CN116590377A - 一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，涉及药物敏感性检测技术领域，本发明所提供的患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法利用三维肿瘤类器官培养，更好地模拟了体内肿瘤生物复杂性，药物处理更接近体内环境，预测患者对不同药物的敏感性，提供个性化用药方案；同时进行单细胞悬浮液和组织片段的同时培养，考虑到细胞异质性以及细胞间相互作用，由于肿瘤组织中存在不同类型的细胞，其中单细胞悬浮液培养可以更好分析不同细胞亚群的行为和反应，组织片段培养可以保留肿瘤组织的三维结构，包括细胞排列方式、细胞间基质的存在，提供了更全面、准确的肿瘤特征和药物响应信息。
Description
技术领域
本发明涉及药物敏感性检测技术领域，具体为一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法。
背景技术
药物敏感性检测是通过测试个体对特定药物的反应来确定他们是否具有药物敏感性的方法，可以帮助医生更好地了解患者的药物反应，并据此调整治疗方案，以确保患者的安全和疗效，药物敏感性检测通常包括：基因检测，一些药物敏感性与个体的基因变异相关，通过基因检测，可以确定某些基因的变异情况，从而预测个体对特定药物的敏感性，肤过敏测试，某些人可能对某些药物存在过敏反应，皮肤过敏测试可以通过在皮肤上施加小剂量的药物来检测患者对该药物的过敏反应，指定药物的特定测试，对于某些药物，可能会进行特定的测试来检测患者对该药物的敏感性。
药物敏感性检测的目的是确定个体对特定药物的反应，并根据测试结果制定个体化的治疗方案，从而提高治疗效果并降低不良反应的风险，这种检测通常由医生或临床药剂师进行，并根据患者的病情和个体特征来决定是否需要进行，由于每个人对药物的反应可能存在差异，有些人可能对某些药物更敏感，而有些人则可能对某些药物不敏感，药物敏感性检测可以帮助医生更好地了解患者的个体差异，从而为他们提供更安全、有效的治疗方案，一些药物可能引起严重的不良反应，包括过敏反应、中毒和器官损伤等，通过药物敏感性检测，可以预测个体对某些药物的敏感性，从而避免不必要的风险和不良反应，了解患者对特定药物的敏感性可以帮助医生选择更适合的药物，提高治疗的效果。
但是在现有技术中，传统药物敏感性检测方法是通过在实验室中使用体外细胞培养的药物敏感性测试，细胞培养法中，将肿瘤细胞分离、培养，然后将不同浓度的药物加入培养基中，观察细胞的生长、增殖和存活情况，通过测定细胞的生存率或细胞增殖抑制率来评估药物的敏感性，该检测方法存在一些局限性，无法考虑多种药物的组合效应、忽略了肿瘤的异质性和复杂性，因此，为了更准确地评估药物敏感性和个体化治疗策略，近年来出现了更多综合性的药物敏感性检测方法，如组织切片培养、体外三维培养，其中组织切片培养无法有效模拟组织细胞实际环境，而三维培养在药物处理阶段通过组织片段的药理测试进行模拟，忽略了细胞亚群的行为和反应，即肿瘤内部的细胞异质性，肿瘤内部的细胞异质性指的是在同一肿瘤中存在多种不同类型的细胞，这些细胞可能具有不同的遗传变异、表型特征、功能状态和药物敏感性，从而导致对于肿瘤内部不同类型细胞的药敏检测效果较差，降低了药物敏感性检测的准确度。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的组织片段的药理测试模拟忽略了细胞亚群的行为和反应，对于肿瘤内部不同类型细胞的药敏检测效果较差的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，该方法包括：
患者来源器官样本采集，采用细针穿刺方式获取患者体内的肿瘤组织样本，采用细针穿刺进行样本采集，具体的穿刺取样步骤如下：
a. 选用超声、CT和MRI影像引导，确定穿刺位置和深度；
b. 对待取样部位进行局部麻醉，采用细针穿刺肿瘤组织，并进行至少2次穿刺来获取器官组织样本；
c. 将细针穿刺采集的组织和细胞样本直接放入含有保存液的容器中，并从容器中取样在载玻片上涂片后进行固定和染色；
