CN116286651A - 骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用 - Google Patents

骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用。将骨与软组织肉瘤组织样本置于改良的类器官培养基中，放入CO2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，两周内即可得到骨与软组织肉瘤类器官。本方法操作简便，显著提高类器官的存活率和数量，缩短了类器官培养时间。利用本方法可获得八种不同亚型的骨与软组织肉瘤类器官。本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行传代与低温储存，且保留了原肿瘤组织块的所有细胞类型，能够更加真实地模拟肿瘤微环境，提供更符合临床的药物敏感测试结果。本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行个性化的CAR‑T治疗评估，化疗药和靶向药的药敏检测以及个性化肿瘤疫苗的制备。

Description

骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，具体地说，涉及一种骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用。
背景技术
肉瘤是一种多发性恶性肿瘤，约占人类恶性肿瘤的1％。肉瘤生长在来源于胚胎中胚层的间充质组织，如肌肉、脂肪组织和骨骼。根据原代组织的表现，肉瘤可分为两类：第一类为软组织肉瘤，包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、未分化多形性肉瘤(UPS)，滑膜肉瘤(SS)和其他小儿肉瘤。第二类为骨肉瘤，包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤(GCTB)和尤文肉瘤(ES)。临床上，手术通常是肉瘤首选的治疗方法，其次是化疗，用于预防肿瘤转移和复发。尽管有这些治疗手段，肉瘤的临床治疗结果仍然不理想。其中，分子异质性与生物和临床多样性，导致了较差的临床治疗结果。因此，建立可靠的模型以反映肉瘤的分子特征和异质性并用于药物开发和个性化医疗非常重要。
传统的体外培养模型的建立需要大量资源，并且需要持续抑制成纤维细胞的生长，该过程不可避免地导致肿瘤在连续传代过程中逐渐丧失分子特征。患者来源的异种移植模型可以保留肿瘤环境的组成部分，但维护成本高，不适合大规模药物筛选。人工类器官系统可以呈现肿瘤表型和分子特征，已经被用于各种类型肿瘤类器官的构建，包括肠道、结直肠、肝、胰腺、前列腺、乳房、膀胱、卵巢和胃肠道肿瘤。然而，多数肿瘤类器官的构建方法利用的是肿瘤组织解离的单细胞，不含免疫或结缔组织元素，并且骨与软组织肉瘤(STBS)的类器官生物库目前尚未建立。
发明内容
本发明的目的是提供骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种骨与软组织肉瘤类器官的制备方法，包括以下步骤：
1)获取骨与软组织肉瘤组织样本，保存在组织保存液中；
2)将组织样本从组织保存液中取出，放置于无菌容器中，加入细胞培养基，将组织样本在细胞培养基中切碎，得到组织团块；
3)将切碎后的组织样本-细胞培养基悬液一并通过无菌滤网；
4)将滤网拦截的组织团块用类器官培养基冲洗至新的无菌容器中，加入类器官培养基，混匀；
5)加入低吸附培养皿中，放入CO2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，培养两周左右，得到骨与软组织肉瘤类器官。
步骤1)使用的组织保存液可以是
Figure BDA0004063716060000021
生物防腐培养基“即用型”。
步骤2)和3)所述的细胞培养基为含100μg/mL Normocin的DMEM/F12。
步骤4)所述的类器官培养基为含50％ L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺(nicotinamide)、1mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)、2v/v％不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01(分子式C25H19N5S)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素(Gastrin)、10μM SB-202190(分子式C20H14FN3O)和50ng/mL人表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基。
