, 여기서, FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다. 예를 들어, FGF2 수준은 약 5 ng/㎖ 미만, 약 4 ng/㎖ 미만, 약 3 ng/㎖ 미만, 약 2 ng/㎖ 미만, 약 1 ng/㎖ 미만일 수 있다. 다른 예에 있어서, FGF2 수준은 약 0.9 ng/㎖ 미만, 약 0.8 ng/㎖ 미만, 약 0.7 ng/㎖ 미만, 약 0.6 ng/㎖ 미만, 약 0.5 ng/㎖ 미만, 약 0.4 ng/㎖ 미만, 약 0.3 ng/㎖ 미만, 약 0.2 ng/㎖ 미만이다.
일례에 있어서, 세포 배양 배지는 약 1 pg/㎖ 내지 100 pg/㎖의 FGF2를 함유한다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 5 pg/㎖ 내지 80 pg/㎖의 FGF2를 함유한다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 10 pg/㎖ 내지 40 pg/㎖의 FGF2를 함유한다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 11 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 12 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 13 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 14 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 15 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 16 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 17 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 18 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 19 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 20 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 21 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 22 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 23 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 24 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 25 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 26 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 27 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 28 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 29 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 30 pg/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 세포 배양 배지는 PDGF-BB가 보충된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 약 1 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 7.5 ng/㎖ 내지 120 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 15 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 15 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 20 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 21 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 22 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 23 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 24 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 25 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 26 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 27 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 28 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 29 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 30 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 31 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 32 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 33 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 34 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 35 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 36 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 37 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 38 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 39 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 40 ng/㎖의 PDGF-BB를 함유할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 세포 배양 배지는 PDGF-AB가 보충된다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 약 1 ng/㎖ 내지 150 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 7.5 ng/㎖ 내지 120 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 15 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 10 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 15 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 20 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 21 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 22 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 23 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 24 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 25 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 26 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 27 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 28 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 29 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 30 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 31 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 32 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 33 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 34 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 35 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 36 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 37 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 38 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 39 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 40 ng/㎖의 PDGF-AB를 함유할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 세포 배양 배지는 또한, EGF가 보충될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/㎖ 내지 7 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, EGF의 수준은 적어도 약 5 ng/㎖일 수 있다.
다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 0.2 ng/㎖ 내지 3.2 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 약 0.4 ng/㎖ 내지 1.6 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.2 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.3 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.4 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.5 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.6 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.7 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.8 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 0.9 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1.0 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1.1 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1.2 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1.3 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 1.4 ng/㎖의 EGF를 함유할 수 있다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 적어도 약 3.2 ng/㎖의 PDGF-BB, 적어도 약 0.08 ng/㎖의 EGF 및 적어도 약 0.002 ng/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 적어도 약 9.6 ng/㎖의 PDGF-BB, 적어도 약 0.24 ng/㎖의 EGF 및 적어도 약 0.006 ng/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 적어도 약 16 ng/㎖의 PDGF-BB, 적어도 약 0.40 ng/㎖의 EGF 및 적어도 약 0.01 ng/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다. 다른 예에 있어서, 세포 배양 배지는 적어도 약 32 ng/㎖의 PDGF-BB, 적어도 약 0.80 ng/㎖의 EGF 및 적어도 약 0.02 ng/㎖의 FGF2를 함유할 수 있다.
