JP2017506511A - 無血清培地 - Google Patents
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Abstract
Description
1.細胞療法のレシピエントに対する疾患伝染のリスク
2.処理技術者および医療関係者に対する疾患伝染のリスク
3.製品の不確実かつ季節的な入手性
4.−20℃での低温貯蔵の必要性
5.著しいバッチ間変動性
6.増大した要求のための予期される主要なサプライチェーンの問題。
(a)線維芽細胞増殖因子(FGF);
(b)形質転換増殖因子β(TGF−β);および
(c)リポタンパク質。
−製造者はFBS供給の不確実性の制約を受けない
−原料の全てがGMP供給者から調達され得るので、疾患伝達のリスクが除かれる
−血清ベースの増殖培地で見られたバッチ変動の問題が解消し、さらに、無血清培地は規定の組成を有するので、製造者または研究者が血清ロットを「バッチテスト」する必要がなくなる。
高密度リポタンパク質(HDL);
低密度リポタンパク質(LDL);
中間密度リポタンパク質(IDL);
超低密度リポタンパク質(VLDL);および
カイロミクロン。
大きい浮揚性LDL(lb LDL)粒子、
小さく密なLDL(sd LDL)粒子、および/または
リポタンパク質(a)(Lp(a))。
(a)骨組織;
(b)血管組織;
(c)軟骨組織;および/または
(d)脂肪組織。
図1は、初期実験の結果を示す。この実験では、無血清環境下で付着する10%血清の存在下で単離したMSCを支持する4つの付着因子の能力を、18時間後に調べた。因子は以下であった:ヒアルロン酸(HA)、フィブロネクチン(FN)、ビトロネクチン(VN)、ラミニン(LN)および上皮成長因子(EGF)。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF2、FGF2)の存在下で付着したMSCの増殖もまた、6日後に評価した。結果は、無血清環境中で18時間後、ビトロネクチン(0.5μg/mL)が最適にMSC付着を支持したことを示した(図1)が、フィブロネクチン(6μg/mL)は、6日後ビトロネクチン(0.5μg/mL)と同様のMSC収量を示した(図2)。EGF(10ng/mL)もまた、継代を行った後MSC付着を増加した(図3)。
(目的および方法)
骨髄由来MSCの増殖、分化、細胞形態および表面マーカー表現型に対する種々のリポタンパク質を含む本発明の培地の効果を評価するために、および無血清培地との使用について、付着因子、すなわちフィブロネクチンの必要性を評価するために、以下を行った。
リポタンパク質研究のために、以下を含有する無血清(SF)培地を調製した:リポタンパク質なし(No lipo)、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)および高密度リポタンパク質(HDL)。既存の他のリポタンパク質はカイロミクロンおよび中間密度リポタンパク質であるが、それらは当時市販されていなかったため本研究では評価しなかった。
MSCを、40×106ヒト骨髄単核細胞/T−175をプレーティングし、37℃、5%CO2、21%O2にて培養することにより、SF培地中のプラスチック接着に基づき、骨髄から単離した。細胞が80〜90%のコンフルエンスに到達したら、それを継代培養した。MSCを、第3継代(P3)の終わりに増殖動態、三系統分化および表面マーカー表現型を評価することにより評価した。リポタンパク質研究のために、種々のリポタンパク質のうちの1つを80ng/mLで含むようにSF培地を改変し、そしてこれらの細胞を、フィブロネクチンでプレコーティングしたT175フラスコ上に播種する。記載したフィブロネクチン研究のために、LDLを含有する標準SF培地(標準処方)を使用し、そして細胞を、フィブロネクチンなし、フィブロネクチンプレコーティングあり、または培地自体にフィブロネクチン添加ありで、T175フラスコ上に播種した。
