CN113073080B - 一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途 - Google Patents

一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113073080B
CN113073080B CN202110621658.4A CN202110621658A CN113073080B CN 113073080 B CN113073080 B CN 113073080B CN 202110621658 A CN202110621658 A CN 202110621658A CN 113073080 B CN113073080 B CN 113073080B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
culture medium
rhabdomyosarcoma
mixture
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110621658.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113073080A (zh
Inventor
黄思颖
李程
孙志坚
康平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co ltd
Zhejiang K2oncology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang K2oncology Co ltd
Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang K2oncology Co ltd, Beijing Ke Ke Medical Science And Technology Co ltd filed Critical Zhejiang K2oncology Co ltd
Priority to CN202110621658.4A priority Critical patent/CN113073080B/zh
Publication of CN113073080A publication Critical patent/CN113073080A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113073080B publication Critical patent/CN113073080B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本公开涉及一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途，培养基含有25‑75μg/mL的740Y‑P、5‑15μM的MHY1485、80‑120ng/mL的有丝分裂生长因子、90‑110ng/mL的Wnt激动剂、4‑15μM的ROCK抑制剂、10‑15ng/mL的BMP抑制剂、10‑15μM的p38激酶抑制剂、以所述培养基的总体积为基准的0.5‑5体积%的N2、以所述培养基的总体积为基准的0.5‑5体积%的B27、1‑5mM的HEPES、2‑5mM的Glutamax、2‑5mM的乙酰半胱氨酸、150‑200U/mL的青霉素‑链霉素和以所述培养基的总体积为基准的5‑15体积%的FBS。本公开的培养基可以用于三维培养多形性横纹肌肉瘤类器官，培养得到的肿瘤类器官的数量多且成活率高。

Description

一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途。
背景技术
横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是由各种分化程度的横纹肌母细胞组成的软组织恶性肿瘤，发病率次于恶性纤维组织细胞瘤和脂肪肉瘤，居软组织肉瘤的第三位。WHO将RMS按组织学分为三种亚型：胚胎型横纹肌肉瘤(ERMS)、腺泡型横纹肌肉瘤(ARMS)与多形性横纹肌肉瘤（PRMS）。胚胎型横纹肌肉瘤约占横纹肌肉瘤的2/3，好发于儿童及青少年，年龄分布呈现两个高峰，即出生后及少年后期，平均年龄5岁。腺泡型横纹肌肉瘤多见于青少年，男多于女。多形性横纹肌肉瘤主要发生于成人，多见于40-70岁。
目前对于RMS的发病原因尚不明晰，不同亚型的RMS可能存在完全不同的发病机制，个体化差异明显，而多形性横纹肌肉瘤是非常罕见的肿瘤，没有确切的发病原因，确诊更为困难。
研究表明，肿瘤类器官可以作为药物筛选模型应用于药物的有效性检测，以协助制定个性化诊疗方案。但是针对多形性横纹肌肉瘤类器官的培养方法尚不完善，体外与体内培养环境差异而造成细胞死亡，且维持细胞体外生长、传代的培养条件尚不明晰，存在肿瘤类器官培养数量少、成活率低等问题。
发明内容
