JP2020110164A - 上皮オルガノイド培養方法及び上皮オルガノイド - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年5月18日に、日本に出願された特願2016−099995号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、本発明は、無血清で作製可能なヒト培養オルガノイドを提供する。
また、本発明は、これまで不可能であった組織から作製されたヒト培養オルガノイドを提供する。
また、本発明者らは、低酸素下で、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を培養することで、オルガノイドを形成可能であることを見出した。
本発明の第1態様に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、インスリン様成長因子1(Insulin−like growth factor1;IGF1)、線維芽細胞増殖因子2(Fibroblast growth factor 2;FGF2)、及びエピレグリン(Epiregulin;EREG)からなる群から選ばれる少なくとも二種、及び下記i)〜iii)の成分のうち少なくとも一種を含む。
i)Wntアゴニスト
ii)骨形成因子(bone morphogenetic protein;BMP)阻害剤
iii)形質転換増殖因子−β(transforming growth factor−β;TGF−β)阻害剤
上記第1態様に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、IGF1及びFGF2を含んでもよい。
前記Wntタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成していてもよい。
前記Wntアゴニストが、Wntタンパク質及びR−スポンジンであってもよい。
前記Wntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及びWnt16からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項4〜6のいずれか一項に記載のオルガノイド培養用細胞培養培地。
前記R−スポンジンが、R−スポンジン1、R−スポンジン2、R−スポンジン3、及びR−スポンジン4からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記BMP阻害剤がノギンであってもよい。
前記TGF−β阻害剤が、A83−01であってもよい。
前記オルガノイド形成工程において、酸素濃度15%〜0.1%である低酸素下で、前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織で培養し、オルガノイドを形成させてもよい。
上記第3態様に係る分化した細胞を含むオルガノイドは、再生医療用であってもよい。
前記Wntタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成していてもよい。
前記Wntアゴニストが、Wntタンパク質及びR−スポンジンであってもよい。
前記Wntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及びWnt16からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記R−スポンジンが、R−スポンジン1、R−スポンジン2、R−スポンジン3、及びR−スポンジン4からなる群から選ばれる少なくとも一種であってもよい。
前記BMP阻害剤がノギンであってもよい。
前記TGF−β阻害剤が、A83−01であってもよい。
上記第5態様に係る分化した細胞を含むオルガノイドは、再生医療用であってもよい。
本発明の第1実施形態に係るオルガノイド培養用細胞培養培地は、IGF1、FGF2、及びEREGからなる群から選ばれる少なくとも二種、及び下記i)〜iii)の成分のうち少なくとも一種を含む。
i)Wntアゴニスト
ii)BMP阻害剤
iii)TGF−β阻害剤
また、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地によれば、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地を用いて培養された上皮幹細胞は、長期間分化能を維持することができ、腫瘍発生頻度が極めて低い。
また、本明細書において、「上皮腫瘍細胞」とは、上述の上皮組織由来の細胞が腫瘍化したものを意味する。
よって、「EGF及びp38阻害剤を実質的に含まない」とは、EGF及びp38阻害剤を全く含まない、又はEGFによるEGFRの発現抑制、及びp38阻害剤による分化抑制及び細胞死が起きない程度の濃度しか含まないことを意味する。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地の構成成分について、以下に詳細を説明する。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地には、あらゆる無血清の細胞培養基本培地が含まれる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、動物細胞用又はヒト細胞用であることが好ましい。
係る無血清の細胞培養基本培地としては、例えば、炭酸系の緩衝液でpH7.2以上pH7.6以下に緩衝化されている規定の合成培地等が挙げられる。より具体的には、グルタミン、インスリン、B27 supplement(Thermo Fisher)、N−Acetyl−L−cystein(和光純薬)、ペニシリン又はストレプトマイシン、及びトランスフェリンが補充されたアドバンスト−ダルベッコ改変イーグル培地/ハムF−12混合培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F−12;DMEM/F12)が挙げられる。
また、アドバンスト−ダルベッコ改変イーグル培地/ハムF−12混合培地に替えてRPMI1640培地(Roswell Park Memorial Institute 1640 medium)、DMEM/F12、並びに、アドバンストRPMI培地等も挙げられる。
