JP2021506285A - 筋由来細胞を取得する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
SMDCを取得するため、失禁患者の大胸筋または上腕二頭筋から、骨格筋バイオプシー検体を採取した。バイオプシーを行うため、まず大胸筋筋膜に達するまで、筋肉の上から約1cm長の切開により皮膚を開いた。筋膜を切開し、1cm3の筋肉組織(バイオプシー検体)を採集した。約4°Cまで予冷され、ゲンタマイシン(1〜5μg/mlの最終濃度)を含有するハムF−10基礎培地からなるバイオプシー検体輸送培地の中に、バイオプシー検体を直接移した。バイオプシー検体を、バイオプシー検体輸送培地内に約26時間、1〜11℃で保存した。次に、バイオプシー検体を1×PBSで満たされたペトリ皿に移した。無菌の鉗子とメスを使って筋肉組織を結合組織から分離した。その後、筋肉組織を1×PBSで満たされた別のペトリ皿に移し、メスを使って2〜3mm2のサイズの小片に切り分けた。上記のような追加の移動ステップを経たのち、組織小片をさらに1mmの小片に切り分けた。組織片を最終的に1×PBSで満たされた遠心分離管の中に移し、1300rpmで10分間、遠心分離を行った。遠心分離後、上清を取り除き、8μg/mlのゲンタマイシンを含有する1×PBS中に筋肉組織を再懸濁した筋肉組織懸濁液を、その後2〜8℃まで48時間、冷却した。冷却後、筋肉組織懸濁液を10分間1300rpmで遠心分離し、上清を取り除き、2.5mlの消化液は、ハムF−10中に、1〜5mg/mlのコラゲナーゼと、2〜4%v/vのHEPES緩衝液と、0.1〜10%v/vのウシ胎児血清と、5〜10μg/mlのゲンタマイシンとを含有した。その後、筋肉組織懸濁液に、5%のCO2、37℃で6〜20時間インキュベーションを行った。次に、懸濁液を1300rpmで10分間遠心分離し、上清を取り除き、ハムF−10中に、10〜20%v/vのFCSと、1〜3ng/mlのbFGFと、3〜10μg/mlのゲンタマイシンと、を含有する培地中に、ペレットを再懸濁し、細胞培養フラスコに播種した。培養フラスコの底に付着したSMDCは、培地を3〜4日毎に交換し、コンフルエントに達した後での剥離後の継代培養により、さらに維持された。1×107〜5×107のSMDCに到達するまで継代培養を行った。
フローサイトメトリー分析を、Guava easyCyte6HT−2Lフローサイトメーター(メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ)で行った。簡潔に言えば、37℃、5分間でトリプシンを用いて細胞を採取し、400rcfで遠心分離し、1%のFCSを含有する1×PBS中に再懸濁した。40000/反応物の濃度の細胞を、5μlの抗CD56−PE(ベックマン・コールター社、フランス)、イソ型IgG1−PE(ベックマン・コールター社)、イソ型Alexa488(シグマ)、抗CD105−PE(ベックマン・コールター社、フランス)またはA2B5−Alexa488抗体(ミリポア)と共に、15分間、1.5mlのエッペンドルフ(登録商標)チューブ中で、4℃の暗所でインキュベーションを行った。96ウェル丸底型プレート中でFACS測定を行うために、細胞を1mlのPBSで洗浄し、400rcfで遠心分離し、200μlの1×PBSの中に再懸濁した。洗浄と懸濁の後、各反応物に、5μlの生存判別色素である7−アミノアクチノマイシンD(ベックマン・コールター社、フランス)を加え、プレートを4℃で10分間インキュベーションした。Guava InCyte(商標)v.2.3ソフトウェアを用いて細胞イベントを取得した。1.8μl/mlのサンプル供給量、最小の3000イベントで、ヒストグラムとドットプロットが生成された。陽性染色は、少なくとも99%陰性として設定されたアイソタイプ対照との比較により得られた。
まず、細胞培養皿の上清を廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄した。常温で20分間、4%のホルムアルデヒド溶液で細胞を覆うことにより、透過化と固定化を行った。次いで、各々にインキュベーションステップを行った後に、PBSで細胞を3回洗浄した。その後、細胞を500μlのハイドロゲンパーオキサイド−ブロック(サーモフィッシャーサイエンティフィック)で覆い、常温で5分間インキュベーションを行った。終濃度が40μg/ml(w/v)の一次抗体(デスミン)をピペットで細胞に加え、少なくとも90分間インキュベーションを行った(37℃、5%CO2)。細胞をその後、500μlのビオチンコンジュゲート二次抗体(ヤギ抗ウサギ、ポリクローナル、サーモフィッシャーサイエンティフィック)で覆い、一次抗体と同じ条件下であるが少なくとも60分間インキュベーションを行った。抗体結合の可視化のため、500μlの西洋ワサビストレプトアビジンペルオキシダーゼ(ベクターラブズ社)を、(PBSで希釈された)2〜5μg/mlの終濃度で添加し、37℃、5%のCO2で20分間インキュベーションを行った後、500μlのクロモゲン単一溶液によって細胞を覆い、5〜15分後にそれを除去した。PBSによる最終洗浄ステップを実施した後、結果を観察した。免疫細胞染色によってデスミン陽性に染色された細胞は、暗赤色に視覚化される。