肿瘤组织处理，将染色后的肿瘤组织样本进行细胞分离、切割，获取单细胞悬浮液以及组织片段；
肿瘤组织培养，将肿瘤单细胞悬浮液和组织片段置于体外培养条件下，并提供适宜的培养基和环境，促使细胞生长和形成三维肿瘤类器官；
药物处理，将不同类型的抗肿瘤药物添加到培养系统中，与肿瘤类器官相互作用，模拟体内药物治疗的效果，并进行细胞和组织观察和功能评估。
本发明进一步地设置为：所述在载玻片上涂片后进行固定和染色的步骤具体包括：
a.准备浓度为2%-4%的乙醛溶液；
b.将涂片浸入乙醛溶液中，使其完全浸润，浸润时间保持为15—30分钟；
c.将固定的涂片用PBS洗涤一次，以去除多余乙醛溶液；
d.选用免疫组织化学染色（IHC）和荧光染色法对药物敏感性检测对应细胞蛋白进行标记；
e.将染色后载玻片上的涂片转移到培养皿中，并添加细胞培养基。培养基成分包括：90%RPMI 1640溶液、10%胎牛血清；
本发明进一步地设置为：所述肿瘤组织培养步骤中的体外培养条件包括培养容器、培养基以及培养条件调节；
所述培养基选用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640、F-12，培养基内选用添加胎牛血清（FBS）和人源血清，以及细胞组织所需的对应营养物和生长因子；
所述培养容器选用培养皿、细胞培养板、培养滤器，将肿瘤单细胞悬浮液和组织片段分别分开加入不同培养基中，细胞悬浮液采用离心分离纯化细胞群，组织片段采用酶消化将组织细胞分离开；
所述培养条件调节，调整培养条件促进细胞生长和三维结构的形成，具体控制因素包括控制培养基pH值、温度和湿度，并提供所需氧气和二氧化碳气氛，添加生长因子和细胞因子，在培养基中添加适当的生长因子和细胞因子，促进肿瘤细胞的生长和类器官的形成，生长因子和细胞因子选用成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板源性生长因子（PDGF）；
本发明进一步地设置为：所述细胞分离，采用酶消化法，将肿瘤组织样本切成小块，选用胰蛋白酶和胶原酶进行酶解，分解细胞间的连接和基质，使用细胞培养基离心获得细胞悬浮液；
本发明进一步地设置为：所述肿瘤组织处理步骤中的组织切割，选用组织切片机、手动切片技术，将肿瘤组织样本切割成薄组织片段；
本发明进一步地设置为：所述肿瘤组织处理步骤中的均质化处理，选用均质器、超声波处理器对肿瘤组织样本进行均质化处理；
本发明进一步地设置为：所述药物处理步骤中的抗肿瘤药物具体为对应敏感性检测药物和需要所选择的对应的抗肿瘤药物，药物选用化疗药物、靶向治疗药物、免疫疗法药物，根据所选药物的特性和目标，确定具体药物浓度和处理时间；
所述药物添加方式具体为，将选定的抗肿瘤药物添加到肿瘤类器官的培养系统中，加入方式选择在培养基中形成药物溶液，然后将其加入培养系统中；
本发明进一步地设置为：所述药物处理步骤中的处理时间和浓度控制，根据药物的特性和预期效果，确定处理时间和药物浓度，时间和浓度参数根据先前研究和临床实践的经验进行确定；
所述药物处理步骤中的细胞和组织观察和功能评估具体为，在药物处理后，定期观察和评估肿瘤类器官中细胞的生存状态、形态学变化和功能，选用显微镜观察细胞形态，细胞增殖和凋亡分析，以及特定标记物的表达分析，根据凋亡分析和表达分析情况，对药物处理后的肿瘤类器官进行功能评估，评估包括：细胞增殖和生存率的测定、细胞周期分析、细胞凋亡检测、细胞迁移和侵袭能力分析。
采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
本发明所提供的患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法利用三维肿瘤类器官培养，更好地模拟了体内肿瘤生物复杂性，包括细胞－细胞相互作用、细胞－基质相互作用、肿瘤微环境，通过体外培养条件下的肿瘤类器官组织，药物处理更接近体内环境，可以更准确地评估药物对肿瘤的反应，预测患者对不同药物的敏感性，提供个性化用药方案；同时进行单细胞悬浮液和组织片段的同时培养，考虑到细胞异质性以及细胞间相互作用，由于肿瘤组织中存在不同类型的细胞，包括肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞，其中单细胞悬浮液培养可以更好分析不同细胞亚群的行为和反应，揭示肿瘤内部的细胞异质性，而组织片段培养则可以提供更接近原生肿瘤微环境的条件，同时组织片段培养可以保留肿瘤组织的三维结构，包括细胞排列方式、细胞间基质的存在，提供了更全面、准确的肿瘤特征和药物响应信息，解决了现有技术中存在的组织片段的药理测试模拟忽略了细胞亚群的行为和反应，对于肿瘤内部不同类型细胞的药敏检测效果较差的问题。