CN115948339A - 高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法。本发明采用自主研发的96孔高通量气液交界类器官培养装置和配套的体系进行神经胶质瘤类器官的培养和传代，相较于传统的培养方法，本发明体系小、通量高，可以直接实现类器官的原位接种、换液和药敏测试，大大提高了实验的效率，节约了经济和人力成本。同时本发明方法培养细胞组织活率高、周期短，保留了类器官组织的异质性，更利于进行患者药物反应性的预测，对于研究药物对于神经胶质瘤的作用非常重要。

Description

高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法

技术领域

本发明涉及本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法。

背景技术

肿瘤类器官(Patient derived organoids,PDOs)是用取自患者肿瘤组织，在实验室中培养出的高度模拟来源肿瘤组织特征，保留原代组织的遗传特征和肿瘤异质性的微型的体外器官模型。肿瘤类器官通常用于疾病模型构建、机制研究和针对患者的个体化精准用药的筛选。

神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤。目前对于神经胶质瘤的治疗，主张以手术切除为主，结合放射治疗、化学治疗、电场治疗和免疫治疗。类器官在对胶质瘤患者进行个体化精准医疗方面具有重要的作用，特别是在化疗方案的制定方面具有特殊的意义。随着对肿瘤发生机制的深入认识，越来越多的证据表明，肿瘤的发生与免疫逃逸密不可分。免疫治疗无疑是胶质瘤治疗研究的重点，也是将来临床治疗胶质瘤方案的重要补充。

肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)是由肿瘤相关基质细胞、免疫细胞，以及相应细胞的分泌产物(如细胞因子和趋化因子)和细胞外基质(ECM)中的非细胞成分组成的。肿瘤微环境为肿瘤提供了良好的生长环境和营养物质，促进肿瘤的进展和转移，这也是临床中导致许多个体患者常规治疗失败的原因。肿瘤类器官相对于PDX动物模型，体外培养环境相对单纯，而缺乏肿瘤微环境的类器官模型，又很难完全模拟肿瘤对于药物的反应性，特别是免疫细胞随着肿瘤类器官的培养，会逐渐功能下降、数量减少，甚至于逐渐消失。

目前神经胶质瘤类器官的培养方法是机械破碎法，使用弹力剪将肿瘤组织剪成1mm³的碎片，加入培养液，在水平摇床上震荡培养。研究结果证明，随着类器官的培养肿瘤免疫细胞会大量的损失，肿瘤免疫微环境受到了很大的破坏。有文献报道采用气液交互法(air-liquid interface,ALI)培养组织来源的类器官，可以在一定程度上保留组织原位的免疫微环境。采用ALI方法培养神经胶质瘤类器官无需摇床，组织处理方法简单，但神经胶质瘤类器官的扩增效率低下，培养时间长，且药物敏感性测试很难实现高通量，因此需要开发一种可提高神经胶质瘤类器官的扩增效率、减少培养时长，能高通量完成药物敏感性测试的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法。

本发明提供了神经胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于，其为在黏附有基质胶培养媒介培养容器中，在培养液存在的条件下对神经胶质瘤类器官进行培养和传代；

所述培养容器包括容器主体和位于主体中的实验槽；所述实验槽包括凹槽和凸台结构；所述凹槽的侧方为凹槽侧壁，所述凸台结构与所述凹槽底面连接，所述凸台结构位于所述凹槽内，所述凸台结构具有水平顶面；

