CN111808817A - 一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基 - Google Patents

一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基，本发明使用了2种培养方法，骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法和骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法。本发明的一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，包括如下步骤：(1)组织清洗:用含1xPen‑Strep Glutamine ADMEM/F12 10ml清洗2‑5遍；(2)将组织切成1mm3大小后，用消化液消化30‑60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；(3)用含1x Pen‑Strep Glutamine ADMEM/F12 10ml清洗3遍；(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加1‑100ug/ml laminin中重悬后铺板；(5)培养期间每3‑4天更换一次骨肿瘤培养基；(6)类器官一般每15‑20天传代1次，传代时每孔加入2‑5倍量的TrpLE Express。

Description

一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基。
背景技术
骨肿瘤是发生于骨骼或其附属组织的肿瘤。有良性，恶性之分，良性骨肿瘤易根治，预后良好，恶性骨肿瘤发展迅速，预后不佳，死亡率高。恶性骨肿瘤分为原发性和继发性。从体内其他组织或器官的恶性肿瘤经血液循环、淋巴系统转移至骨骼为继发性恶性骨肿瘤。还有一类病损称瘤样病变，肿瘤样病变的组织不具有肿瘤细胞形态的特点，但其生态和行为都具有肿瘤的破坏性，一般较局限，易根治。
骨肉瘤的产生和发展的真正原因尚不清楚，可能是由一种或几种负责生成新骨的细胞引起的。骨肉瘤常诊断为10-30岁的儿童和青少年，除手术切除外，不能手术的骨肉瘤患者通常接受放化疗，US1患者的5年相对生存率约为60％。骨肉瘤患者的具体治疗选择与骨肉瘤的起源、肿瘤的大小、诊断的骨肉瘤的类型和分级以及骨肉瘤是否发生转移密切相关。骨肉瘤通常伴有预后不良，而目前用于治疗骨肉瘤的化疗药物大多令人失望。而肿瘤体外培养临床前化疗药物的筛选为癌症患者提供了方便快捷的精准用药指导方法。
目前，缺乏一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基。
发明内容
本发明提供了一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)组织清洗:用含1xPen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗2-5遍，加入2-5倍量；
(2)将组织切成1mm3大小后，用消化液消化30-60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；
(3)用含1x Pen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗3遍；
(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加1-100ug/ml laminin中重悬后铺板；
(5)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；
(6)类器官一般每15-20天传代1次，传代时每孔加入2-5倍量的TrpLE Express。
进一步地，在步骤(2)中，所述的消化液包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000021
进一步地，在步骤(4)中，铺板24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加培养基500ul/孔。
更进一步地，在步骤(6)中，在37℃时消化5-10分钟，加1/10体积FBS终止消化，室温600g离心5分钟，Collagen中重悬24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加骨肿瘤培养基500ul/孔。
本发明的一种骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备胶原基质；
(2)底部胶原层制备：在30mm，0.4um迁移小室中加1ml胶原基质，室温凝固20min或37℃凝固10min；
(3)肿瘤组织剪碎(0.3mm3及以下)，此步在冰上操作，在含1X Normocin的ADMEM/F12洗两遍，400g离心3min；
(4)上部胶原层制备：用1ml胶原基质添加1-100ug/ml laminin(层粘连蛋白)(1ml/30mm迁移小室)将剪碎的肿瘤组织重悬；
(5)将含有组织的胶原层加入到提前在30mm,0.4um迁移小室上凝固好的1ml胶原基质的上部，制备出一个双层的气-液培养体系；室温凝固20min或37℃凝固10min；
(6)在外层60mm细胞培养皿中加入1.5ml骨肿瘤培养基培养；
(7)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；
(8)类器官一般每20-35天传代1次，传代时用300U/ml IV型胶原酶37℃消化30-40分钟，后加I型DNA酶200units/ml，37℃消化10分钟，加ADMEM/F12到10mL，600g离心3min，弃上清，重复2遍。按照1：3或者1：4比例传代到新的迁移小室中培养。
进一步地，在步骤(1)中，Collagen胶原基质的制备方法：
所述的Cellmatrix type I-A、10×Ham’s F-12、缓冲液的比例为8：1：1，骨肿瘤培养另加50ug/ml laminin。
进一步地，在步骤(1)中，缓冲液由含0.05N NaOH、200mM HEPES和2.2g NaHCO3的无菌水组成。
本发明所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，所述的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000031
Figure BDA0002601022630000041
进一步地，所述的高级DMEM/F12培养基由F12培养基和DMEM培养基组成，所述的F12培养基与DMEM培养基的体积比为1:1，称为dmem/f12；Wnt3a条件培养基：Wnt3A-ConditionedMedium由细胞株制备的上清液处理而成，制备用Wnt-3A细胞株购自中科院细胞库。
有益效果：本发明能够成功培养骨肿瘤类器官，为临床前药物筛选提供方便可靠的实验模型。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)3D优势：成对培养人正常组织来源的类器官和肿瘤组织来源的肿瘤类器官；可以健康扩增，长期的培养和低温贮藏。适合高通量；局限性：缺乏基质成分，仅代表组织的上皮部分。
