JP7445293B2 - 細胞培養体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
[1]生体試料から作製した三次元オルガノイドを動物細胞用培地にて培養する工程と、上記三次元オルガノイド由来の遊走能を有する細胞のうち培養容器に接着した細胞を残し、当該細胞以外の成分を当該培養容器から取り除く工程とを含み、上記培養容器の底面上に細胞培養体を形成することを特徴とする細胞培養体の製造方法。
[2]上記動物細胞用培地は、EGF及びTGFβ阻害剤を含むことを特徴とする[1]記載の細胞培養体の製造方法。
[3]上記動物細胞用培地は、Wntアゴニスト及びBMP阻害剤の一方又は両方を含有しないことを特徴とする[1]記載の細胞培養体の製造方法。
[4]上記培養容器に接着した細胞を継代培養する工程を更に含むことを特徴とする上記[1]記載の細胞培養体の製造方法。
[5]上記成分は、三次元オルガノイドに含まれる非接着性の細胞、三次元オルガノイド用培地を含む成分であることを特徴とする上記[1]記載の細胞培養体の製造方法。
[6]上記生体試料は、動物由来のがん細胞を含む試料であることを特徴とする上記[1]記載の細胞培養体の製造方法。
[7]上記[1]乃至[6]いずれか記載の製造方法により製造された細胞培養体。
[8]上記[1]乃至[6]いずれか記載の製造方法により製造された細胞培養体における遺伝子発現パターンを解析する、バイオアッセイ方法。
[9]がん関連遺伝子の遺伝子発現パターンを解析する上記[8]記載のバイオアッセイ方法。
本発明に係る細胞培養体は、生体試料から作製された三次元オルガノイドから作製され、当該三次元オルガノイドの特性・性質を維持しつつ、当該三次元オルガノイドよりも増殖速度が速いといった特徴を有する細胞集団である。一般に、生体試料から作製された細胞株(不死化、無限増殖能)は培養容器の底面に広がり二次元培養される。すなわち、当該細胞株の培養体は面方向の広がりを有する二次元培養体である。本発明に係る細胞培養体は、上述のように三次元オルガノイドの特性・性質を有するが、二次元培養体のように面方向に広がりを有する培養体である。よって、本発明に係る細胞培養体を2.5次元オルガノイド(2.5Dオルガノイド)と称することもできる。
[尿サンプル由来三次元膀胱がんオルガノイドの作製]
膀胱がん罹患犬の尿をカテーテルを用いて採取し、尿中に含まれる細胞を洗浄後、マトリゲルに混合して三次元オルガノイド培養を実施した。培養開始後3~14日ほどで三次元的に増殖する三次元膀胱がんオルガノイドが観察された(参考文献1:Elbadawy & Usui et al., Cancer Science. 110(9):2806-2821, 2019)。参考文献1と同様に、形成した三次元膀胱がんオルガノイドは、H&E染色による上皮構造解析、免疫組織化学染色による尿路上皮細胞マーカー発現の観察、アラマブルーアッセイによる各種抗がん剤に対する反応性の解析および免疫不全マウスへの皮下移植による腫瘍再形成能の評価を行い、生体内の膀胱がん組織の特徴を再現することを確認した。
次に、膀胱がんの特徴を再現した各患畜由来の三次元膀胱がんオルガノイドを用いて2.5Dオルガノイド(本発明に係る細胞培養体)の作製を試みた。まず、三次元膀胱がんオルガノイド培養に用いる培養液を改変した培養液(2.5Dオルガノイド培養液)を作製した(表1)。
2.5D膀胱がんオルガノイドの作製は、図3に示すように、さまざまな系統(BC1~BC3)の3D膀胱がんオルガノイドから分離および培養が可能であることが示された。
2.5Dオルガノイド培養液の有用性を検討するために、通常の細胞株の培養液(ダルベッコ改変イーグル培地(表1参照))との比較を行った。表1に組成を示した2.5Dオルガノイド培養液を用いた場合、三次元膀胱がんオルガノイドから継代後にも細胞の接着及び増殖が観察されたが、ダルベッコ改変イーグル培地を使用した場合には継代を重ねることで細胞の接着が困難となり培養が不能になることがわかった(図4)。この結果から、表1に示した組成の培養液が、2.5Dオルガノイドの継代培養に必須であることを示している。
本実施例で作製した2.5D膀胱がんオルガノイドに含まれる細胞の構成を検討するために、尿路上皮細胞マーカー発現を確認した。2.5D膀胱がんオルガノイドは、浅い継代数(early passage:4~8継代)でも継代を重ねても(late passage: 10~20継代)、尿路上皮細胞マーカーの発現が認められた(図5)。なお、図5は、尿路上皮細胞マーカーであるCK7、CK20及びUPK3Aについて免疫蛍光染色の結果を示している(実験プロトコルについては参考文献1参照)。
