KR102417262B1 - 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용 - Google Patents

인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용 Download PDF

Info

Publication number
KR102417262B1
KR102417262B1 KR1020197005259A KR20197005259A KR102417262B1 KR 102417262 B1 KR102417262 B1 KR 102417262B1 KR 1020197005259 A KR1020197005259 A KR 1020197005259A KR 20197005259 A KR20197005259 A KR 20197005259A KR 102417262 B1 KR102417262 B1 KR 102417262B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
human
organoid
cells
infection
diarrhea virus
Prior art date
Application number
KR1020197005259A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190040212A (ko
Inventor
토시로 사토
카주히코 카타야마
Original Assignee
각고호우징 게이오기주크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 각고호우징 게이오기주크 filed Critical 각고호우징 게이오기주크
Publication of KR20190040212A publication Critical patent/KR20190040212A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102417262B1 publication Critical patent/KR102417262B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C12N5/068—Stem cells; Progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16051—Methods of production or purification of viral material

Abstract

세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과, 상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하고, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관 내강을 구성하는 상피세포가 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2에 의해서 얻어지는, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.

Description

인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 및 그 사용
본 발명은 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 및 그 사용에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양물, 인간 설사병 바이러스의 제조 방법, 인간 설사병 바이러스 제조 키트, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양 키트 및 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 출원은 2016년 8월 24일, 일본에 출원된 2016-163711호에 근거하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
인간 노로바이러스 등 인간 설사병 바이러스에 감염된 경우, 치료 효과가 높은 항바이러스 약은 아직 존재하지 않는다. 인간 설사병 바이러스의 상당수는 장관상피에서 밖에 감염, 증식할 수 없기 때문에, in vitro로 인공적으로 대량 만들어내지 못하여, 치료약 개발의 큰 문제가 되고 있다.
이와 관련된 문제에 대해서, 마우스 노로바이러스를 이용한 세포 배양계가 확립되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 그러나 비특허문헌 1에 기재된 세포 배양계에서는 인간 바이러스를 이용할 수 없기 때문에 인간 바이러스의 연구에 응용하지 못하고, 인간 바이러스의 세포 배양계 개발을 기다리고 있었다.
한편, 인간 장관상피세포의 장기 배양은 오랫동안 불가능했다. 이것은 인간 장관상피줄기세포의 유지에 필요한 증식 인자가 불명확했기 때문으로 생각된다. 최근, 인간 장관상피줄기세포를 세포외 매트릭스 상에 접착시켜서, BMP 저해제, 분열 촉진 증식 인자 및 Wnt 아고니스트가 첨가된 인간 세포용 기본 배지를 함유하는 세포 배양 배지의 존재하에서 배양함으로써, 장기간 인간 장관상피줄기세포를 유지하여 분화시킨 오가노이드 배양에 성공하고 있다(예를 들면, 특허문헌 1을 참조).
일본 특허공보 제5458112호
환경 감염지 vol. 24, no. 6, 2009
그러나 특허문헌 1의 세포 배양 배지는 p38 저해제를 함유하기 때문에, 관련된 배지를 이용한 배양 방법에서는 분화 억제 또는 세포사를 일으키는 경우가 있어서 개량의 여지가 있었다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 인간 설사병 바이러스를 in vitro로 대량 제조하는 방법, 및 이를 위한 오가노이드 및 그 오가노이드 제작 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 인간 소장 유래의 오가노이드 제조 방법을 개량해서 얻어진 배양 오가노이드(ORGANOID)를 사용하여, 인간 설사병 바이러스를 감염시켜서 증식 배양할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 양태를 함유한다.
[1] 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 또는 이것들 세포 중에서, 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여, 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과,
상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관내강을 구성하는 상피세포가 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2에 의해서 얻어지는, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[2] 상기 공정 1 및 공정 2의 배양에 있어서, i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 이용하는 [1]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[3] 상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질, R-스폰진, 및 GSK-3β 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 [2]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[4] 상기 세포 배양 배지가 IGF1 및 FGF2를 함유하는 [2] 또는 [3]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[5] 상기 Wnt 단백질이 그 안정화 물질 아파민과의 복합체를 형성하고 있는 [3] 또는 [4]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[6] 상기 Wnt 단백질이, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 [3]~[5]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[7] 상기 R-스폰진이 R-스폰진1, R-스폰진2, R-스폰진3, 및 R-스폰진4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 [3]~[6]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[8] 상기 BMP 저해제가 노긴(Noggin), 그렘린, 코딘, 코딘 도메인을 함유하는 코딘 유사 단백질, 폴리스타틴, 폴리스타틴도메인을 함유하는 폴리스타틴 관련 단백질, DAN, DAN 시스테인 노트 도메인을 함유하는 DAN 유사 단백질, 스클레로스틴/SOST, 및 α-2 매크로 글로블린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 [2]~[7]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[9] 상기 BMP 저해제가 노긴(Noggin)인 [2]~[8]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[10] 상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질 및 R-스폰진인 [2]~[9]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[11] 상기 TGF-β 저해제가 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494, 및 SJN-2511으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 [2]~[10]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[12] 상기 TGF-β 저해제가 A83-01인 [2]~[11]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[13] 상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 [2]~[12]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[14] 상기 공정 1 및 공정 2에서의 세포외 매트릭스가 마트리겔(등록상표)인 [1]~[13]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
[15] [1]~[14]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양물.
[16] 무혈청인 [15]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양물.
[17] [1]~[14]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드에 인간 설사병 바이러스를 감염시키고, 감염된 2D 오가노이드를 배양하여 인간 설사병 바이러스를 감염·증식 배양하는 공정 3을 가지는 인간 설사병 바이러스의 제조 방법.
[18] i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 구비하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양 키트.
[19] 상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 [18]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양 키트.
[20] i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 구비하는 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
[21] 상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질 및 R-스폰진인 [20]에 기재된 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
[22] 상기 Wnt 단백질이 그 안정화 물질 아파민과의 복합체를 형성하고 있는 [21]에 기재된 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
[23] 상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 [20]~[22]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
[24] 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 또는 이들 세포 가운데 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과,
상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관내강을 구성하는 상피세포가 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2를 가지며,
상기 공정 1 및 공정 2의 배양에 있어서, i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 이용하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
[25] 상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질 및 R-스폰진인 [24]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
[26] 상기 Wnt 단백질이 그 안정화 물질 아파민과의 복합체를 형성하고 있는 [25]에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
[27] 상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 [24]~[26]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
[28] 상기 공정 1 및 공정 2에서의 세포외 매트릭스가 마트리겔(등록상표)인 [24]~[27]의 어느 하나에 기재된 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
본 발명에 의하면, 인간 설사병 바이러스를 in vitro로 증식 배양함으로써 대량으로 제조하는 방법, 및 이를 위한 오가노이드의 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 실시형태의 인간 설사병 바이러스의 증식 배양에 의한 제조 방법의 설명도이다.
