CN113186165A - 一种肾癌相关的类器官组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，公开了一种肾癌相关类器官组合及其应用，包括肾癌相关类器官的分组建立、筛选药物的选择、药物敏感性终点的确立，其中所述肾癌相关类器官来自肾癌患者体内，分别选自肾旁细胞、肾癌细胞以及肾癌癌栓组织，分别经过培养基的培养，得到三种类器官2D和3D模型，进行药物敏感性筛选筛选，根据药物敏感性终点的建立，确定不同肾癌体质患者的药敏特征，为临床用药提供一种确定用药偏好的筛选模型。

Description

一种肾癌相关的类器官组合及其应用
技术领域
本发明涉及肾癌类器官培养领域，具体涉及一种包括肾癌癌旁组织、肾癌肿瘤组织及下腔静脉癌栓类器官的组合，属于细胞培养和药物筛选领域。
背景技术
肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)是一种起源于肾上皮的常见癌症，2018年全球估计有403262例新发病例和175098例死亡。RCC是一组异质性化疗耐药性且放射抵抗力很强的肿瘤，其组织学和分子亚型超过10种，其中透明细胞癌(Clear cell RCC，ccRCC)最为常见，约占75％。ccRCC的一个独特的临床表现即它能够生长到肾静脉或下腔静脉，并形成肿瘤血栓(tumor thrombus，TT)。大约15％的ccRCC患者存在静脉血栓。TT患者的预后很差，如不进行治疗，中位生存期仅5个月，一年疾病特意生存期仅为29％。尽管手术对局部肿块有很高的治疗潜力，但仍有四分之一的局部肾癌患者手术后会在远处复发，其较高的围手术期死亡率和术后并发症仍是一个重大挑战。此外，ccRCC-TT的转录组研究非常有限。因此，探索ccRCC-TT的转录组差异表达基因特征，揭示从原发肿瘤到TT发展进化过程中，特异性基因改变在肿瘤发生、肿瘤维持和治疗敏感性中的作用，开发准确反映癌症遗传多样性和谱系特异性的体外和体内模型系统是至关重要的。到目前为止，ccRCC-TT的类器官模型及基于该模型进行肿瘤个体化治疗的方案尚未见报道。那么建立ccRCC-TT的类器官模型，该模型能够忠实地复制原始肿瘤的患者来源模型对于研究ccRCC-TT发生的分子机制、识别新的诊断、预后生物标志物和个体化的患者治疗是至关重要的。这项技术在泌尿外科研究、临床决策和泌尿系癌症患者的治疗中具有潜在的重要作用。
人源肿瘤类器官(Patient Derived Organoids，PDTO)模型技术是一种体外三维培养的肿瘤精准医疗的前沿技术。PDTO模型能够很好地复制肿瘤的组织复杂性与遗传异质性，在造模成功率、维护难度、筛选难度上均表现出了良好的潜力。人源肿瘤类器官模型是抗肿瘤药物的敏感性检测的核心技术方向。因此，建立肾癌伴下腔静脉癌栓患者的类器官模型可以为肾癌伴下腔静脉癌栓患者的药物治疗进行敏感性检测，在临床上指导肾癌伴下腔静脉癌栓患者个体化用药。
与传统的细胞系和动物模型相比，类器官的优势
由于癌细胞系自身基因组产生变异，使其对药物反应产生大幅度的变化，对药物的敏感性和耐药性经常出现不一致的结果，严重影响了抗癌药物的研究。传统细胞系在测定药物敏感性方面具有多种局限，包括由于长期培养造成的遗传漂移，缺乏有注释的临床数据，以及最重要的是，只有少数肿瘤在塑料上以2D方式生长。比如，在NatureBiotechnology发表，6个国家13个顶级实验室的HeLa细胞系从基因组到转录组，再到蛋白组和细胞表型，都发生了巨大变化。另有研究不同的雌激素受体阳性MCF-7乳腺癌细胞系，发现数百种基因的拷贝数发生了变化，包括乳腺癌常见的突变基因。简而言之体外肿瘤细胞系较难模拟体内复杂的肿瘤微环境。
动物模型建立成本高，公共细胞系资料库数量有限，具有物种差异性和体内人类肿瘤生物学的不确定性。
在培养条件上的局限型
传统的组织培养条件不能使大多数未转化的细胞生长，最终会走向衰老。而类器官具有了组织结构和器官功能、取材广泛，能够最大程度模拟人体器官，不存在伦理关系，体外培养速度快，适合大规模扩增，长期培养仍能保持基因组稳定；体外3D类器官能用于体内移植，解决器官修复再生问题；与体外基因编辑技术结合，能够实现器官水平上的基因改造。
目前关于肾癌类器官研究上，研究很少，肾癌类器官的培养条件不成熟，无法稳定地、同时培育肾癌相关细胞的类器官，能够在体外实现稳定的癌栓类器官特性，由于肾癌类器官的药物筛选中的特殊作用，则无法稳定检测特定药物的药物敏感性，因此，基础医学研究领域缺乏一种能够稳定培育肾癌、癌旁细胞、血栓细胞的类器官筛选模型，从而能够同时对肾癌相关细胞进行药物敏感性筛选，从而增强临床用药的药物敏感性和针对性。
