BR112020011853A2 - métodos para obtenção de células derivadas de músculos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para obtenção de células derivadas do músculo esquelético (SMDC), e o uso de SMDCs em um método para a prevenção e/ou tratamento de neuromiopatias e/ou miopatias, em que a neuromiopatia e/ou a miopatia é/são: incontinência, em particular a urinária, e/ou incontinência anal ou fecal.

Description

MÉTODOS PARA OBTENÇÃO DE CÉLULAS DERIVADAS DE MÚSCULOS ESTADO DA TÉCNICA

[0001] A presente invenção refere-se a métodos de obtenção de células derivadas do músculo esquelético (SMDCs), e o seu uso em um método para melhorar a conexão neuromuscular e para uso no tratamento de uma disfunção muscular, em que a disfunção muscular ocasiona incontinência, em particular a urinária e/ou incontinência anal.

[0002] A capacidade de manter a continência é fundamental para o nosso bem-estar enquanto seres sociais. A perda da continência anal resulta em desvantagens físicas, fisiológicas e sociais. Geralmente, pensa-se que principalmente pessoas idosas e com deficiências sofrem de incontinência anal, no entanto, tais sintomas podem ocorrer em pessoas de todas as idades. O espectro da incontinência anal, isto é, a perda do controle do conteúdo do intestino, varia de pequenas marcas de fezes na roupa íntima à perda de flatos até episódios massivos de defecação descontrolada de fezes moles ou sólidas. As razões de tais situações ocorrerem são complexas e englobam vários níveis. Independentemente da qualidade de vida extremamente prejudicada do indivíduo afetado, a continência anal prejudicada resulta em um fator de custo a não ser subestimado pelo sistema público de saúde. Além disso, a incontinência anal é o segundo motivo mais frequente de hospitalização em asilos (mais frequentemente do que a demência). Um terço da população idosa em asilos ou hospitais apresenta incontinência para fezes.

[0003] Dois músculos esqueléticos são importantes para O controle voluntário dos órgãos da continência: o Musculus sphincter ani externus e o Musculus puborectalis como parte do Musculus levator ani. É provável que o restante da pele do diafragma - Diaphragma pelvis (M. pubococcygeus, M. ischiococceygeus, M. iliococcygeus) - tenha um papel mais ou menos apoiador. O esfíncter anal externo é suportado pelo N. pudendus. Ambos os músculos, o Musculus sphincter ani externus e o Musculus puborectalis, podem manter um tônus constante diretamente proporcional ao volume/quantidade de preenchimento retal, no qual o tônus diminui com o início processo de defecação. O tônus constante da linha de base do M. puborectalis resulta em uma “contorção” da transição retal para a sínfise, formando um ângulo de 90º entre o canal anal e o reto. Tal ângulo anorretal também contribui para a manutenção da continência anal. Uma outra função do M. puborectalis é reter as fezes pelo menos parcialmente formadas, se o esfíncter anal externo estiver danificado.

[0004] O controle sobre os flatos ou fezes líquidas não é possível por meio do M. puborectalis. A continência anal para tais tipos de fezes é proporcionada por meio de uma interação dos esfíncteres anais interno e externo. As almofadas hemorroidas proporcionam uma oclusão hermética. No estado de repouso, o canal anal é ocluído pela atividade tônica constante dos esfíncteres anais externos e pela pressão de repouso da linha de base do esfíncter anal interno. O esfíncter anal interno, que é uma continuação e uma ampliação da camada muscular lisa do cólon, fornece cerca de 75-85% da pressão da linha de base do canal anal fechado. A atividade deste componente do músculo liso é completamente inibida por uma distensão retal, o chamado reflexo inibitório anal retal. Tal relaxamento é acompanhado de uma contração de reflexo do esfíncter anal externo e do M. puborectalis para prevenir a defecação. Tal como mencionado acima, os métodos de tratamento atuais visam principalmente a correção cirúrgica da ruptura do esfíncter. Isso leva à melhora a curto prazo dos sintomas, conforme mencionado acima.

[0005] Formas mais amenas de incontinência anal podem ser tratadas com métodos conservadores de tratamento, que podem resultar em uma melhora nos sintomas. No entanto, em casos mais sérios, a respectiva intervenção cirúrgica resulta frequentemente em uma melhora a curto prazo com poucas chances de sucesso.

[0006] Os métodos convencionais de tratamento compreendem uma mudança na dieta, além de um aumento na captação de fibras, assim como nos casos de sensibilidade anal comprometida, em que o uso de tampões anais e enemas retais são indicados. A ingestão de loperamida, em caso de necessidade, também pode ser recomendada em combinação com substâncias de ligação ao ácido biliar, que reduzem a motilidade intestinal e aumentam a pressão do músculo do esfíncter anal. Uma nova forma de terapia utiliza estrogênio localmente aplicado para mulheres na pós-menopausa, no entanto, faltam estudos randomizados.

[0007] Entretanto, um número distinto de pacientes requer uma intervenção cirúrgica: o reparo esfincteriano (mais ou menos sobreposto) é aplicado com mais frequência no tratamento agudo de lesões traumáticas após o parto, mas também secundariamente após lesões do esfíncter anal causadas sob outras circunstâncias. As perspectivas de curto prazo são boas, porém os resultados de longo prazo são ruins.

[0008] Para incontinência urinária de esforço, foi proposto injetar células derivadas de músculo no local lesionado com a finalidade de melhorar a incontinência urinária de esforço. No entanto, a incontinência urinária de esforço não é comparável a incontinência anal, uma vez que a causa para as duas doenças distintas são completamente diferentes. Além disso, os dois sistemas (urinário x anal) também não apresentam função similar. O trato urinário deve fornecer controle suficiente apenas dos líquidos. O reto é capaz de controlar conteúdos sólidos, fluidos e gasosos. Isso requer requisitos sensoriais completamente diferentes. Portanto, a anatomia é bem diferente entre o trato geniturinário e o reto. Por exemplo, enquanto existe um músculo esfíncter anal externo circundando o reto, não há um elemento equivalente circundando completamente a uretra. Além disso, na localidade dorsal da uretra do homem adulto quase não há músculos estriados que possam ser encontrados no homem adulto, enquanto o esfíncter anal externo do reto é um músculo estriado que é completamente circular.

[0009] os mioblastos, os precursores das fibras musculares, são células musculares mononucleadas que se diferem, de muitas maneiras, dos outros tipos de células. Os mioblastos fundem-se naturalmente para formar miotubos multinucleados pós-mitóticos, que resultam na expressão e entrega a longo prazo de proteínas bioativas. Mioblastos foram utilizados para a entrega de genes ao músculo para doenças relacionadas ao músculo, como distrofia muscular de Duchenne, bem como para doenças não relacionadas ao músculo,

como por exemplo, entrega do gene da adenosina desaminase humana para a síndrome de deficiência de adenosina desaminase; transferência gênica de pró-insulina humana para diabetes mellitus, transferência de genes para expressão de tirosina hidroxilase para a doença de Parkinson; transferência e expressão do fator IX para hemofilia B, entrega do hormônio de crescimento humano para retardo de crescimento.

[0010] A utilização de mioblastos para tratar a degeneração muscular, para reparar danos nos tecidos ou tratar doenças é revelada nos Pedidos de Patente Americano 5,130,141 e 5,538,722. Além disso, o transplante de mioblastos tem sido empregado para reparar a disfunção miocárdica (Robinson et al., 1995; Murry et al., 1996; Gojo et al., 1996; Zibaitis et al., 1994).

[0011] Os mioblastos também podem ser utilizados para reparar lesões musculares envolvidas na manutenção da continência, particularmente na incontinência urinária e/ou anal. As células derivadas do músculo esquelético compreendendo —“mioblastos são conhecidas como células progenitoras dos músculos esqueléticos, que podem sofrer diferenciação a fim de reparar lesões musculares em adultos.

[0012] Vários métodos são descritos no estado da técnica para isolar células derivadas do músculo esquelético. Um método distinto para isolar as células derivadas do músculo esquelético aplica uma técnica de plaqueamento prévio. Desse modo, as células são obtidas a partir de um tecido muscular e uma única suspensão celular é transferida consecutivamente em um recipiente diferente de cultura celular, também conhecido como plaqueamento prévio, para eliminar células não miogênicas, como fibroblastos e enriquecer células miogênicas, como mioblastos. Por exemplo, Rando e Blau, 1994, descrevem tal purificação dos mioblastos na cultura celular (T. A. Rando e H. M. Blau, “Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.,” JJ. Cell Biol., vol. 125, no. 6, pp. 1275-1287, junho de 1994). O uso de etapas múltiplas de plaqueamento prévio, em comparação com o plaqueamento prévio único, melhorou a pureza e a sobrevivência dos mioblastos, o que é necessário para o efeito do tratamento na terapia de transferência de mioblastos (Z. Qu, L. Balkir, J. C. T. van Deutekom, P. D. Robbins, R. Pruchnic, e JJ. Huard, “Development of Approaches to Improve Cell Survival in Myoblast Transfer Therapy,” J. Cell Biol., vol. 142, no. 5, pp. 1257-1267, setembro de 1998).

[0013] A desvantagem dos métodos baseados em técnicas de plaqueamento prévio é que a condução das várias etapas é demorada. Embora as células tenham sido passadas várias vezes na técnica do plaqueamento prévio, é necessário alcançar a quantidade de células desejadas com pureza efetiva (B. Gharaibeh et al., “Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique,” Nat. Protoc., vol. 3, no. 9, p. 1501, agosto de 2008; A. Lu et al., “Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics,” Gene Ther., vol. 15, no. 15, pp. 1116-1125, maio de 2008). Assim, o tempo prolongado na cultura e o aumento do número de duplicações celulares de mioblastos durante o plaqueamento prévio e o replaqueamento podem levar à senescência acompanhada de parada do crescimento, e até falha em atingir a quantidade desejada de células para transferência de mioblastos (W. E. Wright e JJ. W. Shay, “Historical claims and current interpretations of replicative aging,” Nat. Biotechnol., vol. 20, no. 7, pp. 682-688, julho de 2002). Além disso, a falta de sensibilidade do plaqueamento prévio pode levar a uma diminuição geral no número de mioblastos, mesmo que uma maior pureza possa ser alcançada (B. C. Syverud, J. D. Lee, K. W. VanDusen, e L. M. Larkin, “Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering,” J. Regen. Med., vol. 3, no. 2, 2014).

