CN116836934A - 骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物组织工程技术领域，公开一种骨肉瘤类器官培养液，包括原代培养液和传代培养液，原代培养液和传代培养液均包括条件培养基、基础培养基、复合抗生素和生长因子。根据骨肉瘤类器官的特性，在原代培养液中减去了辅助蛋白条件培养基和表皮生长因子，且提高了青霉素‑链霉素的浓度，从而更有利于在原代培养中抑制原代组织的污染风险并能够纯化出骨肉瘤肿瘤细胞；以及，优化的传代培养液能够维持骨肉瘤病理特征，保证增殖速度。适用于人源骨肉瘤类器官的培养。本申请还公开一种培养试剂组合及培养方法。
Description
技术领域
本申请涉及生物组织工程技术领域，例如涉及一种骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法。
背景技术
骨肉瘤（osteosarcoma），是一种恶性骨肿瘤，特点是肿瘤细胞可直接产生骨样组织。骨肉瘤好发于青少年，好发部位为股骨远端、胫骨近端和肱骨近端的干骺端。然而，目前骨肉瘤的发病机制并不明确。
在体外构建的骨肉瘤类器官是研究骨肉瘤的优势模型，便于对其进行研究分析，对发病机制的研究能够起到积极作用。3D培养近年来被广泛应用，相较于传统2D培养更具有优势，为细胞提供更生理的环境。3D培养体系为细胞提供类似体内生长环境的基质，细胞通过与胞外基质间的联系形成一定的三维结构，与体内细胞生长情况更为相似。
在实现本公开实施例的过程中，发现相关技术中至少存在如下问题：3D培养过程中所采用的培养液是构建3D类器官的关键因素，目前针对骨肉瘤类器官培养用的培养液种类少，且培养效果有限。
发明内容
为了对披露的实施例的一些方面有基本的理解，下面给出了简单的概括。所述概括不是泛泛评述，也不是要确定关键／重要组成元素或描绘这些实施例的保护范围，而是作为后面的详细说明的序言。
本公开实施例提供一种骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，以提高骨肉瘤类器官的培养成功率。
在一些实施例中，所述骨肉瘤类器官培养液，包括原代培养液和传代培养液；其中，原代培养液包括条件培养基、基础培养基和复合生长因子，所述复合生长因子包括human EGF 40～100 ng/mL，HEPES 10～15 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1～2 mM，青霉素-链霉素 1.5x～2x，Primocin 0.2～2 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin10～20 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 5～15 μM，A83-01 100～500 nM，SB202190 10～20 nM和胎牛血清2%～15%；所述条件培养基为R-spondin1条件培养基，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%；传代培养液是在原代培养液的基础上，复合生长因子还包括FGF 60～150 ng/mL，且青霉素-链霉素的含量为0.5x～1x；所述条件培养基还包括辅助蛋白条件培养基且所述辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和/或Noggin条件培养基，其中，R-spondin1条件培养基与辅助蛋白培养基的体积比为1﹕0.5～2，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。
在一些实施例中，所述骨肉瘤类器官培养试剂组合，包括：酶解液和前述的骨肉瘤类器官培养液；以及，第一完全培养基和第二完全培养基；所述酶解液包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1～2 mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.5～2.5；Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL。
在一些实施例中，所述骨肉瘤类器官的培养方法，包括：将骨肉瘤样本进行物理预处理，得到2～4 mm的样本组织碎块；将样本组织碎块转移至离心管中，采用前述的骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液进行摇床孵育，孵育30～60min；孵育完成后，将酶解混合液过滤得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀；采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；向培养孔内加入前述的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液进行培养，获得原代骨肉瘤类器官；将所述原代骨肉瘤类器官进行传代培养，所述传代培养过程中采用前述的骨肉瘤类器官培养液的传代培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为10～15天，获得相应代骨肉瘤类器官。
本公开实施例提供的一种骨肉瘤类器官培养液、培养试剂组合及培养方法，可以实现以下技术效果：
本公开实施例提供的骨肉瘤类器官培养液分为原代培养液和传代培养液，根据骨肉瘤类器官的特性，在传代培养液中，以条件培养基和基础培养基的混合液作为载体，其中条件培养基包括R-spondin1条件培养基和辅助蛋白培养基，且辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和/或Noggin条件培养基，通过调控R-spondin1条件培养基、辅助蛋白培养基和基础培养基的比例，获得混合液，并在混合液中分散多种生长因子及各因子的用量，Rspodin1为关键因子，可以激活增殖干细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路，保证3D类器官的干性维持、增殖生长；进一步地协同SB202190、FGF和胎牛血清等，尤其是与FGF和胎牛血清的协同作用，在类器官形成后，维持肿瘤细胞的增殖、代谢活性和分化，保持类器官的病理特征。即，在传代培养过程中，传代培养液中各组分及其用量相互协同，配合青霉素-链霉素的浓度，促进了骨肉瘤类器官细胞的形成和生长，保证培养的成功率；且使得传代培养过程中能够维持病理特征，保证其完整性，以及增殖速度。同时，在传代培养过程中，培养10～15天即可达到传代要求。
而在原代培养过程中，在原代培养液中减去了FGF，提高了青霉素-链霉素的浓度，并在保证Rspodin1条件培养基在混合液中的比例不变的前提下减去了辅助蛋白条件培养基，从而有利于在原代培养中纯化出骨肉瘤肿瘤细胞，减少其他组织细胞的干扰生长。
本公开实施例提供的骨肉瘤类器官培养试剂组合中，酶解液利用Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶进行联合酶解，能够对骨肉瘤样本进行有效酶解，获得的细胞活性高，同时配合Primocin的浓度控制，可有效降低样本污染；然后利用本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液对骨肉瘤肿瘤样本进行培养，能够加快骨肉瘤类器官细胞的生长，提高培养速度。
本公开实施例提供的骨肉瘤类器官的培养方法，操作简单，采用本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液能够有效缩减原代类器官形成与生长时间，且更有利于纯化出骨肉瘤肿瘤细胞。在传代培养时，采用传代培养液，每代培养时间为10～15天。在传代培养过程中，培养3天类器官直径可达50～80 μm，10天可达200μm，传代周期稳定。而且，在采用骨肉瘤类器官培养试剂组合进行原代提取培养过程中，培养3～4天类器官直径即可达50～100 μm，培养10天后即可见大量骨肉瘤类器官形成，最大直径达200 μm以上，原代培养7～10天的骨肉瘤类器官即可进行传代。
以上的总体描述和下文中的描述仅是示例性和解释性的，不用于限制本申请。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图进行示例性说明，这些示例性说明和附图并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件示为类似的元件，附图不构成比例限制，并且其中：
