WO2021241493A1 - 呼吸器オルガノイドの製造方法 - Google Patents

Abstract

呼吸器上皮細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む拡大培養培地で培養する工程、及び、得られた培養物をＦＧＦを含む分化培地で培養する工程を含む、呼吸器オルガノイドの製造方法により、呼吸器感染症の病原体の生活環を再現できるだけでなく、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる呼吸器オルガノイドを製造することができる。

Description

呼吸器オルガノイドの製造方法

　本発明は、呼吸器オルガノイドの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、呼吸器オルガノイドの製造方法、呼吸器オルガノイド、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングする方法、損傷した呼吸器上皮細胞の再生剤、及び、損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地に関する。本願は、２０２０年５月２５日に米国に仮出願された米国特許出願第６３／０２９，５６７号明細書、及び、２０２１年２月８日に米国に仮出願された米国特許出願第６３／１４６，７２０号明細書に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。

　新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）では、ウイルス感染時だけでなく、ウイルス排除後も、頻繁に重篤な呼吸器機能障害が観察される。ＣＯＶＩＤ－１９の治療を目的として抗ウイルス薬の開発が国内外で活発に行われているが、ウイルス排除後の呼吸器機能障害を治療できる薬の開発は十分には進んでいない。抗炎症薬による治療も試みられているが、炎症治癒後も呼吸器機能障害が後遺症として残ることがある。そのため、気管支肺炎等により傷害を受けた気道組織を再生できる新規医薬品の開発が不可欠である。

　ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬を開発するためには、モデル動物だけでなく、優れたインビトロ評価系の開発が不可欠である。現在までに、臓器機能の一部をインビトロで再現できるオルガノイド技術を用いて、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の生活環の再現とウイルス感染による臓器応答の解析が進められてきた（例えば、非特許文献１を参照。）。

Takayama, K., In Vitro and Animal Models for SARS-CoV-2 research, Trends Pharmacol Sci., 41 (8), 513-517, 2020.

　本発明は、呼吸器感染症の病原体の生活環を再現できるだけでなく、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる呼吸器オルガノイド技術を提供することを目的とする。

　本発明は以下の態様を含む。
［１］呼吸器オルガノイドの製造方法であって、（１－１）呼吸器上皮細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む拡大培養培地で培養する工程、及び、（１－２）得られた培養物を、ＦＧＦを含む分化培地で培養する工程、を含む、製造方法。
［２］前記工程（１－２）の前又は後に、得られた培養物を解離して気液
界面培養する工程を更に含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記呼吸器上皮細胞が、気管支上皮細胞、小気道上皮細胞及び肺胞上皮細胞からなる群より選択される１種以上の細胞である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記呼吸器上皮細胞が凍結細胞由来である、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記呼吸器上皮細胞が、体性幹細胞又は多能性幹細胞を分化誘導したものである、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記工程（１－１）において、前記呼吸器上皮細胞をゲルに包埋したうえで前記拡大培養培地で培養する、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記拡大培養培地が、ＢＭＰシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される１つ以上の物質を更に含む、［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］前記ＢＭＰシグナル阻害剤がＮｏｇｇｉｎである、［７］に記載の製造方法。
［９］前記Ｗｎｔシグナル活性化剤がＲ－ｓｐｏｎｄｉｎである、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１０］前記Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎがＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１である、［９］に記載の製造方法。
［１１］前記ｐ３８阻害剤がＳＢ２０２１９０である、［７］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］前記分化培地がＴＧＦ-β阻害剤を更に含む［１］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１である、［１２］に記載の製造方法。
［１４］前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０からなる群より選択される１つ以上の物質である、［１］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０である、［１］～［１４］のいずれかに記載の製造方法。
［１６］基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞、クラブ細胞、肺神経内分泌細胞、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞を含む、人工の呼吸器オルガノイド。
［１７］（ｉ）基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞、クラブ細胞及び肺神経内分泌細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞、（ｉｉ）Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞、又は、（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）、を含む、［１６］に記載の呼吸器オルガノイド。
［１８］頂端面が露出している、［１６］又は［１７］に記載の呼吸器オルガノイド。
［１９］［１］～［１５］のいずれかに記載の製造方法によって製造された、［１６］～［１８］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイド。
［２０］成人型の表現型を示す、［１６］～［１９］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイド。
［２１］（ｉ）アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）陽性、及び／又は、（ｉｉ）ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）陽性の表現型を示す、［２０』に記載の呼吸器オルガノイド。
［２２］呼吸器感染症の病原体の感染能及び／又は増殖能を評価する方法であって、（２－１）［１６］～［２１］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドに、前記病原体を感染させる工程、及び、（２－２）前記病原体の増殖を検出する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体である、方法。
［２３］前記工程（２－２）が、（ｉ）前記病原体のゲノムの増幅を検出する工程、（ｉｉ）前記病原体由来のタンパク質を検出する工程、（ｉｉｉ）細胞のピクノーシスを検出する工程、及び、（ｉＶ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する工程、からなる群より選択される少なくとも１つの工程によって実施される、［２２］に記載の方法。
［２４］前記病原体がウイルスである、［２２］又は［２３』に記載の方法。
［２５］前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、コロナウイルス及びｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）からなる群より選択されるいずれか１種のウイルスである、［２４］に記載の方法。
［２６］前記コロナウイルスが、ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、［２５］に記載の方法。
［２７］呼吸器感染症の治療剤をスクリーニングする方法であって、（３－１）前記呼吸器感染症の病原体を感染させた、［１６］～［２１］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドを、候補物質と接触させる工程、（３－２）前記候補物質接触後の呼吸器オルガノイドにおける、前記病原体の増殖を検出する工程、及び、（３－３）陰性対照と比較して前記増殖が抑制された候補物質を選択する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体である、方法。
［２８］前記工程（３－２）が、（ｉ）前記病原体のゲノムの増幅を検出する工程、（ｉｉ）前記病原体由来のタンパク質を検出する工程、（ｉｉｉ）細胞のピクノーシスを検出する工程、及び、（ｉＶ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する工程、からなる群より選択される少なくとも１つの工程によって実施される、［２７］に記載の方法。
［２９］呼吸器感染症の治療剤をスクリーニングする方法であって、（４－１）前記呼吸器感染症の病原体の感染により傷害された、［１６］～［２１］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドを、候補物質と接触させる工程、（４－２）前記候補物質接触後の呼吸器オルガノイドにおける、前記呼吸器オルガノイドの回復を評価する工程、及び、（４－３）陰性対照と比較して前記回復が亢進した候補物質を選択する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体である、方法。
［３０］呼吸器感染症の予防剤をスクリーニングする方法であって、（５－１）候補物質と接触させた、［１６］～［２１］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドに、前記呼吸器感染症の病原体を感染させる工程、（５－２）感染後の呼吸器オルガノイドにおける、前記病原体の増殖を検出する工程、及び、（５－３）陰性対照と比較して前記増殖が抑制された候補物質を選択する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体である、方法。
［３１］前記工程（５－２）が、（ｉ）前記病原体のゲノムの増幅を検出する工程、（ｉｉ）前記病原体由来のタンパク質を検出する工程、（ｉｉｉ）細胞のピクノーシスを検出する工程、及び、（ｉＶ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する工程、からなる群より選択される少なくとも１つの工程によって実施される、［３０］に記載の方法。
［３２］前記病原体がウイルスである、［３０］又は［３１］に記載の方法。
［３３］前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、コロナウイルス及びＲＳＶからなる群より選択されたいずれか１種のウイルスである、［３２］に記載の方法。
［３４］前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、［３３］に記載の方法。
［３５］［１６］～［２１］のいずれか一項に記載の呼吸器オルガノイドを含む、［２２］～［３４］のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
［３６］ＦＧＦ１０を有効成分とする、損傷した呼吸器上皮細胞の再生剤。
［３７］ＦＧＦ１０を含む、損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地。
［３８］ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ-β阻害剤を更に含む、［３７］に記載の損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地。

