CN111349604B - 类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官 - Google Patents

类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官 Download PDF

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Abstract

类器官培养用细胞培养基包含选自胰岛素样生长因子1(Insulin‑like growth factor 1，IGF1)、成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)、及表皮调节素(Epiregulin，EREG)的至少2种以及选自下述i)～iii)的成分中的至少1种：i)Wnt激动剂、ii)骨形态发生蛋白(bone morphogeneitc protein，BMP)抑制剂、iii)转化生长因子‑β(transforming growth factor‑β，TGF‑β)抑制剂。

Description

类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官
本申请是申请日为2017年5月10日、申请号为201780038054.9、发明名称为“类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及类器官培养用细胞培养基、培养方法及类器官。
本申请提出基于2016年5月18日向日本提出申请的日本专利特愿2016-099995的优先权请求，将其内容引用于本申请。
背景技术
肠道是人体中与外界接触的面积最大的脏器，具有消化吸收等维持生命必不可少的功能。肠道功能的大部分由覆盖其内层的肠道上皮负责。肠道上皮由绒毛和隐窝这2个区域构成，所述绒毛由3系的分化细胞(粘液细胞、吸收上皮细胞、内分泌细胞)形成，所述隐窝主要由未分化增殖细胞形成。在小肠肠腺，肠腺底部存在产生抗菌肽的潘氏(Paneth)细胞。最近，通过分子遗传学的细胞谱系分析，发现夹于潘氏细胞之间的Lgr5阳性细胞(也称为“CBC(隐窝基底柱状，Crypt base columnar)细胞”)为肠道上皮干细胞。Lgr5阳性肠道上皮干细胞产生被称为短暂扩增细胞(Transit amplifying cell)的前体细胞，这些前体细胞无永久的自我复制能力，而且分化能力也仅限于1～3系细胞。短暂扩增细胞在隐窝内随着2～4次的分裂而不断分化，在绒毛完成最终分化。这些分化细胞在绒毛的顶点剥离，通过细胞凋亡而死亡。肠道上皮是新陈代谢快的组织，从隐窝的干细胞用4～5天就移动至绒毛的顶点。潘氏细胞与其他分化细胞不同，在分化的同时向隐窝底部移动，具有长达2个月的细胞寿命。
肠道上皮干细胞的自我复制机理根据数项基因改造小鼠的结果已知受到Wnt信号和骨形态发生蛋白(Bone Morphogeneitc Protein，BMP)信号的控制。作为Wnt信号的抑制分子的APC(腺瘤性结肠息肉病，Adenomatous polyposis coli)的肠道上皮特异性敲除小鼠中，显示肠道上皮细胞的过度增殖和腺瘤形成。此外，使作为BMP的抑制蛋白的头蛋白(Noggin)在肠道上皮细胞过度表达的小鼠中，观察到异位隐窝形成，提示BMP信号对肠道上皮干细胞起到抑制性作用。实际上，确认Wnt信号有在隐窝底部活性高，向管腔侧降低的梯度。另一方面，已知BMP信号显示与Wnt信号相反的梯度。
此外，长久以来都无法实现肠道上皮细胞的长期培养。这被认为是由于维持肠道上皮干细胞所需的增殖因子不明。近年来，通过将肠道上皮干细胞粘接于细胞外基质上，在添加BMP抑制剂、促分裂增殖因子和Wnt激动剂且包含动物或细胞用基本培养基的细胞培养基的存在下进行培养，成功实现了肠道上皮干细胞的长期维持(参照例如专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
日本专利特许第5458112号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
专利文献1中记载的培养方法中所用的细胞培养基中，存在表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的表达因表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor，EGF)的刺激而下降的问题。对于该问题，通过添加p38抑制剂，可维持EGFR的表达。然而，包含p38抑制剂的培养基、培养方法中，可能会引发分化抑制或细胞死亡，部分的人的组织、肿瘤组织的培养无法实现。
为了解决上述课题，本发明提供可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织的类器官培养用细胞培养基。
此外，本发明还提供能在无血清的条件下制作的人培养类器官。
此外，本发明还提供至今为止无法实现的由组织制作的人培养类器官。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人为了解决上述课题而反复认真研究后，结果发现了实质上不含EGF及p38抑制剂，可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织的类器官培养用细胞培养基的组成。
此外，本发明人还发现通过在低氧条件下对来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任1种的组织、或以往无法培养的组织进行培养，可形成类器官。
即，本发明包括以下的形态。
本发明的第一种形态所涉及的类器官培养用细胞培养基包含选自胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1，IGF1)、成纤维细胞生长因子2(Fibroblastgrowth factor 2，FGF2)、及表皮调节素(Epiregulin，EREG)的至少2种以及选自下述i)～iii)的成分中的至少1种：
i)Wnt激动剂、
ii)骨形态发生蛋白(bone morphogeneitc protein，BMP)抑制剂、
iii)转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制剂。
上述第一种形态所涉及的类器官培养用细胞培养基可实质上不含EGF及p38抑制剂。
上述第一种形态所涉及的类器官培养用细胞培养基可包含IGF1及FGF2。
所述Wnt激动剂可以是选自Wnt蛋白、R-海绵硬蛋白、及GSK-3β抑制剂的至少1种。
所述Wnt蛋白可与其稳定化物质阿法敏(Afamin)形成复合物。
所述Wnt激动剂可以是Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白。
所述Wnt蛋白为选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16的至少1种。
所述R-海绵硬蛋白可以是选自R-海绵硬蛋白1、R-海绵硬蛋白2、R-海绵硬蛋白3、及R-海绵硬蛋白4的至少1种。
所述BMP抑制剂可以是选自包括头蛋白、格雷林(Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白，包括卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白，包括DAN、DAN半胱氨酸结结构域的DAN样蛋白，硬骨素(Sclerostin)/SOST、及α2-巨球蛋白的至少1种。
所述BMP抑制剂可以是头蛋白。
所述TGF-β抑制剂可以是选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、及SJN-2511的至少1种。
所述TGF-β抑制剂可以是A83-01。
本发明的第二种形态所涉及的培养方法是上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织的培养方法，其中，具备：制备细胞外基质的细胞外基质制备工序；使上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织粘接于所述细胞外基质上的粘接工序；在所述粘接工序后，添加上述第一种形态所涉及的类器官培养用细胞培养基，对所述上皮干细胞、所述上皮细胞、所述上皮肿瘤细胞、或包含所述这些细胞中的至少任1种的组织进行培养，形成类器官的类器官形成工序。
在所述类器官形成工序中，可在氧浓度15％～0.1％的低氧条件下，以所述上皮干细胞、所述上皮细胞、所述上皮肿瘤细胞、或包含所述这些细胞中的至少任1种的组织进行培养，形成类器官。
本发明的第三种形态所涉及的包含已分化的细胞的类器官通过上述第二种形态所涉及的培养方法获得。
上述第三种形态所涉及的包含已分化的细胞的类器官可用于再生医疗。
本发明的第四种形态所涉及的培养方法是上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织的培养方法，其中，具备：制备细胞外基质的细胞外基质制备工序；使上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织粘接于所述细胞外基质上的粘接工序；在所述粘接工序后，添加类器官培养用细胞培养基，在氧浓度15％～0.1％的低氧条件下对所述上皮干细胞、所述上皮细胞、所述上皮肿瘤细胞、或包含所述这些细胞中的至少任1种的组织进行培养，形成类器官的类器官形成工序；所述类器官培养用细胞培养基包含选自Wnt激动剂、促分裂增殖因子、BMP抑制剂、TGF-β抑制剂、及p38抑制剂的至少1种。
所述Wnt激动剂可以是选自Wnt蛋白、R-海绵硬蛋白、及GSK-3β抑制剂的至少1种。
所述Wnt蛋白可形成为与其稳定化物质阿法敏(Afamin)的复合物。
所述Wnt激动剂可以是Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白。
所述Wnt蛋白可以是选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16的至少1种。