[0014] Outros métodos para o isolamento dos mioblastos, tal como a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), ou a classificação de células ativadas magneticamente (MACS), pareciam promissores, mas devido a possíveis danos causados às células pela aplicação de intensidades de laser de alta tensão nas FACS, bem como as preocupações a respeito da retenção de anticorpos magnéticos por meio do uso das MACS, esses métodos não representam uma escolha efetiva para o isolamento dos mioblastos.

[0015] Considerando estas desvantagens dos métodos do estado da técnica, são necessários novos métodos para o fornecimento de células derivadas do músculo esquelético (SMDC) .

[0016] Tal questão é resolvida no conteúdo definido pelas reivindicações do presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0017] As figuras a seguir fazem parte da presente especificação e são incluídas para demonstrar, de forma mais aprofundada, certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida a partir da referência de um ou mais desenhos em combinação com as descrições detalhadas das modalidades especificas apresentadas aqui.

[0018] A Figura 1 mostra uma imagem microscópica com contraste de fase (ampliação de 100x) das SMDC aderidas ao frasco padronizado de culturas de células.

[0019] A Figura 2 é uma análise das FACS que revela a pureza e a viabilidade das SMDC. O histograma A é uma análise da marcação com CD56, que demonstra que 99,3 % das células são positivas para esse marcador. O histograma B releva a análise de viabilidade através da marcação com/7AAD e demonstra que t 98,77 % das células são viáveis.

[0020] A Figura 3 mostra uma imagem microscópica com uma pluralidade de SMDC ampliadas em 100x, demonstrada através da imunocoloração para o marcador miogênico desmina. As células positivas aparecem com uma coloração mais escura, enquanto as células negativas não estão coloridas.

[0021] A Figura 4 mostra uma imagem microscópica das SMDC introduzidas para diferenciar os miotubos multinucleados. Os miotubos expressam a proteína miogênica desmina conforme apresentada, pela coloração escura.

[0022] A Figura 5 mostra uma análise de FACS das SMDC através da marcação com A2B5. A coloração de controle do isotipo é apresentada no histograma A, em comparação com a coloração de anticorpo A2B5, que é demonstrada no histograma B. O histograma B revela que 96% das células são positivas para A2ZB5.

[0023] A Figura 6 mostra a expressão gênica de enzimas de síntese de antígeno reativo A2B5. As leituras médias por anotação gênica de ST3GAL1, ST3GAL2 e ST3GAL3 sugerem uma expressão mais alta dos mRNAs nas SMDC obtidas pela presente invenção (ST3GAL1: 17,72; ST3GAL2: 20,91; ST3GAL3: 205,89) em comparação às SMDC disponíveis comercialmente (ST3GALI1: 5,97; ST3GAL2: 9,59; ST3GAL3: 97,81).

[0024] A Figura 7 apresenta a comparação do % de células positivas para CD56 em células obtidas pelo exemplo 1, com a presença de uma etapa de arrefecimento, ou o exemplo 9, sem a etapa de arrefecimento. Células obtidas pelo exemplo 1 contém significativamente (*p<0,05 no teste t-student -) % mais elevada de células positivas CD56 (médiat+tSD: 93,28+8,37) em comparação com as células obtidas pelo exemplo 9 (médiatSD: 77,11+8,37). Os dados foram apresentados como médiatSD(desvio padrão) das células derivadas de biópsias musculares de três doadores humanos individuais, que foram divididas ao meio para realizar os procedimentos de acordo com exemplos 1 e 9 em células dos mesmos doadores.

[0025] A Figura 8 releva uma análise de FACS demonstrando a expressão do marcador mesenquimal CDIO5 nas SMDC. O histograma B é uma análise de CD1I05, e demonstra que 98,69% das SMDC são positivas para CD1I05. O histograma A mostra a configuração precisa do limiar através da demonstração do controle de positividade isotópica em apenas 0,31% das SMDC.

[0026] A Figura 9 mostra a capacidade regenerativa neuromuscular das SMDC, de acordo com a presente invenção através da comparação da atividade de AChE (mUr.1 por proteína g) entre CDS6+SMDC (compreendendo aproximadamente 100% das células que expressam CD56) e CD5S6-SMDC (compreendendo aproximadamente 30% das células positivas para CD56). A medição da atividade AChE foi realizada conforme descrito no

Exemplo 11. CDS6+SMDC exibem significantemente (*p<0,05 no teste t-student) maior atividade de AChE em comparação com CD5S6-SMDC. Os dados são apresentados como médiatSEM (erro padrão) de células derivadas de biópsias musculares de três doadores humanos individuais.

[0027] A Figura 10 mostra a capacidade regenerativa neuromuscular das SMDC, de acordo com a presente invenção, comparando a competência de fusão (% de índice de fusão) entre CD5S6+SMDC (compreendendo aproximadamente 100% das células que expressam CD56) e CD5S6-SMDC (compreendendo aproximadamente “30% das células positivas CD56). A quantificação da competência de fusão foi realizada conforme descrito no Exemplo 12. CDS6+SMDC exibem significativamente (*p<0,05 no teste t-student) maior % de índice de fusão em comparação com CD56-SMDC. Os dados são apresentados como médiatSEM de células derivadas de biópsias musculares de três doadores humanos individuais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0028] O uso das palavras “por”, “pelo” ou “pela”, quando em conjunto com o termo “caracterizado” nas reivindicações e/ou nas especificações pode significar “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um”, e “um ou mais de um”.

[0029] O termo “cerca de” significa que são contemplados o valor declarado, mais ou menos 5% do valor declarado ou o erro de padrão para medições do valor fornecido.

[0030] O termo “incontinência anal”, como utilizado no presente documento, refere-se a qualquer perda indesejada de conteúdo intestinal através do ânus, tais como flatos, fezes líquidas ou sólidas. O termo compreende todos os três graus de gravidades: Grau l1 = somente gases, grau 2 = fezes líquidas e moles, grau 3 = fezes sólidas e formadas.

[0031] O termo “esfíncter anal” ou “aparelho de esfíncter anal”, conforme utilizado pelo presente documento, refere- se, particularmente, ao Musculus sphincter ani externus e o Musculus puborectalis como uma parte do Musculus levator ani. No entanto, também inclui o M. pubococcygeus, M. ischiococcygeus, M. iliococcygeus e N. pudendus.

[0032] O termo “célula derivada do músculo esquelético”, ou sua sigla “SMDC”, refere-se a células competentes para fusão multinucleada, como por exemplo, mioblastos, que podem ser células primárias e/ou cultivadas in vitro, e, alternativamente, a outras células com potencial miogênico (por exemplo, a partir de tecido lipoaspirado ou de outros tecidos que abrigam células-tronco, como medula óssea). O termo também compreende células derivadas do tecido adiposo que podem ser isoladas e utilizadas para a cultura de células do músculo esquelético. O termo “célula derivada do músculo esquelético”, ou “SMDC” também se refere a população de células isoladas do tecido muscular. Geralmente, tal população celular compreende células adicionais sem potencial miogênico. Essas células são aqui denominadas “células não miogênicas” ou “células não miogênicas derivadas do músculo esquelético” e são, de preferência, CD56 negativas e/ou desmina negativas. Assim, o termo “células derivadas do músculo esquelético” ou “SMDC”, conforme aqui utilizado, refere-se preferencialmente a uma população de células compreendendo, pelo menos, 30, 40, 50,

60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 100% de células competentes para fusão multinucleada.

[0033] O termo “penetração”, como utilizado no presente documento, refere-se a um processo de introdução de um dispositivo de injeção, tal como uma agulha, em um tecido do corpo sem afetar o processo de injeção.

[0034] O termo “injeção”, como utilizado no presente documento, refere-se à expulsão de uma solução de injeção compreendendo as células supramencionadas, por meio de um dispositivo de injeção, para um local específico dentro do corpo humano, em particular dentro ou adjacente ao tecido muscular fornecido para a continência anal. O processo de injeção pode ser, mas não de forma limitada, estático, isto é, o dispositivo de injeção permanece na posição alcançada. Alternativamente, o processo de injeção é dinâmico. Por exemplo, em algumas modalidades da presente invenção ele ocorre simultaneamente com a retração do dispositivo de injeção a partir do local da injeção.

[0035] O termo “local de injeção”, de acordo com o presente documento, refere-se a um local dentro do corpo humano, sendo próximo ou compondo o tecido muscular que fornece continência anal, no qual o processo de injeção é iniciado. O local de injeção inicial não precisa ser idêntico ao local onde o processo de injeção termina.

[0036] O termo “dispositivo de injeção”, de acordo com o presente documento, refere-se a qualquer dispositivo adequado para a penetração do tecido humano com a finalidade de alcançar um local de injeção de interesse, e é capaz de fornecer soluções, em particular soluções que compreendem células derivadas de músculo no local de injeção de interesse.

[0037] O termo “incontinência fecal”, de acordo com o presente documento, refere-se apenas à perda indesejada de fezes líquidas ou formadas através do ânus.

[0038] O termo “incontinência passiva”, de acordo com o presente documento, refere-se à falta de reconhecimento sensorial da perda de fezes. Isso inclui baixos valores de pressão da linha de base anal e falta de capacidade sensorial da mucosa anal e retal.

[0039] Os termos “defecação imperativa” ou “urgência imperativa”, de acordo com o presente documento, referem-se à falta de capacidade de uma pessoa para adiar a defecação por mais de cinco minutos. Este paciente precisa ir ao banheiro imediatamente.

[0040] O termo “CD56+” ou “positivo para CD56”, de acordo com o presente documento, se refere a uma célula que expressa o marcador celular CD56. Os termos “CD56+” ou “positivo para CD56” também podem ser utilizados para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% da população de células expressam o marcador celular CD56.

[0041] O termo “CD56-” ou “negativo para CD56”, de acordo com o presente documento, se refere a uma célula que não expressa o marcador celular CD56. Os termos “CD56-” ou “negativo para CD56” podem ser utilizados para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, no máximo 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2,

1 ou 0% da população de células expressam o marcador celular CD56.