2.5D膀胱がんオルガノイド及び三次元膀胱がんオルガノイドの細胞増殖スピードを、プレストブルーアッセイを用いて比較検討した。具体的には、early passage及びlate passageの2.5Dオルガノイド細胞とその同系統の3Dオルガノイド細胞を同時に96 well plateに播種して、培養1, 3, 5日目の生細胞数をプレストブルーアッセイを用いて測定し、比較した。その結果を、図6に示した。図6に示すように、三次元膀胱がんオルガノイドと比較して、early passage及びlate passageの2.5D膀胱がんオルガノイドには、増殖スピードの有意な亢進が認められた。
2.5D膀胱がんオルガノイドにおける膀胱がん幹細胞マーカーの発現レベルを、三次元膀胱がんオルガノイド及び細胞株と比較して検討した。具体的には、early passage及びlate passageの2.5Dオルガノイド細胞とその同系統の三次元オルガノイド細胞と二次元細胞株からNucleoSpin kit (タカラバイオ)を用いてRNAを抽出して、QuantiTect Reverse Transcription Kit(QIAGEN)を用いてcDNAに変換したのちに、QuantiTect SYBR I Kit (QIAGEN)とStepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を用いてPCR法を行い、幹細胞マーカーであるCD44とSOX2発現を比較検討した。なお、本実験において細胞株としては、犬尿路上皮がん細胞株(コスモバイオ社製)を使用した。また、本実験では、三次元膀胱がんオルガノイド及び2.5D膀胱がんオルガノイドとして2系統(BC1及びBC2)を使用した。
2.5D膀胱がんオルガノイドが、3D膀胱がんオルガノイド同様にマウス体内での腫瘍再形成能を持つかを検討した。具体的には、免疫不全マウスの背部皮下に2.5Dオルガノイド細胞を移植して、8週間後に形成した腫瘍を摘出し、各種解析を行った。
その結果を図8に示した。図8に示すように、免疫不全マウスへの背部皮下への移植(1×106個、N=4)によって8週間後にどの個体においても腫瘍を形成することが観察された。
上記実験で摘出した2.5D膀胱がんオルガノイド由来腫瘍組織を用いて病理学的に組織を観察した。具体的には、摘出組織をパラフィン包埋後、H&E染色を行った。
その結果を図9に示した。図9に示すように、2.5D膀胱がんオルガノイド由来腫瘍組織において、典型的な尿路上皮がんの病理学的特徴が観察された。
上記実験で摘出した2.5D膀胱がんオルガノイド由来腫瘍組織における尿路上皮細胞マーカー(CK7、CK20及びUPK3A)の発現を上記と同様に確認した。結果を図10に示した。図10に示すように、2.5D膀胱がんオルガノイド由来腫瘍組織においても、尿路上皮細胞マーカーの発現が認められた。
2.5D膀胱がんオルガノイドを1000個づつ96 wellプレートに播種した後に、抗がん剤であるVinblastine、Mitoxantrone及びCarboplatinをそれぞれ72時間処置した。その後、細胞形態への変化を観察するとともにプレストブルーアッセイを用いて生存率を測定した。
山口大学医学部消化器外科学研究室で行われた大腸がん手術検体を用いて作製したヒト大腸がん患者由来の三次元オルガノイドから、同様に2.5D大腸がんオルガノイドを作製した。大腸がん三次元培養オルガノイドについては、エアリキッドインターフェース培養法を用いて作製をおこなった(Usui et al., stem cells international, 7053872 2016)。具体的には、3D大腸がんオルガノイドに2.5Dオルガノイド培養液を処置して7日後に遊走してきた細胞を分離し、継代を重ねた。なお、本例においても、表1に示した組成の2.5Dオルガノイド培養液を使用し、2.5D膀胱がんオルガノイドを作製したときと同条件で2.5D大腸がんオルガノイドを作製した。
Claims (3)
- 動物由来のがん細胞を含む試料から作製したがん由来三次元オルガノイドを動物細胞用培地にて培養する工程と、
上記がん由来三次元オルガノイド由来の遊走能を有する細胞のうち培養容器に接着した細胞を残し、当該細胞以外の成分を当該培養容器から取り除く工程とを含み、
上記培養容器の底面上に細胞培養体を形成し、
前記動物細胞用培地は、EGF及びTGFβ阻害剤を含み、かつ、Wntアゴニスト及びBMP阻害剤を含有しない、
細胞培養体の製造方法。 - 上記培養容器に接着した細胞を継代培養する工程を更に含むことを特徴とする請求項1記載の細胞培養体の製造方法。
- 上記成分は、がん由来三次元オルガノイドに含まれる非接着性の細胞、がん由来三次元オルガノイド用培地を含む成分であることを特徴とする請求項1記載の細胞培養体の製造方法。
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