其中，所述L-WRN细胞培养基的制备方法包括：将1×106-5×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％ FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2条件下，培养L-WRN细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。
进一步地，L-WRN细胞是将R-spondin 3和noggin共表达载体转染到L-Wnt3A细胞获得的，该细胞是稳定的商品化细胞系，可以购自ATCC。该细胞在培养过程中将Wnt3A、R-spondin3和noggin因子分泌到培养基中。此法是获得包含Wnt3A、R-spondin3和noggin因子的经典方法。
前述的方法，步骤1)所述骨与软组织肉瘤组织来源于人类。
前述的方法，步骤1)所述骨与软组织肉瘤类型包括软组织肉瘤和骨肉瘤；
软组织肉瘤包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤和滑膜肉瘤等；
骨肉瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤等。
前述的方法，步骤2)所述组织团块的体积在0.5mm×0.5mm以下，优选0.1mm×0.1mm。
进一步地，步骤2)所述组织团块中包含肿瘤细胞、成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等。
前述的方法，步骤4)所述滤网的孔径优选100μm。
第二方面，本发明提供按照上述方法制备的骨与软组织肉瘤类器官。
所述的骨与软组织肉瘤类器官可进行剪切再培养进行传代。
所述的骨与软组织肉瘤类器官可在低温条件下(液氮)长期保存。
第三方面，本发明提供按照上述方法制备的骨与软组织肉瘤类器官的以下任一应用：
(1)用于药物筛选；
(2)用于CAR-T细胞治疗评估；
(3)用于化疗药和靶向药物药敏检测；
(4)用于个性化肿瘤疫苗的制备。
所述应用包括：将不同种类、浓度、组合的抗肿瘤药物作用于骨与软组织肉瘤类器官，并于一段时间后检测药物对骨与软组织肉瘤类器官的治疗效果、耐药等。
具体步骤如下：
①当骨与软组织肉瘤类器官用于CAR-T治疗评估
将骨与软组织肉瘤类器官与CAR-T细胞混合，共同培养。1-7天后测定肿瘤骨与软组织类器官体中肿瘤细胞的存活度、T细胞在类器官中的浸润程度和炎症因子分泌情况，获得CAR-T细胞治疗效果。
②当骨与软组织肉瘤类器官用于化疗药敏检测
将制备的骨与软组织肉瘤类器官通过与不同化疗药物种类、药物浓度与药物混合方式进行培养，3-21天后对骨与软组织肉瘤类器官的状态和活性进行考察，排序出最佳的化疗药物方案。
③当骨与软组织肉瘤类器官用于靶向药敏检测
将制备的骨与软组织肉瘤类肿瘤组织通过与不同药物种类和药物浓度的靶向药进行培养，3-21天后对肉瘤类器官的状态和活性进行考察，排序得出最佳的靶向药药物方案。
第四方面，本发明提供一种类器官培养基，其为含50％ L-WRN细胞培养基、1mMHEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2％(v/v)不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基。
其中，所述L-WRN细胞培养基的制备方法包括：将1×106-5×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％ FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2条件下，培养L-WRN细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明采用简单方法获得骨与软组织肉瘤类器官，操作简便，显著提高类器官的存活率和数量，大大缩短类器官培养的时间。并且使用本发明方法得到的骨与软组织肉瘤类器官进行高代次培养时，类器官增殖能力较高，形态良好。
(二)相比使用酶解的处理方式，类器官的首次传代时长一般为1-3周，并且获得的肿瘤类器官数量少，用酶解法处理组织的时间比较长，会降低类器官的活力。而本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官数量多，不会破坏类器官的活力。
(三)本发明可获得至少八种不同亚型的骨与软组织肉瘤类器官：脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤等。
(四)本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官保留了原肿瘤组织块的所有细胞类型，能够更加真实的模拟肿瘤微环境，提供更符合临床的药物敏感测试结果。
(五)本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行传代和低温储存。