[0042] O termo “A2B5+” ou “positivo para A2B5”, de acordo com o presente documento, se refere a uma célula que expressa o marcador celular A2B5. Os termos “AZB5+” ou “positivo para A2B5” também podem ser utilizados para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% da população de células expressam o marcador celular A2B5.

[0043] O termo “A2B5-” ou “negativo para A2B5”, de acordo com o presente documento, se refere a uma célula que não expressa o marcador celular A2B5. Os termos “A2ZB5-” ou “negativo para A2B5S” também podem ser utilizados para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, no máximo 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, l1 ou 0% da população celular expressam o marcador celular A2B5.

[0044] O termo “positivo para desmina”, de acordo com o presente documento, se refere a uma célula que expressa o marcador celular desmina. O termo “positivo para desmina” também pode ser utilizado para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% da população de células expressam o marcador celular desmina.

[0045] O termo “negativo para desmina”, de acordo com o presente documento se refere a uma célula que não expressa o marcador celular desmina. O termo “negativo para desmina” também pode ser utilizado para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, no máximo 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0% da população de células expressam o marcador celular desmina.

[0046] O termo “CDIO5+” ou “positivo para CD105”, de acordo com o presente documento se refere a uma célula que expressa o marcador celular CD1I05. Os termos “CD105+” ou “positivo para CD1I05” também pode ser utilizado para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 ou 99% da população de células expressam o marcador celular CD105.

[0047] O termo “CDI05-” ou “negativo para CD105”, de acordo com o presente documento se refere a uma célula que não expressa o marcador celular CDIO05. Os termos “CD105-” ou “negativo para CD105” também pode ser utilizado para uma população celular compreendendo diferentes tipos de células, se, preferencialmente, no máximo 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0% da população de células expressam o marcador celular CD105.

[0048] O termo “meio de diferenciação”, conforme aqui utilizado, refere-se a meios de cultura de células que induzem a fusão em células competentes para fusão multinucleadas ou células miogênicas, como por exemplo, mioblastos. No entanto, tal termo também se refere ao meio de cultura de células que não compreende quaisquer substâncias necessárias para a indução de fusão, caso as células competentes para fusão multinucleada sejam capazes de se fundir sem a respectiva indução.

O termo “meio de crescimento celular”, conforme aqui utilizado, refere-se a qualquer meio adequado para a incubação de células mamíferas, tais como as SMDC, que permite a ligação das referidas células de mamíferos na superfície de um recipiente de incubação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0049] De acordo com a presente invenção, são fornecidos métodos para a obtenção de células derivadas do músculo esquelético (SMDC).

[0050] Um primeiro objeto da presente invenção é direcionado a um método para obter células derivadas do músculo esquelético (SMDC), que compreende as seguintes etapas: (a) arrefecimento de uma amostra obtida do tecido muscular esquelético em um tampão; (b) processamento e arrefecimento da amostra; (c) ressuspensão da amostra da etapa (b) em meio com soro compreendendo pelo menos uma enzima e aquecê-lo em até 38º de 1 a 20 horas; peletização da amostra e (d) ressuspensão dos sedimentos da amostra da etapa (c) para fornecer uma suspensão de célula única a partir da amostra da etapa (c), obtendo, dessa forma, as SMDC.

[0051] Os inventores descobriram que a condução do método da presente invenção vantajosamente permite a obtenção e o enriquecimento das SMDC, exibindo alta capacidade miogênica, sem a necessidade de conduzir etapas de revestimento prévio. Tais SMDC enriquecidas são altamente puras para marcadores miogênicos, como CD56 e desmina, indicando maior potencial miogênico, como analisado, por exemplo, através de um ensaio de potência adequado. Além disso, o enriquecimento das SMDC antes da peletização inicial é vantajoso, uma vez que as células têm de sofrer menos subcultura, levando a uma menor quantidade de células senescentes e a uma alta viabilidade, devido à presente invenção. Adicionalmente, a presente invenção gera células não apenas expressando marcadores miogênicos, tais como CD56 e desmina, mas também marcadores de células precursoras neuronais, tais como A2B5, sugerindo, também, alto potencial para suporte neuromuscular. De fato, as SMDC obtidas pela presente invenção são diferentes das células do estado da técnica em sua expressão gênica das enzimas sintetizadoras de antígeno reativo A2B5, tais como ST3GAL1 ST3GAL2 e ST3GAL3, necessárias para o suporte neuromuscular dos antígenos reativos. Em resumo, as SMDC enriquecidas obtidas pela presente invenção demonstram alta pureza e viabilidade, e, portanto, sugere-se que apresentem alta eficácia clínica no suporte à conexão neuromuscular, bem como na regeneração da fraqueza muscular, especialmente em condições como incontinência urinária e/ou fecal.

[0052] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a etapa (a) compreende a realização de uma biópsia muscular.

[0053] Tal biópsia muscular que serve como fonte de células derivadas de músculo pode ser obtida a partir do músculo no local da lesão ou de outra área que pode ser mais facilmente acessível ao cirurgião clínico. O local da biópsia não é restrito a um músculo esquelético distinto, e pode ser pertencente, por exemplo, da parte superior do braço. O tamanho da biópsia pode compreender, aproximadamente, lcm x lem x lem, ou mais.

[0054] Para o uso de mioblastos no tratamento de lesões musculares, tais como o tratamento de incontinência, os referidos mioblastos são preferencialmente isolados de uma biópsia do músculo esquelético do sujeito a ser tratado.

[0055] Em uma outra modalidade preferida, a etapa (a) é conduzida a uma temperatura inferior a 16ºC, preferencialmente a uma faixa de temperatura de 1 a 16ºC, preferencialmente de 4 a 10ºC, e mais preferencialmente a 7ºC; e por um período de até 96 horas.

[0056] Por conseguinte, é preferível que o método da presente invenção seja conduzido na etapa (a) a uma faixa de temperatura de 1 a 16ºC ou a qualquer temperatura compreendida entre esta faixa, tais como a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15ºC, ou qualquer temperatura intermediária dentro deste intervalo. Em uma outra modalidade preferencial da presente invenção, a faixa de temperatura é de 6 a 8ºC. Em uma modalidade adicional, a faixa de temperatura é inferior a 4ºC, preferencialmente na faixa de 1 a 3ºC.

[0057] Além disso, é preferível que o método da etapa (a) da presente invenção seja conduzido em um momento compreendido no intervalo de até 96 horas, ou em qualquer outro tempo dentro deste intervalo, tais como de 12 a 96 horas, de 12 a 72 horas, de 12 a 48 horas, de 24 a 96 horas, de 24 a 72 horas, de 24 a 48 horas, ou qualquer outro intervalo intermediário.

[0058] Preferencialmente, a etapa (b) compreende o uso de tesoura, bisturi, pinça, filtro ou moinho de bolas e uma centrífuga. No entanto, é evidente para um especialista na técnica que quaisquer outros meios que permitam a trituração ou fragmentação do tecido muscular esquelético estão abrangidos e de acordo com a presente invenção.

[0059] Em outra modalidade preferencial, a etapa (b) é conduzida a uma temperatura na faixa de 1 a 16ºC ou qualquer outra temperatura entre essa faixa, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15ºC, ou qualquer temperatura intermediária compreendida nesta faixa. Em outra modalidade preferida da presente invenção, a etapa (b) é conduzida a uma temperatura na faixa de 4 a 8ºC, mais preferencialmente a 4ºC. Em outra modalidade preferida, a faixa de temperatura é inferior a 4ºC, preferencialmente na faixa entre 1 a 3ºC.

[0060] Ainda mais preferencialmente, a etapa (b) da presente invenção é conduzida por um intervalo distinto de tempo, tal como de 2 a 48 hours, ou a qualquer momento compreendido dentro deste intervalo, tais como de 2 a 36 horas, de 2 a 24 horas, ou qualquer outro intervalo intermediário.

[0061] Por conseguinte, prevê-se que a etapa (b) do método da presente invenção é conduzida através do processamento do tecido muscular esquelético e arrefecimento durante o período de tempo distinto do tecido muscular esquelético processado. Em uma modalidade preferível da invenção, está previsto que o arrefecimento da amostra é conduzido após a etapa de processamento. Os inventores descobriram que o arrefecimento da amostra processada é vantajoso, uma vez que leva a uma diminuição crucial das células não miogênicas, tais como fibroblastos, o que é obtido porque as células não miogênicas, como fibroblastos, são sensíveis à temperatura, devido ao fato de apresentarem uma atividade metabólica mais alta que a das células miogênicas inativas. Por causa dessa característica, as células não miogênicas, tais como fibroblastos, estão morrendo devido à condição de temperatura baixa. Como consequência disso, o arrefecimento da etapa (b) do método da presente fornece um enriquecimento de células miogênicas. Tal enriquecimento é obtido sem a necessidade de conduzir qualquer etapa de plaqueamento prévio. Portanto, o método da presente invenção fornece um bom enriquecimento e purificação das células miogênicas sem a necessidade de conduzir etapas demoradas e que consomem custos.

[0062] A importância da etapa de arrefecimento é particularmente demonstrada sob forma de dados comparativos mostrados nos exemplos abaixo. Em tais exemplos, é revelado que a quantidade de células positivas CD56 são significativamente elevadas. As células positivas CD56 representam um marcador que demonstra a pureza das SMDCs obtidas. Portanto, o método da presente invenção representa um processo que permite a obtenção de SMDCs em uma quantidade superior, bem como em uma qualidade superior, em comparação com os métodos do estado da técnica que não conduzem uma etapa de arrefecimento, tal como prevê o método da presente invenção.

[0063] A molécula CD56, também conhecida como molécula de adesão celular neural (NCAM) é um marcador de comprometimento miogênico expresso em mioblastos do músculo esquelético in vitro (Belles-Isles et al., 1993) e tecido muscular liso in vivo (Romanska et al., 1996). A CD56 está presente na desmina+SMDC, competente em fusão. Demonstrou-se que a CD56, em particular, marca uma população de SMDC que é capaz de formar miotubos multinucleados e expressar uma atividade enzimática mais alta da acetilcolinesterase (AChE) do que das SMDC com CD56 negativo (Thurner et al., 2018). Alta atividade de AChE da SMDC utilizada para tratar pacientes com incontinência fecal, de fato, tem sido associada a um alto sucesso do tratamento em termos de redução dos sintomas da incontinência fecal (Thurner et al., 2018). Assim, culturas de SMDC altamente puras para CD56 e, portanto, com alta atividade de AChE são desejáveis para o tratamento bem sucedido de pacientes com neuromiopatias e/ou miopatias, tal como incontinência fecal. A presente invenção fornece um método para isolar SMDC altamente puro para CD56 e com alta atividade de ACNE.