上記本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、ウシ胎仔血清(fetal bovine serum(FBS)又はfetal calf serum)等の不確定な成分を実質的に含まない。
また、上記オルガノイド培養用細胞培養培地に5%血清を含んでもよい。
本明細書において、「Wntアゴニスト」とは、細胞内でT−cell factor(以下、TCFともいう。)/lymphoid enhancer factor(以下、LEFともいう。)介在性の転写を活性化する薬剤を意味する。よって、Wntアゴニストは、Wntファミリータンパク質に限定されず、Frizzled受容体ファミリーメンバーに結合して活性化するWntアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤、及びTCF/LEFの活性化物質を包含する。Wntアゴニストは、Wntタンパク質、R−スポンジン、及びGSK−3β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。
Wntアゴニストは、該Wntアゴニストの非存在下でのWnt活性のレベルと比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも50%、特に好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは100%、細胞においてWnt活性を刺激する。Wnt活性は、当業者にとって公知の方法を用いて、例えばpTOPFLASH及びpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Wntの転写活性を測定することにより調べることができる(参考文献:Korinek et al.,1997.Science 275:1784−1787)。
Wntアゴニストの一種であるWntタンパク質としては、由来は特に限定されず、各種生物由来のWntタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のWntタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。哺乳動物のWntタンパク質としては、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等が挙げられる。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地において、Wntタンパク質は複数種を組み合わせて用いてもよい。
「1〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法等により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数(10個以下が好ましく、7個以下がより好ましく、6個以下がさらに好ましい。)のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていることを意味する。
また、実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、公知のデータベースから取得できるアミノ酸配列との同一性が、少なくとも80%以上であり、好ましくは少なくとも85%以上、より好ましくは少なくとも90%以上、さらに好ましくは少なくとも92%以上、特に好ましくは少なくとも95%以上、最も好ましくは少なくとも99%以上であるアミノ酸配列等が挙げられる。
Wntアゴニストの一種であるR−スポンジンとしては、R−スポンジン1、R−スポンジン2、R−スポンジン3、及びR−スポンジン4からなるR−スポンジンファミリーが挙げられる。R−スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、Wntシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わることが知られている。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地において、R−スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。
R−スポンジン活性を有する限り、R−スポンジンのフラグメントでもよく、R−スポンジンのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含むものでもよい。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるWntタンパク質の濃度は、50ng/mL以上であることが好ましく、100ng/mL以上10μg/mL以下であることがより好ましく、200ng/mL以上1μg/mL以下であることがさらに好ましく、300ng/mL以上1μg/mL以下であることが特に好ましい。上皮幹細胞の培養中、好ましくは2日ごとにWntアゴニストを培養培地に添加し、好ましくは4日ごとにオルガノイド培養用細胞培養培地を新鮮なものに交換する。
公知のGSK−3β阻害剤は、CHIR−99021、 CHIR−98014(Sigma−Aldrich) リチウム(Sigma)、ケンパウロン(Biomol International, Leost, M. et al.(2000) Eur J Biochem 267, 5983−5994)、6−ブロモインジルビン−30−アセトキシム(Meyer, L et al .(2003) Chem. Biol. 10, 1255−1266)、SB 216763およびSB 415286(Sigma−Aldrich)、並びにGSK−3とaxinとの相互作用を阻止するFRATファミリーメンバー及びFRAT由来ペプチドを含む。概説は、参照により本明細書に組み入れられる、Meijer et al .(2004) Trends in Pharmacological Sciences 25, 471−480に示されている。GSK−3β阻害のレベルを決定するための方法およびアッセイは当業者に公知であり、例えば、Liao et al.(2004),Endocrinology, 145(6) 2941−2949に記載の方法およびアッセイを含む。