进一步的，所述凹槽盛有培养液；所述凸台结构的水平顶面黏附有基质胶培养媒介。

更进一步的，

所述凹槽内培养液的液面接触基质胶培养媒介但不没过基质胶培养媒介；所述凸台结构与凹槽的凹槽侧壁具有间隔，所述凸台结构的高度小于所述凹槽侧壁的高度；

可选的，所述凹槽为圆柱体凹槽；

可选的，所述凸台结构为圆柱体凸台，进一步的，所述凸台的直径为3～3.5mm。

可选的，所述培养容器主体具有多个所述实验槽；

可选的，所述多个实验槽在所述容器主体上成阵列式排布。

本发明中，所述的培养方法中，所述基质胶培养媒介包括基底和神经胶质瘤原代组织；

所述基底包括培养液和基质胶，所述培养液与基质胶的体积比为1：1；所述基底黏附于凸台的水平顶面；

所述神经胶质瘤原代组织黏附于所述基底上。

进一步的，

所述基底黏附于凸台的水平顶面的步骤为：将所述培养液和基质胶混合后置于凸台结构的水平顶面上凝固，所述凝固的条件为30℃～37℃，5min。

本发明中，所述基质胶凝固时间条件为30分钟左右5分钟，此条件可实现基底的半凝固，使神经胶质瘤原代组织可以有一部分嵌入半凝固的胶中，起到固定的作用。

本发明所述基质胶培养媒介中，

所述基底的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。

本发明提供了药敏检测方法，其包括：以本发明所述的培养方法培养神经胶质瘤类器官，其中，培养容器凹槽中添加培养液培养4～7天后置换凹槽培养液为含有待测药物的培养液，根据神经胶质瘤类器官生长状态，获得药敏检测结果。

进一步的，所述培养液包括但不限于Advanced-DMEM细胞培养液、MEM细胞培养液、DMEM细胞培养液、RPMI1640细胞培养液或F-12细胞培养液中的任意一种；所述待测药物包括但不限于细胞毒类的药物、靶向药物、免疫制剂和/或中成药制剂中的至少一种；所述细胞毒类的药物包括但不限于顺铂、卡铂、紫杉醇、氟尿嘧啶和/或丝裂霉素；所述靶向药物包括但不限于埃克替尼、厄洛替尼、吉非替尼、安罗替尼、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、赫赛汀和/或美罗华等；所述免疫制剂包括帕姆单抗和/或纳武单抗；所述中成药制剂包括但不限于鸦胆子油乳和/或华蟾素。

更进一步的，所述药敏实验的判断标准可以直接根据类器官的大小变化来判断，通过比较给药前后的类器官大小和生长情况来判定药敏结果；所述药敏实验的判断标准也可以根据显微镜下类器官形态判断，若显微镜下类器官缩小，边缘出现细胞崩解，说明药物有效；此外所述药敏实验的判断标准还可以在实验结束后，采用试剂盒检测细胞活力，计算细胞死亡率来判定；也可以在实验结束后组织包埋切片染色，检测细胞凋亡来判定。

本发明采用自主研发的96孔高通量气液交界类器官培养装置和配套的体系进行神经胶质瘤类器官的培养和传代，相较于传统的培养方法，本发明体系小、通量高，可以直接实现类器官的原位接种、换液和药敏测试，大大提高了实验的效率，节约了经济和人力成本。同时本发明方法培养细胞组织活率高、周期短，保留了类器官组织的异质性，更利于进行患者药物反应性的预测，对于研究抗体药物对于神经胶质瘤的作用非常重要。

附图说明

图1示96孔无菌气液交界类器官培养装置结构正-剖面结构图；

图2示培养柱顶部的基质胶包被面；

图3示类器官接种和培养；

图4示神经胶质瘤类器官的组织学特征与免疫细胞，其中A,B：神经胶质瘤类器官；C:GFAP是胶质纤维酸性蛋白，主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，是神经胶质瘤的主要标志物；D,E:CD3和CD11b是神经胶质肿瘤中主要的免疫细胞标志物；

图5示神经胶质瘤类器官的高通量原位药物敏感性测试；

图6示气液交界培养的神经胶质瘤类器官。

具体实施方式

本发明提供了高通量气液交界法培养神经胶质瘤类器官的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

目前应用于类器官培养的多槽容器并不能支持气液交界法。如果想使用气液交界法则需要在培养皿中培养，则过程较为繁琐。与多槽容器相比，在培养皿中进行类器官培养的效率和产出量不足，产出量也就是通量。培养皿与多槽容器相比往往需要更多的培养液，成本较高。通过培养皿进行培养难以适应实际应用情况，出现利用气液交界法进行类器官的药物敏感性测试时，现有的类器官培养的多槽容器不支持气液交界法，利用培养皿培养则效率和产出量不足。