(六)本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行个性化的CAR-T治疗评估，化疗药和靶向药的药敏检测。
(七)通过骨与软组织肉瘤类器官的药敏实验与临床情况比对，本发明筛选出的药物与得到有效治疗的病患用药相符。本发明可以在未来提供有效的个性化药物选择，免除病患以身试药的痛苦、风险与经济损失。
附图说明
图1为本发明涉及的A83-01和SB-202190的结构。
图2为本发明较佳实施例中病人肿瘤组织块剪切前后的碎片。
图3为本发明较佳实施例中培养的八种亚型骨与软组织肉瘤类器官统计图(a)以及培养八种亚型骨与软组织肉瘤类器官的显微镜照片(b)。
图4为本发明较佳实施例中纤维肉瘤组织块和对应类器官的单细胞测序的细胞类型统计结果。
图5为本发明较佳实施例中骨肉瘤组织块和对应类器官的单细胞测序的细胞类型统计结果。
图6为本发明较佳实施例中类器官(a)、传代后类器官(b)和冻存后复苏的类器官(c)显微照片。
图7为本发明较佳实施例中使用骨与软组织类器官进行五种化疗药敏测试结果；其中，a～d分别表示纤维肉瘤、低度恶性纤维肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤和骨巨细胞瘤四种类器官分别与异环磷酰胺(IFO)、长春新碱(VCR)、阿霉素(DOX)、甲氨蝶呤(MTX)和卡铂(CBP)五种化疗药物孵育时形态和尺寸的变化。
图8为本发明较佳实施例中CAR-T细胞构建验证结果；其中，a表示包含GD2或CD19scFv、CD28跨膜组成区域和CD3ζ内域序列的GD2 CAR或CD19 CAR结构；b表示RT-qPCR检测GD2-CAR T细胞或CD19-CAR T细胞中的CAR基因表达水平；c表示蛋白印迹的方法检测GD2-CAR T细胞或CD19-CAR T细胞中的CAR蛋白翻译水平。
图9为本发明较佳实施例中使用骨与软组织肉瘤类器官对CAR-T细胞的敏感性测试结果；其中，a-b表示类器官(SO-2和SO-31)与GD2-CAR T细胞或CD19-CAR T细胞孵育一天、两天和三天后GD2的表达情况流式图和统计结果；c表示类器官(SO-2和SO-31)与GD2-CART细胞或CD19-CAR T细胞孵育一天、两天和三天后类器官及其表面形态变化；d表示类器官(SO-2和SO-31)与GD2-CAR T细胞或CD19-CAR T细胞孵育一天、两天和三天时培养基上清中的IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌水平；e和f表示类器官(SO-2和SO-31)与GD2-CAR T细胞或CD19-CAR T细胞孵育三天后免疫荧光结果及CD3和CC3信号强度统计结果(CD3:T细胞标志物；DAPI：细胞核染料；CC3:cleaved caspase 3)。
图10为本发明较佳实施例中个性化肿瘤疫苗制备的结果。其中，a为PLGA纳米颗粒的透射电子显微镜图；b为包覆类器官细胞膜的PLGA纳米颗粒的透射电子显微镜图，即个性化肿瘤疫苗的透射电子显微镜图。
图11为本发明较佳实施例中优化类器官培养基成分时尤文肉瘤类器官(SO-2)随时间的形态和尺寸变化图。
具体实施方式
本发明提供一种利用临床肿瘤组织制备STBS类器官的策略，无需单细胞解离，两周内即可建立。本发明涵盖八种典型的STBS类器官亚型，这些类器官均可传代培养和低温储存。所建STBS类器官可用于化疗药敏测试，同时可用于优化化疗药物使用策略，减少潜在的毒副作用。单细胞转录组学分析证实，STBS类器官保留了大量的肿瘤微环境(TME)中细胞类型的异质性，包括免疫浸润细胞。我们发现STBS类器官或肿瘤中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)很少，这也是基于免疫检查点的免疫疗法导致不良临床结果的原因。基于此，我们使用了两种类型的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)来精确预测STBS类器官对CAR-T细胞的敏感性，为个性化肿瘤免疫治疗提供有效指导。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种骨与软组织肉瘤类器官的制备方法及应用。
所述类器官的制备方法如下：获取骨与软组织肉瘤组织样本，保存在组织保存液；将样本组织从保存液中取出，置于无菌容器中，加入细胞培养基，将样本组织在细胞培养基中切碎，得到组织团块；将切碎后的样本组织-细胞培养基悬液一并通过无菌滤网；将滤网拦截的组织团块用类器官培养基冲洗至新的无菌容器，加入类器官培养基，混匀；加入低吸附培养皿中，放入CO2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，两周内即可得到骨与软组织肉瘤类器官。
本发明的骨与软组织肉瘤类器官制备方法操作简便，显著提高类器官的存活率和数量，大大缩短类器官培养的时间。