実施例1に記載の手順で取得したSMDCを、筋原性マーカーであるCD56(NCAM)とデスミンの純度に対して試験した。CD56で陽性である細胞の百分率を実施例2に記載のフローサイトメトリーを用いて測定した。本発明により得られた実施例1に記載のSMDCは、99.3%のCD56陽性細胞(図2A)と、98.77%の生存細胞(図2B)を含んでいた。さらに、実施例1に記載の方法を用いて得られた1つの代表的なSMDCバッチのデスミン発現について、実施例3に記載されている免疫細胞染色により分析した。図4は実施例1により得られた高純度のSMDCを示しており、細胞のほとんどがデスミン染色に対して陽性であった(図3)。
ヒト筋芽細胞の合胞体筋管への分化は、増殖培地を無血清分化培地に交換した場合に起こる。骨格筋細胞分化培地(プロモセル社)に、骨格筋細胞分化培地補充パックおよび250μlのゲンタマイシンを(培地を入手した会社のプロトコルに記載されているように)補足した。分化の開始のため、実施例1で説明したようにして事前計測された(60000〜480000細胞の)4ウェルまたは24ウェルのディッシュの中に、(増殖培地中の)細胞を播種した。細胞をディッシュに付着させた後(一晩)、増殖培地を廃棄し、細胞を分化培地で1回洗浄し、500μlの分化培地で覆った。
筋原性系譜からなるSMDCは、インビボで骨格筋繊維を表している合胞体筋管を、インビトロで融合して形成することができる。したがってSMDCの筋原性能力がインビトロの分化により試験された。実施例1に記載され取得された細胞を、実施例5に記載されている通りに分化誘導することにより筋原性能力を試験した。SMDCは、図4でのSMDCの代表的なバッチに図示されている通り、デスミン陽性(実施例3に記載の染色)の巨大な筋管を形成した。これらの結果から、骨格筋組織を機能的に再生するために必要なSMDCの筋原性能力が確認された。
実施例1により得られたSMDCを、実施例1にも記載されている細胞計測に従って、70パーセントの密集度まで6ウェルのプレートで1ウェル当たり500000細胞の密度で播種し、次いで全RNAをNeasy RNA 単離キット(キアゲン社)を用いてメーカの使用説明書に従って分離した。RNA濃度と精製度を、変性剤ゲル電気泳動法およびアジレント社の2100バイオアナライザを用いたマイクロ流体分析によって評価した。マイクロアレイハイブリダイゼーションのサンプル調整を、ニュージェン社のOvation Pico SLWTAシステムV2およびニュージェン社のEncore Biotin Moduleマニュアル(ニュージェンテクノロジー社、サンカルロス市、米国)に記載の通りに行った。簡潔には、7.5ngの全RNAを2ステッププロセスで二本鎖cDNAに逆転写し、SPIAタグ配列を導入した。ビーズ精製したcDNAを、SPIA増幅反応を用いて増幅した後、追加でビーズ精製を行った。4.5μgのSPIA cDNAを細分化し、末端ビオチン標識し、アフィメトリクスのPrimeViewヒト遺伝子発現アレイに対し、Gene Chip Hybridization Oven 640の中で45℃で16時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション済みのアレイを洗浄し、アフィメトリクスのFluidics Station FS450の中で染色し、アフィメトリクスのGene Chip Scanner3000 7Gを用いて蛍光シグナルを計測した。アフィメトリクスのGene Chip Command Console v4.1.3ソフトウェアにより流体性とスキャン機能を制御した。データ処理はアフィメトリクスのサービスプロバイダーおよびコア施設である「KFB−Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics」(レーゲンスブルク、ドイツ;www.kfb-regensburg.de)で行った。