所述R-海绵硬蛋白可以是选自R-海绵硬蛋白1、R-海绵硬蛋白2、R-海绵硬蛋白3、及R-海绵硬蛋白4的至少1种。
所述BMP抑制剂可以是选自头蛋白、格雷林(Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、含腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白、卵泡抑素(Follistatin)、含卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白、DAN、含DAN半胱氨酸结结构域的DAN样蛋白、硬骨素(Sclerostin)/SOST、及α2-巨球蛋白的至少1种。
所述BMP抑制剂可以是头蛋白。
所述TGF-β抑制剂可以是选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、及SJN-2511的至少1种。
所述TGF-β抑制剂可以是A83-01。
本发明的第五种形态所涉及的包含已分化的细胞的类器官通过上述第四种形态所涉及的培养方法获得。
上述第五种形态所涉及的包含已分化的细胞的类器官可用于再生医疗。
发明的效果
如果采用上述形态的类器官培养用细胞培养基，则可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。此外，还可从所述细胞和所述组织中的至少一方高效地形成类器官。
附图的简单说明
图1是表示实施例1的各培养基中自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的人上皮肿瘤细胞的培养类器官的图像。
在此，W是Wn-3A，N是头蛋白，R是R-海绵硬蛋白1，A是A83-01。
图2是对实施例1的各培养基中自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的人上皮肿瘤细胞的类器官在孔中所占的面积定量化而得的图表。
缩写同图1。
图3是表示实施例2中的各氧浓度下的初代培养(传代0)的培养开始后第7天的人上皮肿瘤细胞的培养类器官的图像。
图4是表示根据55种大肠肿瘤确立的类器官的最适培养条件的图。
图5A是表示实施例3的各培养基中自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的人肠道干细胞的培养类器官的图像。
图5B是对实施例3的各培养基中自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的人肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积定量化而得的图表。
图6是表示实施例4的各培养基中自第3次传代(传代3)的培养开始起6天后(合计培养天数26天后)、自第4次传代(传代4)的培养开始起6天后(合计培养天数33天后)、及自第6次传代(传代6)的培养开始起6天后(合计培养天数47天后)的人上皮肿瘤细胞的类器官的图像。
图7是表示对本实施方式中采用不同组成的类器官培养用细胞培养基的类器官的形成效率进行评价的结果的表。
具体实施方式
＜＜类器官培养用细胞培养基＞＞
本发明的实施方式1所述的类器官培养用细胞培养基包含选自IGF1、FGF2、及EREG的至少2种以及选自下述i)～iii)的成分中的至少1种：
i)Wnt激动剂、
ii)BMP抑制剂、
iii)TGF-β抑制剂。
如果采用本实施方式的类器官培养用细胞培养基，实质上不含EGF及p38抑制剂，可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。
此外，如果采用本实施方式的类器官培养用细胞培养基，则可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
此外，使用本实施方式的类器官培养用细胞培养基培养的上皮干细胞可长期维持分化能力，肿瘤发生频率极低。
本说明书中，上皮细胞包括从上皮组织获取的已分化的上皮细胞及上皮干细胞。“上皮干细胞”是指具有长期的自我复制机能和向上皮分化细胞的分化能力的细胞，是指来源于上皮组织的干细胞。作为上皮组织，可例举例如角膜、口腔粘膜、皮肤、结膜、膀胱、肾小管、肾脏、消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠))、肝脏、胰脏、乳腺、唾液腺、泪腺、前列腺、毛根、气管、肺等。其中，本实施方式的类器官培养用细胞培养基较好是用于来源于消化器官(食道、胃、十二指肠、小肠(包括空肠及回肠)、大肠(包括结肠)、肝脏、胰脏的上皮细胞的培养。
此外，本说明书中，“上皮肿瘤细胞”是指来源于上述的上皮组织的细胞肿瘤化而得的细胞。
本说明书中，“类器官”是指通过使细胞在受控的空间内高密度地积聚而自组织成的立体的细胞组织体。
本说明书中，“实质上不含”是指完全不含特定成分、或者仅含不会发挥特定成分所具有的机能的程度的特定成分。
因此，“实质上不含EGF及p38抑制剂”是指完全不含EGF及p38抑制剂、或者仅含不会发生基于EGF的EGFR的表达抑制、及基于p38抑制剂的分化抑制及细胞死亡的程度的浓度的EGF及p38抑制剂。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基包含选自IGF1、FGF2、及表皮调节素的至少1种，包含所述3种因子的哪一种可根据培养的细胞或组织的种类等适当选择。其中，本实施方式的类器官培养用细胞培养基较好是包含IGF1及表皮调节素、FGF2及表皮调节素、IGF1及FGF2，更好是包含IGF1及FGF2。通过包含上述因子，即使实质上不含EGF及p38抑制剂，也可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。此外，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
以下，对本实施方式的类器官培养用细胞培养基的构成成分进行详细说明。
＜细胞培养基本培养基＞
本实施方式的类器官培养用细胞培养基中包含任意的无血清的细胞培养基本培养基。本实施方式的类器官培养用细胞培养基较好是用于动物细胞或人细胞。
作为所述的无血清的细胞培养基本培养基，可例举例如用碳酸类缓冲液缓冲化至pH7.2以上且pH7.6以下的规定的合成培养基等。更具体来说，可例举补充了谷氨酰胺、胰岛素、B27 supplement(Thermo Fisher)、N-乙酰-L-胱氨酸(和光纯药工业株式会社)、青霉素或链霉素、及转铁蛋白的改良型达尔伯克改良伊格尔培养基/汉姆氏(Ham's)F-12混合培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12)。
此外，作为替代改良型达尔伯克改良伊格尔培养基/汉姆氏F-12混合培养基的培养基，还可例举RPMI1640培养基(罗斯威尔帕克纪念研究所1640培养基，Roswell ParkMemorial Institute 1640 medium)、DMEM/F12以及改良型RPMI培养基等。
上述本实施方式的类器官培养用细胞培养基实质上不含胎牛血清(fetal bovineserum(FBS)或fetal calf serum)等不确定的成分。
此外，上述类器官培养用细胞培养基在中可含5％血清。
＜Wnt激动剂＞
本说明书中，“Wnt激动剂”是指在细胞内激活T细胞因子(以下也称TCF)/淋巴增强因子(以下也称LEF)介导的转录的药剂。因此，Wnt激动剂并不仅限于Wnt家族蛋白质，包含与卷曲受体家族成员结合来激活的Wnt激动剂、细胞内β-连环蛋白、及TCF/LEF的激活物质。Wnt激动剂较好是选自Wnt蛋白、R-海绵硬蛋白、及GSK-3β抑制剂的至少1种。
Wnt激活剂与不存在该Wnt激活剂的条件下的Wnt活性的水平相比在细胞内激活Wnt活性至少10％、较好是至少20％、更好是至少30％、进一步更好是至少50％、特别好是至少90％、最好是100％。Wnt活性可使用本领域技术人员公知的方法，例如通过用pTOPFLASH及pTOPFLASH Tcf荧光素酶报告构建体测定Wnt的转录活性来进行考察(参考文献:Korinek等，1997.科学275:1784-1787)。
上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织的培养中，较好是包含Wnt激动剂。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基中所含的Wnt激动剂，更好是包含Wnt蛋白与阿法敏的复合物，进一步更好是包含Wnt蛋白与阿法敏的复合物以及R-海绵硬蛋白(R-spondin)这两者。本实施方式的类器官培养用细胞培养基中，通过包含Wnt蛋白与阿法敏的复合物以及R-海绵硬蛋白，上皮干细胞或上皮细胞可更高效地形成类器官。
[Wnt蛋白]
作为Wnt激动剂的一种的Wnt蛋白的来源无特别限定，可使用来源于各种生物的Wnt蛋白。其中，较好是来源于哺乳动物的Wnt蛋白。作为哺乳动物，可例举例如人、小鼠、大鼠、牛、猪、兔等。作为哺乳动物的Wnt蛋白，可例举Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等。本实施方式的类器官培养用细胞培养基中，Wnt蛋白可多种组合使用。
作为制造Wnt蛋白的方法，可例举例如使用Wnt蛋白表达细胞制造的方法等。Wnt蛋白表达细胞中，细胞的来源(生物种、培养形态等)无特别限定，稳定表达Wnt蛋白的细胞即可，可以是暂时表达Wnt蛋白的细胞。作为Wnt蛋白表达细胞，可例举例如稳定表达小鼠Wnt3a的L细胞(ATCC CRL-2647)、稳定表达小鼠Wnt5a的L细胞(ATCC CRL-2814)等。此外，Wnt蛋白表达细胞可使用公知的基因重组技术制作。即，通过将编码所期望的Wnt蛋白的DNA插入公知的表达载体，将所得的表达载体导入适当的宿主细胞，可制作Wnt蛋白表达细胞。编码所期望的Wnt蛋白的基因的碱基序列可从例如GenBank等公知的数据库获取。
