CN114921413B - 一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法 - Google Patents

一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法，该培养基由基础培养基DMEM/F12，溶解于所述基础培养基中的营养因子和特异性细胞因子组成；所述营养因子由以下组分组成：Glutamine，MEM非必需氨基酸，丙酮酸钠，不含维生素A的B27，N‑乙酰半胱氨酸，烟酰胺，P/S；所述特异性细胞因子由以下组分组成：wnt3a，R‑spondin1，IGF1，成纤维细胞生长因子2。本发明的培养基不仅可以提高骨肉瘤类器官的生长速度以及培养稳定性，而且还能明显的延长培养时间和传代次数，且骨肉瘤类器官与原肿瘤组织特性具有高度一致性。

Description

一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及培养基制备技术领域，尤其涉及一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法。
背景技术
骨肉瘤是由间充质细胞发育而来的结缔组织细胞、脂肪组织细胞、骨及软骨组织细胞、平滑肌组织细胞等未分化间叶细胞恶性增殖产生的骨肿瘤，在骨恶性肿瘤中占比达56％。该疾病多见于青春期快速发育的孩子，年发病率大约为4.4/100万，在15-19岁青少年的发病率高达8-11人/100万人/年，是青少年中与恶性肿瘤相关的第二大死亡因素。该肿瘤的特点是生长迅速，肿瘤细胞直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织，且多数患者存在癌细胞早期转移。骨肉瘤传统的治疗方法是通过截肢将病灶根治性切除，但术后患者的5年生存率只有20％，且还是有80％的患者会出现肺转移。肿瘤转移、高复发率和药物治疗抵抗等都是骨肉瘤患者治疗所面临的巨大瓶颈，该疾病的复发率约达30％，出现转移的患者复发率更是高达80％。目前该疾病主要的治疗手段是术前化疗-外科手术-术后化疗的综合保肢治疗模式，虽然对于接受新辅助化疗和手术后的患者，五年生存率可达50-70％，但对于初诊就存在肺转移的患者来说，5年生存率仅为20-30％，且预后极差。关于该疾病的病因、病理以及转移机制并不明了，因而加大对该疾病的研究和药物筛选，具有非常重要的意义，其中体内、体外疾病模型的构建最为关键。
目前常用的骨肉瘤研究模型包括小鼠、大鼠、兔、犬等动物模型，将致癌因素(包括物理、化学、生物等因素)与动物特定部位直接或间接接触以诱导肿瘤的产生；或者在免疫抑制或免疫缺陷的动物内接种患者来源的肿瘤细胞，形成该肿瘤的移植研究模型。诱导性肿瘤模型的构建操作相对简单，但所需要的时间较长，能诱导的肿瘤恶性程度有限，模型的可重复性相对较低，且所用的化学诱导剂可能会对研究者造成伤害等；皮下移植的免疫缺陷动物模型是目前使用最多的模型，但该模型同样也存在耗时长和引入小鼠背景等问题，在基因学和发病学方面与患者真实情况还是存在一定的差距，因此引入更加贴近患者肿瘤真实状态的体外模型，如骨肉瘤患者肿瘤来源的类器官模型，将为该疾病的研究和治疗带来新的机会和启发。
类器官(Organoids)技术自2009年被发明后，在2013年和2017年依次被science和nature methods评为十大突破技术和年度最佳技术，由于其培养环境和细胞组分丰富度的增加，及其对原组织特性的高度还原，该技术被广泛用于疾病建模、药物研发和再生医学等领域。目前已成功建立不同组织来源的肿瘤类器官，包括呼吸系统、消化道、子宫、内脏和神经系统相关的鼻咽癌、肺癌、胃癌、肠癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌和神经胶质瘤类器官等。但是目前关于骨肉瘤类器官模型构建的报道较少，培养方法并不成熟，且该模型能在多大程度上重现患者肿瘤组织的病理特征也有待考量。在此，我们根据骨肉瘤病理发展的机制及相关信号通路，发明了一种更接近骨肉瘤生长环境的类器官培养基，并利用不同患者来源的骨肉瘤组织构建了相应的类器官模型，并建立了标准化的培养方法，为后续疾病机制的研究和药物筛选、开发提供更全面的工具，也为患者的个性化治疗提供临床前指导性研究平台。
发明内容
有鉴于此，有必要针对现有问题，提供一种骨肉瘤类器官培养基及培养方法。
为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种骨肉瘤类器官培养基，包括：基础培养基DMEM/F12，溶解于所述基础培养基中的营养因子和特异性细胞因子；所述营养因子包括以下终浓度的组分：1-5mM的Glutamine，1％-2％的MEM非必需氨基酸，1-5mM的丙酮酸钠，0.5-2×的不含维生素A的B27，1-2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-20mM的烟酰胺，0.5％-1％的P/S；所述特异性细胞因子包括以下终浓度的组分：5-20ng/ml的wnt3a，200-1000ng/ml的R-spondin1，5-20ng/ml的IGF1，5-50ng/ml的成纤维细胞生长因子2(FGF2)。