　本発明は以下の態様を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］呼吸器オルガノイドの製造方法であって、（１－１）呼吸器上皮細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む拡大培養培地で培養する工程、及び（１－２）得られた培養物を、ＦＧＦを含む分化培地で培養する工程を含む、方法。
［Ｐ２］前記呼吸器上皮細胞が、気管支上皮細胞、小気道上皮細胞、及び肺胞上皮細胞からなる群から選択される１種以上の細胞である、［Ｐ１］に記載の方法。
［Ｐ３］前記呼吸器上皮細胞が凍結細胞由来である、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の方法。
［Ｐ４］前記呼吸器上皮細胞が、体性幹細胞又は多能性幹細胞より分化誘導させたものである、［Ｐ１］又は［Ｐ２］に記載の方法。
［Ｐ５］前記呼吸器上皮細胞がマトリゲルに包埋されている、［Ｐ１］～［Ｐ４］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ６］前記工程（１－１）において、前記拡大培養培地がさらに、ＢＭＰシグナル阻害剤、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ、からなる群から選択される１つ以上の物質を含む、［Ｐ１］～［Ｐ５］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ７］前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０からなる群から選択される１つ以上の物質である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
［Ｐ８］前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０である、［Ｐ１］～［Ｐ７］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ９］前記ＢＭＰシグナル阻害剤がＮｏｇｇｉｎである、［Ｐ６］～［Ｐ８］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ１０］前記Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎがＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１である、［Ｐ６］～［Ｐ９］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ１１］基底細胞（基底幹細胞）、線毛細胞、ゴブレット細胞、クラブ細胞、肺神経内分泌細胞、Ｉ型肺胞上皮細胞、及びＩＩ型肺胞上皮細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞を含む、人工の呼吸器オルガノイド。
［Ｐ１２］（ｉ）基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞、クラブ細胞、及び肺神経内分泌細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞、（ｉｉ）Ｉ型肺胞上皮細胞、及びＩＩ型肺胞上皮細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞、又は（ｉｉｉ）前記（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、［Ｐ１１］に記載の呼吸器オルガノイド。
［Ｐ１３］［Ｐ１］～［Ｐ１０］のいずれかに記載の方法によって製造される、［Ｐ１１］又は［Ｐ１２］に記載の呼吸器オルガノイド。
［Ｐ１４］成人型の表現型を示す、［Ｐ１１］～［Ｐ１３］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイド。
［Ｐ１５］前記表現型が、（ｉ）前記呼吸器オルガノイドの呼吸器上皮細胞におけるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の高発現、及び、（ｉｉ）前記呼吸器オルガノイドの呼吸器上皮細胞におけるＩＩ　型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）の高発現から選択される少なくとも１つの表現型である、［Ｐ１４］に記載の呼吸器オルガノイド。
［Ｐ１６］呼吸器感染症の病原体の感染能及び／又は増殖能を評価する方法であって、（２－１）［Ｐ１１］～［Ｐ１５］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドに、前記病原体を感染させる工程、及び、（２－２）前記病原体の増殖を検出する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細菌、及び真菌から選択される１つ以上の病原体である、方法。
［Ｐ１７］前記工程（２－２）が、（ｉ）前記病原体のゲノムの増幅を検出する工程、（ｉｉ）前記病原体由来のタンパク質を検出する工程、（ｉｉｉ）細胞のピクノーシスを検出する工程、及び（ｉｖ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する工程から選択される少なくとも１つの工程によって実施される、［Ｐ１６］に記載の方法。
［Ｐ１８］前記病原体がウイルスである、［Ｐ１６］又は［Ｐ１７］に記載の方法。
［Ｐ１９］前記病原体がインフルエンザウイルス、コロナウイルス及びｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）のいずれか１種のウイルスである、［Ｐ１８］に記載の方法。
［Ｐ２０］前記コロナウイルスがｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、［Ｐ１９］に記載の方法。
［Ｐ２１］呼吸器感染症の治療剤をスクリーニングする方法であって、（３－１）前記呼吸器感染症の病原体を感染させた、［Ｐ１１］～［Ｐ１５］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドを、候補物質と接触させる工程、（３－２）前記候補物質接触後の呼吸器オルガノイドにおける、前記病原体の増殖を検出する工程、及び（３－３）陰性対象と比較して前記増殖が抑制されている候補物質を選択する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細菌、及び真菌から選択される１つ以上の病原体である、方法。
［Ｐ２２］前記工程（３－２）が、（ｉ）前記病原体のゲノムの増幅を検出する工程、（ｉｉ）前記病原体由来のタンパク質を検出する工程、（ｉｉｉ）細胞のピクノーシスを検出する工程、及び（ｉｖ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する工程から選択される少なくとも１つの工程によって実施される、［Ｐ２１］に記載の方法。
［Ｐ２３］呼吸器感染症の予防剤をスクリーニングする方法であって、（４－１）候補物質と接触させた、［Ｐ１１］～［Ｐ１５］のいずれか一項に記載の呼吸器オルガノイドに、前記呼吸器感染症の病原体を感染させる工程、（４－２）感染後の呼吸器オルガノイドにおける、前記病原体の増殖を検出する工程、及び（４－３）陰性対象と比較して前記増殖が抑制されている候補物質を選択する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細菌、及び真菌から選択される１つ以上の病原体である、方法。
［Ｐ２４］前記工程（４－２）が、（ｉ）前記病原体のゲノムの増幅を検出する工程、（ｉｉ）前記病原体由来のタンパク質を検出する工程、（ｉｉｉ）細胞のピクノーシスを検出する工程、及び（ｉｖ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する工程から選択される少なくとも１つの工程によって実施される、［Ｐ２３］に記載の方法。
［Ｐ２５］前記病原体がウイルスである、［Ｐ２１］～［Ｐ２４］のいずれかに記載の方法。
［Ｐ２６］前記病原体がインフルエンザウイルス、コロナウイルス及びＲＳＶのいずれか１種のウイルスである、［Ｐ２５］に記載の方法。
［Ｐ２７］前記コロナウイルスがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、［Ｐ２５］に記載の方法。
［Ｐ２８］［Ｐ１１］～［Ｐ１５］のいずれかに記載の呼吸器オルガノイドを含む、［Ｐ１６］～［Ｐ２７］のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。

　本発明によれば、呼吸器感染症の病原体の生活環を再現できるだけでなく、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる呼吸器オルガノイド技術を提供することができる。