本公开的目的是提供一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途，本公开的培养基能够有效地促进多形性横纹肌肉瘤细胞的生长，采用该培养基培养的多形性横纹肌肉瘤类器官的成活率高、培养数量多。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种用于培养多形性横纹肌肉瘤类器官的培养基，所述培养基含有25-75μg/mL的740Y-P、5-15μM的MHY1485、80-120ng/mL的有丝分裂生长因子、90-110ng/mL的Wnt激动剂、4-15μM的ROCK抑制剂、10-15ng/mL的BMP抑制剂、10-15μM的p38激酶抑制剂、可选的以所述培养基的总体积为基准的0.5-5体积%的N2、可选的以所述培养基的总体积为基准的0.5-5体积%的B27、可选的1-5mM的HEPES、可选的2-5mM的Glutamax、可选的2-5mM的乙酰半胱氨酸、可选的150-200U/mL的青霉素-链霉素和可选的以所述培养基的总体积为基准的5-15体积%的FBS。
本公开第二方面提供一种培养多形性横纹肌肉瘤类器官的方法，该方法包括：
S1、将多形性横纹肌肉瘤癌旁正常组织细胞、培养基和基质胶混合后加入培养板的孔中，并进行第一培养，得到癌旁正常组织胶原层；
S2、将多形性横纹肌肉瘤细胞、基质胶与层粘连蛋白混合后覆于所述癌旁正常组织胶原层上，并进行第二培养，得到双层基质培养体系；
S3、在所述双层基质培养体系中加入本公开第一方面提供的培养基进行扩增培养。
本公开第三方面提供一种采用本公开第二方面提供的方法培养得到的多形性横纹肌肉瘤类器官。
本公开第四方面提供一种本公开第三方面提供的多形性横纹肌肉瘤类器官在药物筛选和肿瘤机制研究中的用途。
通过上述技术方案，本公开的培养基中含有740Y-P和MHY1485，采用该培养基将多形性横纹肌肉瘤细胞与其癌旁正常组织细胞进行三维共培养，能够有效地促进多形性横纹肌肉瘤细胞的生长，培养得到的多形性横纹肌肉瘤类器官的数量多、成活率高。采用培养得到多形性横纹肌肉瘤类器官进行药物筛选，可以针对不同患者个体制定个性化的诊疗方案。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供一种用于培养多形性横纹肌肉瘤类器官的培养基，所述培养基含有25-75μg/mL的740Y-P、5-15μM的MHY1485、80-120ng/mL的有丝分裂生长因子、90-110ng/mL的Wnt激动剂、4-15μM的ROCK抑制剂、10-15ng/mL的BMP抑制剂、10-15μM的p38激酶抑制剂、可选的以所述培养基的总体积为基准的0.5-5体积%的N2、可选的以所述培养基的总体积为基准的0.5-5体积%的B27、可选的1-5mM的HEPES、可选的2-5mM的Glutamax、可选的2-5mM的乙酰半胱氨酸、可选的150-200U/mL的青霉素-链霉素和可选的以所述培养基的总体积为基准的5-15体积%的FBS。
本公开的发明人意外地发现，含有740Y-P和MHY1485的培养基可以有效地促进多形性横纹肌肉瘤细胞的生长，将该培养基用于对多形性横纹肌肉瘤细胞及其癌旁正常组织细胞的三维培养时，可以显著地提高肿瘤类器官的培养数量和成活率。
在本发明的一种优选的具体实施方式中，培养基中740Y-P的含量为30-70μg/mL，MHY1485的含量为6-13μM。更优选地，740Y-P的含量为40-60μg/mL，MHY1485的含量为8-11μM。
在本公开一种优选的具体实施方式中，培养基中还含有90-110ng/mL的有丝分裂生长因子、92-105ng/mL的Wnt激动剂、5-14μM的ROCK抑制剂、12-14ng/mL的BMP抑制剂、11-14μM的p38激酶抑制剂、可选的以所述培养基的总体积为基准的1-4体积%的N2、可选的以所述培养基的总体积为基准的1-2体积%的B27、可选的2-4mM的HEPES、可选的3-5mM的Glutamax、可选的3-4mM的乙酰半胱氨酸、可选的170-190U/mL的青霉素-链霉素和可选的以所述培养基的总体积为基准的8-12体积%的FBS。其中，上述培养基的各组分均可通过购买获得，各组分的组成、剂型、规格等均是领域内已知的，在此不再赘述。本公开的实施例中，将上述各组分进行合理搭配后得到的培养基用于对多形性横纹肌肉瘤细胞及其癌旁正常组织细胞进行三维培养，可以培养得到更多的多形性横纹肌肉瘤类器官，且器官成活率更高。
根据本公开，有丝分裂生长因子、Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂和p38激酶抑制剂均为本领域的技术人员所熟知的。优选地，有丝分裂生长因子可以为EGF和/或FGF；Wnt激动剂可以选自Wnt、Wnt-3a和R-Spondinl-4中的一种或几种；ROCK抑制剂可以为A8301和/或Y-27632；BMP抑制剂可以选自Noggin和/或LDN-212854；p38激酶抑制剂可以选自SB202190、Dilmapimod和SKF-86002中的一种或几种。