1×105細胞(100μL)を氷上の96ウェルプレートの8ウェルの各々(各抗体につき1つおよび非染色細胞につき1つ)中にピペットで分注した。次いで、プレートを400gにて4℃で4分間遠心分離した。上清を、細胞ペレットをかき乱さないように注意深く吸引し、50μLのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、溶液をピペッティングすることによりペレットを再懸濁した。試料をブロッキング溶液中で1時間インキュベートした。ブロッキング後、プレートを前と同様に遠心分離し、適宜抗体を含有する50μLのFACS緩衝液中に再懸濁した。試料を暗所中、4℃で45分間抗体と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーション後、試料をFACS緩衝液で3回洗浄し、その後最終的に200μL FACS緩衝液中に懸濁し、FACS管に移した。BD FACS Canto IIを用いてマーカー発現を評価する10分前に、Sytox Red生存度染料もまた1:10,000の最終希釈度で試料に添加した。
CFU−fアッセイを、骨髄単核細胞(MNC)を1×106 MNC/10cm2の密度で6ウェルプレート中に3連で播種することにより行った。10日目に、細胞を予め冷却した95%メタノールを用いて固定し、2%クリスタルバイオレットで10分間染色した。次いで、試料をPBSで洗浄し、画像化した。HDL群は密集したCFU−fを含有したのに対し、VLDL群およびLDL群は分散したコロニーを含有した。
上記研究は、無血清中の異なる特異的リポタンパク質の比較および付着因子としてのフィブロネクチンの必要性の評価のために設計した。
Claims (18)
- 間葉系幹細胞を培養するための無血清培地であって、
(a)線維芽細胞増殖因子(FGF);
(b)形質転換増殖因子β(TGF−β);および
(c)リポタンパク質;
を含む、培地。 - 前記培地が1μg/mLから100μg/mLの濃度でリポタンパク質を含む、請求項1に記載の培地。
- 前記培地の前記リポタンパク質成分が、以下の:
(a)高密度リポタンパク質(HDL);
(b)低密度リポタンパク質(LDL);
(c)中間密度リポタンパク質(IDL);および
(d)超低密度リポタンパク質(VLDL);
の1つまたはそれ以上を含む、請求項1から2のいずれかに記載の培地。 - LDLを含む、請求項3に記載の培地。
- 前記LDLが:
(a)大きい浮揚性LDL(Ib LDL)粒子;
(b)小さく密なLDL(sd LDL)粒子;および
(c)リポタンパク質(a)(Lp(a));
の1つまたはそれ以上あるいはすべてを含む、請求項4に記載の培地。 - 直径15nmから30nmのLDL粒子を含む、請求項4または5に記載の培地。
- VLDLを含む、請求項3に記載の培地。
- 直径30nmから80nmのVLDL粒子を含む、請求項7に記載の培地。
- 前記培地の前記FGF成分がFGF2(bFGF)であり、必要に応じて1から10ng/mLの濃度である、任意の先行する請求項に記載の培地。
- 前記培地のTGFβ成分がTGHβ−1であり、必要に応じて1から20ng/mLの濃度である、任意の先行する請求項に記載の培地。
- 前記培地がさらに、基本培地を含むかまたは基本培地に基づく、任意の先行する請求項に記載の培地。
- 前記培地がさらに、デキサメタゾン、ヒト血清アルブミン、および/またはインスリン−トランスフェリン−セレン(ITS)を含む、任意の先行する請求項に記載の培地。
- 前記培地が他の増殖因子を含まない、任意の先行する請求項に記載の培地。
- 間葉系幹細胞、例えば、ヒト間葉系幹細胞を培養する方法であって、請求項1から13のいずれかに記載の培地中で該幹細胞をインキュベートする工程を含む、方法。
- (a)ヒト幹細胞を、請求項1から13のいずれかに記載の(b)培地中に含む、組成物。
- 前記幹細胞が、間葉系幹細胞、骨形成細胞、軟骨形成細胞、脂肪生成細胞、または血管形成細胞である、請求項15に記載の組成物。
- 医薬品に使用するための請求項1から13のいずれかに記載の培地中の幹細胞。
- 骨組織、血管組織、軟骨組織、または脂肪組織の形成における使用のための、請求項1から13のいずれかに記載の培地中の幹細胞。
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