図１は、実験例１において、気管支上皮細胞（ｎｏｒｍａｌ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ、以下、「ＮＨＢＥ」という場合がある。）におけるアセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を蛍光免疫染色した結果を示す写真である。核をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）で染色した。 図２は、実験例１において、ヒト呼吸器オルガノイド（ｈｕｍａｎ　Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ、以下、「ｈＢＯ」という場合がある。）三次元培養モデルにおけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 図３は、実験例１において撮影した、ｈＢＯ三次元培養モデルの位相差観察画像及びヘマトキシリン・エオシン染色画像を示す顕微鏡写真である。 図４は、実験例１において、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ及びヒト肺癌細胞株であるＡ５４９におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 図５は、実験例１において、免疫化学染色により、ｈＢＯ三次元培養モデルにおけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現を検出した結果を示す写真である。 図６は、実験例１において、蛍光免疫染色により、ｈＢＯ三次元培養モデルにおけるＡＣＥ２及びＫＲＴ５の発現を検出した結果を示す写真である。 図７は、実験例１において、基底幹細胞のマーカー遺伝子である、ＮＧＦＲ及びＰＲＯＭ１の、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである。 図８は、実験例１において、線毛細胞のマーカー遺伝子である、ＴＵＢＡ１Ａ及びＭＣＩＤＡＳの、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである。 図９は、実験例１において、ゴブレット細胞のマーカー遺伝子である、ＭＵＣ２０及びＭＵＣ５Ｂの、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである。 図１０は、実験例１において、クラブ細胞のマーカー遺伝子である、ＳＣＧＢ１Ａ１及びＫＬＦ５の、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである。 図１１は、実験例１において、ｈＢＯ三次元培養モデルの免疫化学染色により、ＫＲＴ５（基底幹細胞のマーカー）、アセチル化α－チューブリン（線毛細胞のマーカー）、ＭＵＣ５ＡＣ（ゴブレット細胞のマーカー）及びＣＣ１０（クラブ細胞のマーカー）の発現を検出した結果を示す顕微鏡写真である。 図１２は、実験例１において撮影した、ｈＢＯ三次元培養モデルの超薄切片の透過型電子顕微鏡写真画像である。 図１３は、実験例１において撮影した、ｈＢＯ三次元培養モデルの超薄切片の透過型電子顕微鏡写真画像である。 図１４は、実験例２において、気管支マーカーである、ＫＲＴ５、ＭＵＣ２０、ＭＣＩＤＡＳ、ＮＧＦＲ、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａ１の、ｈＢＯ三次元培養モデルにおける発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 図１５は、実験例３において、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＣＩＤＡＳ、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａ１の、ＮＨＢＥ、拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデル及び分化したｈＢＯ三次元培養モデルにおける発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 図１６は、実験例４において、ｈＢＯ三次元培養モデルのＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果に基づいて、気管支のマーカーについて作成したヒートマップである。 図１７は、実験例５における実験スケジュールを示す模式図である。 図１８は、実験例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの免疫組織化学染色により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質（ＳＰ）を検出した結果を示す写真である。 図１９は、実験例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの蛍光免疫染色により、ＳＰ及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。 図２０は、実験例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの蛍光免疫染色により、ＳＰ及びＣＣ１０を検出した結果を示す写真である。 図２１は、実験例５において、Ｃａｍｏｓｔａｔの存在下又は非存在下でｈＢＯ三次元培養モデルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、ＴＣＩＤ５０アッセイによりウイルス力価を測定した結果を示すグラフである。 図２２は、実験例５において、Ｃａｍｏｓｔａｔの存在下又は非存在下で、ｈＢＯ三次元培養モデルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、ウイルス感染から１、２、３、４、５日後に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイを行った結果を示すグラフである。 図２３は、実験例５において、ウイルス感染させていないｈＢＯ三次元培養モデル（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、Ｃａｍｏｓｔａｔの存在下でウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ＋Ｃａｍｏｓｔａｔ）におけるＲＮＡ－ｓｅｑの結果に基づいて、ＧＯ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ遺伝子セットに対してパラメトリック遺伝子セット濃縮解析（ＰＧＳＥＡ）を行った結果を示すグラフである。 図２４は、実験例５において、ウイルス感染させていないｈＢＯ三次元培養モデル（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、Ｃａｍｏｓｔａｔの存在下でウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ＋Ｃａｍｏｓｔａｔ）について、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、ＩＦＮ－β、ＩＳＧ５６及びＩＳＧ１５遺伝子の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 図２５は、実験例５において、ウイルス感染させていないｈＢＯ三次元培養モデル（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）におけるＲＮＡ－ｓｅｑの結果に基づいて作成した、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に関連する遺伝子のヒートマップである。 図２６は、実験例６における実験スケジュールを示す模式図である。 図２７は、実験例６において、ウイルスを感染させていない、ヒト呼吸器オルガノイド由来気液界面細胞培養モデル（以下、「ｈＢＯ－ＡＬＩ」という場合がある。）の蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。 図２８は、実験例６において、ウイルスを感染させていないｈＢＯ－ＡＬＩの蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン及びＡＣＥ２を検出した結果を示す写真である。 図２９は、実験例６において、ｈＢＯ三次元培養モデル、ｈＢＯ－ＡＬＩ及び気管支基底幹細胞（基底幹細胞）における、ＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＦＵＲＩＮ、ＮＧＦＲ、ＭＣＩＤＡＳ、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａの各遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。 図３０は、実験例６において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた、ｈＢＯ三次元培養モデル及びｈＢＯ－ＡＬＩの培養上清中の感染性のあるウイルスを、ＴＣＩＤ５０アッセイにより測定した結果を示すグラフである。 図３１は、実験例６において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させてから２日後のｈＢＯ－ＡＬＩの蛍光免疫染色により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＳＰ、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。 図３２は、実験例７において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｈＢＯ－ＡＬＩに感染させ、感染から７日後に、蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＳＰ、ＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。 図３３は、実験例７において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｈＢＯ－ＡＬＩに感染させ、感染から１５日後に、蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。 図３４は、実験例７において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｈＢＯ－ＡＬＩに感染させ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０を含む又は含まない分化培地で２日間培養した後に、培養上清中に含まれる感染性のあるウイルスを、ＴＣＩＤ５０アッセイにより測定した結果を示すグラフである。 図３５は、実験例７において、ウイルス感染から１５日後に、蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。 図３６は、実験例８において、それぞれ異なるドナー由来のＮＨＢＥから作製した各ｈＢＯ－ＡＬＩにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、感染から２日後に、培養上清中に含まれる感染性のあるウイルスを、ＴＣＩＤ５０アッセイにより測定した結果を示すグラフである。

［呼吸器オルガノイドの製造方法］
　１実施形態において、本発明は、呼吸器オルガノイドの製造方法であって、（１－１）呼吸器上皮細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む拡大培養培地で培養する工程、及び、（１－２）得られた培養物を、ＦＧＦを含む分化培地で培養する工程、を含む、製造方法を提供する。

　実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、呼吸器感染症の病原体の生活環を再現できるだけでなく、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる呼吸器オルガノイド（以下、「ＢＯ」という場合がある。また、ヒトＢＯを「ｈＢＯ」という場合がある。）を製造することができる。

　工程（１－１）で培養する呼吸器上皮細胞は、気管支上皮細胞、小気道上皮細胞及び肺胞上皮細胞からなる群より選択される１種以上の細胞であることができる。呼吸器上皮細胞は、ヒト又は非ヒト動物の生体から採取された細胞であってもよく、凍結保存された細胞であってもよい。あるいは、呼吸器上皮細胞は、ヒト又は非ヒト動物由来の体性幹細胞又は多能性幹細胞を分化誘導したものであってもよい。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等が挙げられる。本明細書において、非ヒト動物としては、特に限定されず、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、サル等が挙げられる。

　まず、工程（１－１）において、呼吸器上皮細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む拡大培養培地で培養する。培養方法は平板培養であってもよく、三次元培養であってもよく、気液界面培養であってもよい。また細胞外マトリックス成分無しでオルガノイドを培養してもよい。この方法を用いれば、頂端部が外になる（頂端面が露出した）オルガノイド（ａｐｉｃａｌ－ｏｕｔ　３Ｄ　ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）作製が可能となる。これにより、呼吸器オルガノイドが形成される。工程（１－１）では、呼吸器上皮細胞をゲルに包埋したうえで拡大培養培地で培養することが好ましい。これにより、呼吸器オルガノイドを形成させやすくなる。

　ゲルとしては、細胞外マトリックス成分がゲル化したもの、細胞外マトリックス成分以外の成分から構成されたもの等が挙げられる。細胞外マトリックス成分としては、例えば、基底膜に含まれる成分、細胞間隙に存在する糖タンパク質が挙げられる。基底膜に含まれる成分としては、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びエンタクチンが挙げられる。細胞間隙に存在する糖タンパク質としては、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ヘパリン硫酸塩等が挙げられる。細胞外マトリックス成分以外の成分から構成されたゲルとしては、例えば、ゲル化したカルボキシメチルセルロース、アルギン酸カルシウムゲル等が挙げられる。ゲルとしては、中でも、マトリゲル（コーニング）が好ましく用いられる。

　例えば、マトリゲルに細胞を包埋して、細胞培養ディッシュの表面にドーム構造を作製し、そこに拡大培養培地を加えて培養するとよい。

　拡大培養培地は、ＦＧＦに加えて、ＢＭＰシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される１つ以上の物質を更に含むことが好ましい。

　拡大培養培地が含むＦＧＦは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０からなる群より選択される１つ以上の物質であることが好ましく、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０であることがより好ましい。ヒトＦＧＦ２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００１３４８５９４．１、ＮＰ＿００１９９７．５等である。ヒトＦＧＦ７タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００２０００．１等である。ヒトＦＧＦ１０タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００４４５６．１等である。拡大培養培地が含むＦＧＦの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ程度であってよい。

　ＢＭＰシグナル阻害剤としては、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９（ＣＡＳ番号：１０６２３６８－６２－０）、ＤＭＨ－１（ＣＡＳ番号：１２０６７１１－１６－１）等が挙げられ、中でも、Ｎｏｇｇｉｎであることが好ましい。拡大培養培地が含むＢＭＰシグナル阻害剤の濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ程度であってよい。

　Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）等が挙げられ、中でも、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎであることが好ましい。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎとしては、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　２、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　３等が挙げられ、中でもＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１であることが好ましい。拡大培養培地が含むＷｎｔシグナル活性化剤の濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ程度であってよい。