本公开第二方面提供一种培养多形性横纹肌肉瘤类器官的方法，该方法包括：S1、将多形性横纹肌肉瘤癌旁正常组织细胞、培养基和基质胶混合后加入培养板的孔中，并进行第一培养，得到癌旁正常组织胶原层；S2、将多形性横纹肌肉瘤细胞、基质胶与层粘连蛋白混合后覆于癌旁正常组织胶原层上，并进行第二培养，得到双层基质培养体系；S3、在双层基质培养体系中加入本公开第一方面提供的培养基进行扩增培养。
本公开的方法中以含有740Y-P和MHY1485的培养基对多形性横纹肌肉瘤细胞及其癌旁正常组织细胞进行三维培养，培养得到的多形性横纹肌肉瘤类器官的数量多且成活率高。
在本公开的一种优选的具体实施方式中，步骤S1中，可以将原多形性横纹肌肉瘤癌旁正常组织细胞置于培养板（例如可以是96孔培养板）的培养孔中，使得每孔中原代培养物为500-1500个，然后再进行第一培养。第一培养的条件可以包括：温度为30-40℃，优选为37℃，时间为0.2-2h，优选为0.5h。本公开对基质胶的种类不做具体限制，可以为本领域的技术人员所常规采用的，例如可以为Matrigel基质胶。基质胶的用量可以在较大的范围内变化，例如相对于10μL的所述培养基，所述基质胶的用量为10-15μL。
在本公开的一种优选的具体实施方式中，步骤S2中，所述的将多形性横纹肌肉瘤癌细胞、基质胶与层粘连蛋白混合后覆于癌旁正常组织胶原层上，并进行第二培养，包括：采用培养基对多形性横纹肌肉瘤癌细胞进行重悬处理，将重悬处理混合物、基质胶与层粘连蛋白混合，得到第一混合物；将第一混合物滴加至癌旁正常组织胶原层上，在30-40℃进行第二培养0.2-2h。重悬处理混合物中的多形性横纹肌肉瘤癌细胞的浓度可以在较大的范围内变化，例如可以为20-60个/μL。层粘连蛋白的用量可以在较大的范围内变化，例如相对于1mL的重悬处理混合物，层粘连蛋白的用量可以为40-60μg。
在本公开的一种优选的具体实施方式中，步骤S3中，所述的在双层基质培养体系中加入本公开第一方面提供的培养基进行扩增培养，包括：在双层基质培养体系中加入50-150μL的培养基，在30-40℃下进行扩增培养至每孔中具有20-40个直径为200-300μM的多形性横纹肌肉瘤类器官。优选地，在扩增培养的第3天对培养基进行换液（例如对将一半的培养基换为新鲜的培养基），以后每隔2-3天更换培养基，至每孔中具有20-40个直径为200-300μM的多形性横纹肌肉瘤类器官。
根据本公开，本公开的方法还可以包括：将步骤S3中扩增培养得到的扩增培养产物与细胞消化液混合，进行细胞消化处理，得到第二混合物；使所述第二混合物细胞消化终止，将细胞消化终止后得到的细胞进行传代培养。
其中，本公开对细胞消化液的种类不做具体限制，细胞消化液可以为TrypleExpress、Trypsin-EDTA Solution、Acctuase等，细胞消化液的用量可以根据实际需要进行选择，优选地，相对于5×105个的细胞团，细胞消化液的用量为2-5mL，消化处理的条件包括：温度为30-40℃，时间为2-6min。
根据本公开，对使第二混合物终止细胞消化的方法不做限制，例如可以为将FBS浓度为5-15体积%的DMEM培养基与第二混合物混合以终止细胞消化。
本公开第三方面提供一种本公开第二方面提供的方法培养得到的多形性横纹肌肉瘤类器官。
本公开第四方面提供一种公开第三方面提供的多形性横纹肌肉瘤类器官在药物筛选和肿瘤机制研究中的用途。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开的实施例中所涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得，此外，在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温（20-25℃）。
本公开的实施例中使用的试剂来源如下：
DMEM培养基购于美国HyClone公司；Cosmo温敏性水凝胶购于Cosmo Bio公司；胎牛血清蛋白（fetal bovine serum FBS）购于内蒙古金源康生物工程有限公司；青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）购于上海生工生物工程股份有限公司；p160ROCK抑制剂、Y‐27632 dihydrochloride抑制剂、collagenase type II、R-Spondinl、Glutamax、laminin购于美国Invitrogen公司；EGF、Wnt-3a、SB202190、HEPES购于美国Sigma--Aldrich公司；A8301、MHY1485、740Y-P购于美国MedChemExpress公司。
本公开实施例1中采用的培养基含有：100ng/mL的EGF、100ng/mL的Wnt-3a、1μg/mL的R-Spondinl、5μM的A8301、8μM的Y‐27632、12ng/mL的Noggin、12μM的SB202190、1体积%的N2、1体积%的B27、10μM的MHY1485、50μg/mL的740Y-P、2mM的HEPES、5mM的Glutamax、4Mm的乙酰半胱氨酸、180U/mL的青霉素-链霉素、10体积%的FBS。
实施例1
S1、用培养基稀释多形性横纹肌肉瘤癌旁正常组织细胞并计数，以每孔1000个细胞与15μL提前4℃解冻的基质胶种植于96孔板，放置于37℃培养箱中进行第一培养30min，得到癌旁正常组织胶原层；