进一步地，所述特异性细胞因子中，5-20ng/ml的IGF1换成0.5-2％的胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)。
第二方面，本发明提供一种骨肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
步骤1，将收集的组织处理成细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel的混合液重悬细胞沉淀，以一定细胞比例种胶滴，于37℃下孵育20-40min，然后加入上述骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养8-15天。
进一步地，所述组织来自骨肉瘤原发灶组织或肺转移的手术切除组织或活检组织。
进一步地，所述步骤1中将收集的组织处理成细胞沉淀，包括：组织经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液消化；消化后加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心得到细胞沉淀。
进一步地，所述步骤2中DMEM/F12和matrigel的混合比例为1：1.5，以104-105细胞/30ul的比例种胶滴。
优选地，所述步骤2中加入骨肉瘤类器官培养基培养的第1～3天，在培养基中添加终浓度为10uM的Y-27632。
第三方面，本发明提供一种骨肉瘤类器官的传代方法，包括以下步骤：
步骤1，将收集的组织处理成细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel的混合液重悬细胞沉淀，以一定细胞比例种胶滴，于37℃下孵育20-40min，然后加入上述骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养8-15天；
步骤3，进一步加入TrypLE消化液消化，终止消化后离心，用DMEM/F12和matrigel的混合液重悬细胞沉淀，以一定细胞比例种胶滴，于37℃下孵育20-40min，然后加入上述骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养8-10天。
进一步地，所述步骤2和步骤3中，DMEM/F12和matrigel的混合比例为1；1.5。
进一步地，所述步骤3中离心的条件为：1000～1400rpm离心3～4min。
进一步地，所述步骤2和步骤3中以104-105细胞/30ul的比例种胶滴。
优选地，所述步骤3中加入骨肉瘤类器官培养基培养的第1～3天，在培养基中添加终浓度为10uM的Y-27632。
第四方面，本发明提供上述培养方法或者传代方法获得的类器官在骨肉瘤发病机制/转移机制研究以及骨肉瘤药物筛选中的用途。
本发明以尽可能少的骨肉瘤组织生长所需组分来构建骨肉瘤类器官培养基，适用于原发灶骨肉瘤以及肺转移骨肉瘤来源的组织样本。本发明的有益效果总结如下：
1、本发明的类器官培养基组分中，以Wnt信号通路激活剂Wnt3a，R-spondin1，胰岛素类似物IGF1以及成纤维细胞生长因子2等特异性细胞因子来替代肿瘤细胞系培养常用的牛血清白蛋白(FBS)，可避免FBS在肿瘤类器官培养过程中发生的批间稳定性差异、FBS诱导类器官过度分化等问题。
2、本发明通过特异性细胞因子Wnt信号通路激活剂Wnt3a、R-spondin1、胰岛素类似物IGF1、营养因子FGF2、Glutamine、MEM非必需氨基酸、丙酮酸钠等进行复配，可以促进骨肉瘤类器官的稳定生长以及功能维持。
3、本发明的类器官培养基较比添加了TGFβ受体抑制剂、BMP抑制剂以及MAPK抑制剂的培养基对骨肉瘤类器官的培养效果更佳，TGFβ、BMP、MAPK这三种信号通路是本领域公认的在骨肉瘤细胞的增殖、转移过程中发挥重要作用的添加剂，其抑制剂的添加可能产生抑制肿瘤细胞生长的作用。
4、本发明的培养基不仅可以提高骨肉瘤类器官的生长速度以及培养稳定性，而且还能明显的延长培养时间和传代次数，且骨肉瘤类器官与原肿瘤组织特性具有高度一致性。
附图说明
图1为实施例3中培养的原发灶骨肉瘤类器官光镜图。
图2为实施例4中培养的原发灶骨肉瘤类器官光镜图。
图3为实施例5中培养的肺转移骨肉瘤类器官光镜图。
图4为实施例6中培养的肺转移骨肉瘤类器官光镜图。
图5为实施例8中传代后的原发灶骨肉瘤类器官光镜图。
图6为实施例9中传代后的肺转移骨肉瘤类器官光镜图。
图7为对比例1的培养基培养后的原发灶骨肉瘤类器官光镜图。
图8为对比例2的培养基培养后的肺转移骨肉瘤类器官光镜图。
具体实施方式
本发明中组分终浓度的百分比为体积百分比。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种骨肉瘤类器官培养基，包括：基础培养基DMEM/F12，溶解于所述基础培养基中的营养因子和特异性细胞因子；所述营养因子包括以下终浓度的组分：2mM的Glutamine，1％的MEM非必需氨基酸，1mM的丙酮酸钠，1×的不含维生素A的B27，1mM的N-乙酰半胱氨酸，10mM的烟酰胺，1％的P/S；所述特异性细胞因子包括以下终浓度的组分：10ng/ml的wnt3a，500ng/ml的R-spondin1，10ng/ml的IGF1，10ng/ml的FGF2。制备方法为：将营养因子和特异性细胞因子加入到基础培养基中混合均匀，即得。
实施例2