(2)气液优势：成对培养人正常组织来源的类器官和肿瘤组织来源的肿瘤类器官；成对培养人正常组织来源的类器官和肿瘤组织来源的肿瘤类器官；适合高通量；允许上皮细胞和基质细胞混合生长；保持组织的自然微环境和细胞间空间结构。
附图说明
图1为本发明的骨肉瘤样本图。
图2为本发明的骨肉瘤样本图。
图3为本发明的骨肿瘤样本图。
图4为本发明的胃骨肿瘤肺转移样本图。
图5为本发明的骨肿瘤样本图。
图6为本发明的骨肿瘤淋巴转移样本图。
图7为本发明的骨肿瘤淋巴转移样本图。
图8为本发明的骨肿瘤肺转移样本图。
图9为本发明的培养基1(即实施例1保护培养基)与培养基2(对比例1的培养基)在类器官3D培养中的效果图。
图10为本发明分别是培养出来的类器官的H&E染色的组织形态学分析以及骨肿瘤表面标志物CK、Ki67、P16、P53、P63的免疫组织学分析图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明内容作进一步详细说明。
实施例1
如图1至图5所示，图1和图2为本发明的骨肉瘤样本图，由图可见经过一定时间培养，可培养出纤维状的类器官；图3为本发明的骨肿瘤样本图；图4为本发明的胃骨肿瘤肺转移样本图，由图可见经过一定时间培养，可培养出实心圆球状或不规则形状的类器官。图5为本发明的骨肿瘤样本图。
本发明的一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)组织清洗:用含1xPen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗2遍，加入2倍量；
(2)将组织切成1mm3大小后，用消化液消化30-60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；所述的消化液包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000061
(3)用含1x Pen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗3遍；
(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加100ug/ml laminin中重悬后铺板；在步骤(4)中，铺板24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加培养基500ul/孔。
(5)培养期间每3天更换一次骨肿瘤培养基；
(6)类器官一般每20天传代1次，传代时每孔加入2-5倍量的TrpLE Express。在37℃时消化10分钟，加1/10体积FBS终止消化，室温600g离心5分钟，Collagen中重悬24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加骨肿瘤培养基500ul/孔。
本发明所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，所述的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000062
Figure BDA0002601022630000071
所述的高级DMEM/F12培养基由F12培养基和DMEM培养基组成，所述的F12培养基与DMEM培养基的体积比为1:1，称为dmem/f12；Wnt3a条件培养基：Wnt3A-ConditionedMedium由细胞株制备的上清液处理而成，制备用Wnt-3A细胞株购自中科院细胞库。
实施例2
如图6至图8所示，图6为本发明的骨肿瘤淋巴转移样本图。图7为本发明的骨肿瘤淋巴转移样本图。图8为本发明的骨肿瘤肺转移样本图，由图可见随着培养时间增加样本发生明显的改变，骨肿瘤类器官逐渐长大向周围延伸并由质地实心向囊状结构生长。
本发明的一种骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备胶原基质；Collagen胶原基质的制备方法：
所述的Cellmatrix type I-A、10×Ham’s F-12、缓冲液的比例为8：1：1，骨肿瘤培养另加50ug/ml laminin。缓冲液由含0.05N NaOH、200mM HEPES和2.2g NaHCO3的无菌水组成。
(2)底部胶原层制备：在30mm，0.4um迁移小室中加1ml胶原基质，室温凝固20min或37℃凝固10min；
(3)肿瘤组织剪碎(0.3mm3及以下)，此步在冰上操作，在含1X Normocin的ADMEM/F12洗两遍，400g离心3min；
(4)上部胶原层制备：用1ml胶原基质添加1-100ug/ml laminin(层粘连蛋白)(1ml/30mm迁移小室)将剪碎的肿瘤组织重悬；
(5)将含有组织的胶原层加入到提前在30mm,0.4um迁移小室上凝固好的1ml胶原基质的上部，制备出一个双层的气-液培养体系；室温凝固20min或37℃凝固10min；
(6)在外层60mm细胞培养皿中加入1.5ml骨肿瘤培养基培养；
(7)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；
(8)类器官一般每20-35天传代1次，传代时用300U/ml IV型胶原酶37℃消化30-40分钟，后加I型DNA酶200units/ml，37℃消化10分钟，加ADMEM/F12到10mL，600g离心3min，弃上清，重复2遍。按照1：3或者1：4比例传代到新的迁移小室中培养。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)组织清洗:用含1xPen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗3遍，加入3倍量；
(2)将组织切成1mm3大小后，用消化液消化30-60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；所述的消化液包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000081
Figure BDA0002601022630000091
(3)用含1x Pen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗3遍；
(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加1ug/ml laminin中重悬后铺板；在步骤(4)中，铺板24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加培养基500ul/孔。
(5)培养期间每4天更换一次骨肿瘤培养基；
(6)类器官一般每15天传代1次，传代时每孔加入2-5倍量的TrpLE Express。在37℃时消化5分钟，加1/10体积FBS终止消化，室温600g离心5分钟，Collagen中重悬24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加骨肿瘤培养基500ul/孔。
本发明所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，所述的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000092