通过Wnt蛋白表达细胞表达的Wnt蛋白只要具有Wnt活性，可以是Wnt蛋白的片段，也可以是包含除Wnt蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列的蛋白质。对于除Wnt蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列，无特别限定，可例举例如亲和性标签的氨基酸序列等。此外，Wnt蛋白的氨基酸序列不需要与可从GenBank等公知的数据库获得的氨基酸序列完全一致，只要具有Wnt活性，可以是与可从公知的数据库获得的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列。
作为与可从GenBank等公知的数据库获得的Wnt蛋白的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，可例举例如可从公知的数据库获得的氨基酸序列中1～数个氨基酸缺失、置换或添加而得的氨基酸序列等。
“1～数个氨基酸缺失、置换或添加而得的氨基酸序列”是指例如通过定向诱变法等公知的变异肽制作法等，可缺失、置换或添加的程度的数量(较好是10个以下，更好是7个以下，进一步更好是6个以下)的氨基酸缺失、置换或添加。
此外，作为实质上相同的氨基酸序列，可例举例如与可从公知的数据库获得的氨基酸序列的同源性为至少80％以上、较好是至少85％以上、更好是至少90％以上、进一步更好是至少92％以上、特别好是至少95％以上、最好是至少99％以上的氨基酸序列等。
Wnt蛋白的活性可通过例如TCF报告试验确认。一般来说，TCF曝光试验是指导入具有作为Wnt信号进入细胞后被特异性激活的转录因子的T细胞因子(TCF)的结合序列的荧光素酶基因，通过荧光素酶的发光简便地评价Wnt蛋白的活性的方法(参考文献:Molenaar等,Cell,86,391,1996.)。作为TCF报告试验以外的方法，可例举利用Wnt信号进入后细胞内的β-连环蛋白稳定化这一点，通过蛋白质印迹对β-连环蛋白的量进行定量评价的方法(参考文献:Shibamono等,Gene to cells,3,659,1998.)等。此外，对于如Wnt5a等通过非经典通路给予细胞信号的Wnt蛋白，可使用通过评价作为细胞内衔接蛋白的Dvl2的磷酸化来评价Wnt蛋白的活性(参考文献:Kikuchi等,EMBO J.,29,3470,2010.)等。
[R-海绵硬蛋白(R-spondin)]
作为Wnt激动剂的一种的R-海绵硬蛋白，可例举包括R-海绵硬蛋白1、R-海绵硬蛋白2、R-海绵硬蛋白3及R-海绵硬蛋白4的R-海绵硬蛋白家族。已知R-海绵硬蛋白家族为分泌蛋白，与Wnt信号传导通路的激活及控制相关。本实施方式的类器官培养用细胞培养基中，R-海绵硬蛋白可多种组合使用。
只要具有R-海绵硬蛋白活性，可以是R-海绵硬蛋白的片段，也可以是包含除R-海绵硬蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列的蛋白质。
[含量]
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的Wnt蛋白的浓度较好是50ng/mL以上，更好是100ng/mL以上且10μg/mL以下，进一步更好是200ng/mL以上且1μg/mL以下，特别好是300ng/mL以上且1μg/mL以下。上皮干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加Wnt激动剂一次，较好是每4天一次将类器官培养用细胞培养基更换为新鲜的培养基。
[GSK-3β抑制剂]
公知的GSK-3β抑制剂包括CHIR-99021、CHIR-98014(西格玛奥德里奇)、锂(西格玛)、肯帕罗酮(Biomol International,Leost,M.等(2000)Eur J Biochem 267,5983-5994)、6-溴靛玉红-30-丙酮肟(Meyer,L等,(2003)Chem.Biol.10,1255-1266)、SB 216763及SB 415286(西格玛奥德里奇)、以及阻止GSK-3与Axin的相互作用FRAT家族成员及来源于FRAT的肽。概述示于通过参照纳入本说明书的Merjer等(2004)Trends inPharmacological Sciences 25,471-480。用于确定GSK-3β抑制的水平的方法及试验对本领域技术人员是公知的，包括例如Liao等(2004),Endocrinology,145(6)2941-2949中记载的方法及试验。
＜阿法敏＞
本说明书中，“阿法敏”是指属于白蛋白家族的糖蛋白，已知存在于血液或体液中。用于细胞培养的培养基中通常添加的血清中包含来源于采集该血清的动物的阿法敏。血清中包含阿法敏以外的杂质等，因此本实施方式的类器官培养用细胞培养基中，较好是不使用血清，单独使用阿法敏。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基中所含的阿法敏的来源无特别限定，可使用来源于各种生物的阿法敏。其中，较好是来源于哺乳动物的阿法敏。作为哺乳动物，可例举例如与上述的“Wnt蛋白”同样的例子。主要的哺乳动物的阿法敏的氨基酸序列及编码其的基因的碱基序列可从例如GenBank等公知的数据库获取。例如，GenBank中，人阿法敏的氨基酸序列以AAA21612的登录号登录，编码其的基因的碱基序列以L32140的登录号登录，牛阿法敏的氨基酸序列以DAA28569的登录号登录，编码其的基因的碱基序列以GJ060968的登录号登录。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基中所含的阿法敏可以是对血清中所含的天然的阿法敏通过公知的方法进行纯化而得的阿法敏，也可以是重组阿法敏。重组阿法敏可通过适当使用公知的基因重组技术制造。作为重组阿法敏的制造方法，例如可将编码阿法敏的DNA插入公知的表达载体，将所得的表达载体导入适当的宿主细胞使其表达重组阿法敏，使用公知的纯化方法纯化来制造。重组阿法敏可以是添加了亲和性标签的阿法敏。添加的亲和性标签无特别限定，可从公知的亲和性标签中适当选择使用。作为亲和性标签，较好是被特异性抗体识别的亲和性标签，可例举例如FLAG标签、MYC标签、HA标签、V5标签等。
上述的Wnt蛋白由于特定的丝氨酸残基被脂肪酸(棕榈油酸)修饰，因此具有较强的疏水性。因此，周知Wnt蛋白在水溶液中容易凝集或变性，所以非常难以纯化和保存。
另一方面，该特定的丝氨酸残基的脂肪酸修饰被报道是Wnt蛋白的生理活性所必须的，参与与卷曲受体家族成员的结合。
此外，还发现在水溶液中，Wnt蛋白与阿法敏1:1结合而形成复合物，在保持高生理活性的同时，可溶化(Active and water-soluble form of lipidated Wnt protein ismaintained by A serum glycoprotein afamin/α-albumin.Mihara E,Hirai H,YamamotoH,Tamura-Kawakami K,Matano M,Kikuchi A,Sato T,Takagi J.Elife.2016Feb 23；5.)。
基于该发现，可通过培养同时表达Wnt蛋白和阿法敏这两者的细胞的方法来制造Wnt蛋白-阿法敏复合物，也可通过共培养Wnt蛋白表达细胞和阿法敏表达细胞来制造Wnt蛋白-阿法敏复合物。Wnt蛋白-阿法敏复合物中的Wnt蛋白质的活性可使用与上述的“Wnt蛋白”同样的方法评价。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的阿法敏的浓度无特别限定，较好是50ng/mL以上且10μg/mL以下，更好是100ng/mL以上且1μg/mL以下，进一步更好是300μg/mL以上且1μg/mL以下。
＜胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1，IGF1)＞
一般来说，“胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1，IGF1)”也被称作生长调节素C，是主要在肝脏中通过生长激素(GH)产生的刺激而分泌的因子。已知人体的几乎所有细胞(特别是肌肉、骨、肝脏、肾脏、神经、皮肤及肺等的细胞)都受到IGF1的影响。IGF1除了胰岛素样效果之外，还具有调节细胞生长(特别是神经细胞)及发育以及细胞DNA合成的功能。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的IGF1的浓度无特别限定，较好是5ng/mL以上且1μg/mL以下，更好是10ng/mL以上且1μg/mL以下，进一步更好是50ng/mL以上且500ng/mL以下。
通过使本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的IGF1的浓度在上述范围内，即使实质上不含EGF及p38抑制剂，也可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。
此外，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
此外，干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加IGF1一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
＜成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)＞
一般来说，“成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)”是碱性的成纤维细胞生长因子，与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factorreceptor，FGFR)结合，具有血管内皮细胞的增殖促进和促进向筒状结构的组织化、即血管新生的功能。此外，已知人FGF2具有低分子量型(LWL)和高分子量型(HWL)这2种同源异构体。LWL主要存在于细胞质，在自分泌(autocrine)中发挥作用；另一方面，HWL位于核内，在细胞内起作用的胞分泌结构中显示活性。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的FGF2的浓度无特别限定，较好是5ng/mL以上且1μg/mL以下，更好是10ng/mL以上且1μg/mL以下，进一步更好是50ng/mL以上且500ng/mL以下。