[0064] De preferência, é previsto que a etapa (c) englobe a condução do tratamento enzimático com uma solução compreendendo qualquer um ou mais selecionados do grupo que consiste em tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, colagenase, desoxirribonuclease e DNAse. Em uma modalidade preferida, a etapa (c) prevê a utilização de colagenase.

[0065] De acordo com a presente invenção, é preferencialmente previsto que a ressuspensão na etapa (c) compreenda a centrifugação da amostra da etapa (b) descartando o sobrenadante e realizando a ressuspensão do sedimento celular em um meio com soro compreendendo pelo menos uma enzima. Além disso, em uma modalidade preferível da presente invenção, também é preferível que uma ou mais etapas de lavagem sejam conduzidas com as células da etapa (ec), incluindo agitação em turbilhão das células em uma solução adequada, tal como um tampão. De acordo com a invenção, a amostra ressuspendida da etapa (b), no meio com soro compreendendo pelo menos uma enzima, é centrifugada após o período de incubação para peletizar as células da amostra e para descartar a enzima que contém o sobrenadante.

[0066] Em uma modalidade preferida da invenção, a enzima da etapa (c) é tripsina.

[0067] Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, a etapa (c) é conduzida a uma temperatura na faixa de 25 a 38ºC, preferencialmente de 36 a 38ºC, particularmente preferível a 37ºC.

[0068] De preferência, a etapa (d) compreende preferivelmente um método selecionado a partir de pelo menos um dos métodos de classificação FACS, centrifugação, classificação eletrocinética, classificação por acostoforese, classificação de células à base de esferas e classificação óptica.

[0069] Os métodos para obter a suspensão celular são bem conhecidos no estado da técnica. Um exemplo de método de enriquecimento adequado é a classificação celular ativada magneticamente (MACSO). O método MACS permite que as células sejam separadas por meio da incubação das células com partículas (http://en.wikipedia.org/wiki/Magnetic nanopartic les) revestidas com anticorpos contra um antígeno de superfície específico. Posteriormente, as células incubadas são transferidas para uma coluna colocada em um campo magnético. Nesta etapa, as células que expressam o antígeno e, portanto, estão às nanopartículas, permanecem na coluna, enquanto as outras células que não expressam o antígeno fluem através da coluna. Através deste método, as células podem ser separadas positivamente e/ou negativamente em relação ao(s) antígeno(s) específico(s). Outro exemplo para um método de enriquecimento adequado é a classificação de células ativadas por fluorescência (FACSO), como é descrito em Webster et al. (Exp Cell Res. janeiro de 1988; 174(1):252- 65).

[0070] Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção, uma outra etapa opcional (e) que é conduzida após a etapa (d), incluindo a incubação da suspensão celular única obtida na etapa (d), em que a incubação na etapa (e) é preferencialmente conduzida a uma temperatura na faixa de 25 a 38ºC, preferencialmente de 36 a 38ºC, mais particularmente de 37ºC, obtendo-se, assim, SMDC aderente.

[0071] Essa etapa adicional de incubação opcional permite que as células cresçam para atingir uma quantidade maior de SMDC. Uma pessoa versada na técnica ajustará as condições de cultura, tais como meio e temperatura, de acordo com o objetivo de obter uma quantidade máxima de SMDC.

[0072] Ainda mais preferencialmente, é previsto que após a etapa (e), opcionalmente um outro passo (f) seja conduzido compreendendo o descarte das células não aderentes da etapa (e), em que a etapa (f) seja preferencialmente conduzida após, pelo menos, 6 horas a 4 dias.

[0073] De acordo com a presente invenção, essa etapa opcional permite, preferencialmente, que as células não miogênicas ou células que flutuam no recipiente de cultura, tais como células mortas, sejam descartadas. Desse modo, as células aderentes desejáveis são, ainda, enriquecidas. Uma pessoa versada na técnica conduzirá a etapa opcional (£) em um momento adequado dentro de um intervalo preferido de 6 horas a 3 dias, dependendo da necessidade real de executar esta etapa. Se tal etapa opcional (£) é realmente necessária, pode ser definido, por exemplo, por meio da observação das células sob um microscópio, que determinará, assim, a quantidade de células não aderentes na cultura celular.

[0074] Em uma outra modalidade preferível da presente invenção, após a etapa (f), opcionalmente, uma outra etapa (g) é conduzida para a propagação das células aderentes da etapa (e), a propagação na etapa (h) compreende a cultura das células aderentes por 1 a 5 passagens para 70 a 80% de confluência.

[0075] De acordo com a presente invenção, uma pessoa versada na técnica é capaz de determinar a duração e a quantidade “necessária de passagens para alcançar a confluência desejável de 70 a 80%.

[0076] Um segundo objeto da presente invenção é direcionado às SMDC, em que as SMDC compreendem pelo menos 60% de células positivas para CD56 e 60% de células positivas para A2B5.

[0077] Em uma outra modalidade preferível da invenção, as SMDC são positivas para CDI05, o que significa que as SMDC expressam CD105 em suas superfícies celulares.

[0078] Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90 %, 95 % ou 98% ou qualquer faixa intermediária entre os valores mencionados de SMDC são positivos para CD1I05, o que significa que as SMDC expressam CD105 em suas superfícies celulares.

[0079] CD105 também é conhecida como endoglina. É uma proteína homodimérica de membrana integral do tipo I com subunidades de 90kD encontradas nas células endoteliais vasculares e nos sinciciotrofoblasto da placenta. CD105 é fracamente expressa em fibroblastos estromais. Também é expressa em monócitos ativados e macrófagos teciduais. A expressão de CDI0O5 é aumentada no endotélio ativado em tecidos submetidos a angiogênese, como em tumores, ou em casos de cicatrização de feridas ou inflamação dérmica. CD105 é um componente do sistema receptor de TGF-B (fator de transmissão de crescimento beta) nas células endoteliais da veia umbilical humana e liga-se ao TGF-Bl e B3 com alta afinidade, mas não se liga ao TGF-pB2. Os receptores de TGF- B demonstraram ser necessários para a diferenciação do músculo esquelético. De fato, o receptor de TGF-B mostrou- se necessário para o aumento da miogenina, um fator de diferenciação do músculo esquelético e competência de fusão dos mioblastos. Assim, as células positivas para CD1I05 podem ser preferidas para SMDC e para SMDC obtidas pelos métodos revelados na presente invenção.

[0080] Em outra modalidade da invenção, as SMDC são positivas para desmina, o que significa que as SMDC expressam desmina em suas superfícies celulares.

[0081] Em uma modalidade preferível da invenção, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90 %, 95 % ou 98%, ou qualquer faixa intermediaria entre os valores mencionados das SMDC, são positivas para desmina, o que significa que as SMDC expressam desmina em suas superfícies celulares.

[0082] Em outra modalidade preferível da invenção, as SMDC são positivas para Pax7, o que significa que as SMDC expressam Pax7 em suas superfícies celulares.

[0083] Em outra modalidade preferível da invenção, as SMDC são positivas para Myf5, o que significa que as SMDC expressam Myf5 em suas superfícies celulares.

[0084] Os antígenos reativos A2B5 pertencem à família dos gangliosídeos da série C, uma família de glicolipídeos que são mais abundantes no sistema nervoso, onde exibem funções, tais como adesão e reconhecimento de células e transdução de sinal.

A perda de gangliosídeos leva a graves defeitos neurológicos, como por exemplo, defeitos degenerativos dos neurônios motores em camundongos com deficiência de gangliosídeos da série C (R.

K.

Yu, Y.-T.

Tsai, T.

Ariga, e M.

Yanagisawa, “Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides-An overview," J.

Oleo Sci., vol. 60, no. 10, pp. 9537-544, 2011). Também foi encontrada, na junção neuromuscular (NMJ) uma grande quantidade de gangliosídeos.

O tratamento da NMJ com anticorpos anti-gangliosídeos levou a um defeito grave na NMJI, apoiando a ideia de que os gangliosídeos são necessários no NMJ (J.

J.

Plomp e H.

JJ.

Willison, “Pathophysiological actions of neuropathy-related anti-ganglioside antibodies at the neuromuscular junction,” J.

Physiol., vol. 587, no.

Pt 16, pp. 3979-3999, agosto de 2009). Além disso, os gangliosídeos marcam especialmente as células-tronco, consideradas por apresentarem potencial regenerativo (R.

K.

Yu, Y.-T.

Tsai, T.

Ariga, e M.

Yanagisawa, “Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides—-An overview,” J.

Oleo Sci., vol. 60, no. 10, pp. 537-544, 2011). Os gangliosídeos reativos de A2B5 são sintetizados por sialiltransferases.

Entre eles, aqueles com maior atividade aceitadora de glicoesfingolipídeo in vitro altamente expressa no cérebro, são ST3GAL1 e ST3GAL2 (E.

R.

Sturgill et al., “Biosynthesis of the major brain gangliosides GDla and GTlb,” Glycobiology, vol. 22, no. 10, pp. 1289-1301, outubro de 2012). O mRNA de ST3GAL1 e ST3GAL2 é expresso em SMDC obtido pela presente invenção e expresso em maior quantidade em comparação com os métodos de cultivo de SMDC disponível. Tomados em conjunto, as SMDC com capacidade regenerativa miogênica também expressando antígenos reativos A2B5, podem não apenas regenerar o músculo esquelético, como também fornecerem suporte neuromuscular, especialmente na nova junção neuromuscular durante a regeneração muscular.