图1是本公开实施例的一种骨肉瘤类器官培养方法的原代培养24 h后的骨肉瘤类器官的光镜图；
图2a和图2b分别是本公开实施例的一种骨肉瘤类器官培养方法的原代培养3天和10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图2c和图2d分别是本公开实施例的另一种骨肉瘤类器官培养方法的原代培养3天和10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图3a和图3b分别是本公开实施例的另一种骨肉瘤类器官培养方法的传代培养3天和10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图3c和图3d分别是本公开实施例的另一种骨肉瘤类器官培养方法的传代培养3天和10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图4是本公开实施例的另一种骨肉瘤类器官培养方法中经酶解预处理的细胞的台盼蓝染色图；
图5a和图5b分别是本公开实施例的另一种骨肉瘤类器官培养方法的传代培养24h和7天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图6a至图6h是对比例1的骨肉瘤类器官培养方法的传代培养10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图7a和图7b是对比例2的骨肉瘤类器官培养方法的原代培养3天和10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图8a和图8b是对比例2的骨肉瘤类器官培养方法的原代培养10天时的骨肉瘤类器官的光镜图；
图9是对比例3的骨肉瘤类器官培养方法原代培养10天的骨肉瘤类器官的光镜图；
图10a和图10b是对比例3的骨肉瘤类器官培养方法传代培养养3天和10天的骨肉瘤类器官的光镜图；
图11是本公开实施例的骨肉瘤类器官培养方法获得的骨肉瘤类器官的免疫组化结果图；
图12是本公开实施例的骨肉瘤类器官培养方法获得的骨肉瘤类器官同源组织的免疫组化结果图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本公开实施例的特点与技术内容，下面结合附图对本公开实施例的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本公开实施例。在以下的技术描述中，为方便解释起见，通过多个细节以提供对所披露实施例的充分理解。然而，在没有这些细节的情况下，一个或多个实施例仍然可以实施。在其它情况下，为简化附图，熟知的结构和装置可以简化展示。
本公开实施例的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本公开实施例的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
本公开实施例中，术语“上”、“下”、“内”、“中”、“外”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本公开实施例及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本公开实施例中的具体含义。
另外，术语“设置”、“连接”、“固定”应做广义理解。例如，“连接”可以是固定连接，可拆卸连接，或整体式构造；可以是机械连接，或电连接；可以是直接相连，或者是通过中间媒介间接相连，又或者是两个装置、元件或组成部分之间内部的连通。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本公开实施例中的具体含义。
除非另有说明，术语“多个”表示两个或两个以上。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开实施例中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本公开实施例中，涉及的各物质的名称均为本领域常规采用的简写、英文名称或商品名称，具体如下：human EGF为重组人表皮生长因子，HEPES为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，Glutamax为GlutaMAX™ 添加剂， N2为N2细胞培养添加剂，B27为无血清添加剂，n-Acetylcysteine为N-乙酰半胱氨酸，Primocin为PrimocinTM抗生素，Nicotinamide为烟酰胺，Gastrin为胃泌素，Prostaglandin E2为前列腺素 E2，FGF为成纤维细胞生长因子，Advanced DMEM/F12为在Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12（DMEM/F12）基础上改良的培养基。
本公开实施例提供的一种骨肉瘤类器官培养液，包括原代培养液和传代培养液；其中，原代培养液包括条件培养基、基础培养基、复合生长因子；复合生长因子包括humanEGF 40～100 ng/mL，HEPES 10～15 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1～2 mM，青霉素-链霉素 1.5x～2x，Primocin 0.2～2 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin10～20 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 5～15 μM，A83-01 100～500 nM，SB202190 10～20 nM和胎牛血清2%～15%；所述条件培养基为R-spondin1条件培养基，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。传代培养液是在原代培养液的基础上，复合生长因子还包括FGF 60～150 ng/mL，且青霉素-链霉素的含量为0.5x～1x；所述条件培养基还包括辅助蛋白条件培养基且所述辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和/或Noggin条件培养基，其中，R-spondin1条件培养基与辅助蛋白培养基的体积比为1﹕0.5～2，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。
本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液中，分为原代培养液和传代培养液，根据骨肉瘤类器官的特性，在传代培养液中，以条件培养基和基础培养基的混合液作为载体，其中条件培养基包括R-spondin1条件培养基和辅助蛋白培养基，且辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和/或Noggin条件培养基，通过调控R-spondin1条件培养基、辅助蛋白培养基和基础培养基的比例，获得混合液，并在混合液中分散多种生长因子及各因子的用量，Rspodin1为关键因子，可以激活增殖干细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路，保证3D类器官的干性维持、增殖生长；进一步地协同SB202190、FGF和胎牛血清等，尤其是与FGF和胎牛血清的协同作用，在类器官形成后，维持肿瘤细胞的增殖、代谢活性和分化，保持骨肉瘤类器官的病理特征。即，在传代培养过程中，传代培养液中各组分及其用量相互协同，配合青霉素-链霉素的浓度，促进了骨肉瘤类器官细胞的形成和生长，保证培养的成功率；且使得传代培养过程中能够维持病理特征，保证其完整性，以及增殖速度。同时，在传代培养过程中，培养10～15天可达到传代要求。而在原代培养过程中，在原代培养液中减去了FGF，提高了青霉素-链霉素的浓度，并在保证Rspodin1条件培养基在混合液中的比例不变的前提下减去了辅助蛋白条件培养基，从而有利于在原代培养中纯化出骨肉瘤肿瘤细胞，减少其他组织细胞的干扰生长，有利于传代培养过程中类器官的生长。