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施条例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、患者来源器官样本采集，采用细针穿刺方式获取患者体内的肿瘤组织样本；
采用细针穿刺进行样本采集，具体的穿刺取样步骤如下：
a. 选用超声、CT和MRI影像引导，确定穿刺位置和深度；
b. 对待取样部位进行局部麻醉，采用细针穿刺肿瘤组织，并进行至少2次穿刺来获取器官组织样本；
c. 将细针穿刺采集的组织和细胞样本直接放入含有保存液的容器中，并从容器中取样在载玻片上涂片后进行固定和染色；
采用细针穿刺相比于手术切除或开放手术等侵入性手术方式，细针穿刺是一种较为轻微的操作，不需要进行大规模组织切除或创伤性操作，更低的感染风险，细针穿刺可以直接穿透皮肤和软组织，获取目标组织样本，对于深处组织和器官的采集，相比较手术取样和活检取样，可更为准确地定位和获取目标组织，避免了对周围正常组织的不必要损伤。
在载玻片上涂片后进行固定和染色的步骤具体包括：
a.准备浓度为2%-4%的乙醛溶液；
b.将涂片浸入乙醛溶液中，使其完全浸润，浸润时间保持为15—30分钟；
c.将固定的涂片用PBS洗涤一次，以去除多余乙醛溶液。
d.选用免疫组织化学染色（IHC）和荧光染色法对药物敏感性检测对应细胞蛋白进行标记。
e.将染色后载玻片上的涂片转移到培养皿中，并添加细胞培养基。培养基成分包括：90%RPMI 1640溶液、10%胎牛血清；
保存液成分包括：pH值为6.8-7.6的Tris缓冲液10mmol/L、甘氨酸20mmol/L、葡萄糖5—10mmol/L、链霉素100 U/mL - 100 μg/mL、胎牛血清25mmol/L；
保存液中的缓冲液可以维持样本的pH值稳定，防止酸碱性变化对样本的影响、链霉素可以抑制微生物的生长和繁殖，防止细菌、真菌等污染样本，而胎牛血清提供细胞生长所需的营养和生长因子，维持细胞的生存状态。
通过染色为细胞组织提供特定的颜色标记，使其在显微镜下更容易观察和分析。
步骤2、肿瘤组织处理，将染色后的肿瘤组织样本进行细胞分离、切割，获取单细胞悬浮液以及组织片段。
细胞分离，采用酶消化法，将肿瘤组织样本切成小块，选用胰蛋白酶和胶原酶进行酶解，分解细胞间的连接和基质，使用细胞培养基离心获得细胞悬浮液；相比机械分离法和免疫磁珠分离，酶消化法通常能够快速而彻底地分解组织间质和细胞间连接物质，释放细胞，同时能够获得更纯的单个细胞悬浮液，避免出现杂质和污染，提高后续药物敏感性检测精度。
组织切割，选用组织切片机、手动切片技术，将肿瘤组织样本切割成薄组织片段，所获取的组织片段用于后续的组织染色、免疫组织化学分析。
均质化处理，选用均质器、超声波处理器对肿瘤组织样本进行均质化处理，通过均质化处理以破坏组织结构，使其变成悬浮液状态，便于后续提取细胞内的DNA、RNA、蛋白质分子，以及单细胞测序分析。
步骤3、肿瘤组织培养，将肿瘤单细胞悬浮液和组织片段置于体外培养条件下，并提供适宜的培养基和环境，促使细胞生长和形成三维肿瘤类器官。
培养容器、培养基，培养基选用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640、F-12，培养基内选用添加胎牛血清（FBS）和人源血清，以及细胞组织所需的对应营养物和生长因子。
培养容器，选用培养皿、细胞培养板、培养滤器；
将肿瘤单细胞悬浮液和组织片段分别分开加入不同培养基中，细胞悬浮液采用离心分离纯化细胞群，组织片段采用酶消化将组织细胞分离开。
培养条件调节，调整培养条件促进细胞生长和三维结构的形成，具体控制因素包括控制培养基pH值、温度和湿度，并提供所需氧气和二氧化碳气氛。