使用本发明方法可以得到八种不同亚型的骨与软组织肉瘤类器官：脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤等。
本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可以进行传代与低温储存，且保留了原肿瘤组织块的所有细胞类型，能够更加真实地模拟肿瘤微环境，提供更符合临床的药物敏感测试结果。
本发明获得的骨与软组织肉瘤类器官可进行个性化的CAR-T治疗评估，化疗药和靶向药的药敏检测。
具体地，骨与软组织肉瘤类器官制备方法，包括如下步骤：
1)获取骨与软组织肉瘤组织样本，保存在组织保存液中；
2)将样本组织从保存液中取出，放置于无菌容器中，加入细胞培养基，将样本组织在细胞培养基中切碎，得到组织团块；
3)将切碎后的样本组织-细胞培养基悬液一并通过无菌滤网；
4)将滤网拦截的组织团块用类器官培养基冲洗至新的无菌容器，加入类器官培养基，混匀；
5)加入低吸附培养皿中，放入CO2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，两周内即可得到骨与软组织肉瘤类器官。
所述步骤1)中骨与软组织肉瘤组织来源于人类。
所述步骤1)中骨与软组织肉瘤类型包括软组织肉瘤和骨肉瘤，软组织肉瘤包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤和滑膜肉瘤等，骨肉瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤等。
所述步骤2)中组织团块体积在0.5mm×0.5mm以下，最优体积为0.1mm×0.1mm。
所述步骤2)中组织团块中包含肿瘤细胞、成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等。
所述步骤4)中滤网的孔径为100μm。
所述步骤2)和3)中的细胞培养基为DMEM/F12，含100μg/mL Normocin。
所述步骤4)中类器官培养基配方如下：
基础培养基：DMEM/F12；
添加物：50％ L-WRN细胞培养基(DMEM/F12，含Wnt3a、RSPO1和noggin)，1mMHEPES,1×Glutamax,10mM nicotinamide,1mM N-acetylcysteine,1×B-27(不含维生素A),0.5μM A83-01,1×Pen-Strep Glutamine,10nM Gastrin,10μM SB-202190和50ng/mLEGF。
所述L-WRN细胞培养基为使用DMEM/F12培养L-WRN细胞3-7天后收取的培养基。具体步骤为：将1×106-5×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％ FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％ CO2条件下，培养L-WRN细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。
本发明提供按照上述方法制备的可传代和低温储存的骨与软组织肉瘤类器官。
所述骨与软组织肉瘤类器官保留了原肿瘤组织中的细胞类型，包含肿瘤细胞、成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等。
所述骨与软组织肉瘤类器官可进行剪切再培养进行传代。
所述骨与软组织肉瘤类器官可在液氮中长时间保存。
本发明还提供所述骨与软组织肉瘤类器官在药物筛选中的用途。
所述用途包括但不限于CAR-T治疗评估、化疗药和靶向药物药敏检测。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及的DMEM/F12培养基购自Gbico；B-27、Glutamax、Pen-StrepGlutamine和EGF购自Invitrogen；Normocin、Gastrin和SB-202190购自Sigma，A83-01购自Tocris。
A83-01和SB-202190的结构见图1。
实施例1纤维肉瘤的培养方法
1、获取病人的纤维肉瘤组织样本，保存在组织保存液中。
2、将样本组织从保存液中取出，放置于10cm培养皿中，加入含100μg/mL Normocin的DMEM/F12细胞培养基中，将样本组织在细胞培养基中切碎至，得到大小0.1mm×0.1mm左右的组织团块，见图2。
3、将切碎后的样本组织-细胞培养基混悬液一并通过100μm的无菌滤网。
4、将滤网拦截的组织团块用类器官培养基冲洗至新的无菌容器，加入类器官培养基，混匀。
类器官培养基：含50％ L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2％体积的不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基。
