CN103396984B

CN103396984B - 一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法

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Publication number: CN103396984B
Application number: CN201310315106.6A
Authority: CN
Inventors: 宗兆文; 陈思旭
Original assignee: 宗兆文; 陈思旭
Current assignee: Army Medical University
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: CN103396984A

Abstract

本发明公开了一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法，包括如下步骤：1)、分离SKPs，传代得SKPs原代细胞；2)、将分离得到的SKPs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增；3)、制备组织工程脊髓，将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含Neurotrophin-3(NT3)、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中；将扩增后的SKPs，以脑源性神经营养素腺病毒表达载体感染，将细胞接种到工程脊髓材料上，进行培养。本发明的方法中，组织工程脊髓可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。

Description

一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法

技术领域

本发明涉及组织工程脊髓的制备方法，尤其涉及一种皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法。

背景技术

脊髓损伤修复是临床救治的难点和重点之一，干细胞移植是治疗脊髓损伤较有前景的方法之一，但目前存在的主要问题有：1.干细胞的自体移植具有无免疫原性和使用方便等优点，但神经干细胞和胚胎干细胞等很难实现自体移植，而皮肤来源的干细胞来源丰富，可进行自体移植。皮肤来源的干细胞可在不同微环境的诱导下分化为包括神经元在内的多种类型的细胞，因而其应用于脊髓损伤修复具有良好的前景和实用价值。2.种子细胞不能更多地分化为神经元和少突胶质细胞等修复细胞，导致其修复效果不佳，因而需要寻找合适的手段诱导其更多地向神经元等分化。3.不适当的移植时机导致移植细胞不能有效地发挥其作用。有研究表明，脊髓损伤后细胞移植的较佳移植时机为伤后10天至2周左右，因而如何在这个时间窗内获得足够量的干细胞或经过合适的扩增条件获得足够量的干细胞是提高干细胞移植修复效果的一个需要解决的实际问题。4.组织工程中移植细胞的存活数量要大大少于修复所需细胞数量。因而需要寻找措施增加移植后干细胞的存活数量，或者增加内源性干细胞的动员，以提高干细胞移植的修复修复效果。

针对上述存在的问题，本领域技术人员致力于开发一种皮肤来源的祖细胞(skin-derivedprecursors，SKPs)的快速增殖和诱导SKPs更多向神经元和少突胶质细胞分化的方法。然后，以上述条件培养的人源性SKPs为种子细胞构建组织工程脊髓，并将其利用到脊髓功能的修复上。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种利用皮肤来源的祖细胞制备组织工程脊髓的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种利用SKPs制备组织工程脊髓的方法，包括如下步骤：

1)、分离SKPs

将皮肤样品酒精消毒后，胰酶消化，然后将真皮组织剪成细胞片并碎吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中，2h后，将悬浮的细胞离心后转移到SKPs生长培养基中，培养约7天后，可见悬浮克隆样生长的细胞SKPs。

2)、SKPs快速扩增

将分离得到的SKPs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增，所述扩增培养基中含有FGF240-60ng/ml和PDGF40-70ng/ml。

3)、制备组织工程脊髓

将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含NT3(Neurotrophin-3)、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，然后吸走培养皿中的液体，将组织工程脊髓材料经过梯度酒精脱水后，真空干燥；

将扩增后的SKPs，以脑源性神经营养素(brainderivedneurotrophicfactor，BDNF)腺病毒表达载体感染，12h后收集细胞接种到上述的工程脊髓材料材料上，加入培养基培养。

进一步地，所述步骤1)中，所述皮肤样品为，0.5×4cm²的全层皮肤，所述胰酶质量体积浓度为0.25％，所述SKPs生长培养基为40ng/mlFGF2和20ng/mlEGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

进一步地，所述步骤2)中，所述扩增培养基为含有50-100ng/mlFGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子(Platelet-DerivedGrowthFactor，PDGF)的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