다른 인자를 본 발명의 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 상피 성장 인자(EGF), 1α,25-다이하이드록시비타민 D3(1,25D), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터류킨-1β(IL-1β) 및 기질 유래 인자 1α(SDF-1α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자극 인자가 보충될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 또한, 세포의 성장을 지지하기에 적당한 양의 적어도 하나의 사이토카인의 존재하에 배양될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 헤파린 또는 그의 유도체의 존재하에 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 약 50 ng/㎖의 헤파린을 함유할 수 있다. 다른 예에서, 세포 배양 배지는 약 60 ng/㎖의 헤파린, 약 70 ng/㎖의 헤파린, 약 80 ng/㎖의 헤파린, 약 90 ng/㎖의 헤파린, 약 100 ng/㎖의 헤파린, 약 110 ng/㎖의 헤파린, 약 110 ng/㎖의 헤파린, 약 120 ng/㎖의 헤파린, 약 130 ng/㎖의 헤파린, 약 140 ng/㎖의 헤파린, 약 150 ng/㎖의 헤파린 또는 그의 유도체를 함유한다. 일례에 있어서, 헤파린 유도체는 술페이트이다. 다양한 형태의 헤파린 술페이트가 해당 분야에 알려져 있으며, 헤파린 술페이트 2(HS2)를 포함한다. HS2는 예를 들어, 수컷 및/또는 암컷 포유동물의 간을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 예시적인 헤파린 술페이트는 수컷 간 헤파린 술페이트(MML HS) 및 암컷 간 헤파린 술페이트(FML HS)를 포함한다.
다른 예에 있어서, 본 발명의 방법 및 세포 배양 배지는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하면서 줄기 세포 증식을 촉진한다. 줄기 세포는 그들이 특정 분화 계통으로 수임되지 않는 경우 미분화된 것으로 여겨진다. 상기 논의된 바와 같이, 줄기 세포는 그들을 분화된 세포와 구분짓는 형태학적 특징을 나타낸다. 추가로, 미분화 줄기 세포는 분화 상태를 검출하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 유전자를 발현한다. 폴리펩티드 산물은 또한 분화 상태를 검출하기 위한 마커로 사용될 수 있다. 따라서, 해당 분야의 숙련자는 일상적인 형태학적, 유전학적 및/또는 프로테옴 분석을 사용하여 본 발명의 방법이 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다.
조성물/
키트
본 발명의 세포 배양 배지는 완전 배지로 제공될 수 있으며, 여기서, 기본 배지 및 성장 인자는 세포 배양 이전에 함께 혼합된다. 대안적으로, 세포 배양 배지 구성성분은 세포 배양 이전에, 또는 그 동안 개별적으로 제공되고, 적합한 기본 배지와 혼합될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 본 발명은 줄기 세포 배양 배지로의 첨가를 위한 혈청 대체 조성물을 제공하며, 당해 조성물은
혈소판 유래 성장 인자(PDGF);
섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함하며;
조성물이 줄기 세포 배양 배지에 첨가되고, 줄기 세포 집단이 세포 배양 배지에서 배양되는 경우, 배양 배지 중 FGF2의 수준은 약 6 ng/㎖ 미만이다. 다른 예에 있어서, 조성물이 줄기 세포 배양 배지에 첨가되고, 줄기 세포 집단이 세포 배양 배지에서 배양되는 경우, FGF2 수준은 약 5 ng/㎖ 미만, 약 4 ng/㎖ 미만, 약 3 ng/㎖ 미만, 약 2 ng/㎖ 미만, 약 1 ng/㎖ 미만일 수 있다. 다른 예에 있어서, FGF2 수준은 약 0.9 ng/㎖ 미만, 약 0.8 ng/㎖ 미만, 약 0.7 ng/㎖ 미만, 약 0.6 ng/㎖ 미만, 약 0.5 ng/㎖ 미만, 약 0.4 ng/㎖ 미만, 약 0.3 ng/㎖ 미만, 약 0.2 ng/㎖ 미만이다.