此处可以使用细胞培养箱或者生物反应器来提供稳定的培养环境。
添加生长因子和细胞因子，在培养基中添加适当的生长因子和细胞因子，促进肿瘤细胞的生长和类器官的形成，生长因子和细胞因子选用成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板源性生长因子（PDGF），并进行细胞观察和维护，在培养过程中，定期观察和评估细胞生长和三维结构的形成情况，使用显微镜对已经染色的细胞和组织进行观察和分析。
同时进行单细胞悬浮液和组织片段的培养，考虑到细胞异质性以及细胞间相互作用，如细胞间信号传导、细胞间相互作用，由于肿瘤组织中存在不同类型的细胞，包括肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞，其中单细胞悬浮液培养可以更好分析不同细胞亚群的行为和反应，揭示肿瘤内部的细胞异质性，而组织片段培养则可以提供更接近原生肿瘤微环境的条件，同时组织片段培养可以保留肿瘤组织的三维结构，包括细胞排列方式、细胞间基质的存在，提供了更全面、准确的肿瘤特征和药物响应信息。
步骤4、药物处理，将不同类型的抗肿瘤药物添加到培养系统中，与肿瘤类器官相互作用，模拟体内药物治疗的效果。
根据对应敏感性检测药物和需要，选择对应的抗肿瘤药物，药物选用化疗药物、靶向治疗药物、免疫疗法药物，根据所选药物的特性和目标，确定具体药物浓度和处理时间。
药物添加，将选定的抗肿瘤药物添加到肿瘤类器官的培养系统中，加入方式选择在培养基中形成药物溶液，然后将其加入培养系统中。
区别直接加入培养基，可以确保药物与肿瘤细胞组织的充分接触，
处理时间和浓度控制，根据药物的特性和预期效果，确定处理时间和药物浓度，时间和浓度参数根据先前研究和临床实践的经验进行确定。
细胞和组织观察和功能评估，在药物处理后，定期观察和评估肿瘤类器官中细胞的生存状态、形态学变化和功能，选用显微镜观察细胞形态，细胞增殖和凋亡分析，以及特定标记物的表达分析，根据凋亡分析和表达分析情况，对药物处理后的肿瘤类器官进行功能评估，评估包括：细胞增殖和生存率的测定、细胞周期分析、细胞凋亡检测、细胞迁移和侵袭能力分析
通过对数据分析结果解读，对实验结果进行数据分析和解读，评估药物对肿瘤类器官的效应，比较不同药物的效果，探索药物对肿瘤细胞和组织的影响机制，患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法直接使用患者自身肿瘤组织，考虑了个体差异，具有更准确的个性化特异性。
本发明所提供的患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法利用三维肿瘤类器官培养，更好地模拟了体内肿瘤生物复杂性，包括细胞－细胞相互作用、细胞－基质相互作用、肿瘤微环境，通过体外培养条件下的肿瘤类器官组织，药物处理更接近体内环境，可以更准确地评估药物对肿瘤的反应，预测患者对不同药物的敏感性，提供个性化用药方案；同时进行单细胞悬浮液和组织片段的同时培养，考虑到细胞异质性以及细胞间相互作用，由于肿瘤组织中存在不同类型的细胞，包括肿瘤细胞、间质细胞、免疫细胞，其中单细胞悬浮液培养可以更好分析不同细胞亚群的行为和反应，揭示肿瘤内部的细胞异质性，而组织片段培养则可以提供更接近原生肿瘤微环境的条件，同时组织片段培养可以保留肿瘤组织的三维结构，包括细胞排列方式、细胞间基质的存在，提供了更全面、准确的肿瘤特征和药物响应信息。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，该方法包括：
患者来源器官样本采集，采用细针穿刺方式获取患者体内的肿瘤组织样本，采用细针穿刺进行样本采集，具体的穿刺取样步骤如下：
a. 选用超声、CT和MRI影像引导，确定穿刺位置和深度；
b. 对待取样部位进行局部麻醉，采用细针穿刺肿瘤组织，并进行至少2次穿刺来获取器官组织样本；
c. 将细针穿刺采集的组织和细胞样本直接放入含有保存液的容器中，并从容器中取样在载玻片上涂片后进行固定和染色；
肿瘤组织处理，将染色后的肿瘤组织样本进行细胞分离、切割，获取单细胞悬浮液以及组织片段；