도 2는 실시예 2에서의 qRT-PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3의 상단은 실시예 2에서의 노로바이러스를 감염시킨 오가노이드의 면역 염색상이다. 하단은 상단의 모식도이다.
도 4의 (a)~(c)는 실험예 3에서의 2D 오가노이드의 광학 현미경 사진이다.
도 5의 (a) 및 (b)는 실험예 4에서의 qRT-PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
[인간 설사병 바이러스의 제조 방법]
일 실시형태로서 본 발명은 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과, 상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관내강(腸管內腔)을 구성하는 상피세포가 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2와, 상기 공정 2에서 얻어진 2D 오가노이드에 인간 설사병 바이러스를 감염시켜서, 감염된 2D 오가노이드를 배양하여 인간 설사병 바이러스를 감염·증식 배양하는 공정 3을 가지고, 상기 공정 1, 공정 2, 및 공정 3의 배양에서 소정의 세포 배양 배지를 이용하는 인간 설사병 바이러스의 제조 방법을 제공한다. 먼저, 공정 1, 공정 2 및 공정 3의 배양에 이용되는 배지에 대해서 설명한다. 또한, 본 실시형태에서 공정 1, 공정 2 및 공정 3의 배양에 이용되는 배지는 모두 동일한 배지여도 좋고, 각각 다른 배지여도 좋다.
(세포 배양 배지)
본 실시형태에 이용되는 배지는, i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지이다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 의하면, 실질적으로 p38 저해제를 함유하지 않고, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는, 이들 세포 중에서, 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 장기간 배양할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 인간 장관상피세포(腸管上皮細胞)란 인간 장관 상피조직으로부터 취득하여 분화된 인간 장관상피세포 및 인간 장관상피줄기세포(腸管上皮幹細胞)를 포함한다. 「인간 장관상피줄기세포」란 장기간 자기 복제 기능과 인간 장관 상피 분화 세포에 대한 분화능을 갖는 세포를 의미하고, 인간 장관 상피조직에 유래하는 줄기세포(幹細胞)를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「오가노이드」란 세포를 제어한 공간 내에 고밀도로 집적시켜서 자기 조직화 한 입체적인 세포 조직체를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「실질적으로 함유하지 않는다」란, 특정 성분을 전혀 함유하지 않거나, 혹은 특정 성분이 가지는 기능을 발휘하지 않는 정도의 농도 밖에 함유하지 않는 것을 의미한다.
따라서, 「실질적으로 p38 저해제를 함유하지 않는다」란, p38 저해제를 전혀 함유하지 않거나, 또는 p38 저해제에 의한 분화 억제 및 세포사가 일어나지 않는 정도의 농도밖에 함유하지 않는 것을 의미한다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는 IGF1, FGF2, EGF 및 에피레귤린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 것이 바람직하고, 상기 4종류 인자의 어느 것을 함유하는지는 적당히 선택할 수가 있다. 그 중에서도, 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는 IGF1 및 에피레귤린, FGF2 및 에피레귤린, 또는 IGF1 및 FGF2를 함유하는 것이 바람직하고, IGF1 및 FGF2를 함유하는 것이 보다 바람직하다.
상기 인자를 함유함으로써, 실질적으로 EGF 및 p38 저해제를 함유하지 않고도 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직으로부터 고효율로 오가노이드를 형성시킬 수 있다.
(세포 배양 기본 배지)
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에는 모든 무혈청 세포 배양 기본 배지가 포함된다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는 인간 세포용인 것이 바람직하다.
관련된 무혈청 세포 배양 기본 배지로서는, 예를 들면, 탄산계 완충액으로 pH 7.2 이상 pH7.6 이하로 완충화되어 있는 규정의 합성 배지 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 글루타민, 인슐린, B27 supplement(Thermo　Fisher), N-Acetyl-L-cystein(와코준야꾸), 페니실린 또는 스트렙토마이신, 및 트랜스페린이 보충된 둘베코 변형 이글 배지/햄 F-12 혼합 배지(Dulbecco＇s　Modified　Eagle　Medium：Nutrient　Mixture　F-12; DMEM/F12)를 들 수 있다.
또, 둘베코 변형 이글 배지/햄 F-12 혼합 배지로 바꾸어 RPMI 1640 배지(Roswell　Park　Memorial　Institute　1640　medium), DMEM/F12 및, 어드밴스트 RPMI 배지 등도 들고 있다.
상기 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 소태아혈청(fetal　bovine　serum(FBS) 또는 fetal　calf　serum) 등 불확정 성분을 실질적으로 함유하지 않는다. 또, 상기 세포 배양 배지에 5% 혈청을 함유해도 좋다.
(Wnt 아고니스트)
본 명세서에 있어서, 「Wnt 아고니스트」란 세포 내에서 T-cell　factor(이하, TCF라고도 한다.)/lymphoid　enhancer　factor(이하, LEF라고도 한다.) 개재성의 전사(轉寫)를 활성화하는 약제를 의미한다. 따라서, Wnt 아고니스트는 Wnt 패밀리 단백질로 한정되지 않고, Frizzled 수용체 패밀리 멤버에 결합해서 활성화하는 Wnt 아고니스트, 세포내 β카테닌 분해의 저해제 및 TCF/LEF의 활성화 물질을 포함한다. Wnt 아고니스트는 Wnt 단백질, R-스폰진 및 GSK-3β 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하고, Wnt 단백질 및 R-스폰진인 것이 보다 바람직하다.
Wnt 아고니스트는 상기 Wnt 아고니스트의 비존재하에서의 Wnt 활성 레벨과 비교하여, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 특히 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 100%, 세포에서 Wnt 활성을 자극한다. Wnt 활성은 당업자에게 공지의 방법을 이용해서, 예를 들면 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라아제 보고된 대조에 의해서, Wnt의 전사 활성을 측정함으로써 조사할 수 있다(참고 문헌: Korinek　et　al., 1997. Science 275: 1784-1787).
인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는, 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직의 배양에서는 Wnt 아고니스트가 함유되는 것이 바람직하다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 Wnt 아고니스트로서는 Wnt 단백질과 아파민의 복합체가 함유되는 것이 보다 바람직하고, Wnt 단백질과 아파민과의 복합체 및 R-스폰진(R-spondin) 모두가 함유되는 것이 더욱 바람직하다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 있어서, Wnt 단백질과 아파민과의 복합체 및 R-스폰진을 함유함으로써 인간 장관상피줄기세포 또는 인간 장관상피세포는 오가노이드를 보다 고효율로 형성할 수 있다.
(Wnt 단백질)
Wnt 아고니스트의 일종인 Wnt 단백질로서는, 유래는 특별히 한정되지 않고, 각종 생물 유래의 Wnt 단백질을 이용할 수가 있다. 그 중에서도, 포유동물 유래의 Wnt 단백질인 것이 바람직하다. 포유동물로서는, 예를 들면, 인간, 마우스, 래트(rat), 소, 돼지, 토끼 등을 들 수 있다. 포유동물의 Wnt 단백질로서는, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16 등을 들 수 있다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에서 Wnt 단백질은 복수종을 조합해서 이용해도 좋다.
Wnt 단백질을 제조하는 방법으로써는, 예를 들면, Wnt 단백질 발현 세포를 이용해서 제조하는 방법 등을 들 수 있다. Wnt 단백질 발현 세포에서, 세포의 유래(생물종, 배양 형태 등)는 특별히 한정되지 않고, Wnt 단백질을 안정적으로 발현하는 세포이면 좋으며, Wnt 단백질을 일과성(一過性)으로 발현하는 세포여도 좋다. Wnt 단백질 발현 세포로서는, 예를 들면, 마우스 Wnt3a를 안정되게 발현하는 L세포(ATCC CRL-2647), 마우스 Wnt5a를 안정되게 발현하는 L세포(ATCC CRL-2814) 등을 들 수 있다. 또, Wnt 단백질 발현 세포는 공지의 유전자 재조합 기술을 이용해서 제작할 수 있다. 즉, 원하는 Wnt 단백질을 코딩하는 DNA를 공지의 발현 벡터에 삽입하고, 얻어진 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입함으로써 Wnt 단백질 발현 세포를 제작할 수 있다. 원하는 Wnt 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열은 예를 들면, GenBank 등의 공지된 데이터베이스로부터 취득할 수가 있다.
Wnt 단백질 발현 세포에 의해 발현되는 Wnt 단백질은 Wnt 활성을 가지는 한 Wnt 단백질의 단편이어도 좋고, Wnt 단백질의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 함유하는 것이어도 좋다. Wnt 단백질의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열에 대해서 특별히 한정되는 것은 없고, 예를 들면 어피니티 태그의 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 또, Wnt 단백질의 아미노산 서열은 GenBank 등의 공지된 데이터베이스로부터 취득할 수 있는 아미노산 서열과 완전히 일치할 필요는 없고, Wnt 활성을 가지는 한 공지의 데이터베이스로부터 취득할 수 있는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열이어도 좋다.
GenBank 등의 공지된 데이터베이스로부터 취득할 수 있는 Wnt 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 예를 들면, 공지의 데이터베이스로부터 취득할 수 있는 아미노산 서열에서, 1~여러 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
「1~여러 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열」이란, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등 공지의 변이 펩티드 제작법 등에 의해서, 결실, 치환 혹은 부가할 수 있는 정도의 수(10개 이하가 바람직하고, 7개 이하가 보다 바람직하며, 6개 이하가 더욱 바람직하다.)의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가되어 있는 것을 의미한다.
또, 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 예를 들면, 공지의 데이터베이스로부터 취득할 수 있는 아미노산 서열과의 동일성이 적어도 80% 이상이고, 바람직하게는 적어도 85% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 92% 이상, 특히 바람직하게는 적어도 95% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 99% 이상인 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
Wnt 단백질 활성은 예를 들면, TCF 실험법으로 확인할 수가 있다. 일반적으로, TCF 실험법이란 Wnt 신호가 세포에 들어오면 특이적으로 활성화되는 전사 인자인 T-cell factor(TCF)의 결합 서열을 가지는 루시페라아제 유전자를 도입하고, Wnt 단백질의 활성의 강함을 루시페라아제 발광에 의해 간편하게 평가하는 방법이다(참고 문헌: Molenaar et al., Cell, 86, 391, 1996.). TCF 실험법 이외의 방법으로는, Wnt 신호가 들어가면 세포내의 β카테닌이 안정화되는 것을 이용해서, β카테닌의 양을 단백질흡입법으로 정량 평가하는 방법(참고 문헌: Shibamoto et al., Gene to cells, 3, 659, 1998.) 등을 들 수 있다. 또한, Wnt5a 등과 같이, non-canonical pathway를 통해서 세포에 신호를 주는 Wnt 단백질에 대해서는, 세포내 어댑터 단백질인 Dvl2의 인산화를 평가함으로써 Wnt 단백질의 활성을 평가하는 방법(참고 문헌: Kikuchi et al., EMBO J., 29, 3470, 2010.) 등을 이용할 수가 있다.
(R-스폰진(R-spondin))
Wnt 아고니스트의 일종인 R-스폰진으로서는, R-스폰진 1, R-스폰진 2, R-스폰진 3 및 R-스폰진 4로 이루어지는 R-스폰진 패밀리를 들 수 있다. R-스폰진 패밀리는 분비 단백질이고, Wnt 신호 전달 경로의 활성화 및 제어에 관련되었다는 점이 알려져 있다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 있어서, R-스폰진을 복수종 조합해서 이용해도 좋다.