[0085] As SMDC, que podem ser utilizadas para o tratamento da disfunção muscular, particularmente para o tratamento de incontinências, como incontinência urinária e/ou anal, exibe preferencialmente um padrão de expressão característico. De preferência, mais do que cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 298% das referidas SMDC expressam CD56 e A2B5. Preferencialmente, as referidas SMDC não expressam CD34, Sca-l e MyoD. Assim, as palavras “não expressam” significam que, preferencialmente, menos de 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou 2% das SMDC expressam os referidos marcadores. O padrão de expressão das SMDC, como descrito acima, pode ser utilizado para determinar o índice de miogenicidade da cultura celular, sem a necessidade de diferenciação. Assim, o referido padrão de expressão das SMDC pode ser para verificar se as células derivadas do músculo esquelético podem ser utilizadas para o tratamento de uma disfunção muscular, particularmente para o tratamento de incontinências, tais como incontinência urinária e/ou anal.

[0086] Um outro objeto da presente invenção é direcionado às SMDC obtidas de acordo com o método da presente invenção.

[0087] De acordo com a presente invenção, as SMDC obtidas com o método da presente invenção podem ser claramente distinguidas das células do estado da técnica, tendo em vista a expressão distinta das enzimas de síntese do antígeno reativo do marcador A2B5 e/ou do marcador A2B5. Uma vez que os gangliosídeos reativos a A2B5 são sintetizados por sialiltransferases, essas sialiltransferases podem, assim, servir como um marcador indireto para a expressão de A2B5. Entre as três importantes sialiltransferases ST3GAL1, ST3GAL2 e ST3GAL3, aquelas com maior atividade aceitadora do glicoesfingolipídeo in vitro altamente expressa no cérebro são ST3GAL1 e ST3GAL2(E. R. Sturgill et al., “Biosynthesis of the major brain gangliosides GDla and GTl1b,” Glycobiology, vol. 22, no. 10, pp. 1289-1301, outubro de 2012). A detecção da expressão de ST3GAL1 e ST3GAL2 permite uma prova indireta da expressão de A2B5. Portanto, o novo método da presente invenção permite a obtenção de SMDC que são diferentes quando comparadas às SMDC obtidas a partir de métodos já existentes no estado da técnica.

[0088] Em uma outra modalidade preferível da presente invenção, as SMDC e as SMDC obtidas a partir do método de acordo com a presente invenção são caracterizadas pela expressão de marcadores distintos. É previsto, de acordo com a presente invenção, que as SMDC são caracterizadas pela expressão positiva de um, dois, três, quatro ou cinco dos marcadores CD56, A2B5, CD105, desmina, Myf5, e Pax7. Ainda mais preferencialmente, é previsto que as SMDC e as SMDC obtidas a partir do método de acordo com a presente invenção, são caracterizadas pela expressão das combinações de marcadores distintos, selecionados a partir da expressão positiva de pelo menos um ou mais marcadores selecionados de CD56, AZB5, CD105, Myf5, e Pax7, e a expressão negativa de pelo menos um ou mais marcadores selecionados de CD34 e MyoD. De preferência, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98%

ou qualquer faixa intermediária dentre os valores mencionados das SMDC, são positivos para qualquer um ou mais de CD56, A2B5, CD1I05, Myf5,e Pax7, Oo que significa que as SMDC expressam CD56, A2B5, CD105, Myf5, e/ou Pax7 em suas superfícies celulares. Além disso, no máximo 59%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0% da população celular expressam qualquer um dos CD34 e/ou MyoD.

[0089] Em uma modalidade particularmente preferível da invenção, as SMDC e as SMDC obtidas a partir do método de acordo com a presente invenção são caracterizadas pela expressão positiva de CD56, A2B5, CD1I05, Myf5, Pax7, e pela expressão negativa de CD34 e MyoD.

[0090] Um outro objeto da presente invenção é direcionado às SMDC obtidas de acordo com um método da presente invenção para uso como uma composição farmacêutica.

[0091] De acordo com a presente invenção, as SMDC obtidas de acordo com um método da presente invenção podem ser utilizadas como ingrediente ativo dentro de uma composição farmacêutica.

[0092] Um outro objeto da presente invenção é direcionado às SMDC obtidas de acordo com um método da presente invenção para uso em um processo de melhoria da conexão neuromuscular.

[0093] Preferencialmente, as a SMDCs, de acordo com a presente invenção, são para uso em um método para melhorar a prevenção e/ou tratamento de neuromiopatias e/ou miopatias. Preferencialmente, as SMDC são para uso em um método de prevenção e/ou tratamento de neuropatias e/ou miopatias, como por exemplo, incontinência fecal «e/ou incontinência urinaria.

[0094] De acordo com a presente invenção, as SMDC podem ser utilizadas em um método que prevê, de preferência, que as SMDC sejam injetadas em um indivíduo que sofra de incontinência. Em geral, a injeção de SMDC em um dado tecido ou local de lesão compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de células em solução ou suspensão, preferencialmente de cerca de 1 x 10º a cerca de 6 x 10º células por 100pl de solução de injeção. A solução de injeção é um meio fisiologicamente aceitável, com ou sem soro autológico. O meio fisiológico aceitável pode ser por meio de exemplo de solução salina fisiológica não limitativa ou de uma solução tamponada com fosfato.

[0095] Finalmente, um outro objeto da presente invenção é direcionado às SMDC obtidas de acordo com o método da presente invenção, para uso em um método de tratamento de disfunção muscular, em que a disfunção muscular é a incontinência, em particular a incontinência urinaria e/ou anal.

[0096] A princípio, qualquer tipo de incontinência anal pode ser tratado, pois o fortalecimento dos sistemas musculares anais proporciona um melhor controle do preenchimento retal. No entanto, é tratada a incontinência anal que resulta da ruptura do períneo, especialmente se o sistema do esfíncter anal e/ou se o M. puborectalis estiver danificado ou ferido. Tal ruptura perineal pode resultar de uma ampla variedade de causas, conforme descrito acima. No entanto, a causa de tal ruptura perineal não é limitativa para a aplicação dos métodos e das SMDC da presente invenção. Os pacientes podem ser tratados com os métodos e as SMDC da presente invenção caso eles sofram de uma ruptura do períneo de terceiro ou quarto grau. Isso se aplica, especialmente às mulheres que sofrem de tal ruptura perineal após o parto com fórceps, às que dão à luz pela primeira vez, as que parem um filho com peso acima de 4kg ou as que sofrem de uma consequência devido a anomalias de posição da criança antes do nascimento. Os métodos e as SMDC da presente invenção também podem ser aplicados após lesão do sistema do esfíncter anal e/ou do M. puborectalis, após procedimentos cirúrgicos. Adicionalmente, os métodos e as SMDC da presente invenção também podem ser aplicados se houver apenas incontinência transitória. Tal tratamento previne o desenvolvimento de uma incontinência anal completa. Outros estados de doenças de incontinência anal a serem tratados com os métodos e as SMDC da presente invenção são as incontinências passivas, incontinências fecais e defecações imperativas.

[0097] Deve-se entender que os métodos e as SMDC de acordo com a presente invenção não podem ser somente utilizados para tratar pacientes que já sofrem com incontinência anal, isto é, que já apresentem os sintomas da incontinência anal, mas podem ser aplicados a indivíduos que ainda não sofrem de incontinência anal, mas com risco elevado de apresentarem- na, como por exemplo, nos casos em que a musculatura retal sofreu danos por cirurgia, parto, acidentes e assim por diante. Outro exemplo seria os casos em que a musculatura retal se torna mais fina do que em um indivíduo saudável, ou em que a musculatura se degenerou devido a outros motivos. Os métodos da presente invenção podem fornecer uma profilaxia adequada para evitar o início da incontinência anal.

[0098] As SMDC a serem utilizadas no tratamento Ou profilaxia da incontinência são preferencialmente homólogas ao receptor.

[0099] Em uma modalidade mais preferível, as referidas SMDC são autólogas ou heterólogas para o receptor. As referidas SMDC podem ser obtidas, por exemplo, por meio de biópsia do bíceps do receptor. As SMDC autólogas reduzem ou minimizam o risco de reações alérgicas, após a injeção de SMDC no receptor. Preferencialmente, as SMDC são células competentes para fusões multinucleadas ou células miogênicas, tais como mioblastos. Mais preferencialmente, as referidas SMDC são células humanas.

[0100] Portanto, a presente invenção também proporciona uma abordagem de profilaxia simples ou método de tratamento para mulheres e homens com incontinência urinária e/ou anal com risco de desenvolverem incontinência urinaria e/ou anal, através do uso de células autólogas derivadas do músculo esquelético para melhorar suas capacidades urinárias e/ou esfíncteres anais. Tal terapia a partir de células derivadas do músculo permite o reparo e a melhora do esfíncter anal e urinário danificado. De acordo com a presente invenção, oO tratamento compreende uma aspiração por agulha para obter células derivadas do músculo, por exemplo, e um breve tratamento de acompanhamento para injetar as células cultivadas e preparadas no paciente. Também de acordo com a presente invenção, células autólogas derivadas do músculo esquelético (SMDC), colhidas e cultivadas para um paciente especifico de incontinência urinária e/ou anal, podem ser empregadas como agentes não alergênicos para aumentar a parede urinária e/ou retal, de forma a melhorar a coaptação e melhorar o músculo do esfíncter urinário e/ou anal. Neste aspecto da invenção, é realizado um transplante simples de células musculares autólogas, como discutido acima.

[0101] De acordo com a presente invenção, células autólogas derivadas de músculo esquelético administradas diretamente no esfíncter urinário e/ou anal, exibem sobrevida a longo prazo. Assim, a injeção de mioblastos autólogos resulta em sobrevivência segura e não imunogênica a longo prazo de miofibras no esfíncter urinário e/ou anal.

[0102] Em uma modalidade particular de acordo com a presente invenção, cerca de 50 a 200pl de uma suspensão de células derivadas do músculo esquelético (com uma concentração de cerca de 1 x 10º a 6 x 10º células por 100ul de solução injetável) são injetadas no esfíncter urinário. O dispositivo de injeção pode ser conectado a um recipiente contendo a suspensão de células a serem injetadas. Para o tratamento da incontinência anal, de preferência cerca de 50pul a lml, mais preferencialmente cerca de 0.5 ml de uma suspensão de células derivadas do músculo esquelético (com uma concentração de cerca de 1 x 10º a 6 x 10º células por 100u1) são injetadas no esfíncter anal externo. O dispositivo de injeção pode ser conectado em um recipiente contendo a suspensão de células a serem injetadas.