本明細書において、「アファミン」とは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質を意味し、血液又は体液中に存在することが知られている。細胞培養に用いる培地に通常添加される血清には、当該血清を採取した動物由来のアファミンが含まれている。血清中にはアファミン以外の不純物等を含むため、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地においては、血清を用いずに、アファミンを単独で使用することが好ましい。
一方、この特定のセリン残基の脂肪酸による修飾は、Wntタンパク質の生理活性に必須であり、Frizzled受容体ファミリーメンバーとの結合に関与することが報告されている。
また、水溶液中において、Wntタンパク質がアファミンと1対1で結合し複合体を形成し、高い生理活性を保ちながら、可溶化する知見もある(Active and water−soluble form of lipidated Wnt protein is maintained by A serum glycoprotein afamin/α−albumin. Mihara E, Hirai H, Yamamoto H, Tamura−Kawakami K, Matano M, Kikuchi A, Sato T, Takagi J. Elife. 2016 Feb 23;5.)。
係る知見に基づき、Wntタンパク質及びアファミンの両方を発現する細胞を培養する方法により、Wntタンパク質−アファミン複合体を製造してもよく、Wntタンパク質発現細胞とアファミン発現細胞を共培養する方法により、Wntタンパク質−アファミン複合体を製造してもよい。Wntタンパク質−アファミン複合体中のWntタンパク質の活性は、上述の[Wntタンパク質]と同様の方法を用いて、評価することができる。
一般的に、「インスリン様成長因子1(Insulin−like growth factor1;IGF1)」は、別名ソマトメジンCとも呼ばれ、主に、肝臓で成長ホルモン(GH)による刺激により分泌される因子である。人体の殆どの細胞(特に、筋肉、骨、肝臓、腎臓、神経、皮膚及び肺等の細胞)は、IGF1の影響を受けることが知られている。IGF1は、インスリン様効果に加え、細胞成長(特に、神経細胞)及び発達、並びに、細胞DNA合成を調節する機能を有する。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるIGF1の濃度が上記範囲であることにより、実質的にEGF及びp38阻害剤を含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、幹細胞の培養中、2日ごとにIGF1を培養培地に添加することが好ましく、4日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
一般的に、「線維芽細胞増殖因子2(Fibroblast growth factor 2;FGF2)とは、塩基性の線維芽細胞増殖因子であって、線維芽細胞増殖因子受容体(fibroblast growth factor receptor;FGFR)と結合し、血管内皮細胞の増殖促進と筒状構造への組織化、すなわち血管新生を促進する機能を有する。また、ヒトFGF2は低分子量型(LWL)と高分子量型(HWL)の2つのアイソフォームを持つことが知られている。LWLは主に細胞質に存在し、自己分泌(オートクリン)で作用し、一方、HWLは核内にあり、細胞内で作用するイントラクリン機構で活性を示す。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるFGF2の濃度が上記範囲であることにより、実質的にEGF及びp38阻害剤を含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、幹細胞の培養中、2日ごとにFGF2を培養培地に添加することが好ましく、4日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
一般的に、「エピレグリン(Epiregulin;EREG)とは、チロシンキナーゼ(ErbB)ファミリー受容体(ErbB1〜4)のうち、ErbB1及びErbB4に特異的に結合するEGF様成長因子である。ケラチン生成細胞、肝細胞、繊維芽細胞、及び血管内皮細胞の増殖を刺激することが知られている。また、EREGは、主に膀胱、肺、腎臓、大腸等のガン腫瘍、胎盤、及び末梢血白血球において発現している。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるEREGの濃度が上記範囲であることにより、EGF及びp38阻害剤を実質的に含まずとも、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織を長期間培養することができる。
また、ヒトを含む哺乳動物由来の上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞、或いはそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織、又は従来では培養することができなかった組織から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、幹細胞の培養中、2日ごとにEREGを培養培地に添加することが好ましく、4日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
骨形成因子(bone morphogenetic protein;BMP)は、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン/スレオニンキナーゼ、I型及びII型受容体からなる受容体複合体に結合する。II型受容体はI型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このI型受容体は、続いて特異的な受容体基質(SMAD)をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。一般的に、BMP阻害剤は、例えば、BMP受容体へのBMP分子の結合を阻止又は阻害するものであって、BMP活性を中和する複合体を形成するためにBMP分子に結合する薬剤である。また、BMP阻害剤は、例えば、BMP受容体と結合し、BMP分子の受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるBMP阻害剤としては、中でも、コーディン様タンパク質又はDAN様タンパク質が好ましく、コーディン様タンパク質がより好ましい。コーディン様タンパク質としては、ノギンが好ましい。コーディン様タンパク質やDAN様タンパク質は拡散性タンパク質であり、様々な親和度でBMP分子に結合し、シグナル伝達受容体へのBMP分子の接近を阻害することができる。上皮幹細胞を培養する場合において、これらのBMP阻害剤をオルガノイド培養用細胞培養培地に添加することにより、幹細胞の喪失を妨げることができる。