发明内容
针对上述技术问题，发明人提供了一种肾癌相关的类器官组合，其中，类器官的组织或细胞来自肾癌患者肾组织，包括癌旁组织、肾癌组织和/或癌栓组织，各组织类器官平行培养，均采取以下步骤获得：
1)组织或细胞采用穿刺或手术从肾癌患者身体获得，洗涤，剔除坏死组织，而后通过消化与物理解离相结合进行组织解离，得到解离细胞；
2)细胞筛收集解离细胞，而后进行洗涤、离心、重悬，得到重悬细胞；
3)所得到重悬细胞分别移入条件性培养基培养，并选自平铺或与基质胶混合，放入容器器皿，构成类器官的2D和3D结构，不同组织的2D或3D的类器官共同构成所述类器官组合。
本发明中，发明人根据肾癌患者的发病阶段，提取率肾癌患者的癌旁组织、癌组织、肾癌血栓组织，这是本领域首次同时分别提取，因为限于培养条件的限制或技术方法的原因，尚未有人对此进行同时研究。
所述肾癌患者为肾癌伴下腔静脉癌栓的患者。进一步优选所述肾癌为透明细胞癌。
所述洗涤使用PBS洗涤，消化和物理解离的步骤为：在含有1mg/mL胶原酶和10μMY-27632的ADDF+++溶液中使用无菌剪刀将组织切碎成小块，于37℃孵育0.5-2小时，每10-20分钟吸取一次裂解液以促进消化，所述ADDF+++溶液含有Advanced DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+10μM Y-27632。
进一步优选，所述洗涤使用PBS洗涤，消化和物理解离的步骤为：含有1mg/mL胶原酶和10μM Y-27632的ADDF+++溶液中使用无菌剪刀将组织切碎成小块，于37℃孵育1小时，每15分钟吸取一次裂解液以促进消化，所述ADDF+++溶液含有Advanced DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+10μM Y-27632Abmole。
进一步地，需要对于该组织进行统一的培养，由于本领域缺乏相应的研究背景，申请人经过多次尝试和改进，建立了一种共同的条件性培养培养基，即DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)+antibiotics+1.5％B27(Gibco)+10％Rspo1-conditioned medium+EGF(50ng/mL,Peprotech PeproTech重组人表皮上皮细胞EGF培养基)+FGF-10(100ng/mL,Peprotech)+N-acetylcysteine(1.25mM,Sigma)+Rho-kinaseinhibitor Y-27632(10μM，Abmole)+A83-01(5μM，Tocris Bioscience)。。
其中：DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。此外，为了增强该培养基的缓冲能力，在DMEM/F12(1：1)中加入15mMHEPES缓冲液(HEPES是一种Good’s缓冲试剂，中文全称为N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸。它的pH缓冲范围在6.8到8.2区间之内，对细胞没有任何毒性。)
B27是在神经元细胞培养中所用的添加物，能够维持神经元细胞长期体外培养，因为神经元培养过程中不能使用血清所以用其代替，是专用于培养神经细胞的血清替代物。
Y-27632：Y-27632是一种选择性的ROCK1(p160ROCK)抑制剂，Ki为140nM，比对其他激酶包括PKC，cAMP依赖性蛋白激酶，mLCK和PAK的作用强200多倍。Y-27632处理，阻断Rho调节的肌动球蛋白的激活，也阻断LPA刺激的MM1细胞入侵活性，这种作用存在浓度依赖性。10μM Y-27632处理在无血清悬浮(SFEB)培养基中的人类胚胎干细胞(hES)，显著减少分离诱导的凋亡，提高克隆效率(从～1％提高到～27％),转基因后促进亚克隆，且使SFEB培养的hES细胞存活及分化成Bf1+皮质和基底端脑祖细胞。
IL-2：能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞。