[0103] Em outra modalidade, a etapa da injeção pode compreender várias injeções individuais, como cerca de 20 a 40 injeções de suspensão de células derivadas do músculo esquelético, em que em cada injeção são injetadas cerca de 50 a 500pl de uma suspensão de células derivadas do músculo esquelético e em que cada injeção é aplicada em outra região do esfíncter anal. No entanto, estes parâmetros devem ser considerados como meramente exemplificativos e o especialista na técnica poderá prontamente adaptar esses procedimentos aos requisitos do tratamento para cada paciente individual.

[0104] Em outra modalidade da presente invenção, O movimento do dispositivo de injeção em direção ao esfíncter urinário e/ou esfíncter anal é monitorado por sonografia e/ou por meio de EMG (eletromiografia). Em uma modalidade particular, uma sonda transretal é introduzida e a posição da sonda transretal é ajustada de maneira ideal para o tratamento do esfíncter urinário e/ou anal com os métodos de acordo com a presente invenção. Em outra modalidade particular, as células derivadas do músculo esquelético são implantadas na área ao redor do defeito do esfíncter urinário, e/ou anal e/ou especialmente na área do defeito do esfíncter urinário e/ou anal. O paciente pode começar, no dia seguinte após a injeção das células, com os exercícios físicos para promover o tratamento da incontinência urinaria e/ou anal, de acordo com a invenção.

[0105] Em outra modalidade, o tratamento é repetido. O tratamento pode ser repetido, por exemplo, dentro de um ano após o último tratamento, após 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 mês(es) após o último tratamento, ou dentro de 1 a 8 semanas, preferencialmente de 2 a 3 semanas, ou 10 a 20 dias após o último tratamento. Em particular, o tratamento pode ser repetido dentro de 2 a 3 semanas após o último tratamento com células da mesma cultura de células utilizadas no tratamento anterior. Tal abordagem permite um volume de injeção reduzido a cada injeção, e fornece às células mais tempo para se adaptarem, se integrarem e para construírem o músculo. Em uma modalidade ainda mais específica, as injeções são repetidas em intervalos de 2 a 3 semanas até que uma melhoria da continência urinária e/ou anal seja obtida.

[0106] Como mencionado acima, uma via de penetração específica é através da pele de um paciente paralelamente ao curso do reto. No entanto, também é contemplado o processo em que a penetração ocorre diretamente no reto, nas proximidades do músculo lesionado. Em particular, os processos de penetração e injeção são monitorados através de meios de imagem ultrassonográfica. Adicionalmente, uma via de penetração alternativa é contemplada para as mulheres, que é através de uma injeção transvaginal. Neste cenário, o dispositivo de injeção penetra a parede da vagina, e é deslocado para frente até atingir o local de injeção desejado. Em particular, os processos de penetração e injeção são monitorados por meios de imagem ultrassonográfica e/ou de EMG (eletromiografia), também neste cenário.

[0107] Em outra modalidade, o processo de injeção envolve injetar as células derivadas de músculo esquelético na forma de uma “banda de injeção”. O termo “banda de injeção”, como utilizado neste documento, refere-se à disposição das células ao longo do comprimento, ou ao longo de uma porção do comprimento, da trilha da injeção, isto é, ao longo do canal criado pela inserção da agulha no tecido muscular. Em outras palavras, após a injeção, a agulha é retirada enquanto, ao mesmo tempo, as células são expelidas da seringa de forma contínua ou intermitente com a agulha de injeção sendo deslocada, em particular, retraída, ao longo da trilha de injeção. Essa distribuição constante de células proporciona uma entrega contínua da solução de injeção,

incluindo as células, ao longo do canal de injeção que é formado quando o dispositivo de injeção/agulha entra no alvo do tecido muscular. Em uma modalidade particular, a banda de injeção ou canal precisa apresentar um diâmetro igual ou inferior a cerca de 0,8mm, uma vez que, do contrário, isso levaria à necrose das células derivadas do músculo esquelético localizadas no centro do canal de injeção, e, consequentemente, resultaria em uma inflamação prejudicial e outros processos.

[0108] O dispositivo de injeção, para uso nos métodos da presente invenção, pode ser qualquer dispositivo capaz de penetrar o tecido humano, e capaz de fornecer soluções, em particular soluções compreendendo as células derivadas do músculo esquelético, para uma localização desejada dentro do organismo de um indivíduo, em particular um indivíduo humano. O dispositivo de injeção pode compreender, por exemplo, uma agulha oca. O dispositivo de injeção pode ser também qualquer tipo de seringa adequada para injetar células derivadas de músculo esquelético. Em modalidades mais sofisticadas, o dispositivo de injeção pode ser, por exemplo, uma pistola de injeção, injetando a suspensão celular através da aplicação de pressão de ar. Em particular, o dispositivo de injeção é adequado para aplicações de laparoscopia e cirurgia por laparoscopia, respectivamente.

[0109] Ao escolher uma agulha de injeção com diâmetro específico, o volume de injeção por mm? pode ser exatamente predeterminado. o diâmetro da agulha de injeção, normalmente, não excede 5mm, pois isso pode levar a danos nas estruturas musculares.

[0110] os meios de imagem ultrassonográfica para monitorar a posição e ação do dispositivo de injeção podem ser alcançados por qualquer dispositivo ultrassônico de imagem padronizado conhecido na técnica. Além das sondas ultrassônicas padronizadas mono ou biplanares, também podem ser utilizadas novas tecnologias ultrassônicas, como, por exemplo, sonografia 3D, sonografia com Doppler colorido etc. Em uma modalidade particular, conforme mencionado acima, o dispositivo de injeção compreende meios de imagem.

[0111] Está contemplado que qualquer método ou composição aqui descritos possam ser implementados em relação a qualquer outro método ou composição aqui descritos.

[0112] Os exemplos a seguir explicam a presente invenção, mas não são considerados limitativos.

[0113] Exemplo 1 - Obtendo as células derivadas do músculo esquelético (SMDC)

[0114] Para obter as SMDC, uma biópsia do músculo esquelético foi realizada em M. pectoralis principal ou em M. biceps brachii ode um paciente incontinente. Para fazer a biópsia, primeiro a pele foi aberta por meio de uma incisão de aproximadamente lcm de comprimento acima do músculo até atingir a fáscia do M. pectoralis principal. Após a abertura da fáscia, lcm?º de tecido muscular (biópsia) foi retirado. A biópsia foi transferida diretamente para um meio de transporte de biópsia arrefecido previamente a aproximadamente 4ºC e composto pelo meio basal Ham's F10 suplementado com gentamicina (concentração final de 1- Sug/ml). A biópsia foi armazenada por aproximadamente 26 horas a 1-11ºC dentro do meio de transporte da biópsia. Em seguida, a biópsia foi transferida para uma placa de Petri preenchida com PBS lx.

O tecido muscular foi separado do tecido conjuntivo com o uso de uma pinça estéril e bisturi.

Em seguida, o tecido muscular foi transferido para outra placa de Petri preenchida com PBS lx, e dissecado em pedaços com tamanhos de 2-3mm? usando um bisturi.

Após uma etapa de transferência adicional, como foi descrito acima, os pedaços de tecido foram cortados em pedaços de Imm.

Os pedações foram finalmente transferidos para um tubo de centrifugação preenchido com PBS lx e centrifugados por 10 minutos a 1300 rpm.

Após o processo de centrifugação, o sobrenadante foi removido e o tecido muscular ressuspenso em PBS 1x, suplementado com 8 pg/ml de gentamicina.

A suspensão do tecido muscular foi, então, arrefecida a 2-8ºC por 48 horas.

Após o arrefecimento, a suspensão de tecido muscular foi centrifugada por 10 minutos a 1300 rpm, o sobrenadante foi, então, removido e 2,5ml de uma solução de digestão contendo 1-5mg/ml colagenase, 2-4% v/v de tampão Hepes,- 0,1-10 % v/v de soro fetal bovino e 5-l10ug/ml gentamicina em Ham's F10. A suspensão do tecido muscular foi, então, intubada por 6 a hours a 37ºC, a 5% de CO». Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 1300 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi removido, os sedimentos foram ressuspensos em um meio contendo 10-20% v/v de FCS, l1-3ng/ml de bFGF e 3-10pug/ml de gentamicina em Hams F10 e plaqueados em frascos de cultura celular.

As SMDC ligadas ao fundo do frasco de cultura foram, ainda, mantidas, mudando o meio a cada 3-4 dias, subcultivando-se após o desprendimento após o alcance da confluência.

A subcultura foi realizada até atingir 1x10'º a 5x107 de SMDC.

[0115] A contagem das células foi realizada de acordo com o manual do Chemometec Nucleocounter"". Este método utiliza a coloração com iodeto de propídio dos núcleos e calcula o número de células em 0,2ml. Antes da contagem automática, 100ul de uma suspensão celular foram misturados com 200upl do Reagente A - Tampão de Lise (com o objetivo de permeabilizar a membrana celular) e foram incubados à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 200pl do Reagente B - Tampão Estabilizador. A suspensão foi misturada, coletada com uma nucleocasette" e, finalmente, medida.

[0116] A Figura 1 demonstra a morfologia das SMDC em frascos de culturas celulares padronizadas obtidas pela presente invenção e visualizadas por microscopia de contaste de fase.

[0117] Exemplo 2 - Citometria de fluxo

[0118] A análise por citometria de fluxo foi realizada em um citômetro de fluxo Guava easyCyte 6HT 2L (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha). Resumidamente, as células foram colhidas utilizando tripsina a 37ºC por 5 minutos, centrifugadas a 400 rcf e ressuspensas em PBS 1x suplementado com 1% de FCS. As células em uma concentração de 40000/reação foram incubadas com 5pL de anti-CD56-PE (Beckman Coulter Inc., França), Isótipo IgGl1-PE (Beckman Coulter), Isótipo Alexa488 (Sigma), anti-CDl05-PE (Beckman Coulter Inc., França) ou anticorpo AZB5-Alexa488 (Millipore) por 15 minutos em um tubo de Eppendorf6 de 1,5mL a 4ºC no escuro. As células foram lavadas com l1mL de PBS, centrifugadas a 400 rcf e ressuspensas em 200pyL de PBS lx para análise FACS em uma placa de fundo redondo contendo 96 poços. Após a lavagem e ressuspensão, cada reação recebeu 5pL de corante de viabilidade 7-aminoactinomicina D (Beckman Coulter Inc., França) e a placa foi incubada por 10 minutos a 4ºC. Os eventos celulares foram obtidos com a ajuda do software Guava InCyte"" v.2.3. Histogramas e gráficos de pontos foram gerados com um mínimo de 3000 eventos com uma taxa de fluxo de amostra de 1.8pL/mML. A coloração positiva foi obtida por comparação com o conjunto de controle de isótipos, com pelo menos 99% negativo.