S2、用15μL的培养基将多形性横纹肌肉瘤癌细胞进行重悬处理，将重悬处理混合物与0.8μg的laminin以及15μL基质胶混合，得到第一混合物，将第一混合物滴加到癌旁正常组织胶原层上，在37℃进行第二培养30min，得到双层基质培养体系；重悬处理混合物中的多形性横纹肌肉瘤癌细胞的浓度为35个/μL；
S3、在双层基质培养体系中加入100μL的培养基，在37℃下进行扩增培养，培养第3天进行培养基半数换液，以后每2-3天更换培养基，至每孔中具有20-40个直径为200-300μM的多形性横纹肌肉瘤类器官时，在每孔中加入2-3倍体积的细胞消化液Tryple Express，在37℃下进行细胞消化处理3-5min，得到第二混合物；当第二混合物中类器官分散成小团并与基质胶分离时用FBS浓度为10体积%的DMEM终止细胞消化。离心后用PBS清洗并收集细胞，按照步骤S1-S3进行类器官铺板或冻存。
实施例2
采用与实施例1相同的方法培养多形性横纹肌肉瘤类器官，不同之处仅在于，本实施例采用的培养基中740Y-P和MHY1485的含量与实施例1采用的培养基的含量不同，本实施例采用的培养基中740Y-P的含量为25μg/mL，MHY1485的含量为5μM。
对比例1
采用与实施例1相同的方法培养多形性横纹肌肉瘤类器官，不同之处仅在于，本实施例采用的培养基中不含740Y-P，其他组分及其对应含量均与实施例1采用的培养基相同。
对比例2
采用与实施例1相同的方法培养多形性横纹肌肉瘤类器官，不同之处仅在于，本实施例采用的培养基中不含MHY1485，其他组分及其对应含量均与实施例1采用的培养基相同。
对比例3
a、用15μL的培养基将多形性横纹肌肉瘤癌细胞进行重悬处理，将重悬处理混合物与0.8μg的laminin以及15μL基质胶混合，得到第一混合物，将第一混合物滴加到96孔板上，在37℃培养30min，得到肿瘤细胞培养体系；重悬处理混合物中的多形性横纹肌肉瘤癌细胞的浓度为35个/μL；
b、在肿瘤培养体系中加入100μL的培养基，在37℃下进行扩增培养，培养第3天进行培养基半数换液，以后每2-3天更换培养基，至每孔中具有20-40个直径为200-300μM的多形性横纹肌肉瘤类器官时，在每孔中加入2-3倍体积的细胞消化液Tryple Express，在37℃下进行细胞消化处理3-5min，得到第二混合物；当第二混合物中类器官分散成小团并与基质胶分离时用FBS浓度为10%的DMEM终止细胞消化。离心后用PBS清洗并收集细胞，按照步骤S1-S3进行类器官铺板或冻存。
对比例4
采用与实施例1相同的方法培养多形性横纹肌肉瘤类器官，不同之处仅在于，本实施例采用的培养基中740Y-P的含量为80μg/mL。
对比例5
采用与实施例1相同的方法培养多形性横纹肌肉瘤类器官，不同之处仅在于，本实施例采用的培养基中MHY1485的含量为20μM。
检测例
1、多形性横纹肌肉瘤形成情况与增殖速率
历时5年，共收集符合伦理要求的34例样本，分别根据实施例与对比例的方法构建多形性横纹肌肉瘤模型，培养至第14天，于倒置显微镜下统计直径在0.2-0.3μM大小的类器官单孔克隆数量，平均单例样本类器官形成数量=总样本克隆数/34例样本，统计结果见表1。
表1 多形性横纹肌肉瘤类器官克隆形成情况
平均单例样本类器官形成数量（×1000个/孔）
实施例1 1.88
实施例2 1.27
对比例1 0.55
对比例2 0.47
对比例3 0.35
对比例4 1.04
对比例5 0.96
由表1可知，在样本来源一致的情况下，培养至第14天，多形性横纹肌肉瘤类器官形成数量分别是实施例1>实施例2>对比例4>对比例5>对比例1>对比例2>对比例3，说明本公开实施例的方法能有效促进多形性横纹肌肉瘤类器官克隆的形成和增殖，肿瘤类器官的培养数量多。
2、多形性横纹肌肉瘤类器官建库成功率
以1个月内肿瘤类器官大小达标、冻存数目达1×106cell为建库标准，统计多形性横纹肌肉瘤类器官建库成功率（成功率=成功次数/34×100%），结果如表2所示。
表2 横纹肌肉瘤类器官建库情况统计表
方法 类器官建库成功例数（例） 类器官建库成功率（%）
实施例1 30 88.24
实施例2 27 79.41
对比例1 17 50.00
对比例2 16 47.06
对比例3 13 38.24
对比例4 23 67.65
对比例5 22 64.71
由表2可知，不同方法处理的多形横纹肌肉瘤类器官建库成功率分别是实施例1>实施例2>对比例4>对比例5>对比例1>对比例2>对比例3，说明本公开实施例的方法能有效进行多形性横纹肌肉瘤类器官模型的体外建模，肿瘤类器官模型的成活率高。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (9)