表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。EGF与靶细胞上的EGF受体特异性识别结合后，发生一系列生化反应，最终可促进靶细胞的DNA合成及有丝分裂。
FGF-10，成纤维细胞生长因子-10(也称为KGF-2)是一种肝素结合生长因子，其刺激表达FGF受体的细胞的增殖和活化。FGF-10主要与FGF-7/KGF相关，在发育过程中表达，并优先在成人肺中表达。
N-乙酰半胱氨酸可具有直接的矿物螯合作用。铅是一种重金属矿物，被称为继发于灭活谷胱甘肽的有毒物质，铅的毒性作用很大程度上受到细胞中谷胱甘肽消耗的影响；这是由于铅对巯基具有很大的亲和力，因此提供半胱氨酸(通过NAC)被认为通过提供更多的底物减少铅的毒性作用，并减少铅与巯基的相互作用。在观察动物研究时，对NAC对肾脏、脑和肝组织进行了针对铅的保护作用(通过血清和组织病理学检查中的生物标志物评估)。
A83-01是选择性小分子抑制剂，抑制TGF-βI型受体ALK-5(IC50＝12nM)，活化素受体ALK-4(IC50＝45nM)和节点受体ALK-7(IC50＝7.5nM)。有效地抑制TGF-β诱导的生长抑制作用，并抑制Smad2磷酸化和p38活性。A83-01也可以抑制TGF-β诱导的上皮细胞向间质细胞的转化(EMT)，在高浓度时抑制Mv1Lu细胞生长。另外，A83-01可以诱导新生Nkx2.5-eGFP+细胞的生长。
使用上述培养基，则能够保证癌旁细胞、肾癌细胞和肾癌血栓组织的细胞稳定建立类器官，在长期能够保持稳定，如果采用DMEM/RPMI常规的肾培养液，则肾相关类器官组合无法建立，这是肾类器官建立的难点之一。
在建立了肾癌相关类器官的药物敏感性模型，发明人需要进行多项药物的筛选，例如：
1、其中化疗药物的选择包括：吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、顺铂
2、靶向药物的选择包括：贝伐珠单抗、贝伐珠单抗、索拉非尼
3、组合包括：厄洛替尼+贝伐珠单抗、吉西他滨+氟尿嘧啶、吉西他滨+顺铂
药敏终点的目的则是鉴定药物是否对于培养类细胞活性的抑制作用，采用方法例如MTT法或CCK8方法，申请人优选MTT法：检测方法为体外给药后肿瘤细胞释放的葡萄糖与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的雪夫氏碱含量，及被活肿瘤细胞还原生成深紫色结晶状产物甲臜的含量，进而判断患者个体对抗肿瘤药物的敏感性和耐受性。
本发明进一步提供一种培养上述类器官或类器官组合的试剂盒，包括了洗涤液、解离液和培养液，所述解离液为PBS溶液，所述解离液为Advanced DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+10μM Y-27632、培养液为DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+100units/mL IL-2+1.5％B27+10％Rspo1-conditioned medium+50ng/mL EGF+100ng/mL FGF+1.25mM N-acetylcysteine+10μM Rho-kinase inhibitor Y-27632+5μM A83-01，所述抗生素优选为青霉素+链霉素组合，浓度为：青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。
有益效果：
1、肾癌-癌栓类器官构建属开创性：目前尚无肾癌癌栓类器官的文章报道，履属首次，且可用于个性化用药指导。并在用药选择上，不单包括传统的化疗药，还有靶向药及化疗靶向药联合；
2、该发明提供了一种培养条件和方法，同时满足肾正常组织、肾肿瘤组织、肾癌癌栓组织类器官诱导培养。满足肿瘤-间质相互作用，将多种细胞类型(如成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞)整合到3D培养系统中的模型，以反映细胞外基质、上皮-基质通讯、细胞-基质相互作用和细胞-细胞串扰的影响，体现在培养体系。
3、所述类器官组合必须相互成组使用，分开使用则意义不大。本发明基于类器官培养进行化疗药、靶向药物、靶向联合化疗药物组合敏感性检测与临床药物反应的符合度进行评价；减小组织量需求，利用患者来源的穿刺或手术组织进行药敏试验，筛选抗肿瘤药物，为临床上预测患者对药物敏感性、耐药性提供实际可行且可靠的方法。