形質転換増殖因子−β(transforming growth factor−β;TGF−β)は、増殖因子の一種であり、腎臓、骨髄、血小板等ほぼすべての細胞で産生される。TGF−βには、5種類のサブタイプ(β1〜β5)が存在する。また、TGF−βは、骨芽細胞の増殖、並びに、コラーゲンのような結合組織の合成及び増殖を促進し、上皮細胞の増殖や破骨細胞に対しては抑制的に作用することが知られている。一般的に、TGF−β阻害剤は、例えば、TGF−β受容体へのTGF−βの結合を阻止又は阻害するものであって、TGF−β活性を中和する複合体を形成するためにTGF−βに結合する薬剤である。また、TGF−β阻害剤は、例えば、TGF−β受容体と結合し、TGF−βの受容体への結合を阻止又は阻害するものであって、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして作用する薬剤である。
本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地は、さらに、Rock(Rho−キナーゼ)阻害剤を含んでいてもよい。Rock阻害剤としては、例えば、Y−27632((R)−(+)−トランス−4−(1−アミノエチル)−N−(4−ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物)、ファスジル(HA1077)(5−(1,4−ジアゼパン−1−イルスルホニル)イソキノリン)、H−1152((S)−(+)−2−メチル−1−[(4−メチル−5−イソキノリニル)スルホニル]−ヘキサヒドロ−1H−1,4−ジアゼピン二塩酸塩)等が挙げられる。Rock阻害剤として、Y−27632を用いる場合は、単細胞に分散された幹細胞の培養の最初の2日間に添加することが好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるY−27632は、10μMであることが好ましい。
<第1実施形態>
本発明の第1実施形態に係る培養方法は、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらの細胞を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、上述のオルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それらの細胞を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備える培養方法である。
本実施形態の培養方法における各工程について、以下に詳細に説明する。
一般的に、「細胞外マトリクス(Extracellular Matrix;ECM)」とは、生物において細胞の外に存在する超分子構造を意味する。このECMは、上皮幹細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれらを含む組織が増殖するための足場となる。
ECMは、様々な多糖、水、エラスチン、及び糖タンパク質を含む。糖タンパク質としては、例えば、コラーゲン、エンタクチン(ナイドジェン)、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。
続いて、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を準備する。本実施形態の培養法において用いられる、上皮幹細胞、上皮細胞、又は上皮腫瘍細胞は上述の<<オルガノイド培養用細胞培養培地>>と同様のものが挙げられる。
続いて、細胞播種後、細胞が乾かないうちに、上述のオルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、培養する。培養温度は30℃以上40℃以下が好ましく、37℃程度がより好ましい。培養時間は用いる細胞によって適宜調整することができる。培養開始からから1〜2週間程度後で、オルガノイドを形成させることができる。また、従来では2〜3ヶ月しか細胞維持培養することができなかった細胞に対し、本実施形態の培養方法では、3ヶ月以上の長期間(好ましくは、10ヶ月程度)においても、細胞を維持培養することができる。本実施形態の培養方法を用いて、上皮幹細胞を培養した場合は、分化能を維持でき、腫瘍発生頻度を極めて低い状態に抑えることができる。
本実施形態における低酸素下とは、酸素濃度が、0.1%以上15%以下であることが好ましく、0.3%以上10%以下であることがより好ましく、0.5%以上5%以下であることがさらに好ましい。
本発明の第2実施形態に係る培養方法は、上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、前記接着工程後に、オルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、低酸素下で前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備え、前記オルガノイド培養用細胞培養培地が、Wntタンパク質及びR−スポンジン(R−spondin)からなるWntアゴニスト、分裂促進増殖因子、骨形成因子(bone morphogenetic protein;BMP)阻害剤、形質転換増殖因子−β(transforming growth factor−β;TGF−β)阻害剤、及びp38阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含み酸素濃度が、0.1%以上15%以下であることが好ましく、0.3%以上10%以下であることがより好ましく、0.5%以上5%以下で培養する培養方法である。
また、本実施形態の培養方法において使用するオルガノイド培養用細胞培養培地は、Wntタンパク質及びR−スポンジン(R−spondin)からなるWntアゴニスト、分裂促進増殖因子、BMP阻害剤、TGF−β阻害剤、及びp38阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