　ｐ３８阻害剤としては、ＳＢ２０２１９０（ＣＡＳ番号：１５２１２１－３０－７）、Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ（ＣＡＳ番号：２８５９８３－４８－４）、ＳＢ２０３５８０（ＣＡＳ番号：１５２１２１－４７－６）、ＦＲ１６７６５３（ＣＡＳ番号：１５８８７６－６６－５）等が挙げられ、中でもＳＢ２０２１９０であることが好ましい。拡大培養培地が含むｐ３８阻害剤の濃度は、１０μＭ～１，０００μＭ程度であってよい。

　拡大培養培地で培養して得られた呼吸器オルガノイドは、継代することができる。継代は、呼吸器オルガノイドを一度解離させて、再度拡大培養培地で培養することにより行うことができる。呼吸器オルガノイドの解離は、機械的せん断処理及び／又は酵素処理により行うことができる。呼吸器オルガノイドを継代する場合においても、解離させた呼吸器オルガノイドをゲルに包埋したうえで拡大培養培地で培養することが好ましい。

　続いて、工程（１－２）において、工程（１－１）で得られた培養物（呼吸器オルガノイド）を、ＦＧＦを含む分化培地で培養する。実施例において後述するように、呼吸器オルガノイドを分化培地で培養することにより、呼吸器オルガノイドにおける気管支マーカーの発現レベルを上昇させ、成熟させることができる。気管支マーカーとしては、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＣＩＤＡＳ、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａ１等が挙げられる。

　分化培地は、ＦＧＦに加えて、ＴＧＦ-β阻害剤を更に含むことが好ましい。

　分化培地が含むＦＧＦは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０からなる群より選択される１つ以上の物質であることが好ましく、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０であることがより好ましい。分化培養培地が含むＦＧＦの濃度は、１ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ程度であってよい。

　ＴＧＦ－β阻害剤としては、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＬＹ２１０９７６１（ＣＡＳ番号：７００８７４－７１－１）等が挙げられ、中でもＡ８３－０１であることが好ましい。拡大培養培地が含むＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、０．１μＭ～１００μＭ程度であってよい。

　実施例において後述するように、工程（１－１）及び工程（１－２）を含む製造方法により製造された呼吸器オルガノイドは、生体と同様に、少なくとも、基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞及びクラブ細胞を含む。呼吸器オルガノイドは直径約１００～２００μｍの球形であり、オルガノイドの外縁は基底幹細胞を含み、オルガノイドの内腔に線毛細胞を含む。

　また、実施例において後述するように、発明者らは、呼吸器オルガノイドの基底幹細胞は新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染・複製効率が低く、線毛細胞では高いことを明らかにした。したがって、外縁に基底幹細胞を含み、内腔に線毛細胞を含む呼吸器オルガノイドにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が基底幹細胞側から感染することになるため、感染・複製効率は高くない。

　本実施形態の呼吸器オルガノイドの製造方法において、上記工程（１－２）の前又は後に、得られた培養物（呼吸器オルガノイド）を解離して気液界面培養する工程を更に含むことが好ましい。

　呼吸器オルガノイドを解離して気液界面培養することにより、呼吸器オルガノイド由来気液界面細胞培養モデル（ＢＯ－ＡＬＩ）を得ることができる。実施例において後述するように、ＢＯ－ＡＬＩでは、線毛細胞が存在する頂端面が露出する。その結果、ＢＯ三次元培養モデルと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染・複製効率を格段に向上させることができる。

［呼吸器オルガノイド］
　１実施形態において、本発明は、基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞、クラブ細胞、肺神経内分泌細胞、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞を含む、人工の呼吸器オルガノイドを提供する。本実施形態の呼吸器オルガノイドは、上述した製造方法により製造することができる。

　呼吸器オルガノイドは、頂端面が露出していることが好ましい。線毛細胞が存在する頂端面が露出した呼吸器オルガノイドは、呼吸器オルガノイドを解離して平面培養、好ましくは気液界面培養することにより得ることができる。

　本実施形態の呼吸器オルガノイドは、（ｉ）アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）陽性、及び／又は、（ｉｉ）ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）陽性の表現型を示すことが好ましい。

　ここで、ＡＣＥ２陽性であるとは、呼吸器オルガノイドの作製に使用した呼吸器上皮細胞と比較して、ＡＣＥ２遺伝子又はＡＣＥ２タンパク質の発現レベルが有意に上昇していることを意味する。

　また、ＴＭＰＲＳＳ２陽性であるとは、呼吸器オルガノイドの作製に使用した呼吸器上皮細胞と比較して、ＴＭＰＲＳＳ２遺伝子又はＴＭＰＲＳＳ２タンパク質の発現レベルが有意に上昇していることを意味する。

　ＡＣＥはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体であり、ＴＭＰＲＳＳ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を切断して活性化するプロテアーゼである。したがって、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２のいずれか、好ましくは双方の発現が陽性である呼吸器オルガノイドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染・複製効率が高く、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生活環を再現できるインビトロモデルとして有用である。

［呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングする方法］
　１実施形態において、本発明は、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングする方法であって、（３－１）前記呼吸器感染症の病原体を感染させた、上述したいずれかの呼吸器オルガノイドを、候補物質と接触させる工程、（３－２）前記候補物質接触後の呼吸器オルガノイドにおける、前記病原体の増殖又は前記病原体の感染により生じた傷害を検出する工程、及び、（３－３）陰性対照と比較して前記増殖又は前記傷害が抑制された候補物質を選択する工程、を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体である方法を提供する。

　まず、工程（３－１）において、呼吸器感染症の病原体を感染させた呼吸器オルガノイドを候補物質と接触させる。

　ここで、呼吸器オルガノイドとしては、上述したものが挙げられ、具体的には、ＢＯ又はＢＯ－ＡＬＩが好ましく用いられる。

　病原体は、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体が挙げられる。目的に応じて、病原体は１種を単独で感染させてもよいし、２種以上を混合して感染させてもよい。病原体はウイルスであってもよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）等が挙げられる。コロナウイルスとしては、ｓｅｖｅｒｅ　ａｃｕｔｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ　２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が挙げられる。

　候補物質としては、特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。

　続いて、工程（３－２）において、候補物質接触後の呼吸器オルガノイドにおける、病原体の増殖又は前記病原体の感染により生じた傷害を検出する。

　病原体の増殖を検出する方法としては、特に限定されず、例えば、前記病原体のゲノムの増幅を検出する方法、病原体由来のタンパク質を検出する方法等が挙げられる。また、病原体の感染により生じた呼吸器オルガノイドの傷害を検出する方法としては、特に限定されず、呼吸器オルガノイドを構成する細胞のピクノーシスを検出する方法、呼吸器オルガノイドからの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を検出する方法等が挙げられる。これらの方法は、いずれか１つを単独で実施してもよいし、２つ以上を組み合わせて実施してもよい。

　陰性対照と比較して前記増殖又は前記傷害が抑制された候補物質は、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤であるということができる。ここで、陰性対照としては、候補物質を接触させていない呼吸器オルガノイド等を用いることができる。

　工程（３－１）において、病原体、呼吸器オルガノイド、候補物質はいずれの順序で接触させてもよい。例えば、病原体を呼吸器オルガノイドに接触させ、感染させた後に、候補物質を接触させてもよい。この場合に、病原体の増殖を抑制する候補物質、あるいは、病原体の感染により生じた傷害を抑制する（病原体の感染により生じた傷害を回復させる）候補物質は、呼吸器感染症の治療剤であるということができる。

　あるいは、工程（３－１）において、呼吸器オルガノイドに候補物質を接触させた後に病原体を接触させてもよい。この場合に病原体の増殖を抑制する候補物質、あるいは、病原体の感染により生じた傷害を抑制する（病原体の感染により発生する傷害を未然に抑制する）候補物質は、呼吸器感染症の予防剤であるということができる。

　実施例において後述するように、発明者らは、ＢＯ－ＡＬＩへのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、線毛細胞は死滅するが、基底幹細胞は残存することを明らかにした。基底幹細胞は気道を構成する他の上皮細胞に分化可能であることから、基底幹細胞の複製・分化機構を解明し、基底幹細胞を自在に制御できれば、基底幹細胞を標的とした気道組織再生を行うことができると考えられる。このような取り組みにより、抗ウイルス薬や抗炎症薬とは異なる作用点を持つ薬を開発できれば、ＣＯＶＩＤ－１９の治療法の選択肢が増えると期待できる。