log2スケールの合計プローブセットシグナルを、アフィメトリクス社のGene Chip Expression Console v1.4ソフトウェアのRMA(1)アルゴリズムを用いて計算した。実施例1で得られたSMDCの遺伝子発現の結果を既存の方法で得られたSMDCと比較するため、2014年のAbujarourら(R. Abujarour et al., “Myogenic differentiation of muscular dystrophy-specific induced pluripotent stem cells for use in drug discovery,” Stem Cells Transl. Med., vol. 3, no. 2, pp. 149-160, Feb. 2014)により発行された、商業的に入手可能なSMDC(Lonza)の遺伝子発現データを、出版物に付属のデータベース「ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/geo/DATA/supplementary/series/GSE46633/GSE46633_RAW.tar;最終追加;2017年7月21日)」からダウンロードした。実施例1で得られたSMDCの遺伝子発現と、Abujarourら(2014年)により分析されたSMDCの比較は、Partek−Flow−ソフトウェアを提供会社(Partek社)に従って適用し、異なる遺伝子のアノテーション当たりの平均リード数を比較することにより行った。したがって、アノテーション当たりの平均リード数が多いほど、より高い遺伝子発現を表すアノテーション付きmRNAの存在量が多くなる。
実施例1を実施して得られたSMDCの神経筋サポート機能を、フローサイトメトリー(実施例2に記載)により行われたSMDCの細胞表面へのA2B5抗体の陽結合により判断した。図5に図示の通り、実施例1で得られた96.16%のSMDCは、A2B5反応性抗体に対して陽性であり、筋原性決定の他に、SMDCは神経細胞的な特性を呈していることが示された。本発明により得られたSMDCの神経筋サポート機能を、先行技術により単離された筋芽細胞と比較するために、SMDCのインビトロST3GAL1およびST3GAL2で最も高いスフィンゴ糖脂質受容体活性を呈するA2B5反応性ガングリオシドの形成に不可欠な酵素の遺伝子発現を、実施例7に記載した通りに解析した。図5に図示の通り、ST3GAL1とST3GAL2の何れのmRNA発現も、本発明により得られたSMDCの方が、市販のSMDCと比較して高かった。さらに、ST3GAL3発現は、実施例1で得られたSMDCの方が高かった。
比較例として、冷却ステップを省略して本発明による方法を実施した。SMDCを取得するため、失禁患者の大胸筋または上腕二頭筋から、骨格筋バイオプシー検体を採取した。バイオプシーを行うため、まず大胸筋の筋膜に達するまで、筋肉の上から約1cm長の切開により皮膚を開いた。筋膜を切開して、1cm3の筋肉組織(バイオプシー検体)を採取した。約4℃まで事前に冷却され、ゲンタマイシン(1〜5μg/mlの最終濃度)を含有するハムF−10基礎培地からなる、バイオプシー検体輸送培地の中に、バイオプシー検体を直接移した。バイオプシー検体を、バイオプシー検体輸送培地内に約26時間、1〜11℃で保存した。次に、バイオプシー検体を1×PBSで満たされているペトリ皿に移した。無菌の鉗子とメスを使って筋肉組織を結合組織から分離した。その後、筋肉組織を1×PBSで満たされた別のペトリ皿に移し、メスを使って2〜3mm2サイズの小片に切り分けた。上記のような追加の移動ステップを経たのち、組織小片をさらに1mmの小片に切り分けた。組織片を最終的に1×PBSで満たされた遠心分離管の中に移し、1300rpmで10分間遠心分離した。遠心分離後、上清を取り除いて、8μg/mlのゲンタマイシンを含有する1×PBSの中に筋肉組織を再懸濁させた。筋肉組織懸濁液を10分間1300rpmで遠心分離してから、上清を取り除き、2.5mlの消化液は、ハムF−10中に、1〜5mg/mlのコラゲナーゼと、2〜4%v/vのHEPES緩衝液と、0.1〜10%v/vのウシ胎児血清と、5〜10μg/mlのゲンタマイシンとを含有した。その後、筋肉組織懸濁液に、5%のCO2、37℃で6〜20時間、インキュベーションを行った。次に、懸濁液を1300rpmで10分間遠心分離し、上清を取り除き、ハムF−10中の3〜10μg/mlのゲンタマイシンと、10〜20%v/vのFCSと、1〜3ng/mlのbFGFと、を含有する培地中に、ペレットを再懸濁し、細胞培養フラスコに播種した。培養フラスコの底に付着したSMDCは、培地を3〜4日おきに交換し、コンフルエントに達した後での剥離後の継代培養により、さらに維持された。1×107〜5×107のSMDCに到達するまで継代培養を行った。