また、本実施形態の培養方法において、低酸素下及び正常酸素下(酸素濃度20%程度)にて、組成が異なる数種類のオルガノイド培養用細胞培養培地を準備し培養することにより、培養する細胞又は組織の種類に応じて、複数の条件の中から適した条件を選択することができ、高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、本実施形態の培養方法において使用するオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるその他の構成成分について、詳細を以下に説明する。
本実施形態の培養方法において使用するオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる分裂促進増殖因子としては、例えば、上皮増殖因子(Epidermal Growth Factor;EGF)、形質転換増殖因子−α(Transforming Growth Factor−α;TGF−α)、脳由来神経栄養因子(brain derived neurotrophic factor;BDNF)、ケラチン生成細胞増殖因子(keratinocyte growth factor;KGF)等の増殖因子のファミリーが挙げられる。これらの分裂促進増殖因子は複数種類を組み合わせて用いてもよい。
EGFは、様々な培養外胚葉性細胞及び中胚葉性細胞に対する強力な分裂促進因子であり、一部の繊維芽細胞の、特異的細胞の分化に顕著な影響を有する。EGF前駆体は、タンパク質分解により切断されて、細胞を刺激する53−アミノ酸ペプチドホルモンを生成させる、膜結合分子として存在する。
前記オルガノイド培養用細胞培養培地に含まれる分裂促進増殖因子としては、中でも、EGFが好ましい。本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地に含まれるEGFの濃度は、5ng/mL以上500ng/mL以下であることが好ましく、10ng/mL以上400ng/mL以下であることがより好ましく、50ng/mL以200ng/mL以下であることがさらに好ましい。
また、前記オルガノイド培養用細胞培養培地にKGFを含む場合においても、KGFと同様の含有量であることが好ましい。複数のKGF、例えばKGF1及びKGF2(FGF7及びFGF10としても知られている。)を使用する場合は、KGFの総含有量が上記範囲であることが好ましい。幹細胞の培養中、2日ごとに分裂促進増殖因子を培養培地に添加することが好ましく、4日ごとに培養培地を新鮮なものに交換することが好ましい。
本明細書において、「p38阻害剤」は、p38シグナル伝達を直接的又は間接的に負に調節する任意の阻害剤を意味する。一般的に、p38阻害剤は、例えば、p38に結合し、且つその活性を低減する。p38プロテインキナーゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)ファミリーの一部である。MAPKは、環境ストレス及び炎症サイトカイン等の細胞外刺激に応答し、遺伝子発現、有糸分裂、分化、増殖、及び細胞生存/アポトーシス等の様々な細胞活性を調節するセリン/スレオニン特異的プロテインキナーゼである。p38 MAPKは、α、β、β2、γ、及びδアイソフォームとして存在する。また、p38阻害剤は、例えば、少なくとも1つのp38アイソフォームに結合し、且つその活性を低減する薬剤でもある。
本発明の第1実施形態に係るオルガノイドは、上述の培養方法により、得られる。
一実施形態において、本発明は、薬物応答のスクリーニング、毒性アッセイ、又は再生医療のための上述のオルガノイドの使用を提供する。
さらに、本実施形態のオルガノイドは、現在のところ適切な組織培養又は動物モデルがないノロウイルスなどの病原体を培養するために使用することができる。
また、本実施形態のオルガノイドは、再生医療において、例えば、放射線照射後又は術後の腸上皮の修復において、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患に罹患している患者の腸上皮の修復において、又は短腸症候群に罹患している患者の腸上皮の修復において、有用である。さらに、本実施形態のオルガノイドは、小腸/結腸の遺伝性疾患の患者における腸上皮の修復において、有用である。また、本実施形態のオルガノイドは、再生医療において、例えば膵臓切除後の移植片又はその一部として、又はI型糖尿病及びII型糖尿病等の糖尿病の治療のために有用である。
(1)オルガノイド培養用細胞培養培地の調製
まず、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度1μg/mLとなるようにヒト組換えR−スポンジン1(R&D systems社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した。さらに、Wnt3aの終濃度300ng/mLとなるように血清含有培地で培養したW−Wnt3a/HEK由来の培養上清を添加した培地(以下、「WNRA培地」と称する。)を用意した。
さらに、終濃度500ng/mLとなるようにEpiregulin(Biolegend社製)、終濃度500ng/mLとなるようにIGF1(Biolegend社製)、又は終濃度50ng/mLとなるようにFGF2(peprotech社製)のうち少なくともいずれか1種類を添加し、構成成分が以下の組み合わせの培地となる培地を用意した。
・WNRA+Epiregulin培地
・WNRA+IGF1培地
・WNRA+Epiregulin+IGF1培地
・WNRA+Epiregulin+FGF2培地
・WNRA+IGF1+FGF2培地
また、コントロールとして、さらに終濃度50ng/mLとなるようにEGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)を添加した培地(以下、「WNRA+EGF培地」と称することがある。)を用意した。また、参考例として、さらに終濃度10μMとなるようにSB202190(Sigma Aldrich社製)を添加した培地(以下、「WNRAS+EGF培地」と称することがある。)を用意した。