［損傷した呼吸器上皮細胞の再生剤］
　１実施形態において、本発明は、ＦＧＦ１０を有効成分とする、損傷した呼吸器上皮細胞の再生剤を提供する。実施例において後述するように、発明者らは、呼吸器感染症の病原体の感染により損傷した呼吸器上皮細胞の再生にＦＧＦ１０が必須であることを明らかにした。

　したがって、本実施形態の再生剤により、呼吸器感染症の病原体の感染により損傷した呼吸器上皮細胞を再生させることができる。

　病原体としては、上述したものと同様であり、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体が挙げられる。病原体はウイルスであってもよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ＲＳＶ等が挙げられる。コロナウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が挙げられる。

　本実施形態の再生剤は、呼吸器感染症の病原体の感染により損傷した呼吸器上皮細胞を再生させることによる、呼吸器感染症の治療剤であるということができる。

　１実施形態において、本発明は、ＦＧＦ１０の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、呼吸器感染症の治療方法を提供する。ＦＧＦ１０は、注射剤、点鼻薬、エアースプレー剤等の剤型に製剤化されていることが好ましい。

　１実施形態において、本発明は、呼吸器感染症の治療における使用のためのＦＧＦ１０を提供する。

　１実施形態において、本発明は、呼吸器感染症の治療剤を製造するためのＦＧＦ１０の使用を提供する。

［損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地］
　１実施形態において、本発明は、ＦＧＦ１０を含む、損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地を提供する。実施例において後述するように、発明者らは、ＦＧＦ１０を含む培地により、呼吸器感染症の病原体の感染により損傷した呼吸器上皮細胞を再生させることができることを明らかにした。

　本実施形態の培地は、Ｒｈｏ－キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、ＴＧＦ-β阻害剤を更に含むことが好ましい。

　ＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１２９８３０－３８－２）、ＨＡ１０７７（ＣＡＳ番号：１０３７４５－３９－７）、Ｈ－１１５２（ＣＡＳ番号：８７１５４３－０７－６）等が挙げられる。ＴＧＦ-β阻害剤については上述したものと同様である。

　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［材料および方法］
（ヒト呼吸器オルガノイド（ｈＢＯ）三次元培養モデル及びヒト呼吸器オルガノイド由来気液界面細胞培養モデル（ｈＢＯ－ＡＬＩ）の培養）
　ｈＢＯ三次元培養モデルを調製する場合には、まず、正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ、ロンザ）を１０ｍｇ／ｍＬの冷やしたマトリゲル（成長因子低減、ＧＦＲ）に懸濁した。続いて、細胞懸濁液５０μＬずつの液滴を、予め３７℃に温めた２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上で１０分間インキュベートし固化した。続いて、５００μＬの拡大培養培地を各ウェルに添加した。拡大培養培地の組成を下記表１に示す。培地は２日ごとに交換した。

　形成されたｈＢＯ三次元培養モデルは次のようにして継代した。ｈＢＯ三次元培養モデルを１ｍＬの０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（ナカライテスク）に懸濁し、Ｐ１０００ピペットチップを用いて機械的にせん断した。続いて、２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を懸濁液に加えた。続いて、室温で５分間インキュベートした後に、ｈＢＯ三次元培養モデルを再びＰ１０００ピペットチップを用いて機械的にせん断した。続いて、７ｍＬの拡大培養培地を加えてチューブに移し、４００ｒｐｍで遠心した。続いて、オルガノイドの断片を冷やした拡大培養培地で再懸濁し、上述したように播種した。ｈＢＯ三次元培養モデルは１０日ごとに継代した。

　ｈＢＯ三次元培養モデルを成熟させる場合には、拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデルを分化培地中で５日間培養した。分化培地の組成を下記表１に示す。表１中、「＋」は含有していることを示し、「－」は含有していないことを示す。ｈＢＯ三次元培養モデルはＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ　ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ（タカラバイオ）を使用して凍結保存することができた。

　ｈＢＯ－ＡＬＩを調製する場合には、２４ウェルプレートで培養された増殖中のｈＢＯ三次元培養モデルを解離させた後、２４ウェルプレートに装着したトランズウェルインサート（コーニング）内に播種した。成熟を促進するために、ｈＢＯ－ＡＬＩを分化培地中で５日間培養した。

（Ａ５４９の培養）
　ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ペニシリン－ストレプトマイシンを添加した、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中で培養した。Ａ５４９は４日ごとに継代した。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の調製）
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｈｕ／ＤＰ／Ｋｎｇ／１９－０２０株及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｈｕ／ＤＰ／Ｋｎｇ／１９－０２７株）は神奈川県衛生研究所から入手した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は日本におけるＣＯＶＩＤ－１９患者から単離された（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＣ５２８２３２．１及びＬＣ５２８２３３．１）。各ウイルスはプラークを形成させて精製し、Ｖｅｒｏ細胞中で増殖させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は－８０℃で保存した。ウイルスの感染実験を含むすべての実験は、京都大学及び大阪大学のバイオセーフティーレベル３の施設で規制に厳密に従って行った。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染及び薬剤処理）
　２４ウェルプレートで培養したｈＢＯ三次元培養モデル（約１００個のオルガノイド）及び２４ウェルプレートに装着したトランズウェルインサート中で培養したｈＢＯ－ＡＬＩ（約１００個のオルガノイドから調製した。）に、０．７×１０^５又は１．３×１０^５　ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた。

　ｈＢＯ三次元培養モデルへの感染実験では、毎日、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む分化培地の半分を新しい分化培地に交換した。薬剤処理実験では感染後のｈＢＯ三次元培養モデルをＣａｍｏｓｔａｔ（カタログ番号「ＳＭＬ００５７」、シグマ－アルドリッチ）を含む分化培地で５日間培養した。なお、Ｃａｍｏｓｔａｔは、ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬としての臨床試験が行われている化合物の１つである。

　ｈＢＯ－ＡＬＩへの感染実験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む分化培地でｈＢＯ－ＡＬＩを９０分間培養した。その後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む分化培地を新しい分化培地と交換した。

（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス力価測定）
　ウイルスの力価は、京都大学のバイオセーフティーレベル３の研究室でｍｅｄｉａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｏｓｅ（ＴＣＩＤ５０）アッセイにより測定した。

　９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック）にＴＭＰＲＳＳ２／Ｖｅｒｏ細胞（カタログ番号「ＪＣＲＢ１８１８」、ＪＣＲＢセルバンク）を播種した。培地としては、５％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ、シグマ－アルドリッチ）を使用した。

　試料を１０^－１～１０^－８まで１０倍ずつ希釈した。希釈した試料をＴＭＰＲＳＳ２／Ｖｅｒｏ細胞に添加し、３７℃で９６時間インキュベートした（ｎ＝３）。続いて、顕微鏡で観察し、細胞変性効果を評価し、リード－ミュンヒの方法によりＴＣＩＤ５０／ｍＬを計算した。

　ｈＢＯ三次元培養モデル、ｈＢＯ－ＡＬＩ、気管支基底幹細胞からＩＳＯＧＥＮＥ　ＩＩ（ニッポンジーン）を用いて全ＲＮＡを抽出した。続いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて全ＲＮＡ５００ｎｇからｃＤＮＡを合成した。

　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及びＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行った。

　標的ｍＲＮＡの発現レベルの相対的定量は２^{－ΔΔＣＴ}法により行った。値はハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの値で基準化した。使用したプライマーの塩基配列を下記表２に示す。

（超薄切片の透過型電子顕微鏡観察）
　ｈＢＯ三次元培養モデルをリン酸緩衝された２％グルタルアルデヒドで固定した。続いて、２％四酸化オスミウム中４℃で２時間後固定を行った。固定の後、試料を一連のエタノール中で脱水し、エポキシ樹脂中に包埋した。続いて、超薄切片を切り取り、酢酸ウラニルと鉛染色液で染色し、電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｈ－７６００）を用いて１００ｋＶで観察した。

（組織病理学及び免疫蛍光法）
　固定したｈＢＯ三次元培養モデル試料を処理し、パラフィン中に包埋した。続いて、２μｍの厚さに切り出し、切片を脱パラフィンし、再水和し、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）で染色した。切片は顕微鏡（ＢＸ５３、オリンパス）及びカメラ（ＤＰ７３、オリンパス）を用いて観察した。