进一步地，所述步骤3)中，组织工程脊髓材料饱和水溶液和生理盐水的体积比为1∶1，生理盐水中NT3、维甲酸和Neuregulin的浓度分别为10ng/ml、6ng/ml和10ng/ml，静置时间为30-40min。

优选地，所述步骤3)中，细胞接种密度为5×10⁵/ml，培养基组分为40ng/mlFGF2和20ng/mlEGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。

相对于单纯的组织材料，本发明的方法中，含有10ng/mlNT3、6ng/ml维甲酸、10ng/mlNeuregulin的组织工程材料可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。

附图说明

图1是本发明分离得到的SKPs；

图2是βIII-tubulin检测SKPs分化为神经元细胞；

图3是DAPI、GFAP和CNPas检测SKPs分化为少突胶质细胞；

本发明中所用组织工程脊髓材料为上海吉尔生化有限公司Sapeptide(sefl-assemblingpeptide)材料RAD15-II。

具体实施方式

实施例1分离SKPs

脊髓损伤患者大腿内侧或背部皮肤常规消毒后，1％利多卡因麻醉，取大小约0.5×4cm²的全层皮肤。酒精消毒，剪取皮肤置于0.25％胰酶消化过夜。次日，Hank’s液清洗后，去除表皮和皮下组织，将真皮组织剪成细胞片并碎吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中。2h后，将悬浮的细胞离心后转移到适合SKPs生长的培养基中(DMEM-F12，3∶1，含40ng/mlFGF2、20ng/mlEGF)，培养约7天后，可见悬浮克隆样生长的细胞SKPs，图1。

采用细胞免疫荧光组织化学检测SKPs是否在诱导后向神经元和少突胶质细胞分化，采用的一抗分别是βIII-tubulin(神经元)、GFAP和CNPas(少突胶质细胞)。细胞免疫荧光组织化学的操作步骤简述如下：将SKPs传代至24孔培养板，细胞约70％融合后加入含10ng/mlBDNF+10ng/mlNT3+6ng/ml维甲酸+5％FBS的培养基(诱导向神经元分化)或含有5％FBS+10ng/mlNeuregulin的培养基(诱导向少突胶质细胞分化)。诱导分化48h后，去除培养基，PBS漂洗后加入95％乙醇固定20min，PBS充分漂洗后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。次日倾去一抗并用PBS充分漂洗后加入对应的荧光二抗，室温孵育约30min后PBS充分漂洗，荧光显微镜下观察并拍照记录。图2显示了SKPs能够被成功诱导为神经元细胞，图3显示了SKPs能够被成功诱导为少突胶质细胞。

实施例2SKPs快速扩增

通常原代细胞的生长较为缓慢，为了在最佳移植时间窗内获得足够量的细胞，本实施例研究了不同生长因子对SKPs的促增殖情况。通过文献调研可知，多种细胞因子参与干细胞增殖的调节，主要有碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor-2，FGF-2)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、白血病抑制因子(leukemiainhibitingfactor，LIF)、db-cAMP、胰岛素生长因子-1(insulingrowthfactor-1，IGF-1)、胰岛素生长因子-2(insulingrowthfactor-2，IGF-2)、血小板源性生长因子(Platederivedgrowthfactor，PDGF)、脑源性神经营养素(brainderivedneurotrophicfactor，BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)、神经生长因子-β(nervegrowthfactor-β，NGF-β)、骨形态发生蛋白-4(bonemorphogenticprotein4，BMP-4)和activinA等，其中FGF-2、EGF和PDGF作用最为强大。但不同细胞因子对不同种类的干细胞作用及其机制不尽相同，同时上述细胞因子在影响干细胞增殖的同时，有可能还会影响其分化和迁移等生物学功能，需要给予注意。因而在观察各种因子的促增殖效果时，还要注意各种细胞因子对分化和迁移功能的影响。需要找到一种既能有效促进干细胞增值，又不影响其分化和迁移功能的培养基配方。