通过使本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的FGF2的浓度在上述范围内，即使实质上不含EGF及p38抑制剂，也可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。
此外，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
此外，干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加FGF2一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
＜表皮调节素(Epiregulin，EREG)＞
一般来说，“表皮调节素(Epiregulin，EREG)”是指与酪氨酸激酶(ErbB)家族受体(ErbB1～4)中的ErbB1及ErbB4特异性结合的EGF样生长因子。已知刺激角质生成细胞、干细胞、成纤维细胞、及血管内皮细胞的增殖。此外，EREG主要在膀胱、肺、肾脏、大肠等的癌肿瘤、胎盘、及外周血白血球中表达。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的EREG的浓度无特别限定，较好是5ng/mL以上且1μg/mL以下，更好是10ng/mL以上且1μg/mL以下，进一步更好是50ng/mL以上且500ng/mL以下。
通过使本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的EREG的浓度在上述范围内，即使实质上不含EGF及p38抑制剂，也可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。
此外，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
此外，干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加EREG一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
＜BMP抑制剂＞
骨形态发生蛋白(bone morphogeneitc protein，BMP)作为二聚体配体与由2种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶、I型及2型受体形成的受体复合物结合。II型受体将I型受体磷酸化，因而该受体激酶被激活。该I型受体接着将特异性受体底物(SMAD)磷酸化，因而通过信号传导通路产生转录活性。一般来说，BMP抑制剂例如为阻止或抑制BMP分子对BMP受体的结合，是为了形成中和BMP活性的复合物而结合于BMP分子的药剂。此外，BMP抑制剂例如为与BMP受体结合，阻止或抑制BMP分子对受体的结合，是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的药剂。
BMP抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的BMP活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。BMP抑制活性可通过使用本领域技术人员公知的方法(参考文献:Zilberberg et al.,BMC Cell Biol,8:41,2007.)测定BMP的转录活性来进行评价。
作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的BMP抑制剂，较好是天然的BMP结合蛋白质，可例举例如头蛋白(Noggin)、格雷林(Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、腱蛋白结构域等腱蛋白样蛋白，卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素结构域等卵泡抑素相关蛋白，DAN、含DAN半胱氨酸结结构域等DAN样蛋白，硬骨素/SOST、核心蛋白聚糖(Decorin)、α2-巨球蛋白等。
作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的BMP抑制剂，其中较好是腱蛋白样蛋白或DAN样蛋白，更好是腱蛋白样蛋白。作为腱蛋白样蛋白，较好是头蛋白。腱蛋白样蛋白和DAN样蛋白是扩散性蛋白质，以各种亲和度与BMP分子结合，可抑制BMP分子向信号传导受体的接近。培养上皮干细胞的情况下，通过将这些BMP抑制剂添加至类器官培养用细胞培养基中，可妨碍干细胞的丧失。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的BMP抑制剂的浓度较好是10ng/mL以上且100ng/mL以下，更好是20ng/mL以上且100μg/mL以下，进一步更好是50ng/mL以上且100ng/mL以下。干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加BMP抑制剂一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
＜TGF-β抑制剂＞
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是生长因子的一种，在肾脏、骨髓、血小板等几乎所有的细胞中产生。TGF-β存在种亚型(β1～β5)。此外，已知TGF-β促进成骨细胞的增殖以及如胶原等结缔组织的合成及增殖，对上皮细胞的增殖和破骨细胞起到抑制性作用。一般来说，TGF-β抑制剂例如为阻止或抑制TGF-β对TGF-β受体的结合，是为了形成中和TGF-β活性的复合物而结合于TGF-β的药剂。此外，TGF-β抑制剂例如为与TGF-β受体结合，阻止或抑制TGF-β对受体的结合，是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的药剂。
TGF-β抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的TGF-β活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。TGF-β抑制活性可通过本领域技术人员公知的方法进行评价。作为所述评价体系，可例举利用荧光素酶报告基因的人PAI-1启动子或使用含Smad结合部位的报告构建体稳定转染细胞的细胞试验(参考文献:De Gouville等,Br J Pharmacol,145(2):166-177,2005.)。
作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的TGF-β抑制剂，可例举例如A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1-苯硫基氨基甲酰基-4-喹啉-4-基吡唑)、ALK5抑制剂I(3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)-1H-吡唑)、LDN193189(4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉)、SB431542(4-[4-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)、SB-505124(2-(5-苯并[1,3]二恶唑-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物)、SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)喋啶-4-基)吡啶-4-基-胺)、SB-525334(6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉)、LY-364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉)、LY2157299(4-[2-(6-甲基-吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]-喹啉-6-羧酰胺)、TGF-βRI激酶抑制剂II 616452(2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶)、TGF-βRI激酶抑制剂III 616453(2-(5-苯并[1,3]二恶唑-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶,HCl)、TGF-βRI激酶抑制剂IX616463(4-((4-((2,6-二甲基吡啶-3-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)苯磺酰胺)、TGF-βRI激酶抑制剂VII 616458(1-(2-((6,7-二甲氧基-4-喹啉基)氧基)-(4,5-二甲基苯基)-1-乙酮)、TGF-βRI激酶抑制剂VIII 616459(6-(2-叔丁基-5-(6-甲基-吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基)-喹喔啉)、AP12009(TGF-β2反义化合物“Trabedersen”)、Belagenpumatucel-L(TGF-β2反义基因修饰同种异体肿瘤细胞疫苗)、CAT-152(青光眼-乐地单抗(抗TGF-β-2单克隆抗体))、CAT-192(美替木单抗(中和TGFβ1的人IgG4单克隆抗体)、GC-1008(抗TGF-β单克隆抗体)等。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的TGF-β抑制剂，其中较好是A83-01。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的TGF-β抑制剂的浓度较好是100nm以上且100μM以下，更好是500nM以上且5μM以下，进一步更好是500nM以上且2μM以下。干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加TGF-β抑制剂一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