　免疫染色は、次のようにして行った。ホルマリン固定し、パラフィン包埋したｈＢＯ三次元培養モデル試料を、ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｏｏｋｅｒ（ダコジャパン）を用いてクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中、１２５℃３０秒間処理し、抗原賦活化した。切片を各抗体と反応させ、続いて、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ　Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｔａｉｎ　ＭＡＸ－ＰＯ（ニチレイバイオサイエンス）と反応させた。使用した抗体を下記表３に示す。切片をＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｔａｉｎ　ＤＡＢ　Ｋｉｔ（ナカライテスク）で染色した後、マイヤーヘマトキシリン溶液で対比染色した。

　感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの二重蛍光免疫染色は、次のようにして行った。切片を脱パラフィン紙、０．５％トリプシンで３０分間処理して抗原賦活化した。続いて、非特異反応を抑制するために、切片を、ＰＢＳ中の５％スキムミルク及びアルブミン（ウシ胎児血清Cohn Fraction V由来、ｐＨ７．０、富士フイルム和光純薬）で、室温、３０分間ブロッキングした。続いて、切片を１次抗体（表３）と４℃で一晩反応させ、洗浄し、２次抗体と室温で１時間反応させた。

　感染させていないｈＢＯ－ＡＬＩ及び感染させたｈＢＯ－ＡＬＩの二重蛍光免疫染色は、次のようにして行った。細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中、４℃で固定した。続いて、細胞を２％ウシ血清アルブミン及び０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳ中、室温で４５分間ブロッキングした。続いて、細胞を１次抗体（表３）と４℃で一晩反応させ、洗浄し、２次抗体と室温で１時間反応させた。

（ＲＮＡ－ｓｅｑ）
　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて全ＲＮＡを調製した。続いて、２１００　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレントテクノロジー）でＲＮＡの完全性を確認した。続いて、ＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　ＩＩ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ）又はＴｒｕＳｅｑ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｍＲＮＡ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐ　ｋｉｔ（イルミナ）を用いて、各メーカーの説明書にしたがってライブラリ調製を行った。

　ＮｅｘｔＳｅｑ５００（イルミナ）又はＮｏｖａＳｅｑ６０００（イルミナ）を用い、それぞれ１５２塩基又は１０１塩基のシングルエンドモードでシーケンスした。続いて、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２を用いてＦａｓｔｑファイルを生成した。続いて、ｃｕｔａｄａｐｔ　ｖｅｒ　２．７を用いて生のリードからアダプター配列をトリミングした。ＨＩＳＡＴ２　ｖｅｒ　２．１．０を用いて、トリミングされたリードをヒト参照ゲノム配列（ｈｇ１９）にマッピングした。

　ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ　ｖｅｒ　２．０．０を使用してｒａｗカウントを計算し、ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｔｈｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ｉＤＥＰ、http://ge-lab.org/idep/）によるヒートマップの可視化に使用した。本実験の生データはＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）にアクセッション番号：ＧＳＥ１５０８１９として提出した。

（ＬＤＨアッセイ）
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の後に、培養上清２５０μＬ中に存在する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）をＬＤＨ－Ｇｌｏ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてメーカーの説明書にしたがってモニターした。吸光度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して波長４９０ｎｍで測定した。感染していない細胞におけるＬＤＨの放出を対照として使用した。

（統計解析）
　統計解析は対応のない両側スチューデントのｔ検定により行った。統計的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くテューキーまたはダネットの事後検定によって評価した。３つの独立した実験の代表的な結果を使用した。

［実験例１］
（凍結保存された成人由来気管支上皮細胞からのヒト呼吸器オルガノイドの作製）
　発明者らは、凍結保存された成人由来気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）からヒト呼吸器オルガノイド（ｈＢＯ）三次元培養モデルを作製することができる条件を検討した。

　図１は、ＮＨＢＥにおけるアセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を蛍光免疫染色した結果を示す写真である。核をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）で染色した。その結果、ほとんどのＮＨＢＥがＫＲＴ５陽性であるが、アセチル化α－チューブリン陰性であることが明らかとなり、ほとんどのＮＨＢＥが基底幹細胞であることが明らかとなった。

　また、検討の結果、ＮＨＢＥをマトリゲルに包埋し、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１、Ｙ－２７６３２及びＳＢ２０２１９０を含むａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（拡大培養培地、上記表１に組成を示す。）中で培養することにより、ｈＢＯ三次元培養モデルを作製することができることが明らかとなった。

　更に、ｈＢＯ三次元培養モデルを、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、Ｙ－２７６３２及びＡ８３－０１を含むａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（分化培地、上記表１に組成を示す。）中で培養することにより、成熟させることができることが明らかとなった。

　続いて、拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデルを、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１又はＮｏｇｇｉｎを含む培地で５日間培養した。続いて、ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。図２は、定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである（ｎ＝３）。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くダネットの事後検定によって評価した。図２に示す値は、ＦＧＦ２を含む培地における測定値を１とする相対値で示した。図２中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。その結果、培地に含まれる増殖因子のうち、ＦＧＦ２がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルの増強に重要であることが明らかとなった。

　図３は、ｈＢＯ三次元培養モデルの位相差観察画像及びヘマトキシリン・エオシン染色画像を示す顕微鏡写真である。５０μＬのマトリゲル中に約１００個のｈＢＯが存在し、各ｈＢＯの直径は約１００～２００μｍであった。

　ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ及びＡ５４９におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。図４は、定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである（ｎ＝３）。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くダネットの事後検定によって評価した。図４に示す値は、ｈＢＯ三次元培養モデルにおける測定値を１とする相対値で示した。図４中、同じ文字を共有していないグループは互いにｐ＜０．０５で有意差があることを示す。その結果、ｈＢＯ三次元培養モデルにおけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルは、ＮＨＢＥ及びＡ５４９におけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現レベルよりも有意に高いことが明らかとなった。

　続いて、免疫化学染色により、ｈＢＯ三次元培養モデルにおけるＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の発現を検出した。図５は免疫化学染色の結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。図５中、矢印はＴＭＰＲＳＳ２の発現が検出された位置を示す。また、ｈＢＯにおけるＡＣＥ２及びＫＲＴ５の発現を蛍光免疫染色により検出した。ＫＲＴ５は基底幹細胞のマーカーである。図６は蛍光免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。核をＤＡＰＩで対比染色した。その結果、ＡＣＥ２はｈＢＯの外縁の一部に発現しており、ＴＭＰＲＳＳ２はｈＢＯの外縁の一部及び内腔の一部に発現することが明らかとなった。

　気管支は、基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞及びクラブ細胞を含む。そこで、ｈＢＯ三次元培養モデルにおけるこれらの各細胞のマーカー遺伝子の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。

　図７は、基底幹細胞のマーカー遺伝子である、ＮＧＦＲ及びＰＲＯＭ１の、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図８は、線毛細胞のマーカー遺伝子である、ＴＵＢＡ１Ａ及びＭＣＩＤＡＳの、ｈＢＯ、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図９は、ゴブレット細胞のマーカー遺伝子である、ＭＵＣ２０及びＭＵＣ５Ｂの、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図１０は、クラブ細胞のマーカー遺伝子である、ＳＣＧＢ１Ａ１及びＫＬＦ５の、ｈＢＯ三次元培養モデル、ＮＨＢＥ、Ａ５４９における発現レベルの測定結果を示すグラフである（ｎ＝３）。

　図７～１０に示す値は、ｈＢＯ三次元培養モデルにおける測定値を１とする相対値で示した。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くダネットの事後検定によって評価した。図７～１０に示す値は、ｈＢＯ三次元培養モデルにおける測定値を１とする相対値で示した。図７～１０中、同じ文字を共有していないグループは互いにｐ＜０．０５で有意差があることを示す。

　その結果、ｈＢＯ三次元培養モデルにおける、基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞及びクラブ細胞のマーカー遺伝子の発現レベルは、ＮＨＢＥにおける発現レベルよりも有意に高いことが明らかとなった。

　図１１は、ｈＢＯ三次元培養モデルの免疫化学染色により、ＫＲＴ５（基底幹細胞のマーカー）、アセチル化α－チューブリン（線毛細胞のマーカー）、ＭＵＣ５ＡＣ（ゴブレット細胞のマーカー）及びＣＣ１０（クラブ細胞のマーカー）の発現を検出した結果を示す顕微鏡写真である。その結果、免疫化学染色の結果からも、ｈＢＯ三次元培養モデルは、ＫＲＴ５、アセチル化α－チューブリン、ＭＵＣ５ＡＣ、ＣＣ１０を発現することが確認された。また、ｈＢＯの外縁はＫＲＴ５陽性であり、内腔はアセチル化α－チューブリン陽性であることが明らかとなった。