其中，所述L-WRN细胞培养基的制备方法包括：将2×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％ FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％ CO2条件下，培养L-WRN细胞5天后，收取培养基，培养期间无需换液。
5、加入低吸附培养皿中，放入CO2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，两周内即可得到纤维肉瘤类器官。
该方法可得到八种不同类型的肉瘤类器官(图3a)，脂肪肉瘤(liposarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、多形性未分化肉瘤(undifferentiated pleomorphic sarcoma,UPS)和滑膜肉瘤(synovial sarcoma，SS)、骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone,GCTB)和尤文肉瘤(Ewingsarcoma,ES)等，类器官形貌见图3b。
实施例2纤维肉瘤的肿瘤组织和对应类器官的细胞类型比对
通过对纤维肉瘤的肿瘤组织和培养出的类器官进行单细胞测序，测序结果表明，病人来源的纤维肉瘤和培养出的纤维肉瘤类器官包含同样的细胞类型，细胞类型如下：平滑肌细胞(smooth muscle cells)，成纤维细胞活化蛋白阳性癌症相关成纤维细胞(fibroblast activation protein positive cancer-associated fibroblasts)，表达FAP的癌症相关成纤维细胞(FAP-CAFs)，肌成纤维细胞(myofibroblasts)，自然杀伤细胞(natural killer cells)，内皮细胞(endothelial cells)，巨噬细胞(macrophages)和间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells)，统计结果见图4。
实施例3骨肉瘤的肿瘤组织和对应类器官的细胞类型比对
通过对骨肉瘤的肿瘤组织和培养出的类器官进行单细胞测序，测序结果表明，病人来源的骨肉瘤组织块和培养出的骨肉瘤类器官包含同样的细胞类型，细胞类型如下：成骨细胞(osteoblasts),成纤维细胞(fibroblasts),间充质细胞(mesenchymal cells),增殖成骨细胞(proliferating osteoblasts),巨噬细胞(macrophages),内皮细胞(endothelial cells),上皮细胞(epithelial cells)和自然杀伤细胞(NK cells),统计结果见图5。
实施例4骨与软组织肉瘤类器官传代和低温保存状态检测
骨与软组织肉瘤类器官进行传代和低温保存后，保持高活力。传代后的类器官和液氮冻存半年的类器官进行复苏后都保持了较好的活力，类器官形态见图6(a～c)。
实施例5骨与软组织肉瘤类器官进行化疗药敏检测
分别将四种骨与软组织肉瘤(Fibrosarcoma,DFSP,GCTB和ES)类器官按照每孔20±5个的密度加入低吸附的24孔细胞培养板中，每孔300μl类器官培养基，每一种骨与软组织肉瘤均有五个复孔用于添加不同的化疗药物。接着向四种骨与软组织肉瘤中分别加入IFO、VCR、DOX、CBP和MTX五种化疗药物，使之终浓度分别为10μM、0.5μM、2μM、10μM和10μM。每七天对其进行显微镜观察拍照，记录不同药物对不同类型类器官的作用效果。统计结果见图7(a～d)。
实施例6使用类器官进行CAR-T效果评估
CD19-CAR-T、GD2-CAR-T的构建：两种CAR结构由GD2或CD19 scFv、CD28跨膜组成区域和CD3ζ内域序列(图8a)。这些CD19或GD2-CAR结构被克隆成慢病毒载体。使用Lipofectamine 3000(购自Invitrogen)共转染CAR载体和包装质粒生成慢病毒颗粒。在48h和72h收集含有慢病毒的上清液，随后在4℃下以50,000×g高速离心2h。重悬于冷PBS中，等分，储存于-80℃。通过Ficoll密度梯度离心从健康供体中分离外周血单核细胞，使用CD3磁珠(购自Miltenyi Biotec)进行分类收获T细胞，并用人T激活剂CD3/CD28免疫磁珠(购自赛默飞)刺激。将T细胞在补充有10％ FBS和100μg/mL青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基的培养基中培养，并用含慢病毒的载体编码转染CD19或GD2基因。使用前在含有100U/mL重组人IL-2(购自R&D)的ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基(购自StemCell Technologies)中培养CAR-T细胞7-10天。
在RNA水平上，qPCR结果证明了CD19-CAR-T和GD2-CAR-T中CAR基因的表达(图8b)；蛋白水平上，Western blot结果证明了CAR蛋白的翻译(图8c)。