肿瘤组织培养，将肿瘤单细胞悬浮液和组织片段置于体外培养条件下，并提供适宜的培养基和环境，促使细胞生长和形成三维肿瘤类器官；
药物处理，将不同类型的抗肿瘤药物添加到培养系统中，与肿瘤类器官相互作用，模拟体内药物治疗的效果，并进行细胞和组织观察和功能评估。
2.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，所述在载玻片上涂片后进行固定和染色的步骤具体包括：
a.准备浓度为2%-4%的乙醛溶液；
b.将涂片浸入乙醛溶液中，使其完全浸润，浸润时间保持为15—30分钟；
c.将固定的涂片用PBS洗涤一次，以去除多余乙醛溶液；
d.选用免疫组织化学染色（IHC）和荧光染色法对药物敏感性检测对应细胞蛋白进行标记；
e.将染色后载玻片上的涂片转移到培养皿中，并添加细胞培养基，培养基成分包括：90%RPMI 1640溶液、10%胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，所述肿瘤组织培养步骤中的体外培养条件包括培养容器、培养基以及培养条件调节；
所述培养基选用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI-1640、F-12，培养基内选用添加胎牛血清（FBS）和人源血清，以及细胞组织所需的对应营养物和生长因子；
所述培养容器选用培养皿、细胞培养板、培养滤器，将肿瘤单细胞悬浮液和组织片段分别分开加入不同培养基中，细胞悬浮液采用离心分离纯化细胞群，组织片段采用酶消化将组织细胞分离开；
所述培养条件调节，调整培养条件促进细胞生长和三维结构的形成，具体控制因素包括控制培养基pH值、温度和湿度，并提供所需氧气和二氧化碳气氛，添加生长因子和细胞因子，在培养基中添加适当的生长因子和细胞因子，促进肿瘤细胞的生长和类器官的形成，生长因子和细胞因子选用成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板源性生长因子（PDGF）。
4.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，所述细胞分离，采用酶消化法，将肿瘤组织样本切成小块，选用胰蛋白酶和胶原酶进行酶解，分解细胞间的连接和基质，使用细胞培养基离心获得细胞悬浮液。
5.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，所述肿瘤组织处理步骤中的组织切割，选用组织切片机、手动切片技术，将肿瘤组织样本切割成薄组织片段。
6.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于：所述肿瘤组织处理步骤中的均质化处理，选用均质器、超声波处理器对肿瘤组织样本进行均质化处理。
7.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，所述药物处理步骤中的抗肿瘤药物具体为对应敏感性检测药物和需要所选择的对应的抗肿瘤药物，药物选用化疗药物、靶向治疗药物、免疫疗法药物，根据所选药物的特性和目标，确定具体药物浓度和处理时间；
所述药物添加方式具体为，将选定的抗肿瘤药物添加到肿瘤类器官的培养系统中，加入方式选择在培养基中形成药物溶液，然后将其加入培养系统中。
8.根据权利要求1所述的一种患者来源器官型组织培养药物敏感性检测方法，其特征在于，所述药物处理步骤中的处理时间和浓度控制，根据药物的特性和预期效果，确定处理时间和药物浓度，时间和浓度参数根据先前研究和临床实践的经验进行确定；
所述药物处理步骤中的细胞和组织观察和功能评估具体为，在药物处理后，定期观察和评估肿瘤类器官中细胞的生存状态、形态学变化和功能，选用显微镜观察细胞形态，细胞增殖和凋亡分析，以及特定标记物的表达分析，根据凋亡分析和表达分析情况，对药物处理后的肿瘤类器官进行功能评估，评估包括：细胞增殖和生存率的测定、细胞周期分析、细胞凋亡检测、细胞迁移和侵袭能力分析。
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