　以上の結果から、基底幹細胞がＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２の双方を発現し、線毛細胞はＴＭＰＲＳＳ２のみを発現することが示された。

　図１２、１３は、ｈＢＯ三次元培養モデルの超薄切片の透過型電子顕微鏡写真画像である。その結果、線毛細胞、ゴブレット細胞、基底幹細胞、９＋２構造、線毛及び微絨毛観察された。

　以上の結果から、凍結保存された成人由来のＮＨＢＥから拡大培養可能な機能的なｈＢＯを作製できたことが示された。

［実験例２］
（ＦＧＦ２処理が気管支マーカーの発現レベルを増強させた）
　拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデルを、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ　１又はＮｏｇｇｉｎを含む培地で５日間培養した。続いて、気管支マーカーである、ＫＲＴ５、ＭＵＣ２０、ＭＣＩＤＡＳ、ＮＧＦＲ、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａ１の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。図１４は、定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである（ｎ＝３）。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くダネットの事後検定によって評価した。図１４に示す値は、ＦＧＦ２を含む培地における測定値を１とする相対値で示した。図１４中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを示し、「＊＊＊＊」はｐ＜０．０００１で有意差があることを示す。その結果、培地に含まれる増殖因子のうち、ＦＧＦ２が気管支マーカーの発現レベルの増強に重要であることが明らかとなった。

［実験例３］
（ＮＨＢＥ、拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデル及び分化したｈＢＯ三次元培養モデルにおける気管支マーカーの発現レベルの比較）
　ＮＨＢＥ、拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデル及び分化したｈＢＯ三次元培養モデルにおける気管支マーカーの発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。気管支マーカーとしては、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＣＩＤＡＳ、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａ１を検討した。

　図１５は、定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである（ｎ＝３）。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くダネットの事後検定によって評価した。図１５に示す値は、ＮＨＢＥにおける測定値を１とする相対値で示した。その結果、気管支マーカーの発現レベルは、ＮＨＢＥ、拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデル及び分化したｈＢＯ三次元培養モデルの順に高くなることが明らかとなった。

［実験例４］
（ｈＢＯ三次元培養モデルのＲＮＡ－ｓｅｑ解析）
　ｈＢＯ三次元培養モデルのＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った（ｎ＝３）。また、比較のために、ＮＨＢＥ、Ａ５４９についてもＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。ヒートマップ解析、主成分分析（ＰＣＡ）遺伝子発現プロファイルのスキャッタープロットの結果は、全て、ｈＢＯ三次元培養モデルがＡ５４９よりもＮＨＢＥに近いことを示した。

　図１６は、気管支上皮細胞のマーカーについて作成したヒートマップである。図１６より、ｈＢＯ三次元培養モデルは気管支上皮細胞のマーカーをＮＨＢＥ又はＡ５４９よりも強く発現することが明らかとなった。

　以上の結果は、ｈＢＯ三次元培養モデルが、ＮＨＢＥ又はＡ５４９よりも高い気管支機能を有することを示す。

［実験例５］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈＢＯ三次元培養モデルでの感染と複製）
　ｈＢＯにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、分化培地中で５日間培養した。図１７は実験スケジュールを示す模式図である。

　培地中に含まれるウイルスは、基底膜側からｈＢＯに感染した。図１８はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの免疫組織化学染色により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質（ＳＰ）を検出した結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。図１８中、「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていないｈＢＯ三次元培養モデルの結果であり、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの結果である。その結果、ＳＰ陽性の細胞はｈＢＯの外縁の一部で観察された。

　図１９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの蛍光免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。ＳＰ及びＫＲＴ５を検出した。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。図２０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたｈＢＯの蛍光免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは２０μｍである。ＳＰ及びＣＣ１０を検出した。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。その結果、ＳＰはＫＲＴ５と共局在するが、ＣＣ１０陽性のクラブ細胞とは共局在しないことが明らかとなった。この結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がｈＢＯ三次元培養モデルでは複製されにくいことを示す。

　図２１は、Ｃａｍｏｓｔａｔの存在下又は非存在下でｈＢＯ三次元培養モデルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、ＴＣＩＤ５０アッセイによりウイルス力価を測定した結果を示すグラフである。その結果、ウイルスを感染させたｈＢＯ三次元培養モデル中に、感染性のあるウイルスが少し検出された。また、このウイルスの産生はＣａｍｏｓｔａｔ処理により減少した。

　図２２は、１０μＭのＣａｍｏｓｔａｔの存在下又は非存在下で、ｈＢＯ三次元培養モデルに１．３×１０^５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、分化培地中で５日間培養し、ウイルス感染から１、２、３、４、５日後にＬＤＨアッセイを行った結果を示すグラフである。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くダネットの事後検定によって評価し、１０μＭのＣａｍｏｓｔａｔの非存在下でｈＢＯ三次元培養モデルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた結果と比較した。その結果、ウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデルの培地中に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の蓄積は観察されなかった。この結果は、細胞毒性がウイルス感染の原因でないことを示唆する。

　図２３は、ウイルス感染させていないｈＢＯ三次元培養モデル（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、１０μＭのＣａｍｏｓｔａｔの存在下でウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ＋Ｃａｍｏｓｔａｔ）におけるＲＮＡ－ｓｅｑの結果に基づいて、ＧＯ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ遺伝子セットに対してパラメトリック遺伝子セット濃縮解析（ＰＧＳＥＡ）を行った結果を示すグラフである。

　図２４は、ウイルス感染させていないｈＢＯ三次元培養モデル（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、１０μＭのＣａｍｏｓｔａｔの存在下でウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ＋Ｃａｍｏｓｔａｔ）について、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、ＩＦＮ－β、ＩＳＧ５６及びＩＳＧ１５遺伝子の発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。

　図２５は、ウイルス感染させていないｈＢＯ三次元培養モデル（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びウイルス感染させたｈＢＯ三次元培養モデル（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）におけるＲＮＡ－ｓｅｑの結果に基づいて作成した、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達に関連する遺伝子のヒートマップである。

　図２３～２５の結果から、ウイルス感染により、自然免疫応答関連遺伝子の発現が少し増強されたことが明らかとなった。

　以上の結果は、ウイルスが、ｈＢＯの外縁に存在する基底幹細胞に感染しにくく、ウイルスの複製があまり行われなかったことを示す。

［実験例６］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｈＢＯ－ＡＬＩでの感染と複製）
　気管支の管腔側からのウイルスの感染を模倣するために、ｈＢＯ－ＡＬＩを使用した。拡大培養したｈＢＯ三次元培養モデルを解離させてトランズウェルインサートに播種し、分化培地中で５日間培養した。図２６は実験スケジュールを示す模式図である。

　図２７、図２８は、ウイルスを感染させていないｈＢＯ－ＡＬＩの蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図２７では、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。図２８では、アセチル化α－チューブリン及びＡＣＥ２を検出した。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。その結果、ｈＢＯ－ＡＬＩにはアセチル化α－チューブリン陽性細胞及びＫＲＴ５陽性細胞が存在することが確認された。また、ＡＣＥ２はアセチル化α－チューブリンと共局在することが明らかとなった。これらの結果は、ｈＢＯ－ＡＬＩが、ウイルス受容体であるＡＣＥ２を強く発現する線毛細胞を含むことを示す。

　図２９は、ｈＢＯ三次元培養モデル、ｈＢＯ－ＡＬＩ及び気管支基底幹細胞（基底幹細胞）における、ＡＣＥ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＦＵＲＩＮ、ＮＧＦＲ、ＭＣＩＤＡＳ、ＭＵＣ５Ｂ、ＳＣＧＢ１Ａの各遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くテューキーの事後検定によって評価した。図２９中、「ｈＢＯ」はｈＢＯ三次元培養モデルの結果であることを示し、「ｈＢＯ－ＡＬＩ」はｈＢＯ－ＡＬＩの結果であることを示し、「Ｂａｓａｌ　ｃｅｌｌｓ」は基底幹細胞の結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。