[0119] Exemplo 3 - Imunocitoquímica

[0120] Primeiro, o sobrenadante das placas de cultura celular foi descartado e as células foram lavadas três vezes com PBS. A permeabilização e fixação foram realizadas cobrindo as células com solução de formaldeído a 4% (v/v; diluído em PBS) por 20 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas com PBS por três vezes após cada etapa de incubação realizada. Posteriormente, as células foram cobertas com 500ul de bloco de peróxido de hidrogênio (Thermo Fisher Scientific) e foram incubadas por cinco minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários (desmina) em uma concentração final de 40ug por ml (w/v) foram pipetados nas células e foram incubados por, pelo menos, 90 minutos (37ºC, 5% CO,). As células foram, então, cobertas com 500ul de anticorpos (cabra anti-coelho, policlonal, Thermo Fisher Scientific) conjugados à biotina e foram incubadas nas mesmas condições dos anticorpos primários, mas a 60 minutos, pelo menos. Para visualização das ligações de anticorpos, 500p7l de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (Vectorlabs) tiveram que ser adicionados em uma concentração final de 2-5upg/ml (diluído em PBS) e incubados a 37º C, 5% de CO2, por 20 minutos seguidos, cobrindo as células com 500pl de solução única de cromogênio, que foi removida após 5 a 15 minutos. Uma etapa final de lavagem com PBS foi realizada antes que os resultados pudessem ser observados. As células coloridas com desmina positiva por imunocitoquímica são visualizadas na cor vermelho escuro.

[0121] Exemplo 4 - Pureza da SMDC

[0122] As SMDC obtidas pelo procedimento descrito no Exemplo 1 foram testadas quanto à pureza dos marcadores miogênicos CD56 (NCAM) e desmina. A porcentagem de células positivas para CD56 foi mensurada por citometria de fluxo, como descrito no Exemplo 2. As SMDC obtidas pela presente invenção, como indicado no Exemplo 1, continham 99,3% de células positivas para CD56 (Figura 2A) e 98,77% de células viáveis (Figura 2B). Além disso, a expressão de desmina de um lote representativo de SMDC, obtido pelo método descrito no Exemplo 1, foi analisada pela imunocitoquímica, conforme é descrito no Exemplo 3. A Figura 4 demonstra a alta pureza das SMDC obtidas pelo Exemplo 1, pois a maioria das células é positiva para processos de coloração por desmina (Figura 3).

[0123] Exemplo 5 - Diferenciação celular

[0124] A diferenciação de mioblastos humanos em miotubos sinciciais ocorre quando o meio de crescimento é substituído por um meio de diferenciação isento de soro. O meio de diferenciação de células do músculo esquelético (Promo Cell) foi suplementado com um pacote de suplementos de meio de diferenciação de células do músculo esquelético (conforme descrito no protocolo da empresa em que o meio foi obtido) e 250pl de gentamicina. Para o início da diferenciação, as células (em meio de crescimento) foram cultivadas em placas de 4 ou 24 poços (60000-480000 células) contadas anteriormente, conforme explicado no Exemplo 1. Depois que as células foram ligadas à placa (durante a noite), o crescimento no meio foi descartado, as células foram lavadas uma vez com meio de diferenciação e cobertas com 500ul de meio de diferenciação.

[0125] Exemplo 6 - Potência miogênica das SMDC

[0126] As SMDC pertencentes à linhagem miogênica são capazes de fundir e formar miotubos sinciciais in vitro, que são representativos para as fibras musculares esqueléticas in vivo. Assim, a potência miogênica das SMDC foi testada por diferenciação in vitro. As células obtidas no Exemplo 1 foram induzidas a se diferenciarem, conforme descrito no Exemplo 5, com a finalidade de testar o potencial miogênico. As SMDC formaram enormes miotubos que eram positivos para desmina (apresentando colorações de acordo com o Exemplo 3), como mostrado em um lote representativo de SMDC na Figura 4. Os resultados confirmaram o potencial miogênico das SMDC, que é necessário para a regeneração funcional do tecido muscular esquelético.

[0127] Exemplo 7 - Análise de expressão genética

[0128] As SMDC obtidas pelo Exemplo 1 foram cultivadas seguindo a contagem de células também descrita no Exemplo 1, a uma densidade de 500.000 células por poço em placas de 6 poços (NUNC Thermo Scientific) até 70% de confluência, e o RNA total foi isolado utilizando o kit de isolamento RNeasy RNA (QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e pureza de RNA foram avaliadas por análise de microfluidos, utilizando eletroforese em gel desnaturante e o bioanalisador 2100 Agilent.

A preparação da amostra para a hibridação com “microarrays” (microarranjos) foi realizada conforme descrito nos manuais do NuGEN Ovation PicoSL WTA System V2 e NUGEN Encore Biotin Module (NuUGEN Technologies, Inc, San Carlos, CA, EUA). Em resumo, 7,5ng do RNA total foram transcritos de forma reversa em cDNA de fita dupla, em um processo de duas etapas, introduzindo uma sequência de marcadores SPIA.

O cDNA purificado de esferas foi amplificado por uma reação de amplificação de SPIA, seguida por uma purificação adicional das esferas. 4,5pug de cDNA de SPIA foram fragmentados, marcados com biotina terminal e hibridizados com matrizes de expressão genética humana Affymetrix PrimeView Human Gene Expression, por 16h e a 45º em um forno de hibridização GeneChip Hybridization Oven 640. As matrizes hibridizadas foram lavadas e marcadas em uma estação Affymetrix Fluidics Station FS450, e os sinais fluorescentes foram medidos com um scanner Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G.

As funções fluídicas e de varredura foram controladas pelo software Affymetrix GeneChip Command Console v4.1.3. O processamento da amostra foi realizado em um fornecedor de serviços e instalações Affymetrix Service Provider and Core Facility, “KFB - Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics” (Regensburg, Alemanha; www.kífb- regensburg.de). Os sinais resumidos dos conjuntos de sondas na escala log, foram calculados utilizando o algoritmo RMA (1) com o software Affymetrix GeneChip Expression Console vl.4 Software.

Com o objetivo de comparar os resultados da expressão gênica das SMDC obtidas pelo Exemplo 1 com as SMDC obtidas pelos métodos do estado da técnica, os dados de expressão gênica das SMDC (Lonza) comercialmente disponíveis, publicados por Abujarour et al., 2014 (R. Abujarour et al., “Myogenic differentiation of muscular dystrophy-specific induced pluripotent stem cells for use in drug discovery,” Stem Cells Transl. Med., vol. 3, no. 2, pp. 149-160, fevereiro de 2014) foram baixados de um banco de dados anexado a uma publicação (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/geo/DATA/supplementary/seri es/GSE46633/GSE46633 RAW.tar; last accession 21.07.2017). A comparação da expressão gênica das SMDC obtidas pelo Exemplo l com as SMDC analisadas por Abujarour et al., 2014 foi realizada comparando as leituras médias por anotação de diferentes genes, aplicando o software Partek Flow, de acordo com a empresa fornecedora (Partek Inc.). Leituras médias mais altas por anotação representam, portanto, uma abundância maior de mRNA anotado, representando uma maior expressão gênica.

[0129] Exemplo 8 = Características de suporte neuromuscular das SMDC

[0130] As características de suporte neuromuscular das SMDC obtidas através do emprego do Exemplo 1 foram determinadas pela ligação positiva do anticorpo A2B5 à superfície celular presente nas SMDC, como realizado por meio da citometria de fluxo (descrita no Exemplo 2). Conforme é mostrado na Figura 5, 96,16 % das SMDC obtidas pelo Exemplo 1 são positivas para o anticorpo reativo A2B5, demonstrando que, além de seu comprometimento miogênico (desmina, expressão de CD56), as SMDC também exibem características neuronais. Para comparar a característica do suporte neuromuscular das SMDC obtidas pela presente invenção com mioblastos isolados pelo métodos do estado da técnica, a expressão gênica das enzimas essenciais para a formação de gangliosídeos reativos para A2B5 exibindo maior atividade aceitadora de glicoesfingolipídeo in vitro, foram analisados os ST3GAL1 e ST3GAL2 das SMDC, conforme indicado no Exemplo

7. A expressão de mRNA de ST3GAL1 e ST3GAL2 foi superior em SMDC obtidas pela proposta de invenção do presente documento em comparação com o SDMC disponível comercialmente, como é mostrado na Figura 5. Além disso, a expressão de ST3GAL3 também foi superior em SMDC obtidas pelo Exemplo 1.