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画にも基づき、説明と同意を得られた大腸腫瘍患者より、大腸腫瘍から少なくとも5cm以上離れた部分を正常粘膜として採取し、また、大腸腫瘍より病変組織を採取した。次いで、ヒト腫瘍組織由来の上皮腫瘍細胞を含む大腸腫瘍組織を、リベラーゼTHを用いて、上皮腫瘍細胞と残りの組織とに分けた。残りの組織については、トリプシンでさらにバラバラに分散した。次いで、上皮腫瘍細胞を、25μLのマトリゲル(登録商標)(BD Bioscience社製)と共に、48ウェルプレートに播種した。上皮腫瘍細胞を播種したウェルに、(1)で調製したWNRA+EGF培地(従来の方法で用いられる培地)、WNRA+Epiregulin培地、WNRA+IGF1培地、WNRA+Epiregulin+IGF1培地、WNRA+Epiregulin+FGF2培地、又はWNRA+IGF1+FGF2培地を各250μLずつ添加し、37℃で酸素濃度20%にて培養した。培養から、2日毎に培地交換を行った。図1は、初代培養(Passage0)の培養開始から7日目の様子を示す画像である。図2は、各培地中の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。
(1)オルガノイド培養用細胞培養培地の調製
まず、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度50ng/mLとなるようにEGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した培地(以下、「ENA培地」と称することがある。)を用意した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、上皮腫瘍細胞を得た。次いで、上皮腫瘍細胞を、25μLのマトリゲル(登録商標)(BD Bioscience社製)と共に、48ウェルプレートに播種した。上皮腫瘍細胞を播種したウェルに、(1)で調製したENA培地を250μL添加し、37℃で酸素濃度1%(以下、「低酸素培養」と称することがある。)、又は酸素濃度20%(以下、「正常酸素培養」と称することがある。)にて培養した。培養から、2日毎に培地交換を行った。図3は、初代培養(Passage0)の培養開始から7日目の培養オルガノイドを示す画像である。
しかしながら、腫瘍化に伴い、一部の構成成分(特に、p38阻害剤)が培養効率を悪化させる場合があった(図4の斜線部参照。)。また、20%酸素条件(正常酸素条件)では、培養効率を悪化させ、一方、1%酸素条件(低酸素条件)では培養可能である場合があった(図4の横線部参照。)。ここで、大腸がんIV(M)は、転移した大腸がんである。
このため、単一の培養条件では全ての腫瘍が培養できず、予め以下に示す8つの培養条件を設定することにより、樹立効率が向上することが明らかとなった。以下において、WR(−)とは、Wntタンパク質及びR−スポンジンからなるWntアゴニストを含まないことを示し、WR(+)とは、Wntタンパク質及びR−スポンジンからなるWntアゴニストを含むことを示す。
・ENA/WR(−)培地、正常酸素培養
・ENA/WR(+)培地、正常酸素培養
・ENAS/WR(−)培地、正常酸素培養
・ENAS/WR(+)培地、正常酸素培養
・ENA/WR(−)培地、低酸素培養
・ENA/WR(+)培地、低酸素培養
・ENAS/WR(−)培地、低酸素培養
・ENAS/WR(+)培地、低酸素培養
(1)Wnt3a−アファミン複合体の調製
Wnt3a−アファミン複合体(以下、「WAfm」と称することがある。)は、ウシ胎児血清にウシアファミンが含まれることを利用し、Wnt3aのみを遺伝子導入した細胞を血清含有培地で培養し、分泌されるWnt3aがアファミンと自動的に安定な複合体を形成することを利用して調製した。すなわち、N末端にタグ配列を有するWnt3aを発現する細胞(W−Wnt3a/HEK)を、10%ウシ胎児血清を含む培地中でディッシュ又は多層フラスコ等で5〜7日間培養し、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清は遠心分離し、フィルター(0.22μm)を通した。集めた培養上清のうち、220mLを使用した。続いて、回収した200mLの培養上清に3mLのP20.1抗体セファロースを加え、4℃で3時間回転混和した後、培地を空のカラムに通して、セファロースを集めた。なお、P20.1抗体はWnt3aのN末端のタグ配列を特異的に認識する抗体である。続いて、カラムに集めたセファロースを3mLのTris bufferd saline(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.5)で洗浄し、洗浄操作を5回繰り返した。続いて、1回あたり3mLのペプチド溶液(0.2mg/mL PAR4−C8 peptide/TBS)を用いて溶出を行い、溶出液を回収した。溶出操作を10回繰り返して、Wnt3a−アファミン複合体を得た。Wnt3aの活性は、W−Wnt3a/HEKの細胞上清を用いたTCFレポーターアッセイにより確認し、市販のWnt3a(R&D systems社製)と比較して、10倍以上の高い活性を有することが確かめられた。
まず、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度1μg/mLとなるようにヒト組換えR−スポンジン1(R&D systems社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した。さらに、Wnt3aの終濃度300ng/mLとなるように血清含有培地で培養したW−Wnt3a/HEK由来の培養上清を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにIGF1(Biolegend社製)を添加し、終濃度50ng/mLとなるようにFGF2(peprotech社製)を添加した培地(以下、「WIFNRA培地」と称することがある。)を用意した。
また、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度1μg/mLとなるようにヒト組換えR−スポンジン1(R&D systems社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した。さらに、終濃度300ng/mLとなるように(1)で調製したWnt3a−アファミン複合体を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにIGF1(Biolegend社製)を添加し、終濃度50ng/mLとなるようにFGF2(peprotech社製)を添加した培地(以下、「WAfmIFNRA培地」と称することがある。)を用意した。