4、通过药敏试验应用，类器官组合通常会出现以下情况：
1)如果药物对于肾旁类器官有抑制性，进而判断该药物对患者可能具有一定的毒副作用，一般不建议使用；
2)如果药物对于肾癌类器官有抑制性，则指导意义是药物在一定药物浓度范围内具有较小中毒量，被认为最小有效量与最小中毒量之间有一定的抑制肿瘤细胞活性的作用。
3)如果药物对于肾栓类器官有抑制性，则指导意义是药物在一定药物浓度范围内具有较小中毒量，被认为最小有效量与最小中毒量之间有一定的抑制肿瘤细胞活性的作用。
通过上述类器官的组合来验证的抗癌药物和组合的作用，在进行临床用药后都具有显著的效果，申请人提供验证性数据，能够从患者来源的原位移植瘤动物模型来验证本筛选模型较常规用药筛选模型，具有节省成本、缩短试药周期及精准用药优点。
附图说明：
图1：取自一名肾癌患者的癌旁组织、肾癌组织和肾癌血栓组织，经过上述培养后，3天和7天的表现；
图2：肾癌患者癌旁类器官长期培养：基于三维基质长期培养，可见类器官边缘呈现腺样结构，结构清晰；
图3：肾癌患者癌旁类器官长期培养：种植于2D塑料培养皿中，可贴壁形成肾腺上皮样结构；
图4：肾癌及癌栓类器官长期培养：类器官增殖生长(21天)，类器官性状稳定；
图5：肾癌及癌栓类器官长期培养：类器官增殖生长(14天)，类器官性状稳定；
图6：Tarceva+AVA联用用于本发明的类器官模型筛选；
图7：Toripalimab用于本发明的类器官筛选模型进行药敏试验；
图8：5-氟尿嘧啶用于本发明的类器官筛选模型进行药敏试验；
图9：5-氟尿嘧啶联合吉西他滨用于本发明的类器官筛选模型进行药敏试验；
图10：苏木精-伊红染色结果，其中上排是肾癌癌旁、肾癌和肾癌癌栓患者组织HE染色结果，下排是培养类器官HE染色结果。结果说明培养类器官与肾癌癌旁、肾癌及癌栓样品在形态上显示出与患者组织高度的相似性。
具体实施方式：
实施例1：
一种肾癌类器官组合的培养过程
1.PBS洗涤肿瘤活检组织样本2次；临床肾癌伴下腔静脉血栓患者
2.剔除坏死粘液的组织；
3.剩余部分在含有1mg/mL胶原酶(Sigma，C9407)和10μM Y-27632的ADDF+++(含有1×Glutamax、10mM HEPES和抗生素的高级DMEM/F12)溶液中使用无菌剪刀将组织切碎成约5mm的小块，于37℃孵育1小时，每15分钟吸取一次裂解液以促进消化；
注意：ADDF+++培养基：Advanced DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+antibiotics+1mg/mL collagenase(Sigma,C9407)+10μM Y-27632。(抗生素为青霉素+链霉素组合，浓度为：青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL)
接下来的所有步骤，枪头需使用DMEM+1％BSA预先湿润，才可操作样本。这可避免隐窝黏附在枪头壁上造成样本流失。
4.冰上解冻Matrigel(BD,354230)和Collagen I(Sigma)，分别取200μL Matrigel和400μL的Collagen I于冰上混匀，构建BME，避免气泡产生；注意：这足够32个培养domes的用量。
5.40微米细胞筛收集解离的细胞；
6.用ADDF+++培养基洗涤悬浮液，250×G离心。如果出现可见的红色颗粒，则在室温下将红细胞在1-2mL红细胞裂解缓冲液(Roche，11814389001)中裂解5分钟，然后加入10mL ADDF+++培养基以250×G离心10分钟。
7.将细胞团块用适量肾类器官生长培养基重悬后与BME(基质胶)混匀；
注：类器官培养基：DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)+antibiotics+1.5％B27(Gibco)+10％Rspo1-conditioned medium+EGF(50ng/mL，Peprotech PeproTech重组人表皮上皮细胞EGF培养基)+FGF-10(100ng/mL，Peprotech)+N-acetylcysteine(1.25mM，Sigma)+Rho-kinase inhibitor Y-27632(10μM,Abmole)+A83-01(5μM,Tocris Bioscience)。(抗生素为青霉素+链霉素组合，浓度为：青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL)
