JP2008148643A - 無血清培地および幹細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】幹細胞の初代培養および継代培養を無血清で行うことを可能にする。
【解決手段】基本培地に、5〜10%濃度のパネキシンと、1〜100ng/mLのbFGFと、1〜100ng/mLのPDGFと、1〜100ng/mLのEGFと、1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合してなる無血清培地を提供する。
【選択図】 図1
【解決手段】基本培地に、5〜10%濃度のパネキシンと、1〜100ng/mLのbFGFと、1〜100ng/mLのPDGFと、1〜100ng/mLのEGFと、1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合してなる無血清培地を提供する。
【選択図】 図1
Description
本発明は、無血清培地および幹細胞の培養方法に関するものである。
従来、細胞培養のために、培地に10%FBS(ウシ胎児血清)を添加する必要がある。しかしながら、BSEやヒト細胞表面への異種タンパク質の付着などの問題から、再生医療製品の開発には無血清培地の使用が望まれている。幹細胞の継代培養のために無血清培地を使用することが報告されている(例えば、特許文献1参照。)。
しかしながら、特許文献1の方法によっても、無血清培地を使用して幹細胞の初代培養を行うことは困難である。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、幹細胞の初代培養および継代培養を無血清で行うことができる無血清培地および幹細胞の培養方法を提供することを目的としている。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、幹細胞の初代培養および継代培養を無血清で行うことができる無血清培地および幹細胞の培養方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、基本培地に、5〜10%濃度のパネキシンと、1〜100ng/mLのbFGFと、1〜100ng/mLのPDGFと、1〜100ng/mLのEGFと、1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合してなる無血清培地を提供する。
本発明によれば、幹細胞を初代培養から培養でき、BSEや異種タンパク質の付着等の問題のない再生医療製品を製造することができる。
本発明は、基本培地に、5〜10%濃度のパネキシンと、1〜100ng/mLのbFGFと、1〜100ng/mLのPDGFと、1〜100ng/mLのEGFと、1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合してなる無血清培地を提供する。
本発明によれば、幹細胞を初代培養から培養でき、BSEや異種タンパク質の付着等の問題のない再生医療製品を製造することができる。
上記発明においては、5〜10ng/mLのbFGFを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、5〜10ng/mLのPDGFを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、10〜20ng/mLのEGFを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、50〜100μg/mLのビタミンCを含むこととしてもよい。
また、本発明は、上記いずれかの無血清培地を用いて培養する幹細胞の培養方法を提供する。
また、上記発明においては、5〜10ng/mLのPDGFを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、10〜20ng/mLのEGFを含むこととしてもよい。
また、上記発明においては、50〜100μg/mLのビタミンCを含むこととしてもよい。
また、本発明は、上記いずれかの無血清培地を用いて培養する幹細胞の培養方法を提供する。
本発明によれば、幹細胞の初代培養および継代培養を行う無血清で行うことができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る無血清培地および幹細胞の培養方法について、図1および図2を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る無血清培地は、基本培地に、5〜10%濃度のパネキシンと、1〜100ng/mLのbFGFと、1〜100ng/mLのPDGFと、1〜100ng/mLのEGFと、1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合することにより構成されている。
基本培地としては、例えば、DMEMまたはα−MEMが使用される。