本实施例提供一种骨肉瘤类器官培养基，包括：基础培养基DMEM/F12，溶解于所述基础培养基中的营养因子和特异性细胞因子；所述营养因子包括以下终浓度的组分：2mM的Glutamine，1％的MEM非必需氨基酸，1mM的丙酮酸钠，1×的不含维生素A的B27，1mM的N-乙酰半胱氨酸，10mM的烟酰胺，1％的P/S；所述特异性细胞因子包括以下终浓度的组分：10ng/ml的wnt3a，500ng/ml的R-spondin1，1％的ITS，10ng/ml的FGF2。制备方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种原发灶骨肉瘤类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，包括以下步骤：
步骤1，将从某患者收集的骨肉瘤原发灶组织处理成细胞沉淀，包括：组织经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液消化；消化后加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心得到细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以105细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育30min，然后加入实施例1的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养，第3天时在培养基中添加终浓度为10uM的Y-276328，一共培养了8天。培养第8天的类器官形态如图1所示。
实施例4
本实施例提供一种原发灶骨肉瘤类器官的培养方法，是采用实施例2的培养基，包括以下步骤：
步骤1，将从某患者收集的骨肉瘤原发灶组织处理成细胞沉淀，包括：组织经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液消化；消化后加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心得到细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以104细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育30min，然后加入实施例2的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养，第3天时在培养基中添加终浓度为10uM的Y-276328，一共培养了8天。培养第8天的类器官形态如图2所示。
实施例5
本实施例提供一种肺转移骨肉瘤类器官的培养方法，是采用实施例1的培养基，包括以下步骤：
步骤1，将从某患者收集的骨肉瘤肺转移组织处理成细胞沉淀，包括：组织经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液消化；消化后加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心得到细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以105细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育30min，然后加入实施例1的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养，第3天时在培养基中添加终浓度为10uM的Y-276328，一共培养了10天。培养第10天的类器官形态如图3所示。
实施例6
本实施例提供一种肺转移骨肉瘤类器官的培养方法，是采用实施例2的培养基，包括以下步骤：
步骤1，将从某患者收集的骨肉瘤肺转移组织处理成细胞沉淀，包括：组织经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液消化；消化后加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心得到细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以104细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育30min，然后加入实施例2的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养，第3天时在培养基中添加终浓度为10uM的Y-276328，一共培养了10天。培养第10天的类器官形态如图4所示。
实施例7
本实施例提供实施例3和实施例4获得的原发灶骨肉瘤类器官形态鉴定，将骨肉瘤类器官进行石蜡包埋、切片，然后进行HE染色观察，具体步骤如下：
1)类器官收集与固定：投入预先配好的固定液中(4％的甲醛固定)固定2小时。完成固定后1200rpm离心5min，弃去福尔马林固定液。
2)梯度脱水：将固定后的类器官依次浸入85％酒精、95％酒精和100％酒精各30min。
3)透明浸蜡：加入二甲苯没过类器官处理20min，重复两次；然后加入石蜡，在60℃浸蜡1.5h。