1.用于培养多形性横纹肌肉瘤类器官的培养基，其特征在于，所述培养基含有25-75μg/mL的740Y-P、5-15μM的MHY1485、80-120ng/mL的有丝分裂生长因子、90-110ng/mL的Wnt激动剂、4-15μM的ROCK抑制剂、10-15ng/mL的BMP抑制剂、10-15μM的p38激酶抑制剂、以所述培养基的总体积为基准的0.5-5体积%的N2、以所述培养基的总体积为基准的0.5-5体积%的B27、1-5mM的HEPES、2-5mM的Glutamax、2-5mM的乙酰半胱氨酸、150-200U/mL的青霉素-链霉素和以所述培养基的总体积为基准的5-15体积%的FBS。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述培养基含有30-70μg/mL的740Y-P、6-13μM的MHY1485、90-110ng/mL的有丝分裂生长因子、92-105ng/mL的Wnt激动剂、5-14μM的ROCK抑制剂、12-14ng/mL的BMP抑制剂、11-14μM的p38激酶抑制剂、以所述培养基的总体积为基准的1-4体积%的N2、以所述培养基的总体积为基准的1-2体积%的B27、2-4mM的HEPES、3-5mM的Glutamax、3-4mM的乙酰半胱氨酸、170-190U/mL的青霉素-链霉素和以所述培养基的总体积为基准的8-12体积%的FBS。
3.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述有丝分裂生长因子为EGF和/或FGF；
所述Wnt激动剂选自Wnt、Wnt-3a和R-Spondinl中的一种或几种；
所述ROCK抑制剂为A8301和/或Y-27632；
所述BMP抑制剂选自Noggin和/或LDN-212854；
所述p38激酶抑制剂选自SB202190、Dilmapimod和SKF-86002中的一种或几种。
4.一种培养多形性横纹肌肉瘤类器官的方法，其特征在于，该方法包括：
S1、将多形性横纹肌肉瘤癌旁正常组织细胞、培养基和基质胶混合后加入培养板的孔中，并进行第一培养，得到癌旁正常组织胶原层；
S2、将多形性横纹肌肉瘤细胞、基质胶与层粘连蛋白混合后覆于所述癌旁正常组织胶原层上，并进行第二培养，得到双层基质培养体系；
S3、在所述双层基质培养体系中加入权利要求1-3中任意一项所述的培养基进行扩增培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述培养板的每孔中的所述多形性横纹肌肉瘤癌旁正常组织细胞为500-1500个；
相对于10μL的所述培养基，所述基质胶的用量为10-15μL；
所述第一培养的条件包括：温度为30-40℃，时间为0.2-2h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述的将所述多形性横纹肌肉瘤癌细胞、基质胶与层粘连蛋白混合后覆于所述癌旁正常组织胶原层上，并进行第二培养，包括：
采用所述培养基对所述多形性横纹肌肉瘤癌细胞进行重悬处理，将重悬处理混合物、所述基质胶与所述层粘连蛋白混合，得到第一混合物；
将所述第一混合物滴加至所述癌旁正常组织胶原层上，在30-40℃进行所述第二培养0.2-2h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述的在所述双层基质培养体系中加入权利要求1-3中任意一项所述的培养基进行扩增培养，包括：
在所述双层基质培养体系中加入50-150μL的所述培养基，在30-40℃下进行所述扩增培养至每孔中具有20-40个直径为200-300μM的多形性横纹肌肉瘤类器官。
8.根据权利要求4或7所述的方法，其特征在于，该方法还包括：将步骤S3中所述扩增培养得到的扩增培养产物与消化液混合，进行细胞消化处理，得到第二混合物；
使所述第二混合物终止细胞消化，将终止细胞消化后得到的细胞进行传代培养。
9.权利要求4-8中任意一项所述的方法培养得到的多形性横纹肌肉瘤类器官。
CN202110621658.4A 2021-06-03 2021-06-03 一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途 Active CN113073080B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110621658.4A CN113073080B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110621658.4A CN113073080B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113073080A CN113073080A (zh) 2021-07-06
CN113073080B true CN113073080B (zh) 2021-08-13

Family

ID=76617044

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110621658.4A Active CN113073080B (zh) 2021-06-03 2021-06-03 一种多形性横纹肌肉瘤类器官及其培养方法、培养基和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113073080B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109844098A (zh) * 2016-06-20 2019-06-04 荷兰皇家科学院 改进的分化方法