针对于此，本发明利用自主研发的培养容器进行类器官的培养，具体而言，培养容器可以通过气液交界法培养类器官，所述培养容器具有实验槽，实验槽中具有凸台结构，所述凸台结构的水平顶面上具有用于组织培养的覆盖层。利用气液交界法进行类器官的药物敏感性测试的情况出现时，可以将类器官通过凸台结构托举悬空培养，通过注入一定量的培养液对类器官通过气液交界法进行药物敏感性测试。培养容器可以具备多个实验槽，可以同时对类器官进行多种药物的敏感性测试，与使用现有容器相比提高了类器官培养的效率和产出量。

为了使本技术领域的人员更好地理解本培养方法，下面将结合附图对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

图1为培养容器示意图。

容器示意图中包括所述容器包括容器主体100和位于主体中用实线示出的实验槽101，图1所示的容器示意图中包括位于容器主体上的数字和字母，所述数字和字母用于对实验槽进行标记。

其中，实验槽包括凹槽201和凸台结构202。所述凸台结构位于凹槽内，凸台结构与凹槽的凹槽侧壁具有间隔。这里的凹槽为圆柱体凹槽，凸台结构为圆柱体凸台。

其中，凸台结构301与凹槽底部303相连，凸台结构301具有水平顶面，凸台结构301与凹槽侧壁303具有一定的间隔，凸台结构具有水平顶面，凸台结构的高度小于凹槽侧壁的高度。

在图1所述的培养容器中，具有多个实验槽，这里采用拥有96个实验槽的容器进行举例说明，当然也可以拥有其他数量的实验槽。通用的96槽细胞培养板两个实验槽的中心间隔为9毫米，考虑到通用的96槽细胞培养板的实验槽分布，培养容器中实验槽可以与通用的96槽细胞培养板的实验槽分布一致，当然也可以与其他的通用多槽细胞培养板中实验槽的分布一致，也可以根据实验需求对实验槽进行排布。实验槽的尺寸也可以按照通用的96槽细胞培养板进行设计，也可以单独进行设计。

培养容器可以通过这样的排布方式兼容常规的酶标仪、活细胞工作站和激光共聚焦显微镜等设备，当然也可以支持其他的标准设备，当然也可以实现通用的96槽细胞培养板相同的功能。所述酶标仪，即酶联免疫检测仪，是酶联免疫吸附试验的专用仪器又称微孔板检测器。所述活细胞工作站是一种用于活细胞成像、细胞迁移测定、优化细胞分析、细胞培养质量控制、细胞增殖分析的仪器。所述激光共聚焦显微镜是一种利用计算机进行图象处理，得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像的仪器。

培养容器尤其适用于体积大于500μm、且同时需要利用气液交界法培养的类器官，具体包括但不限于神经胶质瘤、脑类器官等。

所述培养容器中的实验槽选择了圆柱体凹槽与圆柱体凸台结构作为示例，当然凹槽也可以是其他形状的凹槽，凸台结构也可以是其他形状的凸台。

其中，为了适应实验要求，凹槽内可以注入培养液，培养液可以是肿瘤类器官需要的肿瘤微环境。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、肿瘤相关基质细胞、免疫细胞，以及相应细胞的分泌产物和细胞外基质中的非细胞成分组成的。肿瘤微环境为肿瘤提供了良好的生长环境和营养物质，促进肿瘤的进展和转移。

所述培养容器中的实验槽的圆柱体凹槽与圆柱体凸台结构中，凸台结构的水平顶面的直径可以小于凹槽直径的二分之一。在实际应用时，凹槽中放置培养液，凸台结构会凹槽的部分空间，通过凸台结构的水平顶面的直径可以小于凹槽直径的二分之一这样的设计，让凹槽有充足的空间放置培养液，当然凸台结构的水平顶面的直径也可以不小于凹槽直径的二分之一。