本公开实施例的培养液能够适用于人源骨肉瘤类器官的培养，在培养过程中，能够维持原发组织的形体结构与病理特征。而且，进行6次传代获得的骨肉瘤类器官与肿瘤组织的特征性蛋白marker表达具有一致性。
本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液中，条件培养基中的各蛋白条件培养基采用自制获得，大大降低了成本。其余组份均采用市售产品。
本公开实施例中，将条件培养基和基础培养基按体积比例混合后，获得混合培养基，再向该混合培养基中加入复合抗生素和生长因子，混匀，即得骨肉瘤类器官培养液。
相比于原代培养液，在传代培养液中，保持R-spondin1条件培养基在总体积中的比例不变，增加辅助蛋白条件培养基的体积占比，可以理解的是，通过减少基础培养基的用量，实现在保持R-spondin1条件培养基用量不变的情况，增加辅助蛋白条件培养基的用量。通过辅助蛋白条件培养基的增加，在传代扩增培养过程中进一步维持骨肉瘤病理特征，保证增殖速度。
本公开实施例中，基础培养基包括Advanced DMEM/F12。
本公开实施例中，R-spondin1条件培养基作为原代培养液和传代培养液中的必需组分，对骨肉瘤3D类器官的干性维持和增殖生长起到关键性作用，且获取可以通过常规方法。一般地，R-spondin1条件培养基通过将R-spondin1过表达细胞株依次进行初次培养和传代培养后，再进行收取培养获得的。
在一些实施例中，在R-spondin1条件培养基的获取过程中，初次培养采用第一完全培养基；传代培养采用第二完全培养基，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin，且控制其浓度为5 μg/mL。收取培养采用第一完全培养基。可选地，第一完全培养基包括Advanced DMEM/F12+10%FBS+1% P/S。本实施例中，在传代培养采用的第二完全培养基中增加了5 μg/mL的Puromycin，能够去除目标蛋白表达丢失的细胞株，纯化出高表达目的蛋白的阳性细胞株，获得更高浓度的条件培养基，而且，第一完全培养基和第二完全培养基均采用含血清的培养基，能够保证细胞的正常增殖扩培，快速达到饲养层水平的细胞密度。
本公开实施例中，在传代培养液中增加了辅助蛋白条件培养基，Wnt-3a条件培养基和/或Noggin条件培养基的加入，Wnt-3a和/或Noggin能够协同R-spondin1、A83-01、SB202190、FGF和胎牛血清对类器官的生长起到更好地促进作用，Rspondin1、FGF可以维持类器官干细胞群的生长与再生，A8301和SB202190可以维持类器官细胞群的长时间传代，抑制类器官细胞的体外凋亡，同时Wnt 3a和Noggin蛋白可以进一步的促进Wnt信号通路的激活，获得更多的干性细胞群，提高类器官的形成率，胎牛血清可以促进骨肉瘤细胞的增殖。
在一些实施例中，在传代培养液中，R-spondin1条件培养基和辅助蛋白条件培养基的体积比例为1﹕0.5～2；且传代培养液中R-spondin1条件培养基体积与原代培养液中R-spondin1条件培养基体积相同。
可选地，在传代培养液中，R-spondin1条件培养基和辅助蛋白条件培养基的体积比例为1﹕0.8～1.5。
可选地，在传代培养液中，R-spondin1条件培养基和辅助蛋白条件培养基的体积比例为1﹕1。
基于传代培养液中R-spondin1条件培养基体积与原代培养液中R-spondin1条件培养基体积相同，增加的辅助蛋白条件培养基用量通过减少基础培养基用量进行适应性调整即可，因此，传代培养液中条件培养基占混合培养基（条件培养基和基础培养基的混合液）的体积比例大于原代培养液中条件培养基占混合培养基的体积比例，以保证等量混合培养基中R-spondin1条件培养基的用量保持不变。
在传代培养液中，辅助蛋白条件培养基可以是Wnt-3a条件培养基，也可以是Noggin条件培养基，也可以是Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基。且在辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基的情况下，两者的体积比例不限定根据实际需求确定即可。
可选地，辅助蛋白培养基包括Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基，且Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1: 0.8～1.2。本实施例中，Wnt-3a和Noggin能够协同R-spondin1对类器官的生长起到更好地促进作用，Wnt 3a和Noggin蛋白可以进一步的促进Wnt信号通路的激活，获得更多的干性细胞群，提高类器官的形成率。
可选地，Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2或者其他比例。
可选地，Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1:1。
本公开实施例中，辅助蛋白培养基的获取也可以通过常规方法。一般地，Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基分别通过将Wnt-3a过表达细胞株和Noggin过表达细胞株依次进行初次培养和传代培养后，再进行收取培养获得的。
在一些实施例中，在Wnt-3a条件培养基的获取过程中，初次培养采用第一完全培养基；传代培养采用第二完全培养基，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin，且控制其浓度为5 μg/mL，收取培养采用第一完全培养基。本实施例中，初次培养的第一完全培养基同收取培养的第一完全培养基。可选地，第一完全培养基包括Advanced DMEM/F12+10%FBS +1% P/S。本实施例中，Wnt-3a条件培养基的收取培养采用含血清完全培养基能够满足Wnt3a蛋白生产对血清物质的需求，获得更高纯度的目的蛋白。
在一些实施例中，在Noggin条件培养基的获取过程中，初次培养采用第一完全培养基；传代培养采用第二完全培养基，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin，且控制其浓度为5 μg/mL，收取培养采用第一完全培养基。可选地，第一完全培养基包括Advanced DMEM/F12+10%FBS +1% P/S。本实施例中，Noggin条件培养基的收取培养采用带血清完全培养基能够保持较高水平的饲养层细胞活性，提高因子富集度，同时血清成分可以促进骨肉瘤的生长。
本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液中，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%，控制R-spondin1条件培养基的体积占比在此范围内即可。可选地，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%、12.5%、15%、17%、20%、25%/30%或者40%，等等。本实施例中，在原代培养液和传代培养液中，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的比例是相同的。
在一些实施例中，在原代培养液中，复合生长因子包括human EGF 50～100 ng/mL，HEPES 11～14 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1.2～1.8mM，青霉素-链霉素 1.6x～2x，Primocin 0.5～1.5 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin12～18 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 6～14 μM，A83-01 150～400 nM，SB202190 12～18 nM和胎牛血清5%～15%。
可选地，在原代培养液中，复合生长因子包括human EGF 60～90 ng/mL，HEPES 11～13 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine 1.4～1.6 mM，青霉素-链霉素1.7x～1.9x，Primocin 0.8～1.2 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin14～16 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 8～12μM，A83-01 200～350 nM，SB202190 14～16 nM和胎牛血清8%～12%。