CN110475860A (zh) * 2017-03-16 2019-11-19 美迪恩斯生命科技株式会社 使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养
CN111808817A (zh) * 2020-07-24 2020-10-23 上海昊佰生物科技有限公司 一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基
CN112481214A (zh) * 2020-11-23 2021-03-12 北京科途医学科技有限公司 滑膜肉瘤类器官的培养方法和培养基以及移植体及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109844098A (zh) * 2016-06-20 2019-06-04 荷兰皇家科学院 改进的分化方法
CN110475860A (zh) * 2017-03-16 2019-11-19 美迪恩斯生命科技株式会社 使用肿瘤组织的原代癌细胞的三维培养
CN111808817A (zh) * 2020-07-24 2020-10-23 上海昊佰生物科技有限公司 一种骨肉瘤类器官的培养方法及其骨肿瘤培养基
CN112481214A (zh) * 2020-11-23 2021-03-12 北京科途医学科技有限公司 滑膜肉瘤类器官的培养方法和培养基以及移植体及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Oncogenic pseudogene DUXAP10 knockdown suppresses proliferation and invasion and induces apoptosis of papillary thyroid carcinoma cells by inhibition of Akt/mTOR pathway;Jian Li等;《Clin Exp Pharmacol Physiol.》;20200421;第47卷(第8期);第1473-1483页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113073080A (zh) 2021-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Alvi et al. Functional and molecular characterisation of mammary side population cells
Fukuda et al. Fluorescence-activated cell sorting–based purification of embryonic stem cell–derived neural precursors averts tumor formation after transplantation
Ji et al. Reactive oxygen species enhance differentiation of human embryonic stem cells into mesendodermal lineage
Xu et al. A zebrafish embryo culture system defines factors that promote vertebrate myogenesis across species
Griffiths et al. LIF-independent JAK signalling to chromatin in embryonic stem cells uncovered from an adult stem cell disease
Prusa et al. Amniotic fluid cells and human stem cell research-a new connection
Hardy et al. The human blastocyst: cell number, death and allocation during late preimplantation development in vitro
Carelli et al. Characteristics and properties of mesenchymal stem cells derived from microfragmented adipose tissue
Stukenborg et al. New horizons for in vitro spermatogenesis? An update on novel three-dimensional culture systems as tools for meiotic and post-meiotic differentiation of testicular germ cells