凸台结构的水平顶面可以具有便于基质胶附着的覆盖层。肿瘤类器官培养一般需要将肿瘤类器官放置在基质胶基底上，凸台结构的水平顶面上的覆盖层可以为基质胶基底提供空间从而进行肿瘤类器官培养。在实际实验过程中，考虑到需要在凸台结构的水平顶面进行肿瘤类器官培养，所以将凸台结构的水平顶面使用Tissue treated材料，使用Tissue treated材料的水平顶面为覆盖层，覆盖层便于基质胶基底的附着，当然也可以是其他的材料生成的覆盖层，当然也可以没有覆盖层。

基质胶基底一般滴在需要进行肿瘤类器官培养的位置，在现有一些装置内部用于类器官接种的平面直径为30mm，如果进行类器官药物敏感性测试，一次只能使用1块板，无法进行不同药物比较筛选。在本发明的一些实验场景中，使用所述培养容器的凸台结构的水平顶面宽度最好不小于基质胶基底的最小液滴的直径，优选的宽度介于3～3.5mm之间，可以显著提高检测通量，可实现两名患者，5种药物，3个平行样本，3个药物浓度的同时测定，同时3～3.5mm直径设计可以让基质胶基底不会滴落到凹槽中，可以使基质胶基底更好的附着于水平顶面，易用性更强。考虑到基质胶基底滴在水平面后一般为一面与水平面贴合，另一面为椭球面，考虑到胶滴的形状，这里的凸台结构采用了圆柱体凸台，采用了圆柱体凸台可以更好的适应实验场景。

对于类器官培养的另一方面，凸台的水平顶面直径要求介于3～3.5mm之间,首先因为对于神经胶质瘤类器官的原代分离后的大小约为1～1.5mm，经过20天培养后体积会增大到2mm左右，需要给类器官的生长留出足够空间，才能保证在培养的过程中组织不会落下来。另外还要留下添加类器官培养基的空间，如果太少，增加了换液和补液的频率，而且如果添加培养液太少，影响组织供养，所以本发明培养水平顶面直径是经过合理考虑和实验获得的，培养液体积与培养体系也相适应，从而能更有利与组织器官的培养。同时现有一些装置的集中培养，一个孔里可以同时培养50～200个神经胶质瘤类器官，样本之间营养竞争大，使周边的类器官生长较快，中心的类器官活力较差，生长缓慢，生长情况不均一。采用本方案的培养容器，每个类器官生长条件一致，大小均匀，周期同步。类器官的状态一致性对于药物敏感性检测的准确性也非常重要。

在需要对肿瘤类器官通过气液交界法进行培养的场景中，凹槽中注入培养液，基质胶基底滴在凸台结构的水平顶面上，肿瘤类器官放置在基质胶基底上，控制基底凝固时间，使部分组织嵌于所述基底中固定，考虑到气液交界法的需求，进行培养的肿瘤类器官需要同时与培养液和空气进行接触，这里需要让凸台结构的高度小于凹槽侧壁的高度，通过这样的设计满足气液交界法的需要。

在需要利用气液交界法对肿瘤类器官进行药物敏感性测试的场景中，可以在一个实验槽中对肿瘤类器官进行一种药物的敏感性测试，由于培养容器采用了多实验槽的设计，所以可以同时对肿瘤类器官进行多种药物的敏感性测试。根据实际的测试要求，测试的药物种类只需小于容器的实验槽数量即可，通过培养容器进行药物敏感性测试与使用培养皿进行药物敏感性测试相比提高了测试效率和产出量。

培养容器具有多个实验槽，每一个实验槽内对一个类器官进行培养，当需要对培养好的类器官进行药物敏感性测试时可以直接在本申请提供的容器中进行药物敏感性测试，而通过现有的容器培养出的类器官需要从培养容器转移到测试容器，与现有的流程相比节约了大量时间。