可选地，在原代培养液中，复合生长因子包括human EGF 80 ng/mL，HEPES 12 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine 1.5 mM，青霉素-链霉素 1.8x，Primocin1 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin 15 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 10 μM，A83-01 300 nM，SB202190 15 nM和胎牛血清10%。
在一些实施例中，在传代培养液中，复合生长因子包括human EGF 40～100 ng/mL，HEPES 10～15 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1～2 mM，青霉素-链霉素 0.5x～1x，Primocin 0.2～2 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin10～20 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 5～15 μM，A83-01 100～500 nM，SB202190 3 μM，PGE20.5～1.5μM和FGF 60～150 ng/mL。本实施例的传代培养液中，增加了FGF，在传代培养过程中，其为关键因子，FGF与其他生长因子以条件培养基的共同协同作用，可以维持肿瘤细胞的增殖、代谢活性和分化，保持类器官的病理特征，尤其是其与A83-01、SB202190和PGE2等生长因子的协同作用，促进了骨肉瘤类器官细胞的形成和生长，保证传代培养的传代效率。A83-01、SB202190可以协同维持类器官长期传代的稳定性，FGF可以与Rspondin-1共同维持类器官的干性细胞群及增殖，PGE2（Prostaglandin E2）和胎牛血清成分可以协同完成骨肉瘤类器官多种亚型细胞的分化增殖。
可选地，在传代培养液中，复合生长因子包括human EGF 50～100 ng/mL，HEPES11～14 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine 1.2～1.8mM，青霉素-链霉素0.6x～0.9x，Primocin 0.5～1.5 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin12～18 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 6～14 μM，A83-01 150～400 nM，SB202190 10～20 nM、胎牛血清5%～15%和FGF 60～150 ng/mL。
可选地，在传代培养液中，复合生长因子包括human EGF 60～90 ng/mL，HEPES 11～13 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine 1.4～1.6 mM，青霉素-链霉素0.7x～0.8x，Primocin 0.8～1.2 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin14～16 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 8～12μM，A83-01 200～350 nM，SB202190 12～18 nM、胎牛血清5%～15%和FGF 80～120 ng/mL。
可选地，在传代培养液中，复合生长因子包括human EGF 80 ng/mL，HEPES 12 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1.5 mM，青霉素-链霉素 0.75x，Primocin1 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin15 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 10 μM，A83-01 300 nM，SB202190 15 nM、胎牛血清10%和FGF 100 ng/mL。
本公开实施例还提供一种骨肉瘤类器官培养试剂组合，包括酶解液和前述任一实施例的骨肉瘤类器官培养液；以及前述任一实施例的骨肉瘤类器官培养液中的第一完全培养基和第二完全培养基。其中，酶解液包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1～2 mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.5～2.5；Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL。
本公开实施例的骨肉瘤类器官培养试剂组合是套装试剂，各试剂为独立包装。利用酶解液进行酶解，能够缩短酶解时间，获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；然后利用本公开实施例的骨肉瘤类器官培养液对骨肉瘤肿瘤样本进行培养，能够加快骨肉瘤类器官细胞的生长，提高培养速度。
在一些实施例中，酶解液中，基础培养基采用与骨肉瘤类器官培养液一致的基础培养基，Advanced DMEM/F12。
在一些实施例中，酶解液，包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1.2～1.8mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.8～2.2；Primocin的浓度为0.5～1.5 mg/mL。
可选地，酶解液，包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1.5 mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕2；Primocin的浓度为1 mg/mL。
本公开实施例的培养试剂组合中，酶解液与骨肉瘤类器官培养液的比例不限定，依据培养过程的实际需求确定。
本公开实施例还提供一种骨肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
S110、将骨肉瘤样本进行物理预处理，得到2～4 mm样本组织碎块。
本步骤S110中，物理预处理包括清洗和破碎等物理处理方式。可选地，物理预处理，包括步骤S111、将骨肉瘤肿瘤样本采用含5%双抗（青霉素-链霉素）的PBS缓冲液清洗后，将样本组织转移至金属网筛上中，然后将金属网筛放置于离心管内，其中，金属网筛的筛面适配于离心管的截面并可卡止于离心管内，使金属网筛距离离心管管底具有预设距离；且离心管内盛装有类器官清洗液（例如，Advanced DMEM/F12+1%双抗）；金属网筛的筛孔孔径为2～4mm；S112、利用带有橡胶柱头的推杆均匀挤压和研磨样本组织，使其通过金属网筛并分散于类器官清洗液，从而破碎为相对均一的样本组织碎块。这里，清洗次数和清洗方式不限定，达到充分清洗目的即可，例如，清洗方式为震荡清洗，清洗次数为5次。该物理预处理操作保证了骨肉瘤样本破碎的均匀性，且保证碎块尺寸在2～4 mm范围内，进一步提高了原代培养的成功率和培养时间。可以理解的是，碎块尺寸是指碎块的最大宽度。
S120、将样本组织碎块转移至离心管中，采用前述的骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液进行摇床孵育，孵育30～60min；孵育完成后，将酶解混合液过滤得滤过液，将该滤过液离心处理，获得细胞沉淀。
本步骤S120中，酶解预处理采用前述的骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液。具体地，向离心管内的样本组织碎块（固液混合物）加入前述的骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液，在37℃摇床上孵育30～60min后，加入酶解中止剂，中止酶解后，过滤，获取滤过液。其中，酶解中止剂可以采用4℃的Advanced DMEM/F12，加入量依据酶解液的加入量确定。其中，过滤采用100 μm细胞筛。