本実施形態に係る無血清培地は、基本培地に、5〜10%濃度のパネキシンと、1〜100ng/mLのbFGFと、1〜100ng/mLのPDGFと、1〜100ng/mLのEGFと、1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合することにより構成されている。
基本培地としては、例えば、DMEMまたはα−MEMが使用される。
本実施形態に係る幹細胞の培養方法は、ヒトの骨髄液等から抽出した間葉系幹細胞を、培養容器内に貯留した上記無血清培地内に投入し、温度37℃±0.5℃、CO2濃度5%で初代培養する。初代培養は12日間行う。
次いで、初代培養終了後、培養容器からトリプシン等の蛋白質分解酵素により剥離して回収した間葉系幹細胞を、他の培養容器に播種して、上記無血清培地内において温度37℃±0.5℃、CO2濃度5%で継代培養する。
図1に、本実施形態に係る幹細胞の培養方法により初代培養した結果を示す。
次いで、初代培養終了後、培養容器からトリプシン等の蛋白質分解酵素により剥離して回収した間葉系幹細胞を、他の培養容器に播種して、上記無血清培地内において温度37℃±0.5℃、CO2濃度5%で継代培養する。
図1に、本実施形態に係る幹細胞の培養方法により初代培養した結果を示す。
本実施形態に係る無血清培地およびそれを用いた幹細胞の初代培養によれば、図1に示されるように、10%ウシ胎児血清のみを使用した場合の初代培養と比較して遜色なく、培養9日目には、10%ウシ胎児血清よりも多くの幹細胞を得ることができたことがわかる。
なお、10%ウシ胎児血清および他の増殖因子を添加した場合と比較すると増殖率においては及ばないが、本実施形態に係る無血清培地とそれを用いた幹細胞の培養方法によれば、BSEや異種タンパク質の付着等の問題を生ずることなく、十分な増殖率で幹細胞を初代培養することができるという利点がある。
なお、10%ウシ胎児血清および他の増殖因子を添加した場合と比較すると増殖率においては及ばないが、本実施形態に係る無血清培地とそれを用いた幹細胞の培養方法によれば、BSEや異種タンパク質の付着等の問題を生ずることなく、十分な増殖率で幹細胞を初代培養することができるという利点がある。
図2に、本実施形態に係る幹細胞の培養方法により継代培養した結果を示す。図2のPGFsが本実施形態に係る無血清培地を用いた場合の細胞数である。図中のOBGMは比較例として、無血清培地に代えて本実施形態に係るの10%ウシ胎児血清を用いた場合の細胞数である。また、図中のPGFs_FNは、培養容器内面にフィブロネクチンコーティングを施した場合の比較例である。さらに、図中のB2GFsは本実施形態における無血清培地内のパネキシンに代えて他の増殖因子を使用した場合の比較例である。
本実施形態に係る無血清培地およびそれを用いた幹細胞の継代培養によれば、ウシ胎児血清を用いた場合と比較して、約半分程度の増殖率であるが、十分な増殖を示していることがわかる。ウシ胎児血清の場合には、BSEや異種タンパク質の付着等の問題が考えられるが、本実施形態に係る無血清培地とそれを用いた幹細胞の培養方法によれば、そのような問題を生ずることなく、十分な増殖率で幹細胞を継代培養することができるという利点がある。
また、培養容器内面にフィブロネクチンコーティングを施した場合と比較しても、本実施形態に係る無血清培地においては、結果にほとんど差異はない。また、パネキシン以外の増殖因子を用いた無血清培地と比較して、本実施形態に係る無血清培地を使用することにより、継代培養において大きな増殖率を実現でき、多くの幹細胞を得ることができる。
なお、本実施形態に係る無血清培地においては、1〜100ng/mLのbFGFを含むこととしたが、5〜10ng/mLのbFGFを含むことが望ましい。また、1〜100ng/mLのPDGFを含むこととしたが、5〜10ng/mLのPDGFを含むことが好ましい。さらに、1〜100ng/mLのEGFを含むこととしたが、10〜20ng/mLのEGFを含むことが好ましい。また、1〜1000μg/mLのビタミンCを含むこととしたが、50〜100μg/mLのビタミンCを含むことが好ましい。
Claims (6)
- 基本培地に、
5〜10%濃度のパネキシンと、
1〜100ng/mLのbFGFと、
1〜100ng/mLのPDGFと、
1〜100ng/mLのEGFと、
1〜1000μg/mLのビタミンCとを混合してなる無血清培地。 - 5〜10ng/mLのbFGFを含む請求項1に記載の無血清培地。
- 5〜10ng/mLのPDGFを含む請求項1に記載の無血清培地。
- 10〜20ng/mLのEGFを含む請求項1に記載の無血清培地。
- 50〜100μg/mLのビタミンCを含む請求項1に記載の無血清培地。
- 請求項1から請求項5のいずれかに記載の無血清培地を用いて培養する幹細胞の培養方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2006
- 2006-12-19 JP JP2006341396A patent/JP2008148643A/ja not_active Withdrawn
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