일례에 있어서, FGF2는 약 1 pg/㎖ 내지 100 pg/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다. 다른 예에 있어서, FGF2는 약 5 pg/㎖ 내지 80 pg/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다. 다른 예에 있어서, FGF2는 약 10 pg/㎖ 내지 40 pg/㎖의 수준으로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 10 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 11 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 12 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 13 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 14 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 15 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 16 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 17 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 18 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 약 19 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 20 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 21 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 22 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 23 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 24 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 25 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 26 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 27 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 28 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 29 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, FGF2는 적어도 약 30 pg/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, PDGF-BB는 본 발명의 조성물에 존재한다. 예를 들어, PDGF-BB는 약 1 ng/㎖ 및 150 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB는 약 7.5 ng/㎖ 및 120 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 다른 예에 있어서, PDGF-BB는 약 15 ng/㎖ 및 60 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 10 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 15 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 20 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 21 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 22 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 23 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 24 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 25 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 26 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 27 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 28 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 29 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 30 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 31 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 32 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 33 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 34 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 35 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 36 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 37 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB 적어도 약 38 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 39 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-BB는 적어도 약 40 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 PDGF-AB를 포함한다. 예를 들어, PDGF-AB는 약 1 ng/㎖ 및 150 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB는 약 7.5 ng/㎖ 및 120 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 다른 예에 있어서, PDGF-AB는 약 15 ng/㎖ 및 60 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 10 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 15 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 20 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 21 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 22 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 23 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 24 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 25 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 26 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 27 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 28 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 29 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 30 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 31 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 32 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 33 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 34 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 35 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 36 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 37 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 38 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 39 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, PDGF-AB는 적어도 약 40 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 EGF를 추가로 포함한다. 예를 들어, EGF는 약 0.1 ng/㎖ 및 7 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 5 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
다른 예에 있어서, EGF는 약 0.2 ng/㎖ 및 3.2 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 다른 예에 있어서, EGF는 약 0.4 ng/㎖ 및 1.6 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.2 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.3 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.4 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.5 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.6 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.7 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.8 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 0.9 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 1.0 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 1.1 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 1.2 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 1.3 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, EGF는 적어도 약 1.4 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재할 수 있다.
일례에 있어서, PDGF-BB, EGF 및 FGF2는 각각 적어도 약 3.2 ng/㎖, 0.08 ng/㎖ 및 0.002 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다. 일례에 있어서, PDGF-BB, EGF 및 FGF2는 각각 적어도 약 9.6 ng/㎖, 0.24 ng/㎖ 및 0.006 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다. 일례에 있어서, PDGF-BB, EGF 및 FGF2는 각각 적어도 약 16 ng/㎖, 0.4 ng/㎖ 및 0.02 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다. 일례에 있어서, PDGF-BB, EGF 및 FGF2는 각각 적어도 약 32 ng/㎖, 0.8 ng/㎖ 및 0.01 ng/㎖로 줄기 세포 배양 배지에 첨가되기에 충분한 양으로 존재한다.
일례에 있어서, 본 발명의 조성물은 적합한 용매 중에 또는 그와 함께 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다.
본원에 개시된 세포 배양 배지 및/또는 조성물은 임의로 특정 농도를 제공하기 위한 조성물과 세포 배양 배지의 혼합과 같이 요망되는 목적에 대하여 설명이 기재된 적합한 용기에서 포장될 수 있다.
광범위하게 기재된 바와 같은 본 발명의 목적 또는 범주로부터 벗어남 없이 특정 실시형태에 나타낸 바와 같이 본 발명에 대하여 수많은 변이 및/또는 변형이 이루어질 수 있음이 해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 모든 양태에서 예시적이며 제한적인 것이 아닌 것으로 고려되어야 한다.
본원에 논의되고/거나 참조된 모든 공개문헌은 그들 전문이 본원에 포함된다.
본 명세서에 포함되는 문헌, 법률, 자료, 장치, 논문 등의 임의의 논의는 오직 본 발명을 위한 상황을 제공할 목적이다. 임의의 또는 모든 이들 자료가 선행 기술 기본의 일부를 형성하거나, 본 출원의 각각의 청구범위의 우선일 전에 존재함에 따라 본 발명과 관련된 분야에서 보통의 일반 지식이라는 승인으로 받아들여서는 안 된다.