8.提前准备低附着培养皿，并加入适量条件性培养基，将上步混匀BME的细胞液加入培养皿中。
9.于37℃，5％CO2培养箱中培养，一般培养48小时根据细胞密度考虑是否换液。
10.根据需要，肾类器官生长培养基每3-4天更新一次，传代P2代给药药敏检测，稳定传代+消化后可再重构。
一般可长期传代冻存复苏培养，其特性需要每一代进行鉴定比较，性状能够XX代具有稳定性，特点为：肾癌类器官长期诱导培养，其CK阳性特性维持：
图1为取自一名肾癌患者的癌旁组织、肾癌组织和肾癌血栓组织，经过上述培养后，3天和7天的表现。
图2为肾癌患者癌旁类器官长期培养：基于三维基质长期培养，可见类器官边缘呈现腺样结构，结构清晰。
图3为肾癌患者癌旁类器官长期培养：种植于2D塑料培养皿中，可贴壁形成肾腺上皮样结构。
图4肾癌及癌栓类器官长期培养：类器官增殖生长(21天)，说明类器官性状稳定。
图5肾癌及癌栓类器官长期培养：类器官增殖生长(14天)，说明类器官性状稳定。
实施例2
采用10例肾癌患者，成功率(9/10)：10例患者，有1例患者的肾癌癌栓培养不成功，肾癌组织及肾组织类器官培养均成功；
维护难度：于37℃，5％CO2培养箱中培养，根据需要，肾类器官生长培养基每3-4天更新一次，成功率高。
实施例3
具体筛选药物如下表1
表1 为筛选药物及其数据
Figure BDA0003021471310000081
Figure BDA0003021471310000091
量效曲线：本研究基于类器官模型进行的药物筛选中的候选药物浓度均是通过量效曲线关系确定，基以药物浓度为横坐标，作用强度为纵坐标进行药物剂量判断，候选评价药物均选择治疗安全范围内的药物量进行药敏检测。
实施例4
图6，Tarceva试用于两个或两个以上化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌的三线治疗；近年来也用于肾癌晚期转移性患者用药；贝伐珠单抗(AVA)是一种单克隆抗体，可抑制血管内皮生长因子，用于治疗各类转移性癌症。该研究基于双靶用药，类器官用药结果显示，较对照组相比，肾癌和癌栓患者该药均具有肿瘤抑制效果。(Tarceva10μM+AVA10μM)
1、如果药物对于肾旁类器官有抑制性，进而判断该药物对患者可能具有一定的毒副作用，一般不建议使用；2、如果药物对于肾癌类器官有抑制性，则指导意义是药物在一定药物浓度范围内具有较小中毒量，被认为最小有效量与最小中毒量之间有一定的抑制肿瘤细胞活性的作用。3、如果药物对于肾栓类器官有抑制性，则指导意义是药物在一定药物浓度范围内具有较小中毒量，被认为最小有效量与最小中毒量之间有一定的抑制肿瘤细胞活性的作用。
2、两药在不同效应时各自所需药物浓度之间相互作用是否为协同、相加还是拮抗。
图7，Toripalimab(10μM)对肾癌具有耐药性，但对癌栓类器官具有显著的抑制性，被认为该药可用于治疗肾癌癌栓伴下腔静脉癌栓患者的治疗，且效果显著，而临床仅肾癌患者可能无效。
图8，5-氟尿嘧啶(500μM)对肾癌类器官具有耐药性，但对癌栓类器官具有显著的抑制性。被认为5-氟尿嘧啶可用于治疗肾癌癌栓伴下腔静脉癌栓患者的治疗，且效果显著，而临床仅肾癌患者可能无效。
图9，5-氟尿嘧啶(500μM)联合吉西他滨(500μM)对肾癌类器官具有显著的抑制性。被认为5-氟尿嘧啶联合吉西他滨治疗方案可能是临床肾癌癌栓伴下腔静脉癌栓患者治疗的有效手段。
如果出现图7、8、9，临床医生根据该方法检测药敏结果与患者临床病理及影像学数据结合，给患者提供个性化治疗方案。
实施例5
图10的结果是苏木精-伊红染色结果，其中上排是肾癌癌旁、肾癌和肾癌癌栓患者组织HE染色结果，下排是培养类器官HE染色结果。结果说明培养类器官与肾癌癌旁、肾癌及癌栓样品在形态上显示出与患者组织高度的相似性，能够有效模拟相关细胞的体内真实活动。过这种模式的筛选，更广规模地筛选用药的选择和随访，减少患者的痛苦和用药的准确性，更加有的放矢。
实施例6
表2 培养物预测药物的抑制率
Figure BDA0003021471310000101
临床收取17例肾癌伴下腔静脉癌栓患者验证该方法培养物对待测药物的敏感性，结果如表2所示，肾癌癌旁培养物对待测10种药物均不敏感，肾癌癌组织培养物对Toripalimab敏感且肿瘤抑制率达70％，肾癌癌栓培养物对该药不敏感；Tarceva+AVA联合对肾癌和癌栓培养物均较敏感；5-FU单药对肾癌培养物较敏感，GEM+5-FU联合对肾癌癌栓培养物较敏感。依据这一结果，医生对于相关患者进行用药筛选(即对于肾栓患者采用不同剂量的癌栓敏感药物或组合，对于无癌栓的肾癌患者，采用肾癌类器官敏感或肾癌+癌栓均敏感药物或组合)，有效控制肾癌和癌栓的进展，经过后期跟踪治疗发现，有效率为100％。