実施例1を実施して得られたSMDCの間葉系マーカー発現を、抗CD105抗体、抗CD105−PE(ベックマン・コールター社)の、フローサイトメトリー(図2に記載)により測定されたSMDCの細胞表面への結合により、決定した。図8に図示されている通り、陽性の閾値をアイソタイプ対照(0.31%陽性)に従って設定したとき、実施例1で得られた98.69%のSMDCが、CD105反応性抗体に対して陽性と判定され、SMDCが間葉系細胞および/または間葉に由来するものであることが示唆された。
アセチルコリンエステラーゼ(AChE)活性を測定するため、200000のSMDCを24ウェルプレートのゼラチンコートウェル中に播種し、実施例5に説明されるように分化誘導した。分化の開始から6日で、300μlの0.5mMの5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)溶液(pH7.2、0.1%トリトンX−100を含むリン酸緩衝液で調整)を直ちに添加して、分化培地を24ウェルプレートから丁寧に取り除いた。常温で暗所にて2分間のインキュベーションを行った後、(蒸留水で調製された)50μlの5.76mMのヨウ化アセチルチオコリン(ATI)を添加した。反応内容物は、30℃で60分間のインキュベーションが行われ、Anthos Zenyth 340rtのマイクロプレートリーダー(バイオクロム社、ケンブリッジ、英国)で、412nm(OD412nm)で光学密度(OD)測定を行った。細胞以外の全ての試薬から構成されたブランク反応もまた含まれた。較正OD412nm値は、平均OD412nmからブランクの平均測定値を差し引くことにより取得された。標準曲線の直線方程式を参照して、相対mU(AChEmUrel)のAChE活性を計算した。すぐに使用できる50U/mlのAChE原液(Electrophorus electricus由来、AATバイオクエスト(登録商標)社、サニーベール、カリフォルニア州、米国)の4〜500mU/ml希釈液を測定することにより、標準曲線を取得した。標準希釈液をリン酸緩衝液(pH7.2、0.1%のトリトンX−100を含む)で調整して、直ちに使用した。AChE標準酵素分析については、200μlの各希釈液を、それぞれ300μlの0.5mMのDTNBおよび50μlの5.76mMのATIと混合し、60分後に24ウェルプレートの中でOD412nmを測定した。細胞タイプ特定のタンパク質の濃度に対して正規化するため、測定量の細胞のAChE活性を、これら細胞の総タンパク質含有量で割ることにより、単位gタンパク質あたりのmUrelAChE活性が得られた(AChEmUrel/gタンパク質)。細胞集団内の総タンパク質量を分析するため、実施例5に従って分化した付着細胞の分取分をまずPBSで2回洗浄し、次いでPBST(0.1%のトリトンX−100)で覆ってから、常温で10分間のインキュベーションを行った。次に、溶解物(lysate)を再懸濁し、エッペンドルフ(登録商標)チューブに移し、すぐにボルテックスにかけた後に、1200×gで4分間、遠心分離した。最後に、上澄み液を新たなエッペンドルフチューブに移し、Anthos Zenyth 340rtのマイクロプレートリーダー(バイオクロム社、ケンブリッジ、英国)を用いて540nmでODを測定して、Pierce BCA タンパク質定量キット(サーモサイエンティフィック、マサチューセッツ州、米国)を、メーカの説明書に従って使用することにより、タンパク質濃度を測定した。
SMDCの融合能力は、多核筋管を形成する能力に基づいており、筋原潜在力を表すものである。融合能力は融合率として定量化されるが、これは多核筋管内に存在する核数を表しており、少なくとも3つの核を含む細胞を、観察された顕微鏡視野内の総核数で割ったものとして定められる。SMDCの融合率を測定するために、2×105個の細胞を、ゼラチンでコーティングした24ウェルプレート上に播種し、播種から24時間後に、増殖培地から骨格筋分化培地に切り替えることで、分化誘導を行った。分化から6日後、PBSで細胞を2回洗浄し、4%のPFAで10分間、固定化を行った。次に、PBSで細胞を3回洗浄し、2μg/mlのヘキスト33342溶液により20分間、染色を行った。各サンプルについて、免疫蛍光イメージングの際に少なくとも3つの視野が捉えられ、核と細胞境界を簡単に検出できるように位相差画像を重ね合わせた。融合率は、分析した全ての視野に対する平均値を算出した後に、捉えた各視野に対して、管内の核数を視野あたりの総核数で割ることにより算出した。少なくとも3つの核を有する細胞のみを筋管とみなした。統計分析のため、異なる患者に由来する少なくとも3つの集団を、各集団細胞に対して分析した。