＜其他成分＞
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含Rock(Rho-激酶)抑制剂。作为Rock抑制剂，可例举例如Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷羧酰胺二盐酸盐一水合物)、法舒地尔(HA1077)(5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基磺酰基)异喹啉)、H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂卓二盐酸盐)等。作为Rock抑制剂，使用Y-27632的情况下，较好是在呈单细胞分散的干细胞的培养的最初2天添加。本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的Y-27632较好是10μM。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基还添加胃泌素(或Leu15-胃泌素等适当的替代物)。本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的胃泌素(或适当的替代物)浓度可以是例如1ng/mL以上且10μg/mL以下，可以是例如1ng/mL以上且1μg/mL以下，可以是例如5ng/mL以上且100ng/mL以下。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含至少1种氨基酸。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的氨基酸，可例举例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、及其组合等。一般来说，细胞培养基所含的L-谷氨酰胺的浓度为0.05g/L以上且1g/L以下(通常为0.1g/L以上且0.75g/L以下)。此外，细胞培养基所含的其他氨基酸为0.001g/L以上且1g/L以下(通常为0.01g/L以上且0.15g/L以下)。氨基酸可来源于合成。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含至少1种维生素。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的维生素，可例举例如硫胺(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、D-泛酸钙(维生素B5)、吡哆醛/吡哆胺/吡哆素(维生素B6)、叶酸(维生素B9)、氰基钴胺(维生素B12)、抗坏血酸(维生素C)、钙化醇(维生素D2)、DL-α-生育酚(维生素E)、生物素(维生素H)、甲萘醌(维生素K)等。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含至少1种无机盐。本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的无机盐是为了帮助维持细胞的渗透压平衡并调节膜电位。作为无机盐的具体例子，可例举钙、铜、铁、镁、钾、钠、锌的盐。盐通常以氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐和碳酸氢盐的形式使用。更具体来说，盐可例举CaCl2、CuSO4·5H2O、Fe(NO3)·9H2O、FeSO4·7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4·H2O、ZnSO4·7H2O等。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含至少1种可成为碳能量源的糖。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的糖，可例举例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等。其中，作为糖，较好是葡萄糖，特别好是D-葡萄糖(右旋糖)。本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的糖的浓度较好是1g/L以上且10g/L以下。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含至少1种微量元素。作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的微量元素，可例举例如钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌、铝或它们的离子等。
本实施方式的类器官培养用细胞培养基可还包含至少1种附加药剂。作为所述药剂，可例举被报道改善干细胞培养的营养素或生长因子，例如胆固醇/转铁蛋白/白蛋白/胰岛素/黄体酮、腐胺、亚硒酸盐/其他因子等。
＜＜用于培养上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞或包含这些细胞的组织的方法＞＞
＜实施方式1＞
本发明的实施方式1所涉及的培养方法是上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织的培养方法，其中，具备：制备细胞外基质的细胞外基质制备工序；使上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞的组织粘接于所述细胞外基质上的粘接工序；在所述粘接工序后，添加上述的类器官培养用细胞培养基，对所述上皮干细胞、所述上皮细胞、所述上皮肿瘤细胞、或包含所述这些细胞的组织进行培养，形成类器官的类器官形成工序。
如果采用本实施方式的培养方法，可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。此外，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
以下，对本实施方式的培养方法中的各工序进行详细说明。
[细胞外基质制备工序]
一般来说，“细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)”是指生物中存在于细胞外的超分子结构。该ECM成为用于上皮干细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞的组织增殖的基础。
ECM包含各种各样的多糖、水、弹性蛋白、及糖蛋白。作为糖蛋白，可例举例如胶原、巢蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
作为ECM的制备方法，可例举例如使用结缔组织细胞的方法等。更具体来说，可通过培养ECM产生细胞、例如成纤维细胞之后，取出这些细胞，添加上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞的组织，从而将ECM用作基础。
作为ECM产生细胞，可例举例如主要产生胶原及蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质前胶原、及纤连蛋白的成纤维细胞，主要产生胶原(I型、III型、及V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白、及生腱蛋白-C的结肠肌成纤维细胞等。或者，可使用市售的ECM。作为市售的ECM，可例举例如细胞外基质蛋白质(英杰公司制)、来源于Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制备物(例如Matrigel(商标)(BD生物科技公司制))等。可使用ProNectin(SigmaZ378666)等合成ECM。此外，可使用天热ECM和合成ECM的混合物。
使用ECM来培养干细胞的情况下，可强化干细胞的长期生存及未分化干细胞的持续存在。在不存在ECM的条件下，无法长期培养干细胞培养物，观察不到未分化干细胞的持续存在。另外，如果存在ECM，则可培养在不存在ECM的条件下无法培养的类器官。
ECM通常沉于悬浮有细胞的培养皿的底部。例如，ECM在37℃凝固时，可加入上述的类器官培养用细胞培养基，使其扩散于ECM中使用。培养基中的细胞可通过与ECM的表面结构相互作用，例如通过与整联蛋白相互作用而固定于ECM。
ECM可被覆于培养容器等使用。作为ECM，使用纤连蛋白的情况下，培养容器中所被覆的比例较好是1μg/cm2以上且250μg/cm2以下，更好是1μg/cm2以上且150μg/cm2以下，进一步更好是8μg/cm2以上且125μg/cm2以下。
[粘接工序]
接着，准备上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织。本实施方式的培养法中所使用的上皮干细胞、上皮细胞或上皮肿瘤细胞可例举与上述的＜＜类器官培养用细胞培养基＞＞同样的例子。
作为从上皮组织分离上皮细胞的方法，可例举本技术领域中公知的方法。例如，可通过将螯合剂与分离组织恒温放置来分离隐窝。将该组织清洗之后，在玻璃玻片上讲上皮细胞层从粘膜下层剥离，切碎。然后，在含胰蛋白酶或者、较好是EDTA和EGTA中至少任一方的溶液中恒温放置，例如使用过滤和离心机中至少任一方，将未消化的组织碎片与来源于隐窝的单一细胞分离。可使用其他的蛋白质分解酶、例如胶原酶和分散酶I中的至少任一方来代替胰蛋白酶。使用同样的方法来分离胰脏和胃的碎片。
作为从上皮组织分离干细胞的方法，可例举本技术领域中公知的方法。干细胞在其表面上表达Lgr5和Lgr6中的至少任一方(Lgr5和Lgr6属于大型的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族)。作为分离方法，可例举以下的方法：从上皮组织制备细胞悬浮液，使该细胞悬浮液接触与Lgr5和Lgr6中的至少任一方结合的化学物质，分离该与Lgr5和Lgr6中的至少任一方结合的化学物质，从该结合化合物分离干细胞。