实施例7
肾癌类器官或类器官组合的试剂盒，包括了洗涤液、解离液和培养液，所述解离液为PBS溶液，所述解离液为Advanced DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mLcollagenase+10μM Y-27632、培养液为DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+100units/mL IL-2+1.5％B27+10％Rspo1-conditioned medium+50ng/mLEGF+100ng/mL FGF+1.25mM N-acetylcysteine+10μM Rho-kinase inhibitor Y-27632+5μM A83-01，所述抗生素优选为青霉素+链霉素组合，浓度为：青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。使用方法见实施例1。

Claims (10)

1.一种肾癌相关的类器官组合，其特征在于，类器官的组织或细胞来自肾癌患者肾组织，包括癌旁组织、肾癌组织和/或癌栓组织，各组织类器官平行培养，均采取以下步骤获得：
1)组织或细胞采用穿刺或手术从肾癌患者身体获得，洗涤，剔除坏死组织，而后通过消化与物理解离相结合进行组织解离，得到解离细胞；
2)细胞筛收集解离细胞，而后进行洗涤、离心、重悬，得到重悬细胞；
3)所得到重悬细胞分别移入条件性培养基培养，并选自平铺或与基质胶混合，放入容器器皿，构成类器官的2D和3D结构，不同组织的2D或3D的类器官共同构成所述类器官组合。
2.根据权利要求1所述肾癌相关的类器官组合，其特征在于，所述肾癌患者为肾癌伴下腔静脉癌栓的患者。
3.根据权利要求1所述肾癌相关的类器官组合，其特征在于，所述肾癌为透明细胞癌。
4.根据权利要求1所述肾癌相关的类器官组合，其特征在于，所述洗涤使用PBS洗涤，消化和物理解离的步骤为：在含有1mg/mL胶原酶和10μM Y-27632的ADDF+++裂解液溶液中使用无菌剪刀将组织切碎成小块，于37℃孵育0.5-2小时，每10-20分钟吸取一次裂解液以促进消化，所述ADDF+++裂解液溶液含有Advanced DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+10μM Y-27632。
5.根据权利要求1所述肾癌相关的类器官组合，其特征在于，所述条件性培养基培养为DMEM/F12+1×Glutamax+10mM HEPES+抗生素+1mg/mL collagenase+100units/mL IL-2+1.5％B27+10％Rspo1-conditioned medium+50ng/mL EGF+100ng/mL FGF+1.25mM N-acetylcysteine+10μM Rho-kinase inhibitor Y-27632+5μM A83-01。
6.根据权利要求4或5所述肾癌相关的类器官组合，其特征在于，所述抗生素为青霉素和链霉素的组合。
7.权利要求1所述肾癌相关的类器官组合在建立肾癌药物敏感性模型中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将备选药物分别加入到所述类器官组合的各个模型中，测定细胞的生化指标变化，获得药物敏感性结论，确立临床用药选择。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药敏终点检测方法可采用MTT法或CCK8检测细胞增殖的方法来确定药敏性。
10.根据权利要求1所述的应用中，其特征在于，该述药品终点的检测方法为MTT法，检测方法为体外给药后肿瘤细胞释放的葡萄糖与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的雪夫氏碱含量，及被活肿瘤细胞还原生成深紫色结晶状产物甲臜的含量，进而判断患者个体对抗肿瘤药物的敏感性和耐受性。
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