本步骤S120中，酶解液的加入量与样本大小相关。可选地，每1g样本加入5～10 mL酶解液。可选地，样本组织碎块的重量为0.5g时，酶解液的加入量为7mL。通过控制酶解液的加入量，进而可以控制酶解孵育时间。
可选地，酶解中止剂的加入体积与酶解液的加入体积的比例为1.5～3﹕1。可选地，比例为2﹕1。可选地，酶解液的加入量为7mL，酶解中止剂的加入量为14mL。
可选地，在加入酶解中止剂后，用移液枪进行充分吹打，中止酶解。
可选地，孵育条件包括：摇床频率200 r/min，孵育30～60min。可选地，孵育40～50min。
可选地，滤过液离心处理条件包括：离心力为300 g，离心时间为5 min。
S130、采用基质胶重悬步骤S120获得的细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将该凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固。
可选地，以每孔50μL的接种量将该凝胶接种于孔板中。孔板的孔数不限，例如，24孔板。
可选地，静置培养时间为15～40min。可选地，静置培养时间为15min～30min。可选地，静置培养时间为30min。
本步骤S130中，凝胶凝固的标准为竖直放置培养板凝胶不可自由流动即可。
S140、向培养孔内加入前述的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液进行培养，获得原代骨肉瘤类器官。
S150、将步骤S140获得的原代骨肉瘤类器官进行传代培养，传代培养过程中采用前述的骨肉瘤类器官培养液的传代培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为10～15天，获得相应代骨肉瘤类器官。
本公开实施例的培养方法中，操作简单，采用前述骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液进行酶解处理后，获得的细胞活性高，还可有效降低样本污染；采用原代培养液有利于在原代培养中纯化出骨肉瘤肿瘤细胞，促进了骨肉瘤类器官细胞的形成和生长，保证原代培养的成功率。然后利用传代培养液对骨肉瘤肿瘤样本进行培养，能够加快骨肉瘤类器官细胞的生长，提高培养速度。有效缩减类器官形成与生长时间，以及在传代培养时，培养10～15天即可达到传代要求，原代培养7～10天的骨肉瘤类器官即可进行传代，传代比例可达1﹕1.5至1﹕2，例如，可达1﹕1.5至1﹕1.8。在进行原代提取培养过程中，培养24 h后即可见大量骨肉瘤类器官形成，最大直径达50 μm以上，培养3～4天类器官直径即可达50～100μm，原代培养10天的骨肉瘤类器官直径达80 μm以上的占比多，且直径最大可达200μm。在传代培养过程中，培养10～15天类器官直径可达100～200 μm，传代周期稳定缩短。
在一些实施例中，一种骨肉瘤类器官的培养方法，还包括将步骤S140获得的骨肉瘤类器官进行冻存的步骤。具体冻存操作采用常规操作即可。
下面给出本公开实施例的具体实施例，以说明本公开实施例的效果。
实施例1骨肉瘤类器官培养液
一种骨肉瘤类器官培养液，包括原代培养液和传代培养液。
原代培养液包括条件培养基、基础培养基、复合生长因子。复合生长因子包括human EGF 80 ng/mL，HEPES 12 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine 1.5mM，青霉素-链霉素 1.8x，Primocin 1 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin 15 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 10 μM，A83-01 300 nM，SB202190 10 nM和胎牛血清10%；条件培养基为R-spondin1条件培养基，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。
传代培养液包括条件培养基、基础培养基、复合生长因子。复合生长因子包括human EGF 80 ng/mL，HEPES 12 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1.5mM，青霉素-链霉素 0.75x，Primocin 1 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin15 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 10 μM，A83-01 300 nM，SB202190 10 nM，胎牛血清10%和FGF 100 ng/mL。条件培养基包括R-spondin1条件培养基和辅助蛋白条件培养基，且辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基（Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1:1），其中，R-spondin1条件培养基与辅助蛋白培养基的体积比为1﹕0.5～2，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。
表1-1和表1-2给出了原代培养液和传代培养液中R-spondin1条件培养基、辅助蛋白条件培养基和基础培养基的不同体积用量的具体实例；其中，单位为体积份，VR-spondin1为R-spondin1条件培养基的体积份数，V辅助蛋白为辅助蛋白条件培养基的体积份数，V基础为基础培养基的体积份数，体积占比为R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的占比，体积比1为R-spondin1条件培养基与辅助蛋白条件培养基的体积比，体积比2为条件培养基与基础培养基的体积比。
表1-1 原代培养液
表1-2 传代培养液
本实施例1中原代培养液Ⅰ和传代培养液Ⅰ组成骨肉瘤类器官培养液Ⅰ（简记为培养液Ⅰ），原代培养液Ⅰ和传代培养液Ⅰa组成骨肉瘤类器官培养液Ⅰa（简记为培养液Ⅰa），依此类推，组成培养液Ⅱ/培养液Ⅲ、培养液Ⅲa、培养液Ⅲb、培养液Ⅳ至培养液Ⅳa。
本实施例1的骨肉瘤类器官培养液，将各成分按比例用量混合即可。除了条件培养基自行制备获取外，其余成分均可采用市售产品。
本实施例1的骨肉瘤类器官培养液适用于人源骨肉瘤类器官培养液。
本实施例1中，条件培养基中包括的三种蛋白条件培养基，均可采用常规方法获得（参见后面相关内容）。在此不再赘述。
表1-1和表1-2中给出的对比液A是分别在原代培养液Ⅲ和传代培养液Ⅲa的基础上省略R-spondin1条件培养基，并用基础培养基进行补足获得的。原代培养液的对比液A和传代培养液的对比液A组成了对比培养液A。同理，可以获得其他原代培养液Ⅰ至原代培养液Ⅳ对应的原代对比液，其他传代培养液的Ⅰ至传代培养液Ⅳa对应的传代对比液，从而组成相应的对比培养液。
实施例2
本实施例2的骨肉瘤类器官培养液与实施例1不同的是，改变复合生长因子中各因子的用量，以获得不同生长因子用量的培养液，参见下表2所示。
表2
即，本实施例2中，获得培养液Ⅰ-1、培养液Ⅰ-2、培养液Ⅰ-3、培养液Ⅰ-4和培养液Ⅰ-5，依此类推，获得培养液Ⅰa-1至培养液Ⅰa-5，培养液Ⅱ-1至培养液Ⅱ-5，直至培培养液Ⅳa-1至培养液Ⅳa -5。表2中是将原代培养液和传代培养液中的所有生长因子列出，在确定具体的培养液时，根据原代培养液和传代培养液各自生长因子的区别确定对应的生长因子及用量即可。其中，青霉素-链霉素（原代）是指原代培养液中青霉素-链霉素对应的用量，青霉素-链霉素（传代）是指传代培养液中青霉素-链霉素对应的用量。
本实施例2中，给出了如下表3所示的以复合生长因子1为例的对比生长因子的对比1a至对比1g，表3中未列出的生长因子均与表2中的复合生长因子1相同。
表3
其中，表3中的对比1a是表2的培养液的复合生长因子1中省略了胎牛血清，对比1b是省略了FGF，对比1c是省略了胎牛血清和FGF，同理类推对比1d至对比1g即可。可以理解的是，对比培养液Ⅰ-1a是指在培养液Ⅰ-1的基础上省略了胎牛血清获得的，对比培养液Ⅰ-1b是指在培养液Ⅰ-1的基础上省略了FGF获得的，同理类推获得对比培养液Ⅰ-1c至对比培养液Ⅰ-1g。同理，可以获得对比培养液Ⅰ-2a至对比培养液Ⅰ-2g。等等。