使用本发明培养容器培养出的类器官与通过现有容器培养出的类器官相比，使用本发明培养容器培养出的类器官可以在类器官内保留更多的免疫细胞，很好的维持了类器官组织的异质性。维持类器官组织的异质性对于研究抗体药物对于神经胶质瘤的作用非常重要。对本发明培养容器培养出的类器官进行肿瘤抗体药物的药物筛选与对使用现有容器养出的类器官进行肿瘤抗体药物的药物筛选相比，得到的结果更加准确。

使用本发明培养容器培养的类器官，在类器官接种的时候就把原代组织分别培养在不同的凸台水平顶面上，减少了进行药敏测试前需要把集中培养的类器官独立剥离的步骤，现有的集中培养方法经过基质胶溶解和类器官的剥离过程，类器官的活率下降到45％，影响药敏的准确性；而本发明的培养容器培养的类器官，在药敏试验前保证类器官的活率达到75％以上。采用独立培养和高通量药敏测试方法，可以将组织离体到获得药敏检测结果的时间缩短为10天(原有方法需要20天)。同时药敏试验不需要转板，一次性实现类器官培养和药敏试验，进一步简化了药敏试验的操作步骤。

在对肿瘤类器官通过气液交界法进行培养的场景中，准备好肿瘤类器官、具有肿瘤微环境的培养液和基质胶，将培养液放入培养液注射枪，含基质胶的基底放入基质胶枪。将基底使用基质胶枪滴到本发明培养容器的凸台结构上，并进行一定的处理使基质胶附着于凸台结构水平顶面。在观察仪器，如显微镜的辅助下，将肿瘤类器官放置在含有基质胶的基底上。利用培养液注射枪将一定量的培养液注射到凹槽中，使培养液的液面接触基质胶基底但不没过基质胶基底。对肿瘤类器官进行培养、检测或观察。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1高通量气液交界法神经胶质瘤类器官构建流程

(1)试剂耗材准备

无菌手术器械、15ml离心管、10cm无菌细胞培养皿、96孔无菌气液交界类器官培养装置。

原代组织保存液(含青霉素/链霉素/两性霉素B)、DPBS、红细胞裂解液、DMEM/F12培养液、基质胶、神经胶质瘤类器官培养液(Cellada-GMO-001)。基质胶提前一天从-20℃取出，放置4℃融化，使用前取出放置冰上。

其他直接与基质胶接触的耗材提前放置-20℃冷冻。

(2)新鲜脑胶质瘤肿瘤组织分离

1)取材

标本离体后，尽快取材。采用无菌器械，保证无菌环境，将肿瘤组织放入含有5ml的原代组织保存液(含三抗)的15ml离心管中，4℃转运。

2)清洗

在生物安全柜中取出样品管，用75％酒精擦拭管外侧。开盖后，小心吸去组织保存液，加入含三抗的冷DPBS++，反复清洗后，去除DPBS++。重复清洗2至3次。

3)组织破碎

将清洗后的组织快转移至含有2ml冷DPBS++的10cm的无菌细胞培养皿中，在体视放大镜观察下，用弹力剪刀将肿瘤组织破碎成为直径约为0.5mm～1mm的组织碎片。

4)裂解红细胞

破碎后的组织转移至含有5ml冷DPBS++的15ml离心管中，清洗2次。加入10ml红细胞裂解液，室温下在转速为60rpm的摇床上震荡裂解10分钟，去上清液，用常温的DMEM/F12培养液清洗组织块2次。

(3)底层基质胶包被

用神经胶质瘤类器官培养液与基质胶按照1：1的体积比进行稀释混匀(基质胶A，又名基底)，放置冰上保存。

在图1所示的96孔内的培养柱上表面，滴加体积为50μL的基质胶。按照实验分组和预计铺板的数量进行滴加。滴加基质胶的培养板，盖好盖子，放置37℃细胞培养箱中，固化5分钟，待基质胶半凝固后取出，形成如图2的基质胶A包被面。