作为与Lgr5和Lgr6中的至少任一方结合的化学物质，可例举例如抗体，更具体来说，例如特异性识别Lgr5和Lgr6中的至少任一方并与其结合的单克隆抗体(例如包括小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体等)。使用这样的抗体，例如可利用磁珠，或者通过荧光激活细胞分选仪，分离表达Lgr5和Lgr6中的至少任一方的干细胞。
将通过上述的方法分离的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织接种至所述制备工序中得到的细胞基质上并静置。接种的细胞可通过与ECM的表面结构相互作用，例如通过与整联蛋白相互作用而粘接于ECM。
[类器官形成工序]
接着，细胞接种后，在细胞未干燥之前，添加上述的类器官培养用细胞培养基，进行培养。培养温度较好是30℃以上且40℃一下，更好是37℃左右。培养时间可根据使用的细胞适当调整。培养开始起1～2周左右后，可使类器官形成。此外，对于以往仅可维持培养2～3个月的细胞，通过本实施方式的培养方法，即使3个月以上的较长时间(较好是10个月左右)，也可进行细胞的维持培养。使用本实施方式的培养方法培养上皮干细胞的情况下，可长期维持分化能力，将肿瘤发生频率抑制在极低的状态。
此外，类器官形成工序中，可在低氧条件下进行培养。通过在低氧条件下进行，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
本实施方式中的低氧条件下是指氧浓度较好是0.1％以上且15％以下，更好是0.3％以上且10％以下，进一步更好是0.5％以上且5％以下。
＜实施方式2＞
本发明的实施方式2所涉及的培养方法是上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织的培养方法，其中，具备：制备细胞外基质的细胞外基质制备工序；使上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织粘接于所述细胞外基质上的粘接工序；在所述粘接工序后，添加类器官培养用细胞培养基，在低氧条件下对所述上皮干细胞、所述上皮细胞、所述上皮肿瘤细胞、或包含所述这些细胞中的至少任1种的组织进行培养，形成类器官的类器官形成工序；所述类器官培养用细胞培养基包含选自包括Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白(R-spondin)的Wnt激动剂、促分裂增殖因子、骨形态发生蛋白(bone morphogeneitc protein，BMP)抑制剂、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抑制剂、及p38抑制剂的至少1种；在氧浓度较好是0.1％以上且15％以下、更好是0.3％以上且10％以下、进一步更好是0.5％以上且5％以下的条件下进行培养。
如果采用本实施方式的培养方法，可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。此外，可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
关于本实施方式的培养方法，各工序与上述的实施方式1相同。
此外，本实施方式的培养方法中使用的类器官培养用细胞培养基包含选自包括Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白(R-spondin)的Wnt激动剂、促分裂增殖因子、BMP抑制剂、TGF-β抑制剂、及p38抑制剂的至少1种。
此外，本实施方式的培养方法中，通过在低氧条件下和正常氧条件下(氧浓度20％左右)，准备组成不同的数种类器官培养用细胞培养基进行培养，可根据培养的细胞或组织的种类，从多种条件中选择适合的条件，能够高效地形成类器官。
关于Wnt激动剂、BMP抑制剂、及TGF-β抑制剂，可例举与上述的＜＜类器官培养用细胞培养基＞＞中的示例同样的例子。此外，使用的Wnt蛋白较好是形成为与阿法敏的复合物。本实施方式的培养方法中，通过使用包含包括Wnt蛋白与阿法敏的复合物及R-海绵硬蛋白的Wnt激动剂的类器官培养用细胞培养基，则可由包括人的哺乳动物的上皮干细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织高效地形成类器官。
此外，关于本实施方式的培养方法中使用的类器官培养用细胞培养基所含的其他构成成分，以下进行详细说明。
(促分裂增殖因子)
作为本实施方式的培养方法中使用的类器官培养用细胞培养基所含的促分裂增殖因子，可例举例如表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、脑源性神经生长因子(brain derivedneurotrophic factor，BDNF)、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)等生长因子的家族。这些促分裂增殖因子可多种组合使用。
EGF是针对各种培养外胚层性细胞及中胚层性细胞的强力的分裂增殖因子，对部分的成纤维细胞的特异性细胞分化具有显著的影响。EGF前体通过蛋白质分解被切割，作为使刺激细胞的53-氨基酸肽激素生成的膜结合分子存在。
作为所述类器官培养用细胞培养基所含的促分裂增殖因子，其中较好是EGF。本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的EGF的浓度较好是5ng/mL以上且500ng/mL以下，更好是10ng/mL以上且400μg/mL以下，进一步更好是50ng/mL以上且200ng/mL以下。
此外，所述类器官培养用细胞培养基中包含KGF的情况下，也较好是与KGF同样的含量。使用多种KGF、例如KGF1及KGF2(作为FGF7及FGF10已知)的情况下，较好是KGF的总含量在上述范围内。干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加促分裂增殖因子一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
(p38抑制剂)
本说明书中，“p38抑制剂”是指直接或间接地对p38信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，p38抑制剂例如与p38结合并降低其活性。p38蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一部分。MAPK是对环境压力及炎症细胞因子等细胞外刺激进行应答，条件基因表达、有丝分裂、分化、增殖、及细胞生存/程序性死亡等各种细胞活性的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。p38MAPK作为α、β、β2、γ、及δ同源异构体存在。此外，p38抑制剂也是例如与至少1种p38同源异构体结合并降低其活性的药剂。
p38抑制剂与不存在该抑制剂的条件下的p38活性水平相比，具有较好是50％以上、更好是70％以上、进一步更好是80％以上、特别好是90％以上的抑制活性。p38抑制剂产生的抑制效果可通过本领域技术人员公知的方法进行评价。作为所述的评价体系，可例举Thr180/Tyr182磷酸化的磷酸化部位特异性抗体检测方法、生化学重组激酶试验、肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌试验、p38抑制剂用的DiscoverRx高通量筛选平台、p38活性试验试剂盒(例如密理博公司制、西格玛奥德里奇公司制等)等。
作为本实施方式的类器官培养用细胞培养基所含的p38抑制剂，可例举例如SB-202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、SB-203580(4-[4-(4-氟苯基)-2-[4-(甲基亚磺酰基)苯基]-1H-咪唑-5-基]吡啶)、VX-702(6-(N-氨基甲酰基-2,6-二氟苯氨基)-2-(2,4-二氟苯基)吡啶-3-羧酰胺)、VX-745(5-(2,6-二氯苯基)-2-[2,4-二氟苯基)硫基]-6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮)、PD-169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、RO-4402257(6-(2,4-二氟苯氧基)-2-{[3-羟基-1-(2-羟基乙基)丙基]氨基}-8-甲基吡啶并[2,3-D]嘧啶-7(8h)-酮)、BIRB-796(1-[5-叔丁基-2-(4-甲基苯基)吡唑-3-基]-3-[4-(2-吗啉-4-基乙氧基)萘-1-基]脲)等。
所述类器官培养用细胞培养基所含的p38抑制剂的浓度较好是50nm以上且100μM以下，更好是100nM以上且50μM以下，进一步更好是100nM以上且10μM以下。干细胞的培养中，较好是每2天向培养基中添加p38抑制剂一次，较好是每4天一次将培养基更换为新鲜的培养基。
＜＜类器官＞＞
本发明的实施方式1所涉及的类器官通过上述的培养方法获得。
本实施方式的类器官可应用于再生医疗、上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、使用来源于疾病的上皮类器官的新药研发等。
＜用途＞
一种实施方式中，本发明提供用于药物应答的筛选、毒性试验、或者再生医疗的上述的类器官的用途。
药物应答的筛选中，使用上述的类器官的情况下，将类器官在例如96孔板或384孔板等多孔板中进行培养。使用分子文库，鉴定对该类器官产生影响的分子。作为文库，可例举例如抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如LOPAP(商标)，西格玛奥德里奇公司制)、脂质文库(BioMol公司制)、合成化合物文库(例如LOPAP(商标)，西格玛奥德里奇公司制)或者天然化合物文库(Specs，TimTec公司制)等。另外，可使用基因文库。作为基因文库，可例举例如cDNA文库、反义文库、siRNA、或者其他非编码RNA文库等。作为具体方法，可例举将细胞在试验药剂的多个浓度暴露一定的时间，暴露时间结束时，对培养物进行评价的方法。此外，本实施方式的类器官也可用于鉴定特异性靶向上皮肿瘤细胞，但不靶向由正常细胞形成的类器官的药物。