Figure BDA0002601022630000101
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于：
本发明的一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，包括如下步骤：
(1)组织清洗:用含1xPen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗3遍，加入3倍量；
(2)将组织切成1mm3大小后，用消化液消化30-60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；所述的消化液包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000102
(3)用含1x Pen-Strep Glutamine ADMEM/F1210ml清洗3遍；
(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加80ug/ml laminin中重悬后铺板；在步骤(4)中，铺板24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加培养基500ul/孔。
(5)培养期间每3.5天更换一次骨肿瘤培养基；
(6)类器官一般每28天传代1次，传代时每孔加入2-5倍量的TrpLE Express。在37℃时消化8分钟，加1/10体积FBS终止消化，室温600g离心5分钟，Collagen中重悬24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加骨肿瘤培养基500ul/孔。
本发明所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，所述的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000111
对比例1
对比例1的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：
Figure BDA0002601022630000121
如图9所示，图9为本发明的培养基1(即实施例1保护培养基)与培养基2(对比例1的培养基)在类器官3D培养中的效果图，培养基1培养的3D类器官明显在生长且状态良好，类器官未纤维状且数量在扩增，而现有的类器官通用培养基2培养的类器官细胞几乎死亡，可见培养基1能够成功的培养3D类器官。
图10为本发明分别是培养出来的类器官的H&E染色的组织形态学分析图，以及骨肿瘤表面标志物CK、Ki67、P16、P53、P63的免疫组织学分析。其证明了体外培养的类器官与患者体内肿瘤组织在组织学形态和蛋白表达上高度一致。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)组织清洗:用含1xPen-Strep Glutamine ADMEM/F12 10ml清洗2-5遍；
(2)将组织切成1mm3大小后，用消化液消化30-60分钟，消化后4℃，1200r离心5min；
(3)用含1x Pen-Strep Glutamine ADMEM/F12 10ml清洗3遍；
(4)100uM细胞筛过滤后计数离心，Collagen加1-100ug/ml laminin中重悬后铺板；
(5)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；
(6)类器官一般每15-20天传代1次，传代时每孔加入2-5倍量的TrpLE Express。
2.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的消化液包括如下组分组成：
Figure FDA0002601022620000011
3.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，铺板24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加培养基500ul/孔。
4.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官3D培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(6)中，在37℃时消化5-10分钟，加1/10体积FBS终止消化，室温600g离心5分钟，Collagen中重悬24孔板每孔50ul Collagen含1000个细胞/细胞团，37℃凝固10分钟，加骨肿瘤培养基500ul/孔。
5.一种骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备胶原基质；
(2)底部胶原层制备：在30mm，0.4um迁移小室中加1ml胶原基质，室温凝固20min或37℃凝固10min；
(3)肿瘤组织剪碎(0.3mm3及以下)，此步在冰上操作，在含1X Normocin的ADMEM/F12洗两遍，400g离心3min；
(4)上部胶原层制备：用1ml胶原基质添加1-100ug/ml laminin(层粘连蛋白)(1ml/30mm迁移小室)将剪碎的肿瘤组织重悬；
(5)将含有组织的胶原层加入到提前在30mm,0.4um迁移小室上凝固好的1ml胶原基质的上部，制备出一个双层的气-液培养体系；室温凝固20min或37℃凝固10min；
(6)在外层60mm细胞培养皿中加入1.5ml骨肿瘤培养基培养；
(7)培养期间每3-4天更换一次骨肿瘤培养基；
(8)类器官一般每20-35天传代1次，传代时用300U/ml IV型胶原酶37℃消化30-40分钟，后加I型DNA酶200units/ml，37℃消化10分钟，加ADMEM/F12到10mL，600g离心3min，弃上清，重复2遍。按照1：3或者1：4比例传代到新的迁移小室中培养。
6.根据权利要求5所述的骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，Collagen胶原基质的制备方法：
所述的Cellmatrix type I-A、10×Ham’s F-12、缓冲液的比例为8：1：1，骨肿瘤培养另加50ug/ml laminin。
7.根据权利要求6所述的骨肉瘤类器官的气液培养模型的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，缓冲液由含0.05N NaOH、200mM HEPES和2.2g NaHCO3的无菌水组成。
8.权利要求1至7任一项所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，其特征在于：所述的骨肿瘤培养基包括如下组分组成：
Figure FDA0002601022620000031
9.根据权利要求8所述的骨肉瘤类器官的培养方法中的骨肿瘤培养基，其特征在于：所述的高级DMEM/F12培养基由F12培养基和DMEM培养基组成，所述的F12培养基与DMEM培养基的体积比为1:1，称为dmem/f12；Wnt3a条件培养基：Wnt3A-ConditionedMedium由细胞株制备的上清液处理而成，制备用Wnt-3A细胞株购自中科院细胞库。
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