　その結果、ｈＢＯ三次元培養モデル及びｈＢＯ－ＡＬＩの間で、ｍｕｌｔｉｃｉｌｉａｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＩＤＡＳ）遺伝子以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２関連マーカー遺伝子及び気管支上皮細胞マーカー遺伝子の発現レベルに違いがないことが明らかとなった。ｈＢＯ三次元培養モデルと比較して、ｈＢＯ－ＡＬＩにおいて、ＭＣＩＤＡＳ遺伝子の発現レベルが増強されたことは、ｈＢＯ－ＡＬＩでは線毛細胞の成熟が促進されることを示唆する。

　続いて、ｈＢＯ三次元培養モデル及びｈＢＯ－ＡＬＩにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ、分化培地中で２日間培養した。図３０は、ＴＣＩＤ５０アッセイにより、ｈＢＯ三次元培養モデル及びｈＢＯ－ＡＬＩの培養上清中の感染性のあるウイルスを測定した結果を示すグラフである。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くテューキーの事後検定によって評価した。図３０中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。その結果、ｈＢＯ三次元培養モデルと比較して、ｈＢＯ－ＡＬＩにおける感染性のあるウイルスの複製は有意に多いことが明らかとなった。

　図３１は、ウイルスを感染させてから２日後のｈＢＯ－ＡＬＩの蛍光免疫染色の結果を示す写真である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＳＰ、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。その結果、ＳＰはアセチル化α－チューブリンと共局在するが、ＫＲＴ５とは共局在しないことが確認された。

　以上の結果は、ｈＢＯ－ＡＬＩにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が線毛細胞中で効率よく複製されるが、基底幹細胞では複製されないことを示す。これは、上述した図２９に示すように、基底幹細胞ではＡＣＥ２の発現レベルが低いためであると考えられた。

［実験例７］
（ＦＧＦ１０は、残存した基底幹細胞から気管支上皮細胞層を再生するために必須である）
　図３２は、７．０×１０^４ＴＣＩＤ５０／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｈＢＯ－ＡＬＩに感染させ、感染から７日後に、蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２　ＳＰ、ＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。その結果、アセチル化α－チューブリン陽性細胞及びＳＰ陽性細胞が観察されないことが明らかとなった。この結果は、ウイルス感染により、線毛細胞が死滅したことを示す。一方、ＫＲＴ５陽性の基底幹細胞はウイルス感染から７日後においても残存していることが明らかとなった。

　図３３は、ウイルス感染から１５日後に、蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。その結果、残存した基底幹細胞がアセチル化α－チューブリン陽性の線毛細胞に分化し、気管支上皮層を形成したことが明らかとなった。これらの結果は、ウイルス感染後の気管支上皮層の修復に、基底幹細胞が重要な役割を有していることを示唆した。

　続いて、ウイルス感染及びそれに続く気管支上皮層の再生におけるヒトＦＧＦの効果を検討した。図３４は、７．０×１０^４ＴＣＩＤ５０／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をｈＢＯ－ＡＬＩに感染させ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０を含む又は含まない分化培地で２日間培養した後に、培養上清中に含まれる感染性のあるウイルスを、ＴＣＩＤ５０アッセイにより測定した結果を示すグラフである。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くテューキーの事後検定によって評価した。図３４中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。また、「ｗ／ｏ」は含まないことを示す。その結果、分化培地からＦＧＦ１０を除くと、感染性のあるウイルスの産生が有意に増加することが明らかとなった。

　図３５は、ウイルス感染から１５日後に、蛍光免疫染色により、アセチル化α－チューブリン及びＫＲＴ５を検出した結果を示す写真である。また、ＤＡＰＩで核を対比染色した。図３５中、「ｗ／ｏ」は含まないことを示す。その結果、分化培地からＦＧＦ１０を除くと、残存した基底幹細胞が増殖せず、また、アセチル化α－チューブリン陽性の線毛細胞にも分化しないことが明らかとなった。これに対し、分化培地からＦＧＦ２又はＦＧＦ７を除いても、残存した基底幹細胞は増殖することができ、また、アセチル化α－チューブリン陽性の線毛細胞にも分化できることが明らかとなった。

　これらの結果から、残存した基底幹細胞が気管支上皮層を再生するために、ＦＧＦ１０が必須であることが明らかとなった。

［実験例８］
（ドナーによるウイルス複製効率の違いの検討）
　ｈＢＯ－ＡＬＩの作製に使用するＮＨＢＥのドナーによる、ウイルス複製効率の違いを検討した。４人のドナーから得られたＮＨＢＥからｈＢＯ－ＡＬＩをそれぞれ作製した。各ドナーの情報を表４にまとめた。

　図３６は、７．０×１０^４ＴＣＩＤ５０／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を各ｈＢＯ－ＡＬＩに感染させ、分化培地で２日間培養した後に、培養上清中に含まれる感染性のあるウイルスを、ＴＣＩＤ５０アッセイにより測定した結果を示すグラフである。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続くテューキーの事後検定によって評価した。図３６中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。

　その結果、ドナー４由来のｈＢＯ－ＡＬＩにおけるウイルスの産生が、ドナー１由来のｈＢＯ－ＡＬＩ及びドナー２由来のｈＢＯ－ＡＬＩにおけるウイルスの産生と比較して有意に高いことが明らかとなった。

　以上の結果から、ｈＢＯ－ＡＬＩは、性別の違いを含む、ウイルス複製効率における個別の相違を反映することができることが示された。

　本発明によれば、呼吸器感染症の病原体の生活環を再現できるだけでなく、呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングすることができる呼吸器オルガノイド技術を提供することができる。

Claims (20)

1. 　呼吸器オルガノイドの製造方法であって、
   　（１－１）呼吸器上皮細胞を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む拡大培養培地で培養する工程、及び
   　（１－２）得られた培養物を、ＦＧＦを含む分化培地で培養する工程、
   　を含む、製造方法。
2. 　前記工程（１－２）の前又は後に、得られた培養物を解離して気液界面培養する工程を更に含む、請求項１に記載の製造方法。
3. 　前記呼吸器上皮細胞が、気管支上皮細胞、小気道上皮細胞及び肺胞上皮細胞からなる群より選択される１種以上の細胞である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 　前記呼吸器上皮細胞が、体性幹細胞又は多能性幹細胞を分化誘導したものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 　前記工程（１－１）において、前記呼吸器上皮細胞をゲルに包埋したうえで前記拡大培養培地で培養する、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
6. 　前記拡大培養培地が、ＢＭＰシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される１つ以上の物質を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 　前記ＢＭＰシグナル阻害剤がＮｏｇｇｉｎである、請求項６に記載の製造方法。
8. 　前記Ｗｎｔシグナル活性化剤がＲ－ｓｐｏｎｄｉｎである、請求項６又は７に記載の製造方法。
9. 　前記ｐ３８阻害剤がＳＢ２０２１９０である、請求項６～８のいずれか一項に記載の製造方法。
10. 　前記分化培地がＴＧＦ-β阻害剤を更に含む請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. 　前記ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１である、請求項１０に記載の製造方法。
12. 　前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０からなる群より選択される１つ以上の物質である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
13. 　前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の製造方法。
14. 　基底幹細胞、線毛細胞、ゴブレット細胞、クラブ細胞、肺神経内分泌細胞、Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞からなる細胞群のいずれか１以上の細胞を含む、人工の呼吸器オルガノイド。
15. 　頂端面が露出している、請求項１４に記載の呼吸器オルガノイド。
16. 　（ｉ）アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）陽性、及び／又は、（ｉｉ）ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＭＰＲＳＳ２）陽性の表現型を示す、請求項１４又は１５に記載の呼吸器オルガノイド。
17. 　呼吸器感染症の予防剤又は治療剤をスクリーニングする方法であって、
    　（３－１）前記呼吸器感染症の病原体を感染させた、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の呼吸器オルガノイドを、候補物質と接触させる工程、
    　（３－２）前記候補物質接触後の呼吸器オルガノイドにおける、前記病原体の増殖又は前記病原体の感染により生じた傷害を検出する工程、及び
    　（３－３）陰性対照と比較して前記増殖又は前記傷害が抑制された候補物質を選択する工程、
    　を含み、ここで、前記病原体が、ウイルス、細薗及び真薗からなる群より選択される１つ以上の病原体である、方法。
18. 　ＦＧＦ１０を有効成分とする、損傷した呼吸器上皮細胞の再生剤。
19. 　ＦＧＦ１０を含む、損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地。
20. 　ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ-β阻害剤を更に含む、請求項１９に記載の損傷した呼吸器上皮細胞の再生用培地。

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