另外，本实施方式的类器官可在新候选药物或者已知或新营养补充食品的毒性试验中代替Caco-2细胞等细胞株使用。
另外，本实施方式的类器官可用于培养目前没有适当的组织培养或动物模型的诺如病毒等病原体。
此外，本实施方式的类器官在再生医疗中，例如放射线照射后或术后的肠上皮的修复、患有克隆氏病及溃疡性结肠炎等炎症性肠疾病的患者的肠上皮的修复、或者患有短肠综合征的患者的肠上皮的修复中有用。另外，本实施方式的类器官在小肠/结肠的遗传性疾病的患者的肠上皮的修复中有用。此外，本实施方式的类器官在再生医疗中，例如作为胰脏切除后的移植物或其一部分，或者I型糖尿病及II型糖尿病等糖尿病的治疗中有用。
以下，通过实施例对本发明进行说明，但本发明并不受到以下的实施例的限制。
实施例
[实施例1]
(1)类器官培养用细胞培养基的制备
首先，向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)以最终浓度1μg/mL的条件添加人重组R-海绵硬蛋白1(R&D systems公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)。然后，制备以Wnt3a的最终浓度300ng/mL的条件添加用含血清培养基培养的来源于W-Wnt3a/HEK的培养上清的培养基(以下也称“WNRA培养基”)。
然后，添加最终浓度500ng/mL的表皮生长因子(Epiregulin)(Biolegend公司制)、最终浓度500ng/mL的IGF1(Biolegend公司制)、或者最终浓度50ng/mL的FGF2(peprotech公司制)中的至少任一种，制备构成成分为以下的组合的培养基。
·WNRA+表皮生长因子培养基
·WNRA+IGF1培养基
·WNRA+表皮生长因子+IGF1培养基
·WNRA+表皮生长因子+FGF2培养基
·WNRA+IGF1+FGF2培养基
此外，作为对照，另外制备以最终浓度50ng/mL的条件添加EGF(Thermo FicherSCIENTIFIC公司制)的培养基(以下也称“WNRA+EGF培养基”)。此外，作为参考例，另外制备以最终浓度10μM的条件添加SB202190(西格玛奥德里奇公司制)的培养基(以下也称“WNRAS+EGF培养基”)。
(2)来源于大肠肿瘤的上皮肿瘤细胞的培养
同时基于庆应义塾大学医学部伦理委员会认可的伦理研究计划，从进行说明并获得同意的大肠肿瘤患者，作为正常粘膜采集距离大肠肿瘤至少5cm以上的部分，并从大肠肿瘤采集病变组织。接着，将来源于人肿瘤组织的包含上皮肿瘤细胞的大肠肿瘤组织用释放酶(Liberase)TH分为上皮肿瘤细胞和其余组织。对于其余组织，通过胰蛋白酶进一步分散。接着，将上皮肿瘤细胞与25μL的Matrigel(注册商标)(BD生物科技公司制)一起接种至48孔板。向接种了上述上皮肿瘤细胞的孔中添加WNRA-EGF培养基(以往的方法中所用的培养基)、WNRA+表皮生长因子培养基、WNRA+IGF1培养基、WNRA+表皮生长因子+IGF1培养基、WNRA+表皮生长因子+FGF2培养基、或WNRA+IGF1+FGF2培养基各250μL，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。图1是表示自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的情况的图像。图2是对各培养基中的肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积定量化而得的图表。
根据图1和图2确认，与WNRA+EGF培养基相比，不论使用哪种培养基，类器官的面积均增大，可高效地进行培养。可知特别是使用作为包含IGF1和FGF2的培养基的“WNRA+IGF1+FGF2培养基”的情况下，可高效地培养类器官。
[实施例2]
(1)类器官培养用细胞培养基的制备
首先，制备向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)以最终浓度50ng/mL的条件添加EGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)的培养基(以下也称“ENA培养基”)。
(2)来源于大肠肿瘤的上皮肿瘤细胞的培养
使用与实施例1的(2)同样的方法获得上皮肿瘤细胞。接着，将上皮肿瘤细胞与25μL的Matrigel(注册商标)(BD生物科技公司制)一起接种至48孔板。向接种了上皮肿瘤细胞的孔中添加250μL(1)中制备的ENA培养基，在37℃以氧浓度1％(以下也称“低氧培养”)、或氧浓度20％(以下也称“正常氧培养”)的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。图3是表示自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的培养类器官的图像。
由图3确认，对于此次使用的上皮肿瘤细胞，低氧培养条件对类器官的形成是必须的。
此外，图4是表示根据55种大肠肿瘤确立的类器官的最适培养条件的图。由图4可知，正常大肠上皮类器官的培养中，作为类器官培养用细胞培养基所含的构成成分，需要包括Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白的Wnt激动剂、EGF、p38抑制剂、头蛋白、及TGF-β抑制剂的所有构成成分，而肿瘤细胞的话，可进行较少构成成分的培养。
然而，随着肿瘤话，一部分的构成成分(特别是p38抑制剂)也会使培养效率恶化(参照图4的斜线部)。此外，存在20％氧条件(正常氧条件)下使培养效率恶化，而1％氧条件(低氧条件)下可培养的情况(参照图4的横线部)。在此，大肠癌IV(M)是转移的大肠癌。
因此，可知无法在单一的培养条件下培养所有的肿瘤，通过设定以下所示的8种培养条件，确立效率提高。以下，WR(-)表示不含包括Wnt蛋白和R-海绵硬蛋白的Wnt激动剂，WR(+)表示包含包括Wnt蛋白和R-海绵硬蛋白的Wnt激动剂。
·ENA/WR(-)培养基，正常氧培养
·ENA/WR(+)培养基，正常氧培养
·ENAS/WR(-)培养基，正常氧培养
·ENAS/WR(+)培养基，正常氧培养
·ENA/WR(-)培养基，低氧培养
·ENA/WR(+)培养基，低氧培养
·ENAS/WR(-)培养基，低氧培养
·ENAS/WR(+)培养基，低氧培养
[实施例3]
(1)Wnt3a-阿法敏复合物的制备
Wnt3a-阿法敏复合物(以下也称“WAfm”)利用胎牛血清中包含牛阿法敏这一点，用含血清培养基培养仅导入Wnt3a基因的细胞，利用所分泌的Wnt3a自动与阿法敏形成稳定的复合物这一点制备。即，在含10％胎牛血清的培养基中用培养皿或多层烧瓶等培养表达N末端具有标签序列的Wnt3a的细胞(W-Wnt3a/HEK)5～7天，回收培养上清。接着，回收的培养上清离心分离，通过过滤器(0.22μm)。收集的培养上清中，使用220mL。接着，向回收的200mL的培养上清中加入3mL的P20.1抗体琼脂糖，在4℃旋转混合3小时后，将培养基通过空的柱，收集琼脂糖。另外，P20.1抗体是特异性识别Wnt3a的N末端的标签序列的抗体。接着，将收集于柱中的琼脂糖用3mL的Tris缓冲液(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.5)清洗，清洗操作重复5次。接着，每次用3mL的肽溶液(0.2mg/mL PAR4-C8肽/TBS)进行洗脱，回收洗脱液。洗脱操作重复10次，获得Wnt3a-阿法敏复合物。Wnt3a的活性通过使用W-Wnt3a/HEK的细胞上清的TCF报告试验确认，结果与市售的Wnt3a(R&D systems公司制)相比，具有10倍以上的高活性。
(2)类器官培养用细胞培养基的制备
首先，向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)以最终浓度1μg/mL的条件添加人重组R-海绵硬蛋白1(R&D systems公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)。然后，制备以Wnt3a的最终浓度300ng/mL的条件添加用含血清培养基培养的来源于W-Wnt3a/HEK的培养上清，以最终浓度100ng/mL的条件添加IGF1(Biolegend公司制)，以最终浓度50ng/mL的条件添加FGF2(peprotech公司制)的培养基(以下也称“WIFNRA培养基”)。
此外，向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)以最终浓度1μg/mL的条件添加人重组R-海绵硬蛋白1(R&D systems公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)。然后，制备以最终浓度300ng/mL的条件添加(1)中制备的Wnt3a-阿法敏复合物，以最终浓度100ng/mL的条件添加IGF1(Biolegend公司制)，以最终浓度50ng/mL的条件添加FGF2(peprotech公司制)的培养基(以下也称“WAfmIFNRA培养基”)。
此外，作为比较例，向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo FicherSCIENTIFIC公司制)以最终浓度1μg/mL的条件添加人重组R-海绵硬蛋白1(R&D systems公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)。然后，制备以Wnt3a的最终浓度300ng/mL的条件添加用含血清培养基培养的来源于W-Wnt3a/HEK的培养上清，以最终浓度50ng/mL的条件添加EGF(ThermoFicher SCIENTIFIC公司制)，以最终浓度10μM的条件添加SB202190(西格玛奥德里奇公司制)的培养基(以下也称“WENRAS培养基”)。