R-스폰진 활성을 가지는 한, R-스폰진의 단편이어도 좋고, R-스폰진의 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 함유하는 것이어도 좋다.
(함유량)
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 Wnt 단백질의 농도는 50ng/mL 이상인 것이 바람직하고, 100ng/mL 이상 10㎍/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 200ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 더욱 바람직하고, 300ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 특히 바람직하다. 인간 장관상피줄기세포 배양중, 바람직하게는 2일마다 Wnt 아고니스트를 배양 배지에 첨가하고, 바람직하게는 4일마다 세포 배양 배지를 신선한 것으로 교환한다.
(GSK-3β 저해제)
공지된 GSK-3β 저해제는 CHIR-99021, CHIR-98014(Sigma-Aldrich), 리튬(Sigma), 켄파울론(Biomol　International, Leost, M.　et　al. (2000) Eur　J　Biochem　267, 5983-5994), 6-브로모인디루빈-30-아세톤옥심(Meyer, L　et　al. (2003) Chem. Biol. 10, 1255-1266), SB　216763 및 SB　415286(Sigma-Aldrich) 및 GSK-3과 axin의 상호작용을 저지하는 FRAT 패밀리 멤버 및 FRAT 유래의 펩티드를 함유한다. 개략적인 설명은, 참조에 따라서 본 명세서에 포함되는 Meijer　et　al. (2004) Trends　in　Pharmacological　Sciences　25, 471-480에 나타나 있다. GSK-3β 저해 레벨을 결정하기 위한 방법 및 어세이는 당업자에게 공지된 내용이고, 예를 들면, Liao　et　al. (2004), Endocrinology, 145(6) 2941-2949에 기재된 방법 및 어세이를 포함한다.
(아파민)
본 명세서에 있어서, 「아파민」이란 알부민 패밀리에 속하는 당단백질을 의미하고, 혈액 또는 체액 중에 존재한다는 것이 알려져 있다. 세포 배양에 이용하는 배지에 통상 첨가되는 혈청에는, 그 혈청을 채취한 동물 유래의 아파민이 포함되어 있다. 혈청 중에는 아파민 이외의 불순물 등을 함유하기 때문에, 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에서는 혈청을 이용하지 않고, 아파민을 단독으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 아파민은, 유래는 특별히 한정되지 않고, 각종 생물 유래의 아파민을 이용할 수 있다. 그 중에서도, 포유동물 유래의 아파민인 것이 바람직하다. 포유동물로서는, 예를 들면, 상술한 [Wnt 단백질]과 같은 것을 들 수 있다. 주요 포유동물 아파민의 아미노산 서열 및 이것을 코딩하는 유전자의 염기 서열은 예를 들면, GenBank 등의 공지된 데이터베이스로부터 취득할 수가 있다. 예를 들면, GenBank에서 인간 아파민의 아미노산 서열은 AAA21612, 이것을 코딩하는 유전자의 염기 서열은 L32140의 등록 번호(accession number)로 등록되어 있고, 소 아파민의 아미노산 서열은 DAA28569, 이것을 코딩하는 유전자의 염기 서열은 GJ060968의 등록 번호로 등록되어 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 아파민은 혈청 등에 함유되는 천연 아파민을 공지된 방법으로 정제한 것이어도 좋고, 재조합 아파민이어도 좋다. 재조합 아파민은 공지의 유전자 재조합 기술을 적당히 이용하여 제조할 수 있다.
재조합 아파민의 제조 방법으로는, 예를 들면, 아파민을 코딩하는 DNA를 공지의 발현 벡터에 삽입하고, 얻어진 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입하여 재조합 아파민을 발현시키며, 공지의 정제 방법을 이용해서 정제함으로써 제조할 수 있다. 재조합 아파민은 어피니티 태그를 부가한 아파민이어도 좋다. 부가하는 어피니티 태그는 특별히 한정되지 않고, 공지의 어피니티 태그로부터 적당히 선택해서 이용할 수가 있다. 어피니티 태그로서는, 특이적 항체에 의해 인식되는 어피니티 태그인 것이 바람직하고, 예를 들면, FLAG 탭, MYC 태그, HA 태그, V5 태그 등을 들 수 있다.
상술한 Wnt 단백질은 특정 세린 잔기가 지방산(팔미톨레산)으로 수식되어 있기 때문에, 강한 소수성을 갖는다. 그 때문에, Wnt 단백질은 수용액 중에서는 응집 또는 변성되기 쉽기 때문에, 정제 및 보존이 매우 어려운 점이 널리 알려져 있다.
한편, 이 특정 세린 잔기의 지방산에 의한 수식은, Wnt 단백질의 생리 활성에 필수이고, Frizzled 수용체 패밀리 멤버와의 결합에 관여한다는 것이 보고되어 있다.
또, 수용액 중에 있어서, Wnt 단백질이 아파민과 1대1로 결합해서 복합체를 형성하고, 높은 생리 활성을 유지하면서 가용화하는 지견도 있다(Active　and　water-soluble　form　of　lipidated　Wnt　protein　is　maintained　by　A　serum　glycoprotein　afamin/albumin. Mihara　E, Hirai　H, Yamamoto　H, Tamura-Kawakami　K, Matano　M, Kikuchi　A, Sato　T, Takagi　J. Elife. 2016　Feb　23; 5.).
관련된 지견을 바탕으로, Wnt 단백질 및 아파민 모두를 발현시키는 세포를 배양하는 방법에 의해서, Wnt 단백질 아파민 복합체를 제조해도 좋고, Wnt 단백질 발현 세포와 아파민 발현 세포를 함께 배양하는 방법에 의해서, Wnt 단백질-아파민 복합체를 제조해도 좋다. Wnt 단백질-아파민 복합체 중의 Wnt 단백질의 활성은 상술한 [Wnt 단백질]과 동일한 방법을 이용해서 평가할 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 아파민의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 50ng/mL 이상 10㎍/mL 이하인 것이 바람직하고, 100ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 300㎍/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 더욱 바람직하다.
(인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1))
일반적으로, 「인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1)」는 별명 소마토메딘 C로도 불리며, 주로 간장에서 성장 호르몬(GH)에 의한 자극으로 분비되는 인자이다. 인체의 대부분의 세포(특히, 근육, 뼈, 간장, 신장, 신경, 피부 및 폐 등의 세포)는 IGF1의 영향을 받는 것으로 알려져 있다. IGF1는 인슐린 유사 효과에 더하여 세포 성장(특히, 신경세포) 및 발달, 그리고 세포 DNA 합성을 조절하는 기능을 가진다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 IGF1의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 5ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 바람직하고, 10ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 50ng/mL 이상 500ng/mL 이하인 것이 더욱 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 IGF1의 농도가 상기 범위의 것으로, 실질적으로 p38 저해제를 함유하지 않고도, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 장기간 배양할 수 있다.
또, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직으로부터 고효율로 오가노이드를 형성시킬 수 있다.
또, 인간 장관상피줄기세포의 배양 중, 2일마다 IGF1를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일마다 배양 배지를 신선한 것으로 교환하는 것이 바람직하다.
(섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2))
일반적으로, 「섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2)란 염기성 섬유아세포 증식 인자로서, 섬유아세포 증식 인자 수용체(fibroblast　growth　factor　receptor; FGFR)와 결합하고, 혈관내 피세포의 증식 촉진과 통 형상 구조로의 조직화, 즉 혈관 신생을 촉진하는 기능을 갖는다. 또, 인간 FGF2는 저분자량형(LWL)과 고분자량형(HWL) 2개의 동형 단백질을 가지는 것이 알려져 있다. LWL는 주로 세포질에 존재하여 자기 분비(오토크라인)로 작용하는 한편, HWL은 핵내에 있으며 세포 내에서 작용하는 인트라크라인(intracrine) 기구에서 활성을 나타낸다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 FGF2의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 5ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 바람직하고, 10ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 50ng/mL 이상 500ng/mL 이하인 것이 더욱 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 FGF2의 농도가 상기 범위임에 따라서, 실질적으로 p38 저해제를 함유하지 않고도 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 장기간 배양할 수 있다.
또, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직으로부터 고효율로 오가노이드를 형성시킬 수 있다.
또, 인간 장관상피줄기세포의 배양중, 2일마다 FGF2를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일마다 배양 배지를 신선한 것으로 교환하는 것이 바람직하다.
(에피레귤린(Epiregulin; EREG))
일반적으로, 「에피레귤린(Epiregulin; EREG)이란 티로신인산화효소(ErbB) 패밀리 수용체(ErbB1~4) 중에서, ErbB1 및 ErbB4에 특이적으로 결합하는 EGF 유사 성장 인자이다. 케라틴 생성 세포, 줄기세포, 섬유아세포 및 혈관내피세포의 증식을 자극하는 점이 알려져 있다. 또, EREG는 주로 방광, 폐, 신장, 대장 등의 암 종양, 태반 및 말초혈백혈구에서 발현하고 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 EREG의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 5ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 바람직하고, 10ng/mL 이상 1㎍/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 50ng/mL 이상 500ng/mL 이하인 것이 더욱 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 EREG의 농도가 상기 범위임에 따라서, 실질적으로 p38 저해제를 함유하지 않고도 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 장기간 배양할 수 있다.
또, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직으로부터 고효율로 오가노이드를 형성시킬 수 있다.
또, 인간 장관상피세포의 배양중, 2일마다 EREG를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일마다 배양 배지를 신선한 것으로 교환하는 것이 바람직하다.
(BMP 저해제)
골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP)는 2량체 리간드로서 2종류의 다른 수용체 세린/트레오닌키나아제, I형 및 II형 수용체로 이루어지는 수용체 복합체에 결합한다. II형 수용체는 I형 수용체를 인산화하고, 그 결과 이 수용체 키나아제가 활성화된다. 이 I형 수용체는 계속해서 특이적인 수용체 기질(SMAD)을 인산화하고, 그 결과 신호 전달 경로에 의해서 전사 활성이 된다. 일반적으로, BMP 저해제는 예를 들면, BMP 수용체로의 BMP 분자 결합을 저지 또는 저해하는 것으로서, BMP 활성을 중화하는 복합체를 형성하기 위해서 BMP 분자에 결합하는 약제이다. 또한, BMP 저해제는 예를 들면, BMP 수용체와 결합해서 BMP 분자의 수용체로의 결합을 저지 또는 저해하는 것으로, 안타고니스트 또는 역아고니스트로 작용하는 약제이다.
BMP 저해제는 이 저해제의 비존재하에서의 BMP 활성 레벨과 비교하여, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 저해 활성을 가진다. BMP 저해 활성은 당업자에게 공지의 방법(참고 문헌: Zilberberg　et　al., BMC　Cell Biol, 8:41, 2007.)을 이용해서 BMP의 전사 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 BMP 저해제로는 천연 BMP 결합 단백질인 것이 바람직하고, 예를 들면, 노긴(Noggin), 그렘린, 코딘(Chordin), 코딘 도메인 등의 코딘 유사 단백질; 폴리스타틴(Follistatin), 폴리스타틴 도메인 등의 폴리스타틴 관련 단백질; DAN, DAN 시스테인 노트 도메인 등의 DAN 유사 단백질; 스클레로스틴/SOST, 데코린, α-2 매크로 글로블린 등을 들 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 BMP 저해제로서는, 그 중에서도 코딘 유사 단백질 또는 DAN 유사 단백질이 바람직하고, 코딘 유사 단백질이 보다 바람직하다. 코딘 유사 단백질로서는 노긴이 바람직하다. 코딘 유사 단백질이나 DAN 유사 단백질은 확산성 단백질이고, 다양한 친화도로 BMP 분자에 결합하여, 신호 전달 수용체로의 BMP 분자의 접근을 저해할 수 있다. 상피세포를 배양하는 경우에, 이들 BMP 저해제를 세포 배양 배지에 첨가함으로써, 줄기세포의 상실을 방해할 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 BMP 저해제의 농도는 10ng/mL 이상 100ng/mL 이하인 것이 바람직하고, 20ng/mL 이상 100ng/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 50ng/mL 이상 100ng/mL 이하인 것이 더욱 바람직하다. 줄기세포의 배양중, 2일마다 BMP 저해제를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일마다 배양 배지를 신선한 것으로 교환하는 것이 바람직하다.