细胞增殖活性的测定采用³H-TdR掺入和液体闪烁计数法测量，所需[甲基-³H]胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)购自中科学院上海原子核研究所，具体方法为：SKPs在传代时调整细胞数为细胞数为3×10⁵/ml，向每个培养瓶加入终浓度为2μCi/ml的³H-TdR，加入上述含有不同细胞因子的培养基培养。2天后收集细胞用HClO₄-H₂O₂法65℃水浴消化。待完全消化后，用NaOH中和消化液至pH7.0。然后取0.1ml样本，加入1.5ml乙二醇/乙醚(1∶1)溶液和5ml二甲苯液闪烁4h后用LS6500液闪计数仪(BeckmanCOULTERTM，USA)进行液闪计数。细胞分化采用细胞荧光免疫组化学进行检测，方法简述为：将SKPs传代至24孔培养板，细胞约70％融合后加入上述含有不同细胞因子的培养基培养48h后，去除培养基，PBS漂洗后加入95％乙醇固定20min，PBS充分漂洗后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。次日倾去一抗并用PBS充分漂洗后加入对应的荧光二抗，室温孵育约30min后PBS充分漂洗，荧光显微镜下观察并拍照记录。细胞迁移功能采用Transwell的方法进行测定，简述如下：常规收集各种条件处理过的SKPs，取100μl细胞悬液，细胞数约1×10⁵，接种于Transwell小室(Costar，USA)内。每组重复6个标本。约1h后，Transwell小室外加伤口液或正常组织液或生理盐水400μl。4小时后，取出Transwell小室，PBS冲洗，用棉签轻轻擦去微孔膜上层的细胞，95％酒精固定小室下层细胞，苏木素染色后高倍镜下计数。取10个视野的均数作为该样本从微孔膜上层迁移至下层的细胞数。

结果表明，对SKPs而言，在单个因子的作用下，FGF2的作用最强，呈剂量依赖性，约在80ng/ml达到平台；联合因子的作用中，FGF2+PDGF的作用最强。两种培养条件没有影响SKPs的分化和迁移特性。优化后的的SKPs扩增培养基为：含有50-100ng/mlFGF2和30-50ng/mlPDGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。优化后的培养基较优化之前可增加SKPs的增殖速率约30％以上。

表1不同浓度PDGF对SKPs生物学性状的影响

实施例3SKPs分化神经元和少突胶质细胞分化条件的优化

脊髓损伤局部微环境不利于移植的干细胞向神经元等修复细胞分化，为此需要首先摸索出增加干细胞向神经元等修复细胞分化的条件，然后再在组织工程脊髓中复合这些条件以提高干细胞移植的修复效果。

离体实验观察SKPs向神经元和少突胶质细胞分化的条件。诱导向神经元分化的培养基有三种：(1)5％FBS；(2)6ng/ml维甲酸；(3)10ng/mlBDNF+10ng/mlNT3+6ng/ml维甲酸+5％FBS。向雪旺氏细胞诱导共使用两种诱导培养基：(1)5％FBS；(2)5％FBS+10ng/mlNeuregulin。结果表明在10ng/mlBDNF+10ng/mlNT3+6ng/ml维甲酸+5％FBS的培养基条件下诱导SKPs向神经元的分化几率最高，约为12.5％。(3)5％FBS+10ng/mlNeuregulin的培养体系诱导SKPs向少突胶质细胞分化的几率最高，约为6.5％。

实施例4制备组织工程脊髓

在室温下饱和水溶液1ml，滴加到35mm的盛有1ml含10ng/mlNT3、6ng/ml维甲酸、10ng/mlNeuregulin生理盐水溶液的培养皿中，底部预先放置一大小约2cm×2cm的盖玻片。静置30-40min后，动作轻柔地从边缘吸走培养皿中的液体。将Sapeptide材料经过梯度酒精(30％、50％、70％、90％和100％)脱水后，在用真空干燥器干燥。

上述方法分离培养和扩增SKPs后，以BDNF腺病毒表达载体感染之，12h后收集细胞并计数以5×10⁵/ml的密度接种到Sapeptide材料上，加入1ml培养基，每4h观察并根据情况再次添加适量培养基，培养24h进行离体观察，或者培养12h进行在体移植。