此外，实施例1中的对比培养液A的基础上，再分别结合对比1a至对比1g，获得对比培养液A-1a（省略了R-spondin1和胎牛血清）至对比培养液A-1g（省略了R-spondin1且提高A83-01的用量）。
实施例3 骨肉瘤类器官培养试剂组合
一种骨肉瘤类器官培养试剂组合，包括酶解液和实施例1或实施例2的骨肉瘤类器官培养液，以及第一完全培养基、第二完全培养基和第三完全培养基。其中，酶解液包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1～2mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.5～2.5；Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL。骨肉瘤类器官培养液、酶解液、第一完全培养基和第二完全培养基各自独立包装。
本实施例3中，酶解液中的基础培养基为Advanced DMEM/F12。第一完全培养基包括Advanced DMEM/F12、10%FBS和1% P/S，第二完全培养基包括Advanced DMEM/F12、10%FBS、1% P/S和5 μg/mL的Puromycin。
根据Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin的浓度不同，分别获得如下表4所示的五种酶解液。
表4
本实施例3中，酶解液按各组分的用量混合即可。
实施例4
一种骨肉瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
S201、物理预处理：将骨肉瘤肿瘤样本（例如，重量为0.5g）采用组织液（含5%双抗（青霉素-链霉素）的PBS缓冲液）清洗后，将样本组织转移至金属网筛上（保证无菌操作），然后将金属网筛放置于离心管（例如，50mL容积的离心管）内，其中，金属网筛的筛面适配于离心管的截面并可卡止于离心管内，使金属网筛距离离心管管底具有预设距离；且离心管内盛装有类器官清洗液（例如，1mL的Advanced DMEM/F12+1%双抗）；金属网筛的筛孔孔径为2～4mm；然后，利用带有橡胶柱头的推杆均匀挤压和研磨样本组织，使其通过金属网筛并分散于类器官清洗液，从而破碎为相对均一的样本组织碎块；其中，橡胶柱头适配于离心管的截面。
S202、将步骤S201获得的样本组织碎块转移至离心管中，并向离心管内加入实施例3骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液进行酶解预处理获得滤过液；将滤过液离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得细胞沉淀。其中，酶解预处理具体包括以下步骤：向离心管内的样本组织碎块（固液混合物）加入7mL酶解液，在37℃摇床（200 r/min）上孵育30～60min后，加入14mL酶解中止剂（4℃的Advanced DMEM/F12），用移液枪进行充分吹打，中止酶解，采用100 μm细胞筛进行过滤，获取滤过液。
S203、采用基质胶重悬步骤S202获得的细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50μL的接种量将该凝胶接种24孔板的培养孔中，再静置培养30min，使得该凝胶凝固。
S204、向培养孔内加入实施例1或者实施例2的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液进行培养，获得原代骨肉瘤类器官（记为P0代类器官）。本步骤S204中，培养24h后可见骨肉瘤类器官形成，且骨肉瘤类器官的最大直径达50μm以上，且原代培养7～10天即可以进行传代。
S205、将步骤S204获得的原代骨肉瘤类器官（P0代类器官）进行传代培养，在传代培养过程中采用实施例1或实施例2的骨肉瘤类器官培养液的传代培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为10～15天，获得相应代骨肉瘤类器官。
本实施例4中，原代培养3天的骨肉瘤类器官即可进行传代，传代比例可为1﹕1.5至1﹕1.8。可以稳定长期进行骨肉瘤类器官的传代培养，传代周期10～15天。
本实施例4中，对步骤S202中采用实施例3中的酶解液Ⅱ进行酶解处理，并在步骤S204中具体采用实施例1的培养液Ⅲa的原代培养液Ⅲ进行原代培养24h后的骨肉瘤类器官进行检测，获得如图1所示的光镜图。可见，培养24h的骨肉瘤类器官中细胞数量多，且具有直径达50μm左右的细胞，以及如图2a和图2b所示的分别原代培养3天和10天的骨肉瘤类器官的光镜图，可见，在原代培养10天时，200 μm直径以上的类器官数量增多，且类器官直径达80 μm以上的占比多，可见，原代培养10天时可以进行传代。进一步地，在步骤S205中采用培养液Ⅲa的传代培养液Ⅲa进行传代培养，如图3a和3b所示的第一代传代培养（P1）3天和10天的类器官的光镜图，可见，类器官形态好，长势良好，生长直径最大近200 μm，且视野内大直径类器官比例高。
本实施例4中，对步骤S202中采用实施例3中的酶解液Ⅱ进行酶解处理，并在步骤S204中具体采用实施例1的培养液Ⅳ的原代培养液Ⅳ进行原代培养，如图2c和图2d所示的分别原代培养3天和10天的骨肉瘤类器官的光镜图，可见，200 μm直径以上的类器官数量多，且类器官直径达80 μm以上的占比多，且原代培养10天时即可以进行传代。进一步地，在步骤S205中采用培养液Ⅳ的传代培养液Ⅳ进行传代培养，如图3c和3d所示的第一代传代培养（P1）3天和10天的类器官的光镜图，可见，类器官形态好，长势良好，生长直径最大近200μm，且视野内大直径类器官比例高。
本实施例4中传代培养方法可以采用常规培养方法，也可以采用实施例6的传代培养方法，培养结果一致。
本实施例4中，步骤S202中，分别采用实施例3中的酶解液Ⅰ至酶解液Ⅴ以及对比酶解液Ⅰ和对比酶解液Ⅱ进行酶解预处理，各酶解液所对应的孵育时间如下表5所示。
表5
可见，采用实施例3的酶解液Ⅱ进行酶解能够明显缩短降解孵育时间，具有更短的酶解时间。而采用酶解液对比Ⅰ和酶解液对比Ⅱ的进行酶解时，降解孵育时间明显延长，可见，Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型胶原酶能够协同作用，对骨肉瘤样本起到更好的降解作用。
同时，对酶解后的骨肉瘤样本的细胞进行了台盼蓝染色，如图4所示的采用实施例3的酶解液Ⅱ酶解预处理骨肉瘤肿瘤样本组织碎块的细胞的台盼蓝染色图，可见，酶解效果好，且细胞具有很好的活性。
实施例5
本实施例5的一种骨肉瘤类器官的培养方法，与实施例4不同的是，步骤S201的物理预处理采用如下方法进行：
将骨肉瘤肿瘤样本（例如，重量为0.5g）采用含5%双抗（青霉素-链霉素）的PBS缓冲液震荡清洗5次后，将样本组织转移至培养皿（例如，60mm培养皿）中，然后用眼科剪剪碎至2～4mm组织碎块，获得样本组织碎块。并将组织碎块转移至离心管中。其余操作步骤和操作参数均相同。
即实施例4和实施例5采用不同的物理预处理获得样本组织碎块后，通过后续相同的培养步骤进行培养。经比较，实施例4中采用的物理预处理方法能够提高成功培养获得原代骨肉瘤类器官的成功率，培养成功率能够达到80%以上。而实施例5的物理预处理方法的原代骨肉瘤类器官的成功率仅在60%左右。这里的培养成功率是指培养24h后可见骨肉瘤类器官形成，且骨肉瘤类器官的最大直径达50μm以上，且原代培养3天即可以进行传代。
本实施例5中，对步骤S202中采用实施例3中的酶解液Ⅱ进行酶解处理，并在步骤S204中具体采用实施例1的培养液Ⅲa（或者培养液Ⅲ）的原代培养液Ⅲ进行原代培养24h后的骨肉瘤类器官进行检测，获得如图5a所示的光镜图。可见，培养24h的骨肉瘤类器官还未形成直径大于30μm以上的类器官，且通过定期观察，发现原代培养第10天时，才逐步形成类器官，如图5b所示的原代培养10天的骨肉瘤类器官的光镜图，可见，骨肉瘤类器官的直径经由少量能够达到100μm左右，大部分细胞直径在50μm～80μm范围内。
实施例6
本实施例6是在实施例4或5培养获得的原代骨肉瘤类器官（P0代类器官）进行传代处理。具体地，骨肉瘤类器官传代处理包括以下步骤：