4)包埋切片：用包埋模具包类器官，然后切片机切成4-6μm的切片贴于防脱载玻片。
5)烤片：将载玻片放置在玻片架上，放入烘箱中，65℃，30min，将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可。
6)脱蜡：使用二甲苯脱蜡三次，每次10min；然后用100％酒精浸洗三次，每次1分钟；最后用流水浸洗1分钟。
7)H&E染色：先用苏木素染色8min，然后水洗1min，接着用1％盐酸酒精分化1-2秒钟，然后再用流水冲洗30min，再接着用1％伊红浸染1-2min，最后用流水冲洗1min。
8)染色后固定：依次浸入95％酒精和100％酒精，每种试剂各两次，每次2min。
9)透明及封固：使用二甲苯透明2min，取出晾干后用中性树胶封固。
10)在普通光学显微镜下观察组织形态结构。
实施例8
本实施例提供一种原发灶骨肉瘤类器官的传代方法，是采用实施例1的培养基，包括以下步骤：
步骤1，将与实施例3相同的组织处理成细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以104细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育25min，然后加入实施例1的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养12天；
步骤3，进一步加入TrypLE消化液消化10分钟，终止消化后1200rpm离心3分钟，然后用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以104细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育25min，然后加入上述骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养，第3天时在培养基中添加终浓度为10uM的Y-276328，一共培养了10天。培养第10天的类器官形态如图5所示。
实施例9
本实施例提供一种肺转移骨肉瘤类器官的传代方法，是采用实施例1的培养基，包括以下步骤：
步骤1，将与实施例5相同的组织处理成细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以105细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育30min，然后加入实施例1的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养10天；
步骤3，进一步加入TrypLE消化液消化8分钟，终止消化后1200rpm离心3分钟，然后用DMEM/F12和matrigel比例为1：1.5的混合液重悬细胞沉淀，以105细胞/30ul的比例种胶滴，于37℃下孵育30min，然后加入上述骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5％CO2浓度下培养，第3天时在培养基中添加终浓度为10uM的Y-276328，一共培养了10天。培养第10天的类器官形态如图6所示。
对比例1
本对比例提供的培养基为在实施例1的基础上去除IGF1，且添加了TGFβ受体抑制剂、BMP抑制剂以及MAPK抑制剂，其它同实施例1，使用该培养基的培养效果和实施例3进行对比。
使用上述培养基按照实施例3的方法进行骨肉瘤类器官培养。
结果在步骤2培养8天后，在普通光学显微镜下随机挑选中间区域10个视野进行类器官数量与尺寸大小测定。实施例3的类器官在数量与平均尺寸上明显优于对比例1，光镜结果如图7所示。
这说明采用本发明的培养基更适宜骨肉瘤类器官的生长。
对比项 类器官数量 平均尺寸
实施例3 88 50-80um
对比例1 61 28-35um
对比例2
本对比例提供的培养基为在实施例1的基础上去除IGF1，且添加了TGFβ受体抑制剂、BMP抑制剂以及MAPK抑制剂，其它同实施例1，使用该培养基的培养效果和实施例5进行对比。
使用上述培养基按照实施例5的方法进行骨肉瘤类器官培养。
结果在步骤2培养8天后，在普通光学显微镜下随机挑选中间区域10个视野进行类器官数量与尺寸大小测定。实施例5的类器官在数量与平均尺寸上明显优于对比例1，光镜结果如图8所示。
这说明采用去除本发明的培养基更适宜骨肉瘤类器官的生长。
对比项 类器官数量 平均尺寸
实施例5 78 48-73um
对比例2 58 23-30um
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种骨肉瘤类器官培养基，其特征在于：由基础培养基DMEM/F12，溶解于所述基础培养基中的营养因子和特异性细胞因子组成；所述营养因子由以下终浓度的组分组成：1-5mM的Glutamine，1%-2% 的MEM 非必需氨基酸，1-5mM的丙酮酸钠，0.5-2×的不含维生素A的B27，1-2mM的N-乙酰半胱氨酸，5-20mM的烟酰胺，0.5%-1%的P/S；所述特异性细胞因子由以下终浓度的组分组成：5-20ng/ml的wnt3a，200-1000 ng/ml的R-spondin1，5-20ng/ml的IGF1，5-50ng/ml的FGF2。
2.根据权利要求1所述的一种骨肉瘤类器官培养基，其特征在于：所述特异性细胞因子中，5-20ng/ml的IGF1换成0.5-2%的ITS。