(TGF-β 저해제)
형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β)는 증식 인자의 일종이고, 신장, 골수, 혈소판 등 거의 모든 세포에서 산생된다. TGF-β에는 5종류의 아류형(β1~β5)이 존재한다. 또한, TGF-β는 골아세포의 증식 및 콜라겐과 같은 결합 조직의 합성 및 증식을 촉진하고, 상피세포의 증식이나 파골세포에 대해서는 억제적으로 작용하는 것이 알려져 있다. 일반적으로, TGF-β 저해제는, 예를 들면 TGF-β 수용체로의 TGF-β 결합을 저지 또는 저해하는 것으로서, TGF-β 활성을 중화하는 복합체를 형성하기 위해서 TGF-β에 결합하는 약제이다. 또, TGF-β 저해제는 예를 들면, TGF-β 수용체와 결합하여 TGF-β의 수용체로의 결합을 저지 또는 저해하는 것이며, 안타고니스트 또는 역아고니스트로서 작용하는 약제이다.
TGF-β 저해제는 이 저해제의 비존재하에서의 TGF-β 활성 레벨과 비교해서, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 저해 활성을 가진다. TGF-β 저해 활성은 당업자에게 공지의 방법으로 평가할 수 있다. 관련된 평가계로서는, 루시페라아제 보고된 유전자를 움직이는 인간 PAI-1 프로모터 또는 Smad 결합 부위를 함유하는 보고된 구축물을 이용해서 세포가 안정적으로 감염되어 있는 세포 어세이를 들 수 있다(참고 문헌: De Gouville et al., Br J Pharmacol, 145(2):166-177, 2005.).
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 TGF-β 저해제로서는, 예를 들면, A83-01(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1-페닐티오카르바모일-4-퀴놀린-4-일피라졸), ALK5　Inhibitor　I(3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노닐)-1H-피라졸), LDN193189(4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라조로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린), SB431542(4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-피리딘­2­일-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드), SB-505124(2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 염산염수화물), SD-208(2-(5-클로로-2-플루오로페닐)프테리딘-4-일) 피리딘-4-일-아민), SB-525334(6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린), LY-364947(4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린), LY2157299(4-[2-(6-메틸-피리딘-2-일)-5,6-디히드로-4H-피로로[1,2-b]피라졸-3-일]-퀴놀린-6-카르본산아미드), TGF-β　RI　Kinase　Inhibitor　II　616452(2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘), TGF-β　RI　Kinase　Inhibitor　III　616453(2-(5-벤조[1,3]디옥솔-4-일-2-tert-부틸-1H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘,　HCl), TGF-β　RI　Kinase　Inhibitor　IX　616463(4-((4-((2,6-디메틸피리딘-3-일)옥시)피리딘-2-일)아미노)벤젠술폰아미드), TGF-β　RI　Kinase　Inhibitor　VII　616458(1-(2-((6,7-디메톡시-4-퀴놀릴)옥시)-(4,5-디메틸페닐)-1-에타논), TGF-β　RI　Kinase　Inhibitor　VIII　616459(6-(2-tert-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일)-퀴녹살린), AP12009(TGF-β2 안티센스 화합물 “Trabedersen”Belagenpumatucel-L(TGF-β2 안티센스 유전자 수식 동종이계 종양 세포 백신), CAT-152(Glaucoma-lerdelimumab(항-TGF-β2 단일 클론 항체)), CAT-192(Metelimumab(TGFβ을 중화하는 인간 IgG4 단일 클론 항체), GC-1008(항-TGF-β 단일 클론 항체) 등을 들 수 있다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 TGF-β 저해제로서는, 이 중에서도 A83-01이 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 TGF-β 저해제 농도는 100nM 이상 10μM 이하인 것이 바람직하고, 500nM 이상 5μM 이하인 것이 보다 바람직하며, 500nM 이상 2μM 이하인 것이 더욱 바람직하다. 줄기세포 배양중, 2일마다 TGF-β 저해제를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일마다 배양 배지를 신선한 것으로 교환하는 것이 바람직하다.
(γ세크레타아제 저해제)
γ세크레타아제 저해제는 이 저해제의 비존재하에서의 γ세크레타아제 활성 레벨과 비교해서, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 저해 활성을 가진다. γ세크레타아제 저해 활성은 당업자에게 공지의 방법으로 평가할 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 γ세크레타아제로서는, 예를 들면, BMS299897, DAPT, DBZ, JLK6, L-685, 458, LY411575 등을 들 수 있다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 γ세크레타아제로서는, 이 중에서도 LY411575가 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 γ세크레타아제 저해제의 농도는 1nM 이상 10μM 이하인 것이 바람직하고, 100nM 이상 1μM 이하인 것이 더욱 바람직하다.
세포 1개당 인간 설사병 바이러스의 생산량 증가의 관점에서, γ세크레타아제 저해제는 공정 2의 단층 배양으로 이용하는 것이 바람직하다. 줄기세포 배양중, 2일마다 γ세크레타아제 저해제를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일간 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.
(분열 촉진 증식 인자)
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되어 있어도 좋은 분열 촉진 증식 인자로는, 예를 들면, 상피 증식 인자(Epidermal　Growth　Factor; EGF), 뇌 유래 신경영양인자(brain　derived　neurotrophic　factor; BDNF), 케라틴 생성 세포 증식 인자(keratinocyte　growth　factor; KGF) 등 증식 인자의 패밀리를 들 수 있다. 이들의 분열 촉진 증식 인자는 복수 종류를 조합해서 이용해도 좋다.
EGF는 여러 가지 배양외배엽성 세포 및 중배엽성 세포에 대한 강력한 분열 촉진 인자이고, 일부 섬유아세포의 특이적 세포 분화에 현저한 영향을 미친다. EGF 전구체는 단백질 분해에 의해서 절단되고, 세포를 자극하는 53-아미노산 펩티드 호르몬을 생성시키는 막 결합 분자로서 존재한다.
상기 세포 배양 배지에 함유되어 있어도 좋은 분열 촉진 증식 인자로서는, 그 중에서도 EGF가 바람직하다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 EGF의 농도는 5ng/mL 이상 500ng/mL 이하인 것이 바람직하고, 10ng/mL 이상 400ng/mL 이하인 것이 보다 바람직하며, 50ng/mL 이 200ng/mL 이하인 것이 더욱 바람직하다.
또, 상기 세포 배양 배지에 KGF를 함유하는 경우에도, KGF와 동일한 함유량인 것이 바람직하다. 복수의 KGF, 예를 들면 KGF1 및 KGF2(FGF7 및 FGF10으로도 알려져 있다.)를 사용하는 경우는, KGF의 총 함유량이 상기 범위인 것이 바람직하다. 줄기세포 배양중, 2일마다 분열 촉진 증식 인자를 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하고, 4일마다 배양 배지를 신선한 것으로 교환하는 것이 바람직하다.
(그 외 성분)
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 추가로 Rock(Rho-키나아제) 저해제를 함유하고 있어도 좋다. Rock 저해제로서는, 예를 들면, Y-27632((R)-(＋)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드 2염산염 일수화물), 파수딜(HA1077)(5-(1,4-디아제판-1-일술포닐)이소퀴놀린), H-1152((S)-(＋)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀 2염산염) 등을 들 수 있다. Rock 저해제로서 Y-27632를 이용하는 경우는, 단세포에 분산된 줄기세포 배양의 최초 2일간 첨가하는 것이 바람직하다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 Y-27632는 약 10μM인 것이 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는 추가로 가스트린(또는 Leu15-가스트린 등의 적절한 대체물)이 첨가되어도 좋다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 가스트린(또는 적절한 대체물) 농도는, 예를 들면 1ng/mL 이상 10㎍/mL이어도 좋고, 예를 들면 1ng/mL 이상 1㎍/mL 이하여도 좋으며, 예를 들면 5ng/mL 이상 100ng/mL 이하여도 좋다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는 추가로 적어도 1종의 아미노산을 함유해도 좋다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 아미노산으로서는, 예를 들면, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-시스테인, L-시스틴, L-글루타민산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리진, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-바린 및 그 조합 등을 들 수 있다. 일반적으로, 세포 배양 배지에 함유되는 L-글루타민의 농도는 0.05g/L 이상 1g/L 이하(통상, 0.1g/L 이상 0.75g/L 이하)이다. 세포 배양 배지에 함유되는 그 외의 아미노산은 0. 001g/L 이상 1g/L(통상, 0.01g/L 이상 0.15g/L 이하)이다. 아미노산은 합성 유래여도 좋다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 추가로 적어도 1종의 비타민을 함유하고 있어도 좋다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 비타민으로서는, 예를 들면, 티아민(비타민 B1), 리보플라빈(비타민 B2), 니아신(비타민 B3), D-판토텐산 칼슘(비타민 B5), 피리독살/피리독사민/피리독신(비타민 B6), 엽산(비타민 B9), 시아노코바라민(비타민 B12), 아스코르빈산(비타민 C), 카르시페롤(비타민 D2), DL-α 토코페롤(비타민 E), 비오틴(비타민 H), 메나디온(비타민 K) 등을 들 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 추가로 적어도 1종의 무기염을 함유하고 있어도 좋다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 무기염은 세포의 침투압 평형의 유지를 돕기 위해서, 그리고 막 전위의 조절을 돕기 위한 것이다. 무기염의 구체적인 예로서는, 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 아연의 염을 들 수 있다. 염은 통상, 염화물, 인산염, 황산염, 질산염 및 중탄산염의 형태로 이용된다. 추가로 구체적인 염으로는, CaCl2, CuSO4-5H2O, Fe(NO3)-9H2O, FeSO4-7H2O, MgCl, MgSO4, KCl, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4, Na2HPO4-H2O, ZnSO4-7H2O 등을 들 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 추가로 적어도 1종의 탄소 에너지원이 될 수 있는 당을 함유하고 있어도 좋다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 당으로서는, 예를 들면, 글루코오스, 갈락토오스, 말토오스, 프룩토오스 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 당으로는 글루코오스가 바람직하고, D-글루코오스(덱스트로스)가 특히 바람직하다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 당의 농도는 1g/L 이상 10g/L인 것이 바람직하다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 추가로 적어도 1종의 미량 원소를 함유하고 있어도 좋다. 본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지에 함유되는 미량 원소로서는, 예를 들면, 바륨, 브롬, 코발트, 요오드, 망간, 크롬, 구리, 니켈, 셀렌, 바나듐, 티타늄, 게르마늄, 몰리브덴, 규소, 철, 불소, 은, 루비듐, 주석, 지르코늄, 카드뮴, 아연, 알루미늄 또는 이들의 이온 등을 들 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는, 추가로 적어도 1종의 부가적인 약제를 함유하고 있어도 좋다. 이러한 약제로서는, 줄기세포 배양을 개선하는 점이 보고된 영양소 또는 증식 인자, 예를 들면, 콜레스테롤/트랜스페린/알부민/인슐린/프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산염/다른 인자 등을 들 수 있다.