选取高表达GD2(神经节苷脂，PUBCHEM CID为6450346)的类器官(实施例1构建的滑膜肉瘤类器官，编号为SO-31)来评估GD2-CAR-T的治疗效果，选取GD2低表达类器官(实施例1构建的尤文肉瘤类器官，编号为SO-2)作为对照，同时选取CD19-CAR-T细胞作为GD2-CAR-T的对照。在低吸附24孔板中将两种类器官分别与50000个CD19-CAR-T或GD2-CAR-T共孵育，培养基为ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基。在CO2培养箱中，37℃培养。在第0、1、2或3天进行流式检测，结果见图9(a和b)，GD2-CAR-T作用于GD2高表达类器官后，GD2信号随时间降低；通过显微镜观察类器官状态，观察到GD2-CAR-T对GD2高表达类器官的吸附和生长抑制，见图9c；通过ELISA检测共孵育体系的培养基中IFN-γ、TNF-ɑ和IL-2水平，随孵育时间的延长，GD2-CAR-T和SO-31共孵育组的培养基上清中，杀伤因子(IFN-γ和TNF-ɑ)和T细胞增殖信号(IL-2)均呈现显著增加，统计结果见图9d；通过对三天共孵育后的类器官进行CD3(T细胞标志)、cleaved-caspase 3(CC3,细胞凋亡标志)和DAPI(细胞核染料)免疫荧光成像，GD2-CAR-T和SO-31共孵育组呈现T细胞对类器官的浸润和类器官的细胞凋亡，激光共聚焦图像结果和荧光强度统计结果分别见图9(e和f)。
实施例7使用类器官进行个性化肿瘤疫苗的制备
合成PLGA纳米颗粒：称取10mg PLGA溶解在1ml的二氯甲烷中，加入200μl的超纯水，探头超声(15℃，100w，5min)后，将其分散到2ml 2％胆酸钠水溶液中，再次探头超声(15℃，115w，5min)后，将其分散到10ml的0.6％胆酸钠溶液中，搅拌(300rpm,25℃),15min。12000rpm离心10min后，收集沉淀，纯水重悬后，在同样条件下离心洗涤两遍即可得到PLGA纳米颗粒，透射电子显微镜表征见图10a。
配置类器官消化液：DMEM/F12培养基，10％FBS,200U/mL I型胶原酶(购自Worthington)，100μg/mL DNase I(购自Sigma)。
去除类器官培养上清，加入1mL的消化液，37℃消化30分钟以获得单细胞。将获得的单细胞离心，去除上清后加入3mL低渗溶液(1mM PBS)重悬，使用液氮和37℃水浴反复冻融三次，1000rpm离心10min去除沉淀，再12000rpm离心30min以获得细胞膜。将细胞膜沉淀重悬在1mM PBS中，按照PLGA纳米颗粒与膜蛋白质量比10：1进行投料混合，通过脂质体寄出器后即可获得包覆类器官细胞膜的PLGA纳米颗粒，即为个性化肿瘤疫苗，对其进行透射电子显微镜表征见图10b。
实施例8类器官培养基成分的优化
以尤文肉瘤(ES)类器官培养为例，本发明对三种培养基添加剂(L-WRN细胞培养基、胃泌素和人表皮生长因子)进行了成分优化。
配制四种不同成分的类器官培养基，分别为L-WRN细胞培养基(-)，胃泌素(-)，人表皮生长因子(-)和包含四种成分的类器官培养基(即实施例1的类器官培养基)。
L-WRN细胞培养基(-)：含1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2％体积的不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基。
胃泌素(-)：含50％ L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2％体积的不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基。
人表皮生长因子(-)：含50％ L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2％体积的不含维生素A的B-27、0.5μMA83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素和10μM SB-202190的DMEM/F12培养基。
类器官培养基：含50％ L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2％体积的不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基。
所述L-WRN细胞培养基为使用DMEM/F12培养L-WRN细胞5天后收取的培养基上清。具体步骤为：将3×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％ FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％ CO2条件下，培养L-WRN细胞5天后，收取培养基，培养期间无需换液。