S301、对实施例4或实施例5中基质胶包埋的原代骨肉瘤类器官，每孔使用1 mL 4℃ Advanced DMEM/F12培养基吹散，回收于离心管中，离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得基质胶与细胞混合沉淀。
S302、将获得的沉淀采用TrypLE（Gibco）重悬获得重悬液；将该重悬液置于37℃水浴8～10 min；然后向重悬液中加入两倍体积的4℃的Advanced DMEM/F12培养基中止消化，用移液枪反复吹打数次。离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得二次细胞沉淀。
其中，TrypLE的使用量以包埋类器官的基质胶量为准，理论上每100 μL基质胶包埋的类器官使用1 mL TrypLE进行重悬。
其中，中止消化后使用移液枪反复吹打情况与类器官的消化程度直接相关。使用1mL移液枪吹打10-20次，然后用1 mL移液枪头套200 μL移液枪头再次吹打10-20次，可以将所有类器官消化为均一大小的细胞团，一般的，细胞团中含2-10个细胞。
S303、用Advanced DMEM/F12重悬二次细胞沉淀，吹打均匀，离心处理（离心力为300 g，离心时间为5 min），获得三次细胞沉淀。若杂质较多，可重复此步骤。
S304、采用基质胶重悬三次细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后以每孔50 μL的接种量将该凝胶接种24孔板中，37℃培养箱孵育30 min，使得该凝胶凝固。
S305、向凝固后的类器官培养孔中加入实施例1或实施例2中的传代培养液进行传代培养，获得P1代类器官。
本实施例6中，依据实际需要将传代培养获得的Pn代类器官，重复步骤S301至S305，从而获得Pn+1代类器官。其中，n为大于或等于1的整数。
对比例1
与实施例4的骨肉瘤类器官的培养方法不同的是，在采用培养液Ⅲa （同培养液Ⅲa-1）的基础上，步骤204的原代培养采用原代培养液Ⅲ进行原代培养7天，获得原代骨肉瘤类器官。步骤S205中，在传代培养过程中分别采用对比培养液A-1a（省略了R-spondin1和胎牛血清）、对比培养液Ⅲa-1a（省略了胎牛血清）、对比培养液Ⅲa -1b（省略FGF）、对比培养液Ⅲa -1c（省略胎牛血清和和FGF）、对比培养液Ⅲa -1d（省略SB202190和FGF）、对比培养液Ⅲa -1e（省略SB202190和胎牛血清）、对比培养液Ⅲa -1f（提高SB202190的用量）和对比培养液Ⅲa -1g（提高培养液Ⅲa中A83-01的用量）中的传代培养液进行传代培养。其他步骤及参数均与实施例4相同。
如图6a-6h所示，依次分别为采用对比培养液A-1a、对比培养液Ⅲa-1a、对比培养液Ⅲa-1b、对比培养液Ⅲa-1c、对比培养液Ⅲa-1d、对比培养液Ⅲa-1e、对比培养液Ⅲa-1f和对比培养液Ⅲa-1g中的传代培养液进行传代培养10天的骨肉瘤类器官的图片，可见，骨肉瘤类器官的大小仍然达不到实施例4中图3a和图3b的骨肉瘤类器官，类器官数量少，且小类器官比例高。经过比对分析，对比培养液A-1a、Ⅲa -1c最差，主要原因是R-spondin1是类器官形成的关键因子，血清和FGF是骨肉瘤类器官增殖的关键因子，对比培养液Ⅲa-1a、Ⅲa-1b、Ⅲa -1d、Ⅲa -1f较差，虽有类器官形成，但是增殖速度缓慢，形成率较低，主要原因是FGF和血清对骨肉瘤类器官的增殖影响，SB202190对类器官的稳定性有着重要作用，对比培养液Ⅲa -1g略差，主要体现在类器官数量较少，形态略差，主要原因是A8301对类器官稳定性有着重要作用。
对比例2
与实施例4的骨肉瘤类器官的培养方法不同的是，分别采用对比培养液A（省略R-spondin1条件培养基）的原代培养液和传代培养液分别进行步骤S204的原代培养和步骤S205的传代培养。其他步骤及参数均与实施例4相同。
如图7a所示，为采用对比培养液A中的原代培养液进行原代培养3天时骨肉瘤类器官的图片；可见，原代培养液中缺少了R-spondin1条件培养基的情况下，很难形成类器官，且形成数量少。而接下来采用对比培养液A的传代培养液进行传代培养时，传代培养更为困难。如图7b所示，为传代培养10天后的骨肉瘤类器官的图片，形成的类器官形态差，且尺寸小，不均一等。
经合理分析可知，在对比培养液A省略了R-spondin1条件培养基的基础上，若采用其他对比培养液，例如对比培养液A-1a（省略R-spondin1条件培养基和胎牛血清）、对比培养液A-1b（省略R-spondin1条件培养基和FGF）直至对比培养液A-1g（省略R-spondin1条件培养基并提高对比培养液A中A83-01的用量）的原代培养液和传代培养液进行原代培养和传代培养的情况下，原代培养会更加形成类器官，甚至会无法形成类器官，导致无法进行传代培养。例如，如图8a所示的采用对比培养液A-1g的原代培养液原代培养10天的骨肉瘤类器官的图片，未观察到类器官的形成，根本无法进行传代培养，可见，A83-01的用量对类器的形成起到关键作用。以及如图8b所示的采用对比培养液Ⅲa -1f的原代培养液原代培养10天的骨肉瘤类器官的图片，也未观察到类器官的形成，根本无法进行传代培养，可见，SB202190的用量对类器的形成也起到关键作用。
通过该对比例2可知，本公开实施例的培养液作为一个有机整体，组分及各自的用量均是关键因子，对骨肉瘤的成功培养和培养效果起到协同作用。
对比例3
与实施例4不同的是，步骤204中，向培养孔内加入实施例1的培养液Ⅲa的传代培养液Ⅲa进行原代培养；步骤S205中，传代培养液采用实施例1的培养液Ⅲa的传代培养液Ⅲa。其余步骤及参数均与实施例4相同。
图9为对比例3中采用培养液Ⅲa的传代培养液Ⅲa进行原代培养10天的骨肉瘤类器官（记为P0-对比Ⅲa）的图片。图10a和图10b分别为对比例3中采用培养液Ⅲa的传代培养液Ⅲa进行传代培养3天和10天的骨肉瘤类器官（记为P1-对比Ⅲa和P1＇-对比Ⅲa）的图片。将图9与图2b进行比对可见，P0-对比Ⅲa的类器官形态略差于图2b所示的实施例4中采用培养液Ⅲa的原代培养液Ⅲ进行原代培养10天获得的类器官的形态。而将图10a和图10b分别对应与图3a和图3b进行比对分析，可见，图3b中骨肉瘤类器官中肿瘤细胞尺寸更大，大尺寸肿瘤细胞更多，说明，经P1传代后，纯化后的类器官生长的更快。
本公开实施例中，对实施例4中获得的原代骨肉瘤类器官，采用实施例6中的传代方法，进行传代培养，并进行至9次传代，获得第10代骨肉瘤类器官。其中，实施例4中采用实施例3的酶解液Ⅲ酶解预处理后，实施例4中的原代培养以及实施例6中的传代培养中均采用实施例1的培养液Ⅲ。对每次传代培养10天后获得的骨肉瘤类器官进行了鉴定。鉴定方法为：将骨肉瘤肿瘤组织样本和该样本形成的类器官进行多聚甲醛固定和石蜡包埋，对石蜡包埋切片进行免疫组化染色，共表征了HE、Vimentin、SATB2、Ki67四项指标。
如图11所示的由骨肉瘤肿瘤组织样本培养获得的第10代骨肉瘤类器官免疫组化结果，如图12所示的实施例4中进行原代骨肉瘤类器官培养用的骨肉瘤肿瘤组织样本（即同源骨肉瘤组织）的免疫组化结果图。可见，第10代骨肉瘤类器官与同源肿瘤组织的特征性蛋白marker表达的一致性。
本公开实施例中，在不做特殊说明时，涉及百分比浓度时均为体积百分比浓度。
本公开实施例的实施例4至实施例6，以及对比例1至对比例3中，提供的是骨肉瘤组织的相关实验结果。
而且，本公开实施例还采用实施例1和实施例2的其他培养液对骨肉瘤组织进行培养，培养获得的骨肉瘤类器官的检测分析结果与采用培养液Ⅲ培养获得的骨肉瘤类器官的检测分析结果一致，在此不再赘述。
此外，本公开实施例公开了一种条件培养基的获取方法，包括：
S401、复苏目的细胞系，并使用第一完全培养基进行培养。第一完全培养基采用Advanced DMEM/F12+10%FBS（胎牛血清）+1% P/S（双抗（青霉素加链霉素））。目的细胞系为目的蛋白过表达细胞株，通过慢病毒转染方式，向CHO细胞系中转入目的基因，实现特定蛋白的过表达。目的蛋白包括Wnt-3a、R-spondin1和Noggin。
S402、在初次培养至细胞汇合度达90%后，传代到10cm培养皿，然后使用第二完全培养基进行一次筛选培养2-3天；在细胞汇合度达90%后，传代至新10cm培养皿，然后使用第二完全培养基进行二次筛选培养2～3天。其中，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin，且控制其浓度为5 μg/mL。