また、比較例1として、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度1μg/mLとなるようにヒト組換えR−スポンジン1(R&D systems社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した。さらに、Wnt3aの終濃度300ng/mLとなるように血清含有培地で培養したW−Wnt3a/HEK由来の培養上清を添加し、終濃度50ng/mLとなるようにEGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)を添加し、終濃度10μMとなるようにSB202190(Sigma Aldrich社製)を添加した培地(以下、「WENRAS培地」と称することがある。)を用意した。
また、比較例2として、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度1μg/mLとなるようにヒト組換えR−スポンジン1(R&D systems社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した。さらに、終濃度300ng/mLとなるように(1)で調製したWnt3a−アファミン複合体を添加し、終濃度50ng/mLとなるようにEGF(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)を添加し、終濃度10μMとなるようにSB202190(Sigma Aldrich社製)を添加した培地(以下、「WAfmENRAS培地」と称することがある。)を用意した。
慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画にも基づき、説明と同意を得られた大腸腫瘍患者より、大腸腫瘍から少なくとも5cm以上離れた部分を正常粘膜として採取し、また,大腸腫瘍より病変部位を採取した。採取した組織はEDTA又はリベラーゼTHにより上皮細胞を抽出し、マトリゲル(登録商標)に包埋した。
上皮細胞(以下、「腸管幹細胞」と呼ぶ。)を含むマトリゲル(登録商標)は48ウェルプレートに播種し、培地とともに培養した。具体的には、下記の通りである。
培養した腸管幹細胞を、25μLのマトリゲル(登録商標)(BD Bioscience社製)と共に、48ウェルプレートに播種した。(2)で調製した4種類の培地(「WIFNRA培地」、「WAfmIFNRA培地」、「WENRAS培地」、及び「WAfmENRAS培地」)を各ウェルに250μLずつ添加し、37℃で酸素濃度20%にて培養した。培養から、2日毎に培地交換を行った。図5Aは、初代培養(Passage0)の培養開始から7日目の様子を示す画像であり、図5Bは、各培地中の腸管幹細胞のオルガノイドがウェル中に占める面積を定量化したグラフである。図5A及び図5Bにおいて、「W」は血清を含むWnt3aを示し、「WAfm」は無血清のWnt3a−アファミン複合体を示す。
よって、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地が、正常上皮細胞のハイスループットスクリーニング等、単一細胞からのオルガノイドの形成効率の向上に極めて有効であることが明らかとなった。
(1)Wnt3a−アファミン複合体の調製
実施例3の(1)と同様の方法を用いて、Wnt3a−アファミン複合体を調製した。
実施例4の(2)と同様の方法を用いて、「WIFNRA培地」、「WAfmIFNRA培地」、及び「WENRAS培地」を調製した。また、比較例2として、市販のAdvanced DMEM/F−12培地(Thermo Ficher SCIENTIFIC社製)に、終濃度1μg/mLとなるようにヒト組換えR−スポンジン1(R&D systems社製)を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにノギン(Peprotech社製)を添加し、終濃度500nMとなるようにA83−01(Tocris社製)を添加した。さらに終濃度300ng/mLとなるように(1)で調製したWnt3a−アファミン複合体を添加し、終濃度100ng/mLとなるようにIGF1(Biolegend社製)を添加し、終濃度50ng/mLとなるようにFGF2(peprotech社製)を添加し、終濃度10μMとなるようにSB202190(Sigma Aldrich社製)を添加した培地(以下、「WAfmIFNRAS培地」と称することがある。)を用意した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、上皮腫瘍細胞を得た。次いで、上皮腫瘍細胞を、25μLのマトリゲル(登録商標)(BD Bioscience社製)と共に、48ウェルプレートに播種した。上皮腫瘍細胞を播種したウェルに、(2)で調製した「WIFNRA培地」、「WAfmIFNRA培地」、「WENRAS培地」、及び「WAfmIFNRAS培地」を各250μLずつ添加し、37℃で酸素濃度20%にて培養した。培養から、2日毎に培地交換を行った。図6は、3回目の継代(Passage3)の培養開始から6日後(合計培養日数26日後)、4回目の継代(Passage4)の培養開始からの6日後(合計培養日数33日後)、及び6回目の継代(Passage6)の培養開始からの6日後(合計培養日数47日後)の様子を示す画像である。図6において、「W」は血清を含むWnt3aを示し、「WAfm」は無血清のWnt3a−アファミン複合体を示す。
さらに、今回使用した大腸腫瘍由来の上皮腫瘍細胞では、Wntタンパク質及びR−スポンジンWntアゴニストが必須であり、Wnt3aを含む培地(「WIFNRA培地」)による培養では、Wnt3aに含まれる血清による増殖阻害が見られ、長期培養することができなかった。一方、無血清のWnt3a−アファミン複合体を含む培地(「WAfmIFNRA培地」)による培養では、長期培養することができた。
また、前記細胞及び前記組織のうち少なくともいずれか一方から高効率でオルガノイドを形成させることができる。
また、本実施形態のオルガノイド培養用細胞培養培地を用いて培養された上皮幹細胞は、長期間分化能を維持することができ、腫瘍発生頻度が極めて低い。