본 출원은 2015년 3월 4일자 출원된 AU 2015900752호 및 2015년 3월 5일자 출원된 AU 2015900777호로부터 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
:
실시예
1: 세포 배양 배지 중 성장 인자
인간 혈소판 용해물에서 중간엽 계통 전구 세포(MPC)의 일련의 증식을 평가하기 위하여, 세포를 세포 증식을 측정하기 전 7일 동안 인간 혈소판 용해물에서 배양하였다. 혈소판 용해물을 2개의 개별 공급처(공급처 A 및 공급처 B)로부터 수득하였다. 혈소판 용해물 백분율은 0 내지 10% 범위였다. 제7일의 MPC 증식은 도 1에 나타나 있다. 세포를 공급처 B로부터 수득되는 10%의 인간 혈소판 용해물에서 성장시킨 경우 세포 증식이 가장 높은 것을 주목하였다.
성장 인자 EGF, FGF2, VEGF, PDGF-AA 및 PDGF-BB의 농도(pg/㎖)를 공급처 A 및 B로부터 수득되는 인간 혈소판 용해물에서 측정하였다. 성장 인자 농도(pg/㎖)는 도 1에 나타나 있다. 공급처 B가 가장 높은 농도의 EGF(8,036 pg/㎖), 가장 높은 농도의 PDGF-BB(46,432 pg/㎖) 및 가장 낮은 농도의 FGF2(199 pg/㎖)를 가졌음을 주목하였다.
| 피분석물 시료 | EGF | FGF-2 | VEGF | PDGF-AA | PDGF-BB |
| pg/㎖ | pg/㎖ | pg/㎖ | pg/㎖ | pg/㎖ | |
| 공급처 A - 로트 1 | 3,875 | 266 | 3,745 | 31,063 | 139,300 |
| 공급처 A - 로트 2 | 4,197 | 234 | 5,252 | 36,110 | 199,900 |
| 공급처 B - 로트 1 | 8,036 | 199 | 3,745 | 46,432 | 326,100 |
| 공급처 A - 로트 3 | 5,982 | 314 | 2,546 | 37,852 | 230,600 |
실시예
2: 세포 증식에서의 성장
인자의
효과
세포 증식에서의 hPL에서의 성장 인자의 효과를 평가하기 위하여, 세포 집단을 성장 인자 EGF, FGF2, VEGF, PDGF-AA 및 PDGF-BB의 항체 길항제에 노출시켰다.
세포 집단을 단일의 항체 길항제, 모든 항체 길항제의 조합 또는 Ig 항체 대조군 중 어느 하나에 노출시켰다. 항체를 알앤디 시스템즈(R&D systems)로부터 수득하고, 포화 농도로 첨가하였다. 항체의 첨가 후에, 세포를 세포 증식의 측정 전에 3% hPL(PLTMax)에서 5일 동안 배양하였다. 항체 길항제에 노출되는 각 세포 집단에서의 세포 증식의 수준을 Ig 대조군 항체에 노출되는 세포 집단에서의 세포 증식의 수준과 비교하였다.
PDGF-BB의 항체 중화는 시험되는 단일의 항-미토겐 항체의 MPC 증식에서 유의미한 감소를 초래하는 유일한 조건이었다(도 2).
모든 항체 길항제의 조합은 세포 증식의 거의 완전한 억제를 초래하였다(도 2). 따라서, hPL에 의한 세포 증식의 자극은 이러한 초기 실험에서 시험되는 5가지 성장 인자에 의해 거의 완전하게 포함된다.
또한, 이들 결과에 의해, 다른 성장 인자(들) 중 하나가 PDGF-BB 유도 MPC 증식에 기여하였음이 입증된다.
실시예
3: 세포 증식에서의 성장
인자의
효과
어떤 다른 성장 인자(들)가 PDGF-BB 유도 MPC 증식에 기여하는지 평가하기 위하여, MPC 세포를 도 3에 나타낸 바와 같이 다양한 항체의 조합을 사용하여 배양하였다.
항체의 첨가 후에, 세포를 세포 증식의 측정 전에 3% hPL(PLTMax)에서 5일 동안 배양하였다. 항체 길항제에 노출되는 각 세포 집단에서의 세포 증식의 수준을 Ig 대조군 항체에 노출되는 세포 집단 및 항체에 노출되지 않는 세포 집단에서의 세포 증식의 수준과 비교하였다(도 3).