3.一种骨肉瘤类器官的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，将收集的组织处理成细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel的混合液重悬细胞沉淀，以一定细胞比例种胶滴，于37℃下孵育20-40min，然后加入权利要求1或2所述的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5% CO2浓度下培养8-15天。
4.根据权利要求3所述的一种骨肉瘤类器官的培养方法，其特征在于：所述步骤2中DMEM/F12和matrigel的混合比例为1：1.5，以104-105细胞/30ul的比例种胶滴。
5.根据权利要求3或4所述的一种骨肉瘤类器官的培养方法，其特征在于：所述步骤2中加入骨肉瘤类器官培养基培养的第1~3天，在培养基中添加终浓度为10uM的Y-27632。
6.一种骨肉瘤类器官的传代方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，将收集的组织处理成细胞沉淀；
步骤2，采用DMEM/F12和matrigel的混合液重悬细胞沉淀，以一定细胞比例种胶滴，于37℃下孵育20-40min，然后加入权利要求1或2所述的骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5% CO2浓度下培养8-15天；
步骤3，进一步加入TrypLE消化液消化，终止消化后离心，用DMEM/F12和matrigel的混合液重悬细胞沉淀，以一定细胞比例种胶滴，于37℃下孵育20-40min，然后加入所述骨肉瘤类器官培养基，于37℃、5% CO2浓度下培养8-10天。
7.根据权利要求6所述的一种骨肉瘤类器官的传代方法，其特征在于：所述步骤2和步骤3中，DMEM/F12和matrigel的混合比例为1：1.5。
8.根据权利要求6所述的一种骨肉瘤类器官的传代方法，其特征在于：所述步骤2和步骤3中以104-105细胞/30ul的比例种胶滴。
9.根据权利要求6~8任意一项所述的一种骨肉瘤类器官的传代方法，其特征在于：所述步骤3中加入骨肉瘤类器官培养基培养的第1~3天，在培养基中添加终浓度为10uM的Y-27632。
10.权利要求3~5任意一项所述的培养方法或者权利要求6~9任意一项所述的传代方法获得的类器官在骨肉瘤发病机制/转移机制研究以及骨肉瘤药物筛选中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115851577A (zh) * 2022-12-23 2023-03-28 北京市创伤骨科研究所 一种基于单细胞的骨肉瘤类器官模型的构建方法
CN116515754B (zh) * 2023-03-17 2024-01-30 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种脂肪肉瘤类器官、培养基及培养方法
CN116836934B (zh) * 2023-08-31 2023-11-24 北京大橡科技有限公司 骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法
CN117701505A (zh) * 2024-02-06 2024-03-15 山东伯桢生物科技有限公司 肉瘤组织类器官培养基、构建肉瘤组织类器官和肉瘤组织类器官库的方法、构建动物疾病模型的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109661460A (zh) * 2016-08-24 2019-04-19 学校法人庆应义塾 用于人腹泻症病毒的感染·增殖培养的2d类器官及其使用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2020225085A1 (en) * 2019-05-03 2020-11-12 Katholieke Universiteit Leuven Medium for growth of organoids
CN111808817A (zh) * 2020-07-24 2020-10-23 上海昊佰生物科技有限公司 一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基
CN114317439B (zh) * 2021-12-23 2024-04-16 北京基石生命科技有限公司 一种培养肿瘤类器官的方法
CN115261302B (zh) * 2022-07-20 2023-06-06 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种基质胶及其制备方法和应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109661460A (zh) * 2016-08-24 2019-04-19 学校法人庆应义塾 用于人腹泻症病毒的感染·增殖培养的2d类器官及其使用

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