さらに、本実施形態の培養方法により得られたオルガノイドは、再生医療、上皮細胞の基礎医学研究、薬物応答のスクリーニング、疾患由来上皮オルガノイドを用いた創薬研究等に応用することができる。
Claims (19)
- 上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織の培養方法であって、
細胞外マトリクスを調製する細胞外マトリクス調製工程と、
前記細胞外マトリクス上に上皮幹細胞、上皮細胞、上皮腫瘍細胞、又はそれら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を接着させる接着工程と、
前記接着工程後に、上皮オルガノイド培養用細胞培養培地を添加し、酸素濃度15%〜0.1%である低酸素下で、前記上皮幹細胞、前記上皮細胞、前記上皮腫瘍細胞、又は前記それら細胞のうち少なくともいずれか一方を含む組織を培養し、上皮オルガノイドを形成させるオルガノイド形成工程と、を備える、上皮オルガノイド培養方法。 - 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、Wntアゴニスト、分裂促進増殖因子、BMP阻害剤、TGF−β阻害剤、及びp38阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む請求項1に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、インスリン様成長因子1(Insulin−like growth factor1;IGF1)、線維芽細胞増殖因子2(Fibroblast growth factor 2;FGF2)、及びエピレグリン(Epiregulin;EREG)からなる群から選ばれる少なくとも二種、及び下記i)〜iii)の成分のうち少なくとも一種を含み、p38阻害剤を実質的に含まない、請求項1に記載の上皮オルガノイド培養方法。
i)Wntアゴニスト
ii)骨形成因子(bone morphogenetic protein;BMP)阻害剤
iii)形質転換増殖因子−β(transforming growth factor−β;TGF−β)阻害剤 - 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、EGF及びp38阻害剤を実質的に含まない請求項3に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、IGF1及びFGF2を含む、請求項3又は4に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記Wntアゴニストが、Wntタンパク質、R−スポンジン、及びGSK−3β阻害剤からなる群から選択される少なくとも一種である請求項2〜5のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記Wntタンパク質がその安定化物質アファミンとの複合体を形成している請求項6に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記Wntアゴニストが、Wntタンパク質及びR−スポンジンである請求項6又は7に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記Wntタンパク質が、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及びWnt16からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項6〜8のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記R−スポンジンが、R−スポンジン1、R−スポンジン2、R−スポンジン3、及びR−スポンジン4からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項6〜8のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記BMP阻害剤が、ノギン、グレムリン、コーディン、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質、フォリスタチン、フォリスタチンドメインを含むフォリスタチン関連タンパク質、DAN、DANシステインノットドメインを含むDAN様タンパク質、スクレロスチン/SOST、及びα−2マクログロブリンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項2〜10のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、A83−01、SB−431542、SB−505124、SB−525334、SD−208、LY−36494、及びSJN−2511からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項2〜11のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記BMP阻害剤がノギンである請求項2〜12のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、A83−01、SB−431542、SB−505124、SB−525334、SD−208、LY−36494、及びSJN−2511からなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項2〜13のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、A83−01である請求項14に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 前記上皮オルガノイド培養用細胞培養培地が、無血清培地である請求項1〜15のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の上皮オルガノイド培養方法で製造された上皮オルガノイド。
- 請求項16に記載の上皮オルガノイド培養方法で製造された再生医療オルガノイド製剤。
- 請求項17に記載の上皮オルガノイドを使用する、薬物応答スクリーニング方法又は毒物アッセイ方法。
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