Ge et al. Poly-L-ornithine promotes preferred differentiation of neural stem/progenitor cells via ERK signalling pathway
de Carvalho et al. Glycogen synthase kinase 3 induces multilineage maturation of human pluripotent stem cell-derived lung progenitors in 3D culture
He et al. Activation, isolation, identification and in vitro proliferation of oval cells from adult rat livers
Chong et al. Cryopreservation of neurospheres derived from human glioblastoma multiforme
EP1792979A1 (en) Cell culture system for the enrichment and expansion of stem cells
Emmrich et al. miRNAs can increase the efficiency of ex vivo platelet generation
US20120258083A1 (en) Placental vascular lobule stem cells
Galli The neurosphere assay applied to neural stem cells and cancer stem cells
WO2019109668A1 (zh) 一种用于培养尿液来源细胞的培养基
Shen et al. Characterization of porcine extraembryonic endoderm cells
Colombo et al. Embryonic Stem–Derived Versus Somatic Neural Stem Cells: A Comparative Analysis of Their Developmental Potential and Molecular Phenotype
Wang et al. Bioinspired one cell culture isolates highly tumorigenic and metastatic cancer stem cells capable of multilineage differentiation
Alison et al. Markers of adult tissue-based stem cells
KR20240057445A (ko) 조혈 이식체의 개선 방법
Benzing et al. Neural conversion of human embryonic stem cell colonies in the presence of fibroblast growth factor-2
Theus et al. Reproducible expansion and characterization of mouse neural stem/progenitor cells in adherent cultures derived from the adult subventricular zone

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: 101111, 5th Floor, Building 3, Zone 3, No. 88 Jinghai Fifth Road, Daxing District Economic and Technological Development Zone, Beijing

Patentee after: Beijing Ke Ke medical science and Technology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Patentee after: ZHEJIANG K2ONCOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 100176 Room 302, unit 2, building 7, huilongsen Science Park, Daxing Economic and Technological Development Zone, Beijing

Patentee before: Beijing Ke Ke medical science and Technology Co.,Ltd.

Country or region before: China

Patentee before: ZHEJIANG K2ONCOLOGY Co.,Ltd.