본 실시형태와 관련된 세포 배양 배지는 동물 유래 담즙을 추가로 함유하고 있어도 좋다. 실시예에서 후술하듯이, 세포 배양 배지에 동물 유래 담즙을 첨가함으로써, 인간 설사병 바이러스의 증식을 현저하게 촉진할 수 있다. 동물 유래 담즙으로는, 소 담즙 추출물, 돼지 담즙 추출물 등을 들 수 있다. 이들 담즙 추출물은 시판되는 것이어도 좋다.
(공정 1)
공정 1은 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정이다.
공정 1에 있어서, 세포외 매트릭스를 조제하는 세포외 매트릭스 조제 공정과, 세포외 매트릭스 중의 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 세포외 매트릭스 상에 접착시키는 접착 공정과, 상기 접착 공정 후에 상술한 세포 배양 배지를 첨가하여 상기 인간 장관상피줄기세포, 상기 인간 장관상피세포 또는 상기 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 배양하여 오가노이드를 형성시키는 오가노이드 형성 공정을 구비하는 것이 바람직하다. 공정 1이 구비하는 바람직한 공정에 대해서 이하에 자세하게 설명한다.
《세포외 매트릭스 조제 공정》
일반적으로, 「세포외 매트릭스(Extracellular Matrix; ECM)」란, 생물에 있어서 세포 밖에 존재하는 초분자 구조를 의미한다. 이 ECM은 상피줄기세포, 상피 종양 세포, 또는 그것들을 함유하는 조직이 증식하기 위한 기반이 된다.
ECM은 여러 가지 다당, 물, 엘라스틴 및 당단백질을 함유한다. 당단백질로서는, 예를 들면, 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴, 라미닌 등을 들 수 있다.
ECM의 조제 방법으로는, 예를 들면, 결합 조직 세포를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, ECM 산생 세포, 예를 들면, 섬유아세포를 배양한 후에 이들 세포를 꺼내고, 상피줄기세포, 상피세포, 상피 종양 세포 또는 그것들을 함유하는 조직을 첨가함으로써 ECM를 기반으로 이용할 수가 있다.
ECM 산생 세포로는, 예를 들면, 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 산생하는 연골 세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 산생하는 섬유아세포, 주로 콜라겐(I형, III형 및 V형), 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸, 히알루론산, 피브로넥틴 및 테나신 C를 산생하는 결장근섬유아세포 등을 들 수 있다. 또는, 시판하는 ECM를 이용해도 좋다. 시판하는 ECM으로는, 예를 들면, 세포외 매트릭스 단백질(Invitrogen사제), Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종 세포에 유래하는 기저막 조제물(예를 들면, 마트리겔(등록상표)(BD Biosciences사제)) 등을 들 수 있다. ProNectin(Sigma Z378666) 등의 합성 ECM를 이용해도 좋다. 또, 천연 ECM 및 합성 ECM의 혼합물을 이용해도 좋다.
줄기세포를 배양하기 위해서 ECM을 사용하는 경우, 줄기세포의 장기 생존 및 미분화 줄기세포의 계속적 존재를 강화할 수 있다. ECM의 비존재하에서는 줄기세포 배양물을 장기간에 걸쳐서 배양하지 못하고, 미분화 줄기세포의 계속적 존재는 관찰되지 않는다. 게다가 ECM이 존재하면, ECM의 비존재하에서는 배양할 수 없는 오가노이드를 배양할 수가 있다.
ECM는 통상 세포가 현탁된 접시 바닥에 가라앉아 있다. 예를 들면, ECM이 37℃에서 응고될 때, 상술한 세포 배양 배지를 더해서 ECM 중에 확산시켜서 이용해도 좋다. 배양중인 세포는 ECM의 표면 구조와 상호작용 함으로써, 예를 들면, 인테그린과 상호 작용함에 따라 ECM에 고착할 수 있다.
ECM은 배양 용기 등에 코팅해서 이용해도 좋다. ECM으로서 피브로넥틴을 이용하는 경우, 배양 용기 중에 코팅되는 비율은 1㎍/cm2 이상 250㎍/cm2 이하인 것이 바람직하고, 1㎍/cm2 이상 150㎍/cm2 이하인 것이 보다 바람직하며, 8㎍/cm2 이상 125㎍/cm2 이하인 것이 더욱 바람직하다.
세포외 매트릭스로서는 마트리겔(등록상표)을 이용하는 것이 바람직하다. 실시예에 있어서, 후술하는 바와 같이, 세포외 매트릭스로서 마트리겔(등록상표)을 사용하면, 2D 오가노이드의 배양기재에 대한 접착이 양호해지는 경향이 있다.
《접착 공정》
계속해서, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 그것들 세포중에서 적어도 어느 일방을 함유하는 조직을 준비한다.
인간 장관 상피조직으로부터 인간 장관상피세포를 단리(單離)하는 방법으로는, 이 기술 분야에서 공지된 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 킬레이트제와 단리 조직을 항온 방치함에 따라서, 음와(陰窩)를 단리할 수 있다. 이 조직을 세정한 후, 유리 슬라이드로 인간 장관상피세포층을 점막 하층에서 박리하여 가늘게 절단한다. 이 후, 트립신 또는 바람직하게는 EDTA 및 EGTA 중에서 적어도 어느 일방을 함유하는 액 중에서 항온 방치하고, 예를 들면, 여과 및 원심기의 적어도 어느 일방을 이용해서, 미소화된 조직 단편과 음와 유래의 단일 세포를 분리한다. 트립신을 대신해서, 그 외의 단백질 분해 효소, 예를 들면 콜라게나아제 및 디스파제 I의 적어도 어느 일방을 사용해도 좋다.
인간 장관 상피조직으로부터 줄기세포를 단리하는 방법으로써 이 기술 분야에서 공지된 방법을 들 수 있다. 줄기세포는 그 표면상에서 Lgr5 및 Lgr6 중 적어도 어느 일방(Lgr5 및 Lgr6은 대형 G 단백질 공역 수용체(GPCR) 수퍼 패밀리에 속한다)을 발현한다. 단리방법으로는 인간 장관 상피조직으로부터 세포현탁액을 조제하고, 이 세포 현탁액을 Lgr5 및 Lgr6 중 적어도 어느 일방과 결합하는 화학물질에 접촉시켜서, 이 Lgr5 및 Lgr6 중 적어도 어느 일방과 결합하는 화학물질을 분리하고, 이 결합 화합물로부터 줄기세포를 단리하는 방법을 들 수 있다.
Lgr5 및 Lgr6 중 적어도 어느 일방과 결합하는 화학물질로서는, 예를 들면 항체, 보다 구체적으로는, 예를 들면 Lgr5 및 Lgr6 중 적어도 어느 일방을 특이적으로 인식해서, 거기에 결합하는 단일 클론 항체(예를 들면, 마우스 및 래트 단일 클론 항체를 함유하는 단일 클론 항체 등)를 들 수 있다. 이러한 항체를 이용해서, 예를 들면 자성 비드를 활용하거나, 또는 형광 활성화 세포 분별장치를 통해서 Lgr5 및 Lgr6 중 적어도 어느 일방을 발현하고 있는 줄기세포를 단리할 수 있다.
상술한 방법에 따라서 단리된 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 인간 장관 표피 종양 세포, 또는 그것들 세포 중에서 적어도 어느 일방을 함유하는 조직을 상기 조제 공정에서 얻어진 세포 매트릭스에 포매(包埋)하고, 플레이트에 파종해서 정치(靜置)한다. 파종된 세포는 ECM의 표면 구조와 상호 작용함에 따라, 예를 들면, 인테그린과 상호작용 함으로써 ECM에 접착할 수 있다.
《오가노이드 형성 공정》
계속해서, 세포 파종 후에 세포가 마르지 않는 동안, 상술한 세포 배양 배지를 첨가해서 배양한다. 배양 온도는 30℃ 이상 40℃ 이하가 바람직하고, 37℃ 정도가 보다 바람직하다. 배양 시간은 이용하는 세포에 의해서 적당히 조제할 수 있다. 배양 개시로부터 1~2주 정도 후에 오가노이드를 형성시킬 수 있다. 또한, 종래에는 2~3개월 밖에 세포 유지 배양할 수 없었던 세포에 대해서, 공정 1에서는 3개월 이상의 장기간(바람직하게는, 10개월 정도)에도 세포를 유지 배양할 수 있다. 공정 1에 의해서 3D 오가노이드를 얻을 수 있다(도 1 참조.).
또한, 오가노이드 형성 공정에서, 저산소 하에서 배양을 실시해도 좋다. 저산소하에서 배양을 실시함으로써, 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 인간 장관 상피 종양 세포 또는 그것들 세포 중 적어도 어느 일방을 함유하는 조직으로부터 고효율로 오가노이드를 형성시킬 수 있다.
본 실시형태에서의 저산소 하에서란, 산소 농도가 0.1% 이상 15% 이하인 것이 바람직하고, 0.3% 이상 10% 이하인 것이 보다 바람직하며, 0.5% 이상 5% 이하인 것이 더욱 바람직하다.
(공정 2)
공정 2는 상기 공정 1에서 얻어진 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여 2D 오가노이드를 얻는 공정이다.
도 1에 나타내듯이, 3D 오가노이드에서 인간 설사병 바이러스에 감염하는 부위는 장관의 안쪽 부분이다. 따라서, 3D 오가노이드를 무너뜨려서 안쪽 부분을 드러내도록 할 필요가 있다.
3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하는 방법으로는, 특별히 한정되지 않고, 물리적 방법, 효소 처리법 등을 들 수 있지만, 세포를 손상시키지 않는 관점에서 효소 처리법이 바람직하다. 효소 처리법에 이용되는 효소로는 트립신 등, 상기 [접착 공정]에서 든 것과 동일한 것을 들 수 있다.
계속해서, 상기 [세포외 매트릭스 조제 공정]과 동일하게 해서 조제된 세포외 매트릭스 상에 파종하여 정치한다. 파종된 세포는 ECM의 표면 구조와 상호 작용함으로써, 예를 들면, 인테그린과 상호작용 하여 ECM에 접착할 수 있다.
계속해서, 세포 파종 후, 세포가 마르지 않는 동안에 상술한 분화 배지를 첨가하여 단층 배양한다. 공정 2에 따라서 2D 오가노이드를 얻을 수 있다(도 1 참조.).
(공정 3)
공정 3은 상기 공정 2에서 얻어진 2D 오가노이드에 인간 설사병 바이러스를 감염시켜서, 감염된 2D 오가노이드를 배양하는 공정이다(도 1 참조.). 2D 오가노이드가 액체 배지와 접하는 세포 표면은 3D 오가노이드의 안쪽 면도 포함하기 때문에, 인간 설사병 바이러스가 효율적으로 감염된다.
인간 설사병 바이러스로는, 로타바이러스, 노로바이러스, 사포바이러스, 아스트로바이러스, 장관 아데노바이러스, 파레코바이러스, 아이치바이러스 등을 들 수 있고, 노로바이러스가 바람직하다. 실시예에서 후술하듯이, 공정 3에 의해서 인간 설사병 바이러스가 증식한다.
본 실시형태의 인간 설사병 바이러스의 제조 방법에 의하면, in vitro로 인공적으로 대량으로 인간 설사병 바이러스 증식 배양함으로써 만들어 낼 수 있고, 인간 설사병 바이러스에 대한 병태의 해명, 항바이러스약과 소독약 개발, 백신 개발 등에 도움이 될 수 있다.
[키트]
1 실시형태에 있어서, 본 발명은 i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 구비하는 인간 설사병 바이러스 제조 키트를 제공한다.
본 실시형태의 키트는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양 키트라고 할 수도 있다.
본 실시형태의 키트에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 동물 유래 담즙을 추가로 함유하고 있어도 좋다. 실시예에 있어서, 후술하는 바와 같이, 세포 배양 배지에 동물 유래 담즙을 첨가함으로써 인간 설사병 바이러스의 증식을 현저하게 촉진할 수 있다.
동물 유래 담즙으로는 소 담즙 추출물, 돼지 담즙 추출물 등을 들 수 있다. 이들 담즙 추출물은 시판되는 것이어도 좋다.
본 실시형태의 키트에서 상기 세포 배양 배지는 무혈청이어도 좋다.
본 실시형태의 키트는 상기 세포 배양 배지 외에 세포 배양 기구, 사용 설명서 등을 추가로 구비하는 것이어도 좋다. 세포 배양 기구 등으로는, 세포 배양 플레이트 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
본 실시형태의 키트는 인간 설사병 바이러스의 제조 방법에 바람직하게 이용할 수 있다. 인간 설사병 바이러스의 제조 방법에 사용하는 시약류를 키트화 함으로써, 보다 간편하고 단시간에 인간 설사병 바이러스를 제조할 수 있다.
[오가노이드의 제조 방법]
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하고, 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과, 상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드로부터 단백질 분해 효소에 의해 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하며, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관 내강을 구성하는 상피세포가 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2를 가지고, 상기 공정 1 및 공정 2의 배양에 있어서, i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β) 저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 이용하는 오가노이드의 제조 방법을 제공한다.