[0131] Exemplo 9 - Obtendo células sem arrefecimento após a dissecção do tecido

[0132] Como um exemplo comparativo, o método da presente invenção foi conduzido omitindo a etapa de arrefecimento. Para obter as SMDC, uma biópsia do músculo esquelético foi retirada do M. pectoralis principal ou do M. biceps brachii, de um paciente incontinente. Para fazer a biópsia, primeiro a pele foi aberta por uma incisão de aproximadamente lcm de comprimento acima do músculo até que a fáscia do M. pectoralis principal fosse alcançada. Após a abertura da fáscia, leem? de tecido muscular (biópsia) foi retirado. A biópsia foi transferida diretamente em um meio de transporte de biópsia arrefecido previamente a aproximadamente 4ºC e composto por um meio basal de Ham's F10, suplementado com gentamicina (concentração final de 1-5pg/ml). A biópsia foi armazenada por aproximadamente 26 horas a 1-11ºC dentro do meio de transporte de biópsia. Em seguida, a biópsia foi transferida para uma placa de Petri preenchida com PBS lx. O tecido muscular foi separado do tecido conjuntivo por meio de uma pinça estéril e um bisturi. Em seguida, o tecido muscular foi transferido para outra placa de Petri preenchida com PBS lx e dissecado em pedaços com tamanhos entre 2-3 mm? usando um bisturi. Após uma etapa adicional de transferência, conforme mencionado acima, os pedaços do tecido foram cortados em pedações de Imm. Os pedaços foram finalmente transferidos para um tubo de centrifugação por 10 minutos a 1300rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e o tecido muscular foi ressuspenso em PBS lx suplementado com 8ug/ml de gentamicina. A suspensão de tecido muscular foi centrifugada a 10 minutos a 1300rpm, o sobrenadante foi removido, e 2,5ml de uma solução de digestão contendo 1- S5mg/ml de colagenase, 2-4% v/v de tampão Hepes, 0,1-10% v/v de soro fetal de bezerro e 5-10ug/ml de gentamicina em Ham's F10. A suspensão do tecido muscular foi então intubada por 6 a 20 horas a 37ºC, em 5% de CO;. Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 1300rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi removido, os sedimentos foram ressuspensos em um meio contendo 10-20% v/v de FCS, l1-3ng/ml de bFGF e 3-10ug/ml de gentamicina em Hams F10 e cultivados em frascos para culturas celulares. As SMDC ligadas no fundo do frasco de cultura foram, ainda, mantidas, mudando o meio a cada 3-4 dias e subcultivando-se após o descolamento, depois da obtenção da confluência. A subcultura foi realizada até atingir 1x10'º a 5x107 de SMDC.

[0133] Exemplo 10 - Expressão do marcador de células mesenquimais das SMDC

[0134] A expressão do marcador mesenquimal das SMDC obtidas através do emprego do Exemplo 1 foi determinada pela ligação do anticorpo anti-CDl05, anti-CDl05-PE (Beckman Coulter Inc., França), à superfície celular das SMDC medida por citometria de fluxo (descrita no Exemplo 2). Como é mostrado na Figura 8, 98,69% das SMDC obtidas pelo Exemplo 1 são detectadas como positivas para o anticorpo reativo CD105 quando o limiar de positividade for definido de acordo com o controle Isótipo (0,31% positivo), sugerindo que as SMDC são mesenquimais e/ou de origem mesenquimal.

[0135] Exemplo 11 = Medição da atividade da acetilcolinesterase das SMDC

[0136] Para a medição da atividade de acetilcolinesterase (AChE), 200.000 SMDC foram cultivadas em um poço revestido com gelatina de uma placa de 24 poços e foram induzidas a se diferenciarem, conforme descrito no Exemplo 5. Seis dias após o início da diferenciação, o meio de diferenciação foi cuidadosamente removido da placa de 24 poços com a adição imediata de 300puL de solução 0,5mM de ácido 5,5'-ditiobis- 2-nitrobenzóico (DTNB), preparado em tampão fosfato, pH 7,2 com 0,1% de triton X-100). Após 2 minutos de incubação à temperatura ambiente, no escuro, foram adicionados 50puL de 5,76mMM de iodeto de acetilcolina (ATI), preparado em água destilada. O conteúdo da reação foi incubado por 60 minutos a 30ºC no escuro, seguido da medição da densidade óptica (OD) a 412nm (OD412nm) em um leitor de microplacas Anthos Zzenyth 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, Reino Unido). Também foi incluída uma reação em branco, composta por todos os reagentes, exceto as células. Os valores corrigidos de OD412nm foram obtidos subtraindo a medição média em branco da média de OD412nm. A atividade de AChE em mU relativo (ACRE mUrel) foi calculada de acordo com a equação linear de uma curva padrão. A curva padrão foi obtida através da medição das diluições de 4-500mU/ml de um estoque pronto para uso de AChE de 50U/mL (da Electrophorus electricus, AAT BioquestO

Inc., Sunnyvale, CA, EUA). As diluições padronizadas foram preparadas em tampão fosfato (pH 7,2 com 0,1% de triton X- 100) e foram utilizadas imediatamente. Para a análise enzimática padrão de AChE, 200puL de cada diluição foram misturados com 300pL de 0,5mM de DTNB e 50uL de 5,76mM de ATI, respectivamente, e a OD412nm foi medida após 60 minutos em uma placa de 24 poços. Para normalizar as concentrações de proteínas específicas do tipo de célula, a atividade da AChE da quantidade medida de células foi dividida pelo conteúdo total de proteínas dessas células, resultando em atividade de mUrel AChE por g de proteína (AChE mUrel/g de proteína). Para analisar a quantidade total de proteína dentro de uma população celular, uma alíquota de células aderentes diferenciadas de acordo com o Exemplo 5 foi primeiramente lavada duas vezes com PBS, posteriormente coberta com PBST (0,1% de Triton X-100) e, então, incubada por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, o lisado foi ressuspenso e transferido para um tubo Eppendorfo, agitado em turbilhão rapidamente e depois centrifugado por 4 minutos a 1200*g. Finalmente, o sobrenadante transparente foi transferido para um tubo Eppendorf fresco e a concentração de proteína foi determinada utilizando o kit Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, MA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante, medindo a OD a 540nm com um leitor de microplacas Anthos Zenyth 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, Reino Unido).

[0137] Exemplo 12 - Quantificação da competência de fusão das SMDC

[0138] A competência de fusão das SMDC é baseada em sua capacidade de formar miotubos multinucleados e representa sua potência miogênica.

A competência de fusão é quantificada como índice de fusão, que representa o número de núcleos localizados nos miotubos multinucleados, definidos como células contendo pelo menos 3 núcleos, divididos pelo número total de núcleos no campo microscópico observado.

A fim de determinar o índice de fusão das SMDC, 2*105 células foram cultivadas em placas de 24 poços revestidas com gelatina e induzidas a se diferenciarem através da mudança do crescimento para o meio de diferenciação do músculo esquelético 24 horas após a cultura.

Após 6 dias de diferenciação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com 4% de PFA por 10 minutos.

Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS e coloridas com solução de 2ug/mL de Hoechst33342 por 20 minutos.

Para cada amostra, pelo menos três campos foram capturados durante a imagem de imunofluorescência e sobrepostos com imagens de contraste de fase para permitir a fácil detecção dos limites de núcleos e células.

O índice de fusão foi calculado para cada campo de visão capturado dividindo o número de núcleos dentro dos tubos com o número total de núcleos por campo, após o cálculo da média de todos os campos analisados.

Somente as células que tiveram pelo menos 3 núcleos foram consideradas como miotubos.

Para análise estatística, pelo menos 3 populações derivadas de diferentes pacientes foram analisadas para cada grupo celular.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para obter células derivadas do músculo esquelético (SMDC), caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) arrefecimento de uma amostra obtida a partir do tecido muscular esquelético em um tampão; (b) processamento e arrefecimento da amostra; (c) ressuspensão da amostra da etapa (b) em meio a um soro compreendendo pelo menos uma enzima, aquecendo-a em até 38ºC por 1 a 20 horas; realizando a peletização da amostra e a (d) ressuspensão dos sedimentos da amostra obtidos na etapa (c) para fornecer uma suspensão de célula única a partir da amostra da etapa (c), obtendo, assim, as SMDC.

2. Um método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra (a) é conduzida a uma temperatura inferior a 16ºC, preferencialmente em uma faixa de temperatura de 1 a 16ºC, preferencialmente de 4 a 10ºC, mais preferencialmente a 7ºC; e por um período de até 96 horas.

3. Um método, de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende o uso de tesouras, bisturi, pinça, filtro ou moinho de bolas.

4, Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de arrefecimento da etapa (b) é conduzido a uma temperatura na faixa de 1 a 16ºC, preferencialmente de 4 a 8ºC, mais preferencialmente 4 “C e por um intervalo de 2 horas a 48 horas.

5. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende conduzir o tratamento enzimático com uma solução compreendendo qualquer um ou os mais dos grupos selecionados que consiste em tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, colagenase, desoxirribonuclease e DNAse.

6. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é conduzida a uma temperatura na faixa de 25 a 38ºC, preferencialmente de 36 a 38ºC, mais preferencialmente a 37ºC.

7. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) compreende preferencialmente um método selecionado, entre pelo menos um dos métodos de classificação de FACS, de centrifugação, classificação eletrocinética, classificação por acostoforese, classificação celular por esferas e classificação óptica.

8. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma outra etapa adicional (e) é conduzida após a etapa (d), incluindo a incubação da suspensão de célula única obtida na etapa (d), em que a incubação na etapa (e) é preferencialmente realizada em uma temperatura na faixa de 25 a 38ºC, preferencialmente de 36 a 38ºC, mais preferencialmente a 37ºC, obtendo-se assim, SMDC aderentes.

9. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que após a etapa (e), opcionalmente, uma outra etapa (f) é realizada, compreendendo o descarte de células não aderentes da etapa (e), em que a etapa (£) é preferencialmente conduzida após, pelo menos, 6 horas a 4 dias.

10. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que após a etapa (f), opcionalmente, uma outra etapa (g) é conduzida para a propagação das células aderentes da etapa (e), a propagação na etapa (h) compreendendo a cultura das células aderentes por 1 a 5 passagens para atingirem 70 a 80% de confluência.

11. SMDC, caracterizadas por compreenderem pelo menos 60% de células positivas para CD56 e 60% de células positivas para A2B5.

12. SMDC, caracterizadas por serem obtidas de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.

13. SMDC, de acordo com as reivindicações 11 e 12, caracterizadas pela expressão de combinações distintas de marcadores, selecionadas a partir da expressão positiva de, pelo menos, um ou mais dos marcadores selecionados dentre CD56, A2B5, CD1I05, Myf5 e Pax7/, e a expressão negativa de, pelo menos, um ou mais marcadores selecionados de CD34 e MyoD.

14. SMDC, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizadas por serem usadas como composição farmacêutica.

15. SMDC, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizadas por serem usadas em um método de prevenção e/ou tratamento de neuropatias e/ou miopatias, preferencialmente, as SMDC sendo utilizadas em um método de prevenção e/ou tratamento de neuromiopatias e/ou miopatias associadas à incontinência fecal e/ou à incontinência urinária.

16. SMDC, de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizadas por serem usadas em um método de tratamento de uma disfunção muscular, em que a disfunção muscular é a incontinência, em particular a urinária e/ou a incontinência anal ou fecal.