S403、在二次筛选培养至细胞汇合度达90%后，用胰酶消化传代至T175透气培养瓶，每瓶透气培养瓶中控制总培养基30 mL；采用第一完全培养基（同步骤S101）继续培养至细胞汇合度达95%～100%，期间2天或者3天换液一次；然后去除培养基，用10mLPBS震荡清洗一遍，每瓶加入新配制的第一完全培养基，孵育培养。
S404、在孵育培养阶段中，每孵育24小时收取一次培养基，并将培养基在4℃下离心处理（离心力为2000 g，离心时间为5 min），将上清液转移至500mL无菌瓶，并置于4℃下存储，依据收取时间顺序对应获得第一次条件培养基至第十二次条件培养基；其中，将第一次条件培养基至第四次条件培养基混合作为第一批次条件培养基；将第五次条件培养基至第八次条件培养基混合作为第二批次条件培养基；将第九次条件培养基至第十二次条件培养基混合作为第三批次条件培养基。且每批次条件培养基采用0.22μm真空过滤器。冻存条件为零下80℃。
S405、使用时，将冻存的第一批次条件培养基、第二批次条件培养基和第三批次条件培养基解冻后等体积比例混合，作为目的蛋白条件培养基。
采用上述蛋白条件培养基的制备方法，成本低。
当然，条件培养基的获取方法不限于上述步骤，只要相应阶段采用相应的培养基即可。
本公开实施例中，涉及类器官的光镜图中，图上所标示的标尺均是代表200μm。
以上描述和附图充分地示出了本公开的实施例，以使本领域的技术人员能够实践它们。其他实施例可以包括结构的以及其他的改变。实施例仅代表可能的变化。除非明确要求，否则单独的部件和功能是可选的，并且操作的顺序可以变化。一些实施例的部分和特征可以被包括在或替换其他实施例的部分和特征。本公开的实施例并不局限于上面已经描述并在附图中示出的结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (10)
1.一种骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，包括原代培养液和传代培养液；其中，原代培养液包括条件培养基、基础培养基和复合生长因子，所述复合生长因子包括human EGF40～100 ng/mL，HEPES 10～15 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine1～2mM，青霉素-链霉素 1.5x～2x，Primocin 0.2～2 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin10～20 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 5～15 μM， A83-01 100～500 nM，SB202190 10～20 nM和胎牛血清2%～15%；所述条件培养基为R-spondin1条件培养基，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%；
传代培养液是在原代培养液的基础上，复合生长因子还包括FGF 60～150 ng/mL，且青霉素-链霉素的含量为0.5x～1x；所述条件培养基还包括辅助蛋白条件培养基且所述辅助蛋白条件培养基包括Wnt-3a条件培养基和/或Noggin条件培养基，其中，R-spondin1条件培养基与辅助蛋白培养基的体积比为1﹕0.5～2，R-spondin1条件培养基的体积占条件培养基和基础培养基体积之和的20%～40%。
2.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，在传代培养液中，复合生长因子包括human EGF 80 ng/mL，HEPES 12 mM，Glutamax 1x，N2 1x，B27 1x，n-Acetylcysteine 1.5 mM，青霉素-链霉素 1x，Primocin 1 mg/mL，Niacinamide10 mM，Gastrin15 nM，Prostaglandin E2 1 μM，Y-27632 10 μM，A83-01 300 nM，SB202190 15nM、胎牛血清10%和FGF 100 ng/mL。
3.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，
在传代培养液中，R-spondin1条件培养基和辅助蛋白条件培养基的体积比例为1﹕0.8～1.5；且传代培养液中R-spondin1条件培养基体积与原代培养液中R-spondin1条件培养基体积相同。
4.根据权利要求3所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，
在传代培养液中，R-spondin1条件培养基和辅助蛋白条件培养基的体积比例为1﹕1。
5.根据权利要求1所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，辅助蛋白培养基包括Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基，且Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基的体积比为1:0.8～1.2。
6.根据权利要求1至5任一项所述的骨肉瘤类器官培养液，其特征在于，R-spondin1条件培养基、Wnt-3a条件培养基和Noggin条件培养基，各自通过初次培养和传代培养后，再进行收取培养获得；
其中，在初次培养中，采用第一完全培养基，第一完全培养基包括Advanced DMEM/F12，10%FBS和1% P/S；
在传代培养中，采用第二完全培养基，第二完全培养基是在第一完全培养基的基础上，加入Puromycin，且控制其浓度为5 μg/mL；
在收取培养中，采用第一完全培养基。
7.一种骨肉瘤类器官培养试剂组合，其特征在于，包括：酶解液和如权利要求1至6任一项所述的骨肉瘤类器官培养液；以及，权利要求6的骨肉瘤类器官培养液中的第一完全培养基和第二完全培养基；所述酶解液包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1～2 mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕1.5～2.5；Primocin的浓度为0.2～2 mg/mL。
8.根据权利要求7所述的骨肉瘤类器官培养试剂组合，其特征在于，所述酶解液包括基础培养基、Ⅳ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和Primocin；其中，Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的总浓度为1.5 mg/mL，且Ⅳ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶的质量比为1﹕2；Primocin的浓度为1 mg/mL。
9.一种骨肉瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括：
将骨肉瘤样本进行物理预处理，得到2～4 mm的样本组织碎块；
将样本组织碎块转移至离心管中，采用如权利要求7或8所述的骨肉瘤类器官培养试剂组合中的酶解液进行摇床孵育，孵育30～60min；孵育完成后，将酶解混合液过滤得滤过液，将所述滤过液离心处理，获得细胞沉淀；
采用基质胶重悬所述细胞沉淀，获得混有细胞的凝胶；然后将所述凝胶接种于培养孔，于37℃细胞培养箱静置培养，使得所述凝胶凝固；
向培养孔内加入如权利要求1至6中任一项所述的骨肉瘤类器官培养液的原代培养液进行培养，获得原代骨肉瘤类器官；
将所述原代骨肉瘤类器官进行传代培养，所述传代培养过程中采用如权利要求1至6中任一项所述的骨肉瘤类器官培养液的传代培养液进行培养，每次传代培养的培养周期为10～15天，获得相应代骨肉瘤类器官。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述物理预处理，包括：
将骨肉瘤肿瘤样本采组织液清洗后，将样本组织转移至金属网筛上，然后将金属网筛放置于离心管内，其中，金属网筛的筛面适配于离心管的截面并可卡止于离心管内，使金属网筛距离离心管管底具有预设距离；且离心管内盛装有类器官清洗液；金属网筛的筛孔孔径为2～4 mm；
利用带有橡胶柱头的推杆均匀挤压和研磨样本组织，使其通过金属网筛并分散于类器官清洗液，从而破碎为相对均一的样本组织碎块；其中，橡胶柱头适配于离心管的截面。
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