이러한 연구에 의해, PDGF-BB, EGF 및 FGF2가 hPL에 의한 MPC 증식을 자극하는 것이 입증된다. 추가로, PDGF-BB 및 EGF는 각각 FGF2와 상승적으로 작용하여, 세포 증식을 촉진한다. 3% hPL에서 FGF2의 농도가 하위-분열촉진 용량인 대략 6 pg/㎖임을 주목하였다.
예상되는 바와 같이, 세포 증식의 차이는 Ig 대조군으로 배양되는 세포 집단과 항체에 노출되지 않는 세포 집단 사이에서 관찰되지 않았다.
이들 데이터는 MPC 증식이 재조합 미토겐에 의해 유도되는 화학적으로 정의된, 완전 인간화 이종-부재의 세포 배양 배지의 개발에 대한 기반을 나타낸다.
실시예
4:
우태아혈청
무함유 세포 배양 배지의 개발
기본 세포 배양 배지의 시작은 알파 변형 이글 최소 필수 배지(MEM) 또는 스템스팬(상표명)을 포함하였다.
통상 이글 알파 MEM으로 지칭되는 Earle의 평형 염이 있는 이글 MEM의 알파 변형은 비-필수 아미노산, 피루브산나트륨 및 추가의 비타민을 함유한다. 이들 변형은 성장하는 하이브리드 마우스 및 햄스터 세포에서 이용하기 위하여 처음으로 기재되었다(문헌[Stanners et al. Nat New Biol., 230, 52 - 54, 1971]).
스템스팬(상표명)은 스템셀 테크놀로지즈(STEMCELL Technologies)로부터 구매가능한 우태아혈청 부재의, 조혈 세포 증식 배지이다. 스템스팬(상표명)의 조성은 개시되어 있지 않다.
PDGF-BB, EGF 및 FGF2를 포함하는 조성물을 하기의 농도로 각 기본 배지에 첨가하였다:
MSC 집단을 조직 배양 플라스틱(도 4 - 알파 MEM; 도 7 - 스템스팬(상표명)), 피브로넥틴(도 5 - 알파 MEM; 도 8 - 스템스팬(상표명)) 또는 3% hPL(도 6 - 알파 MEM; 도 9 - 스템스팬(상표명))에서 상기 배지(a 내지 d)의 각각에서 배양하였다.
성장 인자 보충된 배지에서 배양되는 세포 집단에서의 세포 증식을 성장 인자가 존재하지 않는 기본 배지에서 배양되는 세포 집단에서의 세포 증식과 비교하였다. 세포 증식의 가장 큰 증가는 PDGF-BB(32 ng/㎖), EGF(0.8 ng/㎖) 및 FGF2(0.02 ng/㎖)가 보충된 알파 MEM 또는 스템스팬(상표명) 기본 배지에서 배양되는 세포에서 관찰되었다.
실시예
5: 이종-부재의 세포 배양
동결보존된 인간 MPC를 해동시키고, 재조합 인간 성장 인자가 보충된 이종-부재의 배지 또는 성장 인자가 존재하지 않는 이종-부재의 배지에 1,000개 세포/웰로 96 웰 플레이트 상으로 씨딩하였다.
성장 인자를 하기의 농도로 제공하였다:
배양물을 5% CO2, 35 내지 37℃로 설정된 가습 NuAire 인큐베이션에 장착된 인큐사이트 줌(IncuCyte Zoom) 실시간 영상화 현미경(에센 바이오사이언스(Essen BioScience)) 내측에서 약 120시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 6시간마다 동시에 영상화시켜, 배양 기간 동안 컨플루언스(confluence)의 수준을 측정하였다. 증식 역학을 시간에 걸친 컨플루언스의 백분율로서 계산하였다(도 10).