Claims (16)
- 骨格筋細(SMDC)を取得する方法であって、
(a)骨格筋組織から得られた試料を緩衝液中で冷却するステップ;
(b)前記試料を処理及び冷却するステップ;
(c)ステップ(b)の試料を少なくとも1つの酵素を含む血清を伴う媒体中で再懸濁し、38℃に至るまで1〜20時間加熱するステップ;試料をペレット形成し、及び、
(d)ステップ(c)の試料から単一細胞懸濁液を提供するためにステップ(c)の試料のペレットを再懸濁し、それによってSMDCを取得するステップ;
を含む方法。 - ステップ(a)が、16℃より低い温度、好ましくは1〜16℃、好ましくは4〜10℃、特に好ましくは7℃の温度で;最大96時間の範囲の時間で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)が、はさみ、メス、ピンセット、フィルター又はボールミルの使用を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)における冷却が、1〜16℃の範囲、好ましくは4〜8℃の範囲、特に好ましくは4℃の温度で、かつ、2時間から48時間の範囲の時間行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)が、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ及びDNAseからなる群から選択される1つ又は2つ以上を含む溶液で酵素処理を行うことを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)が25〜38℃の範囲、好ましくは36〜38℃の範囲、特に好ましくは37℃の温度で行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)が、好ましくは、FACSソーティング、遠心分離、動電学的ソーティング、音響フォレーシスソーティング、ビーズベースの細胞ソーティング及び光学的ソーティングの少なくとも1つから選択される方法を含む、請求項1に記載の方法。
- さらなる任意のステップ(e)が、ステップ(d)の後に実施され、ステップ(d)で得られた単一細胞懸濁液のインキュベーションを含み、ステップ(e)でのインキュベーションが、好ましくは25〜38℃の範囲、好ましくは36〜38℃の範囲、特に好ましくは37℃の温度により、付着性SMDCが得られる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(e)の後に、任意に、ステップ(e)の非付着性細胞の廃棄を含むさらなるステップ(f)が実施され、ステップ(f)が好ましくは少なくとも6時間〜4日後に行われる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(f)の後に、任意に、ステップ(e)の付着細胞を増殖させるさらなるステップ(g)が実施され、ステップ(h)における増殖が、1〜5継代に対して70〜80%の集密度の付着細胞の培養を含む、請求項1に記載の方法。
- SMDCが、少なくとも60%のCD56陽性及び60%のA2B5陽性細胞を含むSMDC。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法に従って得られたSMDC。
- SMDCが、CD56、A2B5、CD105、Myf5及びPax7から選択される少なくとも1つ以上のマーカーの陽性発現、並びに、CD34及びMyoDから選択される少なくとも1つ以上のマーカーの陰性発現から選択される異なるマーカーの組み合わせの発現によって特徴付けられる、請求項11又は12に記載のSMDC。
- 医薬組成物として使用するための、請求項11〜13に記載のSMDC。
- 神経筋障害及び/又は筋障害を予防及び/又は治療する方法で使用するための、請求項11から13に記載のSMDC。好ましくは、便失禁及び/又は尿失禁などの神経筋障害及び/又は筋障害を予防及び/又は治療する方法で使用ためのSMDC。
- 筋機能障害を治療する方法において使用するための請求項11〜13に記載のSMDCであって、筋機能障害が失禁、特に尿失禁及び/又は肛門若しくは便失禁である、SMDC。
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