分别利用上述四种培养基进行尤文肉瘤类器官培养，在第1、7和14天对其形态进行拍照记录，结果见图11，结果表明，这三种成分的任一成分的缺失均会对尤文肉瘤的类器官生长起到限制作用。最终本发明采用了优化后的骨与软组织肉瘤类器官的培养基配方。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.骨与软组织肉瘤类器官的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取骨与软组织肉瘤组织样本，保存在组织保存液中；
2)将组织样本从组织保存液中取出，放置于无菌容器中，加入细胞培养基，将组织样本在细胞培养基中切碎，得到组织团块；
3)将切碎后的组织样本-细胞培养基悬液一并通过无菌滤网；
4)将滤网拦截的组织团块用类器官培养基冲洗至新的无菌容器中，加入类器官培养基，混匀；
5)加入低吸附培养皿中，放入CO2培养箱，37℃培养，每两天进行半换液，培养两周，得到骨与软组织肉瘤类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)和3)所述的细胞培养基为DMEM/F12，含100μg/mL Normocin。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的类器官培养基为含50％L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2v/v％不含维生素A的B-27、0.5μM A83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子的DMEM/F12培养基；
其中，A83-01的分子式为C25H19N5S，SB-202190的分子式为C20H14FN3O；
所述L-WRN细胞培养基的制备方法包括：将1×106-5×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2条件下，培养L-WRN细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述骨与软组织肉瘤组织来源于人类。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述骨与软组织肉瘤类型包括软组织肉瘤和骨肉瘤；
软组织肉瘤包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、多形性未分化肉瘤和滑膜肉瘤；
骨肉瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤和尤文肉瘤。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述组织团块的体积在0.5mm×0.5mm以下，优选0.1mm×0.1mm。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)所述组织团块中包含肿瘤细胞、成纤维细胞、间充质细胞、上皮细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞。
8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)所述滤网的孔径为100μm。
9.按照权利要求1-8任一项所述方法制备的骨与软组织肉瘤类器官的以下任一应用：
(1)用于药物筛选；
(2)用于CAR-T细胞治疗评估；
(3)用于化疗药和靶向药物药敏检测；
(4)用于个性化肿瘤疫苗的制备。
10.类器官培养基，其特征在于，其为含50％L-WRN细胞培养基、1mM HEPES、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、10mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、2v/v％不含维生素A的B-27、0.5μMA83-01、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、292μg/mL L-谷氨酰胺、10nM胃泌素、10μM SB-202190和50ng/mL人表皮生长因子的DMEM/F12培养基；
其中，A83-01的分子式为C25H19N5S，SB-202190的分子式为C20H14FN3O；
所述L-WRN细胞培养基的制备方法包括：将1×106-5×106个L-WRN细胞均匀铺设于直径10cm的细胞培养圆皿中，使用10mL含10％FBS的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2条件下，培养L-WRN细胞3-7天后，收取培养基，培养期间无需换液。
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