실시예
6:
MPC로부터의
세포 배양 배지에서의 사이토카인 수준의 비교
3가지 상이한 공여자로부터의 MPC를 표준 배지(알파-MEM + 10% FBS) 또는 알파-MEM + 3% 인간 AB 혈청 + PDGF-BB, EGF 및 FGF2를 포함하는 우태아혈청 무함유 배지에서 단계적으로 증식시켰다. 사이토카인 수준을 세포 증식 후에 세포 배양 배지에서 측정하였다(도 11).
Ang1 수준은 우태아혈청 무함유 배지에서 성장하는 3개의 공여자 세포 집단 중 2개에서 상승하였다. Ang1:VEGF 비는 우태아혈청 무함유 배지에서 성장한 모든 공여자 세포 집단에서 증가하였다.
Claims (20)
- 시험관내 줄기세포 증식의 촉진방법으로서, 중간엽 계통 전구체 또는 줄기세포의 집단을 혈소판 유래 성장인자(platelet derived growth factor: PDGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor: EGF) 및 섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2: FGF2)를 포함하는 우태아혈청 무함유 세포 배양배지(fetal bovine serum free cell culture medium)에서 배양하는 단계를 포함하되,
상기 PDGF의 수준은 3 ng/ml 내지 120 ng/ml이고, 상기 EGF의 수준은 0.08 ng/ml 내지 7 ng/ml이며, 상기 FGF2의 수준이 20 pg/ml 내지 2 ng/㎖이고, 상기 세포 배양배지는 상기 중간엽 계통 전구체 또는 줄기세포를 미분화 상태로 유지하며, 상기 증식은 혈청, PDGF 및 FGF2를 포함하지 않는 대조군 배지에 비해 0일 내지 7일 사이에 증가 또는 가속화되는, 시험관내 줄기세포 증식의 촉진방법.
- 시험관내 중간엽 계통 전구체 또는 줄기세포 증식의 촉진을 위한 우태아혈청 무함유 세포 배양배지로서,
기본 배지;
혈소판 유래 성장인자(PDGF);
표피 성장인자(epidermal growth factor: EGF); 및
섬유아세포 성장인자 2(FGF2)를 포함하되,
상기 PDGF의 수준은 3 ng/ml 내지 120 ng/ml이고, 상기 EGF의 수준은 0.08 ng/ml 내지 7 ng/ml이며, 상기 FGF2의 수준이 20 pg/ml 내지 2 ng/㎖이고, 상기 세포 배양배지는 상기 중간엽 계통 전구체 또는 줄기세포를 미분화 상태로 유지하며, 상기 증식은 혈청, PDGF 및 FGF2를 포함하지 않는 대조군 배지에 비해 0일 내지 7일 사이에 증가 또는 가속화되는, 우태아혈청 무함유 세포 배양배지.
- 제1항에 있어서, 상기 FGF2의 수준은 0.3 pg/㎖ 내지 1.5 ng/㎖인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 FGF2의 수준은 1 ng/㎖인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 PDGF는 PDGF-BB인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 PDGF-BB의 수준은 9.0 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 PDGF-BB의 수준은 10 ng/㎖인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 EGF의 수준은 5 ng/㎖인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 배양배지는 알파-최소 필수 배지(alpha-minimal essential medium) 또는 우태아혈청 무함유 증식배지를 포함하는, 방법.
- 삭제
- 제2항에 있어서, 상기 FGF2의 수준은 0.3 ng/ml 내지 1.5 ng/ml인, 세포 배양배지.
- 제2항에 있어서, 상기 FGF2의 수준은 1 ng/ml인, 세포 배양배지.
- 제2항에 있어서, 상기 PDGF는 PDGF-BB이고, 상기 PDGF-BB의 수준은 10 ng/㎖인, 세포 배양배지.
- 제2항에 있어서, 상기 PDGF는 PDGF-BB이고, 상기 PDGF-BB의 수준은 9.0 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖인, 세포 배양배지.
- 제2항에 있어서, 상기 EGF의 수준은 5 ng/㎖인, 세포 배양배지.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 세포 배양배지는 3% 인간 혈청을 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 세포 배양배지는 3% 인간 혈청을 포함하는, 세포 배양배지.
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