공정 1 및 공정 2의 자세한 사항은, [인간 설사병 바이러스의 제조 방법]에서 설명한 공정과 같다. 실시예로 후술하듯이, 2D 오가노이드는 Mucin 2 양성 세포인 배상세포를 함유한다.
2D 오가노이드는 재생 의료, 상피세포의 기초 의학 연구, 약물 응답의 스크리닝, 질환 유래 상피 오가노이드를 이용한 신약 개발 연구 등에 응용할 수 있다.
[배양물]
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양물을 제공한다. 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드는 상술한 바와 같다. 여기서 「배양물」은 2D 오가노이드에 더해서, 세포 배양 배지 및 세포외 매트릭스를 함유하는 것이다. 본 실시형태의 배양물에서 세포 배양 배지는 무혈청이어도 좋다. 또, 세포 배양 배지는 동물 유래 담즙을 포함하고 있어도 좋다. 또, 세포외 매트릭스는 마트리겔(등록상표)이어도 좋다.
[용도]
일 실시형태로써, 본 발명은 인간 설사병 바이러스, 특히 노로바이러스 소독약의 스크리닝 방법, 소독약 개발, 상기 바이러스의 감염 세포, 감염 메카니즘 특정, 상기 바이러스에 의해 생기는 설사병 증상의 예방·치료약 스크리닝, 예방·치료약의 신약 개발 수단을 제공한다.
인간 설사병 바이러스에 대한 약물 응답의 스크리닝에 있어서, 상술한 2D 오가노이드를 이용하는 경우, 오가노이드를 예를 들면 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트 등의 멀티 웰 플레이트 중에서 배양한다. 분자 라이브러리를 사용해서, 이 오가노이드 및/또는 감염 인간 바이러스에 영향을 주는 분자를 동정(同定)한다. 라이브러리로는, 예를 들면, 항체 단편 라이브러리, 펩티드 살균 바이러스 디스플레이 라이브러리, 펩티드 라이브러리(예를 들면, LOPAP(상표), Sigma　Aldrich사제), 지질 라이브러리(BioMol사제), 합성 화합물 라이브러리(예를 들면, LOPAP(상표), Sigma　Aldrich사제) 또는 천연 화합물 라이브러리(Specs, TimTec사제) 등을 들 수 있다. 또한, 유전자 라이브러리를 이용해도 좋다. 유전자 라이브러리로서는 예를 들면, cDNA 라이브러리, 안티 센스 라이브러리, siRNA, 또는 그 외의 비코드 RNA 라이브러리 등을 들 수 있다. 구체적인 방법으로는, 어떤 일정한 시간에 걸쳐서 인간 설사병 바이러스 감염 세포 및 인간 설사병 바이러스 시험 약제의 복수의 농도로 폭로하고, 폭로 시간 종료시에 배양물을 평가하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 실시형태의 2D 오가노이드는 신규 후보 약물 또는 기존 혹은 신규 영양 보조 식품의 독성 어세이에서 Caco-2 세포 등 세포주의 사용을 대신하는 것이 될 수 있다.
이하, 실시예에 따라서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[실험예 1]
(세포 배양 배지의 조제)
우선, 시판하는 Advanced　DMEM/F-12 배지(Thermo　Ficher　SCIENTIFIC 사제)에 종농도 1㎍/mL가 되도록 인간 재조합 R-스폰진 1(R＆D　systems사제)를 첨가하고, 종농도 100ng/mL가 되도록 노긴(Peprotech사제)을 첨가하며, 종농도 500nM가 되도록 A83-01(Tocris사제)을 첨가했다(이하, 「NRA 배지」라고 부른다.).
또한, 종농도 300ng/mL의 Wnt3a, 종농도 500ng/mL의 IGF1(Biolegend사제), 종농도 50ng/mL의 FGF2(peprotech사제), 종농도 50ng/mL의 EGF(Thermo　Ficher　SCIENTIFIC사제), 종농도 10μM의 SB202190(Sigma　Aldrich사제) 및 종농도 1μM의 LY411575(Sigma　Aldrich사제) 각각을 이하의 편성으로 첨가한 배지를 준비했다.
·WNRA＋IGF1＋FGF2 배지
·WENRAS 배지
·ENRA 배지
·ENRAL 배지
약어의 의미를 이하에 나타낸다.
W; Wnt3A
E; EGF
N; Noggin
R; Rspondin1
A; A-83-01
S; SB202190
L; LY411575
[실험예 2]
(오가노이드를 이용한 노로바이러스의 증식)
《장관줄기세포의 배양》
게이오기쥬꾸 대학 의학부 윤리위원회에서 승인된 윤리 연구 계획에 근거하여, 설명과 동의를 얻을 수 있었던 정상인 및 소화관 종양 환자보다, 소화관 종양으로부터 적어도 5cm 이상 떨어진 부분을 정상 점막으로 채취했다. 채취한 조직은 EDTA 또는 리베라제 TH로 상피세포를 추출하고, 마트리겔(등록상표)에 포매했다.
상피세포(이하, 「장관줄기세포」라고 부른다.)를 함유하는 마트리겔(등록상표)을 48 웰 플레이트에 파종해서 배양했다. 구체적으로는, 하기와 같다.
배양한 장관줄기세포를 25μL의 마트리겔(등록상표)(BD　Bioscience사제)와 함께, 48 웰 플레이트에 파종했다. (1)에서 조제한 WNRA＋IGF1＋FGF2 배지를 웰에 100μL씩 첨가하고, 37℃에서 배양했다. 배양하고 나서, 2일마다 배지를 교환하고, 7일간 배양하여 3D 오가노이드를 얻었다.
《플레이트의 제작》
PBS(-)로 희석한 2.5% 마트리겔(등록상표)을 96 웰 플레이트에 50μL/웰로 첨가하고, 37℃에서 1시간 이상 인큐베이트 했다. 그 후, 각 웰을 PBS(-)로 3회 씻고, 이하의 세포 배양에 사용했다.
《오가노이드의 평면 배양 및 노로바이러스 감염》
2D 오가노이드를 형성하여 노로바이러스를 감염시켰다. 구체적으로는, 상기 오가노이드를 TrypLE(상표) Express(Thermo　Ficher　SCIENTIFIC사제)를 이용해서 무너뜨리고 단일 세포로 했다. 이 단일 세포를 3개로 나누고, 각 배지(WENRAS 배지(증식 배지), ENRA 배지(분화 배지 1), ENRAL 배지(분화 배지 2))에서 세정한 후, 종농도 10μM의 Y-27632(Rock 저해제; 와코준야꾸사제) 첨가한 각 배지에 현탁했다. 이 세포 현탁액을 1×105cells/웰로 각 웰에 뿌리고, 3시간 이상 정치하여 플레이트에 접착시켰다.
그 다음, 10% 유제를 각 분화 배지에서 10배 희석한 분변 노로바이러스를 5μL/웰에 더해서 3시간 인큐베이트 했다. 그 후, PBS(-)로 3회 세정하고, 각 배지를 250μL/웰에 넣는 동시에 20μL 샘플링했다(day 0). 그 후, 감염 후 1일, 2일, 3일, 6일의 배지를 20μL 샘플링했다(day 1, day 2, day 3, day 6).
《노로바이러스 RNA의 정제》
샘플링 한 배지로부터 High　Pure　Viral　RNA　Kit(Roche　Life　Science사제)를 이용해서 바이러스 RNA를 정제하여, 30μL의 바이러스 RNA 현탁액을 얻었다.
《리얼타임 qRT-PCR에 의한 노로바이러스 게놈의 측정》
109 카피/L의 템플릿 DNA로부터 10배 희석 계열을 제작고, 이것을 스탠다드로 했다. 표 1에 나타내는 조성으로, 리얼타임 qRT-PCR 믹스를 제작했다. 또, 표 2에 나타내는 사이클로 qRT-PCR를 실시했다. qRT-PCR의 결과를 도 2에 나타낸다.
[표 1]
Figure 112019018688881-pct00001
[표 2]
Figure 112019018688881-pct00002
도 2에 나타내듯이, 분화 배지 1을 이용한 경우의 오가노이드 배양 상청중의 노로바이러스 게놈의 증가 배율은 증식 배지를 이용한 경우와 비교해서 압도적으로 높았다. 이 점에서, 분화 배지 1을 이용한 배양 오가노이드에 의해 인간 노로바이러스를 감염·증식시키는 것이 확인되었다.
또, 감염 후 6일 후의 각 배지에서 배양한 오가노이드를 DAPI 염색 및 항인간 노로바이러스 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp) 항체 및 항 Mucin2 항체로 면역 염색했다. 이 오가노이드의 형광 염색상을 도 3에 나타낸다.
도 3의 정중앙 및 우측에 나타내듯이, RdRp의 발현이 확인되었다. 이에 따라, 노로바이러스가 오가노이드에 감염해서 증식하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 도 3의 정중앙 및 우측에 나타내듯이, Mucin2의 발현이 확인되었다. 이에 따라, 오가노이드가 배아(고블릿) 세포로 분화하고 있는 것이 확인되었다.
[실험예 3]
(세포외 매트릭스의 검토)
발명자들은 2D 오가노이드의 세포 접착이 안정되지 않는 경우가 있다는 것을 발견했다.
여기서, 세포외 매트릭스를 검토했다. 세포외 매트릭스로서는 콜라겐 I 및 마트리겔(등록상표)을 사용했다.
《플레이트의 제작》
PBS(-)로 희석한 2.5% 마트리겔(등록상표) 또는 10% 콜라겐 I를 96 웰 플레이트에 50μL/웰로 첨가하여, 37℃에서 1시간 이상 인큐베이트 했다. 그 후, 각 웰을 PBS(-)로 3회 씻고, 이하의 세포 배양에 사용했다. 또한, 비교를 위해서 코팅 없는 96 웰 플레이트를 사용했다.
《3D 오가노이드의 형성》
실험예 2와 마찬가지로 장관줄기세포를 배양하여 3D 오가노이드를 얻었다.
《2D 오가노이드의 형성》
얻어진 오가노이드를 TrypLE(상표) Express(Thermo　Ficher　SCIENTIFIC사제)를 이용해서 무너뜨리고 단일 세포로 했다. 이 단일 세포를 ENRA 배지(분화 배지 1)에서 세정한 후, 종농도 10μM의 Y-27632(Rock 저해제; 와코준야꾸사제) 첨가의 ENRA 배지에 현탁했다. 이 세포현탁액을 1×105cells/웰로 각 웰에 뿌리고, 다음날 세포의 접착을 관찰했다.
도 4(a)~(c)는 각 조건에서의 2D 오가노이드의 광학 현미경 사진이다. 도 4(a)는 코팅 없는 96 웰 플레이트를 사용한 결과이고, 도 4(b)는 세포외 매트릭스로서 콜라겐 I를 사용한 결과이며, 도 4(c)는 세포외 매트릭스로서 마트리겔(등록상표)을 사용한 결과이다.
그 결과, 세포외 매트릭스로서 마트리겔을 사용하면, 2D 오가노이드의 기재로의 배양 기재에 대한 접착이 양호하다는 것이 분명해졌다.
[실험예 4]
(세포 배양 배지의 검토)
오가노이드를 이용한 노로바이러스의 증식에 있어서, 세포 배양 배지에 동물 유래 담즙을 첨가하고, 그 영향을 검토했다. 또, 3D 오가노이드의 배지 및 2D 오가노이드의 배지로서 실험예 2에서 이용한 WENRAS 배지(증식 배지) 및 ENRA 배지(분화 배지 1)를 다양한 조합으로 이용해서 그 영향을 검토했다.
《플레이트의 제작》
PBS(-)로 희석한 2.5% 마트리겔(등록상표)을 96 웰 플레이트에 50μL/웰로 첨가하고, 37℃에서 1시간 이상 인큐베이트 했다. 그 후, 각 웰을 PBS(-)로 3회 씻고, 이하의 세포 배양에 사용했다.
《3D 오가노이드의 형성》
실험예 2와 마찬가지로 장관줄기세포를 배양하여 3D 오가노이드를 얻었다. 이 때, 배지로서 실험예 2에서 이용한 WENRAS 배지(증식 배지) 또는 ENRA 배지(분화 배지 1)를 사용했다.
《2D 오가노이드의 형성》
얻어진 3D 오가노이드를 TrypLE(상표) Express(Thermo　Ficher　SCIENTIFIC사제)를 이용해서 무너뜨리고 단일 세포로 했다. 이 단일 세포를 WENRAS 배지(증식 배지) 또는 ENRA 배지(분화 배지 1)에서 세정한 후, 종농도 10μM의 Y-27632(Rock 저해제; 와코준야꾸사제) 첨가의 각 배지에 현탁했다. 또한, 각 배지에 0.1% 돼지 담즙 추출물(Bile　extract　porcine, BEP)을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 준비했다. 이 세포 현탁액을 1×105cells/웰로 각 웰에 뿌리고, 3시간 이상 정치해서 플레이트에 접착시켰다.
3D 오가노이드의 배양 및 2D 오가노이드의 배양에 이용한 배지의 조합을 하기 표 3에 나타낸다. 표 3 중, 「＋」은 첨가한 것을 나타내고, 「-」는 첨가하지 않은 것을 나타낸다.
[표 3]
Figure 112019018688881-pct00003
그 다음, 10% 유제를 각 분화 배지에서 10배 희석한 분변 노로바이러스를 5μL/웰에 더해서 3시간 인큐베이트 했다. 그 후, PBS(-)로 3회 세정하고, 각 배지를 250μL/웰에 넣는 동시에 20μL 샘플링했다(day 0). 그 후, 감염 후 1일, 2일, 3일, 6일의 배지를 20μL 샘플링했다(day 1, day 2, day 3, day 6).
《노로바이러스 RNA의 정제》
샘플링한 배지로부터 High　Pure　Viral　RNA　Kit(Roche　Life　Science사제)를 이용해서 바이러스 RNA를 정제하고, 30μL의 바이러스 RNA 현탁액을 얻었다.
《리얼타임 qRT-PCR에 의한 노로바이러스 게놈의 측정》
실험예 2와 마찬가지로 리얼타임 qRT-PCR을 실시해서 노로바이러스의 증식을 측정했다. 도 5(a) 및 (b)는 qRT-PCR의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5(a)는 그룹 1~4의 결과를 나타내고, 도 5(b)는 그룹 5~8의 결과를 나타낸다.
그 결과, 3D 오가노이드의 배양 및 2D 오가노이드 배양의 쌍방으로 분화 배지를 사용한 그룹 7 및 8에서 노로바이러스의 증식이 현저하게 높은 것이 분명해졌다. 또, 배지에 동물 유래 담즙을 함유하는 그룹 8에서 노로바이러스의 증식이 더욱 현저하게 높은 것이 분명해졌다.
본 발명에 의하면, in vitro로 인공적으로 대량으로 인간 설사병 바이러스를 증식 배양하여 만들어 낼 수 있고, 인간 설사병 바이러스에 대한 병태의 해명, 항바이러스약과 소독약 개발, 백신 개발 등에 도움이 될 수 있다.
<110> KEIO UNIVERSITY <120> 2D ORGANOID FOR INFECTION AND CULTURE OF HUMAN DIARRHEA VIRUS, AND USE OF SAID 2D ORGANOID <130> IP2019-001 <150> JP 2016-163711 <151> 2016-08-24 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer named COG2F <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 cargarbcna tgttyagrtg gatgag 26 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer named COG2R <400> 2 tcgacgccat cttcattcac a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesyzed probe for RING2 <400> 3 tgggagggcg atcgcaatct 20