此外，作为比较例，向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo FicherSCIENTIFIC公司制)以最终浓度2μg/mL的条件添加人重组R-海绵硬蛋白1(R&D systems公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)。然后，制备以最终浓度300ng/mL的条件添加(1)中制备的Wnt3a-阿法敏复合物，以最终浓度50ng/mL的条件添加EGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC公司制)，以最终浓度10μM的条件添加SB202190(西格玛奥德里奇公司制)的培养基(以下也称“WAfmENRAS培养基”)。
(3)肠道干细胞的培养
同时基于庆应义塾大学医学部伦理委员会认可的伦理研究计划，从进行说明并获得同意的大肠肿瘤患者，作为正常粘膜采集距离大肠肿瘤至少5cm以上的部分，并从大肠肿瘤采集病变部位。采集的组织通过EDTA或释放酶TH提取上皮细胞，包埋于Matrigel(注册商标)。
包含上皮细胞(以下称为“肠道干细胞”)的Matrigel(注册商标)接种于48孔板，与培养基一起进行培养。具体的操作如下。
将培养后的肠道干细胞与25μL的Matrigel(注册商标)(BD生物科技公司制)一起接种至48孔板。向各孔中分别添加250μL(2)中制备的4种培养基(“WIFNRA培养基”、“WAfmIFNRA培养基”、“WENRAS培养基”、及“WAfmENRAS培养基”)，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。图5A是表示自初代培养(传代0)的培养开始后第7天的情况的图像，图5B是对各培养基中的人肠道干细胞的类器官在孔中所占的面积定量化而得的图表。图5A和图5B中，“W”表示含血清的Wnt3a，“WAfm”表示无血清的Wnt3a-阿法敏复合物。
由图5A和图5B可知，使用作为以往的培养条件的“WENRAS培养基”的情况下，自肠道干细胞的单一细胞的类器官的形成效率差，无法生长至足够的大小。另一方面，使用“WIFNRA培养基”的情况下，可以自肠道干细胞的单一细胞更高效地形成类器官。另外，将以往的含血清Wnt3a替换为无血清的Wnt3a-阿法敏复合物的情况下，基于IGF1+FGF2的单一正常上皮细胞的培养效率飞跃性地改善。
因此，可知本实施方式的类器官培养用细胞培养基对于正常上皮细胞的高通量筛选等自单一细胞的类器官的形成效率的提高非常有效。
[实施例4]
(1)Wnt3a-阿法敏复合物的制备
使用与实施例3的(1)同样的方法制备Wnt3a-阿法敏复合物。
(2)类器官培养用细胞培养基的制备
使用与实施例4的(2)同样的方法制备“WIFNRA培养基”、“WAfmIFNRA培养基”、及“WENRAS培养基”。此外，作为比较例，向市售的改良型DMEM/F-12培养基(Thermo FicherSCIENTIFIC公司制)以最终浓度2μg/mL的条件添加人重组R-海绵硬蛋白1(R&D systems公司制)，以最终浓度100ng/mL的条件添加头蛋白(Peprotech公司制)，以最终浓度500nM条件添加A83-01(Tocris公司制)。然后，制备以最终浓度300ng/mL的条件添加(1)中制备的Wnt3a-阿法敏复合物，以最终浓度100ng/mL的条件添加IGF1(Biolegend公司制)，以最终浓度50ng/mL的条件添加FGF2(peprotech公司制)，以最终浓度10μM的条件添加SB202190(西格玛奥德里奇公司制)的培养基(以下也称“WAfmIFNRAS培养基”)。
(3)来源于大肠肿瘤的上皮肿瘤细胞的培养
使用与实施例1的(2)同样的方法获得上皮肿瘤细胞。接着，将上皮肿瘤细胞与25μL的Matrigel(注册商标)(BD生物科技公司制)一起接种至48孔板。向接种了上皮肿瘤细胞的孔中分别添加250μL(2)中制备“WIFNRA培养基”、“WAfmIFNRA培养基”、“WENRAS培养基”、及“WAfmIFNRAS培养基”)，在37℃以氧浓度20％的条件进行培养。培养开始后每2天进行一次培养基的更换。图6是表示自第3次传代(传代3)的培养开始起6天后(合计培养天数26天后)、自第4次传代(传代4)的培养开始起6天后(合计培养天数33天后)、及自第6次传代(传代6)的培养开始起6天后(合计培养天数47天后)的情况的图像。图6中，“W”表示含血清的Wnt3a，“WAfm”表示无血清的Wnt3a-阿法敏复合物。
由图6可知，此次使用的来源于大肠肿瘤的上皮肿瘤细胞中，对于作为p38抑制剂的SB202190显示毒性，存在SB202190的条件下(“WENRAS培养基”、及“WAfmIFNRAS培养基”)未能发育。另一方面，采用含IGF1及FGF2的培养基(“WIFNRA培养基”)的培养中，确认了基于上皮肿瘤细胞的类器官的形成。
另外，此次使用的来源于大肠肿瘤的上皮肿瘤细胞中，包括Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白的Wnt激动剂是必须的，采用含Wnt3a的培养基(“WIFNRA培养基”)的培养中，可见Wnt3a所含的血清导致的增殖抑制，未能长期培养。另一方面，采用包含无血清的Wnt3a-阿法敏复合物的培养基(“WAfmIFNRA培养基”)的培养中，实现了长期培养。
此外，图7是表示对本实施方式中采用不同组成的类器官培养用细胞培养基的类器官的形成效率及是否可长期培养进行评价的结果的表。图7中，○表示可形成类器官且可进行1个月左右的长期培养，◎表示可高效地形成类器官且可进行1个月左右的长期培养，◎◎表示可更高效地形成类器官且可进行3个月左右的长期培养。此外，图7中，“正常氧”表示氧浓度20％左右的正常氧培养条件，“低氧”表示氧浓度1％左右的低氧培养条件。
由图7可知，如果采用本实施方式的类器官培养用细胞培养基或培养方法，则对于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织，不限细胞或组织的种类，可形成类器官，还可长期培养。
工业上利用的可能性
如果采用本实施方式的类器官培养用细胞培养基，则可长期培养来源于包括人的哺乳动物的上皮干细胞、上皮细胞、或上皮肿瘤细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织、或以往无法培养的组织。
此外，还可从所述细胞和所述组织中的至少一方高效地形成类器官。
此外，使用本实施方式的类器官培养用细胞培养基培养的上皮干细胞可长期维持分化能力，肿瘤发生频率极低。
另外，通过本实施方式的培养方法获得的类器官可应用于再生医疗、上皮细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、使用来源于疾病的上皮类器官的新药研发等。

Claims (13)

1.一种类器官制造方法，其特征在于，具备：
制备细胞外基质的细胞外基质制备工序；
使上皮干细胞、上皮细胞、上皮肿瘤细胞、或包含这些细胞中的至少任1种的组织粘接于所述细胞外基质上的粘接工序；
在所述粘接工序之后，添加类器官培养用细胞培养基，在氧浓度15％～0.1％的低氧条件下，对所述上皮干细胞、所述上皮细胞、所述上皮肿瘤细胞、或所述包含这些细胞中的至少任1种的组织进行培养，形成类器官的类器官形成工序，所述类器官培养用细胞培养基包含选自胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1，IGF1)、成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)、及表皮调节素(Epiregulin，EREG)的至少2种以及选自下述i)～iii)的成分中的至少2种：
i)Wnt激动剂、
ii)BMP抑制剂、
iii)TGF-β抑制剂，
并且所述培养基中实质上不含p38抑制剂。
2.根据权利要求1所述的类器官制造方法，其中，所述类器官培养用细胞培养基实质上不含EGF。
3.根据权利要求1所述的类器官制造方法，其中，所述类器官培养用细胞培养基包含IGF1及FGF2。
4.根据权利要求1～3中的任一项所述的类器官制造方法，其中，所述Wnt激动剂是选自Wnt蛋白、R-海绵硬蛋白、及GSK-3β抑制剂的至少1种。
5.根据权利要求4所述的类器官制造方法，其中，所述Wnt蛋白与其稳定化物质阿法敏形成复合物。
6.根据权利要求4所述的类器官制造方法，其中，所述Wnt激动剂为Wnt蛋白及R-海绵硬蛋白。
7.根据权利要求4所述的类器官制造方法，其中，所述Wnt蛋白为选自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16的至少1种。
8.根据权利要求4所述的类器官制造方法，其中，所述R-海绵硬蛋白是选自R-海绵硬蛋白1、R-海绵硬蛋白2、R-海绵硬蛋白3、及R-海绵硬蛋白4的至少1种。
9.根据权利要求1～3中的任一项所述的类器官制造方法，其中，所述BMP抑制剂是选自包括头蛋白、格雷林、腱蛋白、腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白，包括卵泡抑素、卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白，包括DAN、DAN半胱氨酸结结构域的DAN样蛋白，硬骨素/SOST、及α2-巨球蛋白的至少1种。
10.根据权利要求9所述的类器官制造方法，其中，所述BMP抑制剂为头蛋白。
11.根据权利要求1～3中的任一项所述的类器官制造方法，其中，所述TGF-β抑制剂可以是选自A83-01、SB-431542、SB-505124、SB-525334、SD-208、LY-36494、及SJN-2511的至少1种。
12.根据权利要求11所述的类器官制造方法，其中，所述TGF-β抑制剂为A83-01。
13.根据权利要求1～3中的任一项所述的类器官制造方法，其中，所述类器官培养用细胞培养基为无血清培养基。
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