离体观察的项目有细胞的分化和增殖情况。其中，分化使用细胞免疫组织化学的方法，具体操作同前，增殖采用针对Ki67的细胞免疫组织化学，具体操作同前。结果发现，相对于单纯的组织材料，含有1NT3、6ng/ml维甲酸、10ng/mlNeuregulin的组织工程材料可有效地促进细胞增殖，其向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％左右，远远高于单纯支架材料的1.8％和0.5％。

然后我们将构建负载BDNF腺病毒感染的SKPs的组织材料移植到小鼠体内，移植后1w、2w和3w常规收集标本，分别进行针对GFP的实时定量PCR(SybGreen技术)计量脊髓中存活的细胞量、免疫组织化学分析细胞的分化情况、BBB功能评定小鼠神经功能恢复情况。其中，小鼠模型同前，BBB评分法简述如下：A.通过观察下肢针刺反射评估感觉功能：0，无反射；1，一侧肢体反射；2，两侧肢体反射；3，头从一侧转向刺激；4，头从两侧转向刺激；5，一侧对照肢体收缩；6，两侧对照肢体收缩；运动功能评分系统：0，无后肢运动(BBB评分0)；1，痉挛的、非控制性一侧后肢运动(BBB评分1-2)；2，痉挛的、非控制性两侧后肢运动(BBB评分3-5)；3，一侧后肢控制性运动(BBB评分6-7)；4，两侧后肢控制性运动(BBB评分8-9)；5，一侧后肢辅助行走(BBB评分10-12)；6，两侧后肢辅助行走(BBB评分13-21)。

观察结果表明，复合组织材料移植后细胞存活量明显高于对照组，移植细胞向神经元和少突胶质细胞分化的比例为4.8％和1.5％，明显高于对照组的1.8％和0.5％，同时，小鼠的功能恢复明显高于对照组。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种利用SKPs制备组织工程脊髓的方法，包括以下步骤：

1)、分离SKPs

将皮肤样品酒精消毒后，胰酶消化，然后将真皮组织剪成细胞片吹打成细胞悬液，过滤后接种于含DMEM培养液的培养瓶中，2h后，将悬浮的细胞离心后转移到SKPs生长培养基中，培养约7天后，可见悬浮克隆样生长的细胞SKPs；

2)、SKPs快速扩增

将分离得到的SKPs原代细胞移入扩增培养基中进行扩增，所述扩增培养基中含有FGF240-60ng/ml和PDGF40-70ng/ml；

3)、制备组织工程脊髓

将组织工程脊髓材料饱和水溶液，滴加到含NT3、维甲酸和Neuregulin的生理盐水溶液中，静置，然后吸走培养皿中的液体，将组织工程脊髓材料经过梯度酒精脱水后，真空干燥；将扩增后的SKPs，以脑源性神经营养素(brainderivedneurotrophicfactor，BDNF)腺病毒表达载体感染，12h后收集细胞接种到上述的工程脊髓材料上，加入培养基培养；

所述步骤1)中，皮肤样品为，0.5×4cm²的全层皮肤；胰酶质量体积浓度为0.25％，SKPs生长培养基为：含40ng/mlFGF2和20ng/mlEGF的DMEM-F12培养基；培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养；

所述步骤2)中，扩增培养基为含有50-100ng/mlFGF2和30-50ng/ml血小板源性生长因子的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养；

所述步骤3)中，组织工程脊髓材料饱和水溶液和所述生理盐水的体积比为1∶1，生理盐水中NT3、维甲酸和Neuregulin的浓度分别为10ng/ml、6ng/ml和10ng/ml，静置时间为30-40min；

细胞接种密度为5×10⁵/ml，培养基组分为含40ng/mlFGF2和20ng/mlEGF的DMEM-F12培养基，培养条件为：湿化的培养箱中37℃培养。