Claims (28)

  1. 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서, 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과,
    상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관 내강을 구성하는 상피세포의 장관의 내측의 부분이 표면에 노출되어 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2에 의해서 얻어지는, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공정 1 및 공정 2의 배양에 있어서, i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-β; TGF-β저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 이용하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질, R-스폰진 및 GSK-3β 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 IGF1 및 FGF2를 함유하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 Wnt 단백질이 그 안정화 물질 아파민과의 복합체를 형성하고 있는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 Wnt 단백질이, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 R-스폰진이 R-스폰진1, R-스폰진2, R-스폰진3, 및 R-스폰진4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 BMP 저해제가 노긴(Noggin), 그렘린, 코딘, 코딘 도메인을 함유하는 코딘 유사 단백질, 폴리스타틴, 폴리스타틴 도메인을 함유하는 폴리스타틴 관련 단백질, DAN, DAN 시스테인 노트 도메인을 함유하는 DAN 유사 단백질, 스클레로스틴/SOST, 및 α-2 매크로 글로블린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 BMP 저해제가 노긴(Noggin)인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  10. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질 및 R-스폰진인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 TGF-β저해제가 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494, 및 SJN-2511으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  12. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 TGF-β저해제가 A83-01인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  13. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 1 및 공정 2에서의 세포외 매트릭스가 마트리겔(등록상표)인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양물.
  16. 제15항에 있어서,
    무혈청인, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양물.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드에 인간 설사병 바이러스를 감염시키고, 감염된 2D 오가노이드를 배양하여 인간 설사병 바이러스를 감염·증식 배양하는 공정 3을 가지는 인간 설사병 바이러스의 제조 방법.
  18. i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-βTGF-β저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 구비하고,
    세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서, 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과,
    상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관 내강을 구성하는 상피세포의 장관의 내측의 부분이 표면에 노출되어 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2에 의한, 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드를 얻기 위해서 사용되는,
    인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드 배양 키트.
  20. i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-βTGF-β저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 구비하고,
    세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포 또는 이들 세포 중에서, 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과,
    상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관 내강을 구성하는 상피세포의 장관의 내측의 부분이 표면에 노출되어 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2와,
    상기 2D 오가노이드에 인간 설사병 바이러스를 감염시키고, 감염된 2D 오가노이드를 배양하여 인간 설사병 바이러스를 감염·증식 배양하는 공정 3에 의해 인간 설사증 바이러스를 제조하기 위해서 사용되는,
    인간 설사병 바이러스 제조 키트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질 및 R-스폰진인 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 Wnt 단백질이 그 안정화 물질 아파민과의 복합체를 형성하고 있는 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 인간 설사병 바이러스 제조 키트.
  24. 세포외 매트릭스 상에 인간 장관상피줄기세포, 인간 장관상피세포, 또는 이들 세포 가운데 적어도 어느 하나를 함유하는 조직을 입체 배양하여 3D 오가노이드를 얻는 공정 1과,
    상기 공정 1에서 얻어진 상기 3D 오가노이드를 분산시켜서 단일 세포를 조제하고, 상기 단일 세포를 세포외 매트릭스 상에서 단층 배양하여, 분화한 융모세포 및 배상세포를 함유하는 인간 장관 내강을 구성하는 상피세포가 단층 구조로 되어 있는 2D 오르가이드를 취득하는 공정 2를 가지며,
    상기 공정 1 및 공정 2의 배양에 있어서, i) Wnt 아고니스트, ii) 인슐린 유사 성장 인자 1(Insulin-like　growth　factor1; IGF1), 섬유아세포 증식 인자 2(Fibroblast　growth　factor　2; FGF2), EGF(Epidermal　Growth　Factor) 및 에피레귤린(Epiregulin; EREG)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종, iii) 골형성 인자(bone　morphogenetic　protein; BMP) 저해제, iv) 형질 전환 증식 인자-β(transforming　growth　factor-βTGF-β저해제, 및 v) γ세크레타아제 저해제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 함유하는 세포 배양 배지를 이용하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 Wnt 아고니스트가 Wnt 단백질 및 R-스폰진인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 Wnt 단백질이 그 안정화 물질 아파민과의 복합체를 형성하고 있는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양 배지가 동물 유래 담즙을 추가로 함유하는 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 1 및 공정 2에서의 세포외 매트릭스가 마트리겔(등록상표)인 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2D 오가노이드의 제조 방법.
KR1020197005259A 2016-08-24 2017-08-21 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용 KR102417262B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016163711 2016-08-24
JPJP-P-2016-163711 2016-08-24
PCT/JP2017/029743 WO2018038042A1 (ja) 2016-08-24 2017-08-21 ヒト下痢症ウイルスの感染・増殖培養用２ｄオルガノイド及びその使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190040212A KR20190040212A (ko) 2019-04-17
KR102417262B1 true KR102417262B1 (ko) 2022-07-07