(4)类器官接种

用1ml移液器枪头，轻轻将一个个经过破碎、裂红和清洗步骤的大小基本一致的神经胶质瘤原代组织在超净工作台内转移至还未完全凝固的基质胶A上表面，如图3所示。每个培养柱上可以接种1～3个神经胶质瘤类器官。转移过程尽量快速，并且在低温环境中操作。将转移完成的培养板，放置细胞培养箱中，凝固30分钟。取出培养板，顺着孔边缘，向每个细胞培养孔中添加预热的100μL神经胶质瘤类器官培养液，直至培养液的顶部达到基质胶A的上表面。

(5)类器官的培养

将加好培养液的培养板放入37℃细胞培养箱中静置培养。根据培养液蒸发速度，每4～7天更换培养液，更换培养液的时候注意液体不要直接滴加在类器官表面，以防将类器官冲下培养面。每天观察类器官的生长状态，拍照记录增值速度、形态变化和污染情况，谱图光学拍照如图6所示。免疫细胞和组织学特征如图4所示，形成的类器官很好的保留了肿瘤组织中的免疫细胞和组织学特征。维持类器官组织的异质性，对于研究抗体药物对于神经胶质瘤的作用非常重要，可以很好的进行患者药物反应性的预测。

(6)类器官的原位药物敏感性测试

对于需要进行药物敏感性测试的类器官，直接对孔板进行分组(药物种类和浓度)，向不同的培养孔中置换添加相应药物的培养液，进行类器官水平的高通量药物测试(图5)。不需要对类器官进行二次转移，减少了对类器官的损伤。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.神经胶质瘤类器官的培养方法，其特征在于，其为在黏附有基质胶培养媒介的培养容器中，在培养液存在的条件下对神经胶质瘤类器官进行培养和传代；

所述培养容器包括容器主体和位于主体中的实验槽；

所述实验槽包括凹槽和凸台结构；

所述凹槽的侧方为凹槽侧壁，所述凸台结构与所述凹槽底面连接，所述凸台结构位于所述凹槽内，所述凸台结构具有水平顶面；

所述凹槽内盛有培养液；

所述凸台结构的水平顶面黏附有基质胶培养媒介。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，

所述凹槽内培养液的液面接触基质胶培养媒介但不没过基质胶培养媒介。

3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，

所述凸台结构与凹槽的凹槽侧壁具有间隔，所述凸台结构的高度小于所述凹槽侧壁的高度。

4.根据权利要求1～3任一项所述的培养方法，其特征在于，

所述凹槽为圆柱体凹槽；

所述凸台结构为圆柱体凸台。

5.根据权利要求1～4任一项所述的培养方法，其特征在于，所述凸台的直径为3～3.5mm。

6.根据权利要求1～5任一项所述的培养方法，其特征在于，

所述培养容器主体具有多个所述实验槽；

所述多个实验槽在所述容器主体上成阵列式排布。

7.根据权利要求1～6任一项所述的培养方法，其特征在于，所述基质胶培养媒介包括基底和神经胶质瘤原代组织；

所述基底包括培养液和基质胶，所述培养液与基质胶的体积比为1：1；所述培养液包括DMEM细胞培养液或RPMI1640细胞培养液中任意一种；所述基底黏附于凸台的水平顶面；

所述神经胶质瘤原代组织黏附于所述基底上。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述基底黏附于凸台的水平顶面的步骤为：将所述培养液和基质胶混合后置于凸台结构的水平顶面上凝固，所述凝固的条件为30℃～37℃，5min。

9.根据权利要求7或8所述的培养方法，其特征在于，

所述基底的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。

10.药敏检测方法，其特征在于，包括：以权利要求1～9任一项所述的培养方法培养神经胶质瘤类器官，其中，培养容器凹槽中添加培养液培养4～7天后置换凹槽培养液为含有待测药物的培养液，根据神经胶质瘤类器官生长状态，获得药敏检测结果。

Images