Family

ID=61244904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197005259A KR102417262B1 (ko) 2016-08-24 2017-08-21 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20200087617A1 (ko)
EP (1) EP3505620B1 (ko)
JP (1) JP6869554B2 (ko)
KR (1) KR102417262B1 (ko)
CN (1) CN109661460A (ko)
WO (1) WO2018038042A1 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011140441A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
EP3149156B1 (en) 2014-05-28 2021-02-17 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
CA2963704A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Children's Hospital Medical Center In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same
EP3452578B1 (en) 2016-05-05 2022-08-10 Children's Hospital Medical Center Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same
US11767515B2 (en) 2016-12-05 2023-09-26 Children's Hospital Medical Center Colonic organoids and methods of making and using same
CN108588010B (zh) * 2018-04-26 2022-03-08 清华大学 二维培养系统在小鼠肠上皮干细胞体外培养中的应用
US20220033780A1 (en) * 2018-11-02 2022-02-03 Public University Corporation Nagoya City University Method for preparing intestinal organoid derived from pluripotent stem cell
JP7446587B2 (ja) 2018-12-27 2024-03-12 慶應義塾 抗ヒトノロウイルス剤
JPWO2020235206A1 (ko) * 2019-05-23 2020-11-26
CN114502722A (zh) * 2019-08-01 2022-05-13 延世大学校产学协力团 用于增进Wnt蛋白的活性的培养基组合物
WO2021161390A1 (ja) * 2020-02-10 2021-08-19 花王株式会社 ヒトノロウイルス不活化評価法
JP7445293B2 (ja) 2020-03-23 2024-03-07 国立大学法人東京農工大学 細胞培養体及びその製造方法
CN116490618A (zh) 2020-12-03 2023-07-25 庆应义塾 具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造方法
GB202109913D0 (en) * 2021-07-09 2021-08-25 Stichting Hubrecht Organoid Tech Organoid-derived monolayers and uses thereof
WO2023153737A1 (ko) * 2022-02-09 2023-08-17 한국생명공학연구원 3차원 장관 오가노이드 유래 장 줄기세포 집합체 배양을 위한 화학적 조성이 명확한 2차원 배양법
CN114921413B (zh) * 2022-05-31 2023-03-24 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014506801A (ja) * 2011-02-28 2014-03-20 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 細胞培養システム

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5458112A (en) 1977-10-19 1979-05-10 Hitachi Ltd Electronic controller for internal combustion engine
ES2948761T3 (es) * 2009-02-03 2023-09-18 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Combinaciones de inhibidores de la replicación del virus de la influenza
GB201111244D0 (en) * 2011-06-30 2011-08-17 Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw Culture media for stem cells
US20140328808A1 (en) * 2011-10-27 2014-11-06 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Technique for isolating/culturing colorectal epithelial stem cell, and technique for transplanting colorectal epithelium employing said technique
SG10201709338RA (en) * 2012-12-31 2017-12-28 Janssen Biotech Inc Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
EP2958991A1 (en) * 2013-02-25 2015-12-30 F. Hoffmann-La Roche AG Liquid culturing of epithelial stem cells
WO2014132933A1 (ja) * 2013-02-26 2014-09-04 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法
US11193110B2 (en) * 2015-01-30 2021-12-07 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods to generate gastrointestinal epithelial tissue constructs
WO2017059449A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 Baylor College Of Medicine Cultivation of human noroviruses
CN109072179B (zh) * 2016-02-18 2022-04-01 学校法人庆应义塾 细胞培养基、培养方法以及类器官

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014506801A (ja) * 2011-02-28 2014-03-20 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 細胞培養システム

Also Published As

Publication number Publication date
EP3505620A4 (en) 2020-03-25
KR20190040212A (ko) 2019-04-17
CN109661460A (zh) 2019-04-19
US20200087617A1 (en) 2020-03-19
WO2018038042A1 (ja) 2018-03-01
JP6869554B2 (ja) 2021-05-12
EP3505620A1 (en) 2019-07-03
EP3505620B1 (en) 2023-07-26
JPWO2018038042A1 (ja) 2019-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102417262B1 (ko) 인간 설사병 바이러스의 감염·증식 배양용 2d 오가노이드 및 그 사용
US11834681B2 (en) Cell culture medium for culturing organoid, culture method, and organoid
EP3418376B1 (en) Cell culture medium, culture method, and organoid
JP2024028791A (ja) 上皮細胞培養用培養容器及びその使用
WO2024071212A1 (ja) 細胞外基質の非存在下でオルガノイドを培養するための薬剤
EP4257672A1 (en) Method for producing two-dimensional small intestinal organoids having villus structure
WO2023042901A1 (ja) 小細胞肺癌患者ｃｔｃ由来オルガノイド製造と小細胞肺癌分子標的治療薬としてのｉｇｆ１ｒ阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right