CN109679915A - 一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法 - Google Patents

一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种鼻咽癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法。根据鼻咽癌来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，鼻咽癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。本发明的培养与鉴定方法以及特有的鼻咽癌类器官培养基，可以成功稳定的培养出与亲本肿瘤病理生理学特征、基因分型高度一致，组织形态高度相似的鼻咽癌类器官。

Description

一种鼻咽癌类器官的培养与鉴定方法
技术领域
本发明涉及类器官培养领域，进一步涉及鼻咽癌类器官培养领域，特别是用于鼻咽癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法。
背景技术
在我国鼻咽癌已经成为耳鼻咽喉恶性肿瘤的主要癌种和病死因素，在中国南部两广地区(如广东、广西等)尤其高发。放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法，Ⅰ、Ⅱ期鼻咽癌单纯放疗即可获得良好的治疗效果，初次治疗的5年总生存率可达75％-84.5％。然而首程治疗后复发和转移率高达10-36％。另外，复发鼻咽癌患者再程放化疗效果不佳，有报道5年生存率仅为16％-20％。近年来突飞猛进的靶向治疗和免疫治疗给复发鼻咽癌患者带来希望的同时，也带来如何从众多的免疫治疗药物中做出最佳选择这一重要问题。
所有的癌症研究都依赖稳定的细胞供应—可在实验室中培养的正常细胞和癌性细胞。肿瘤3D类器官养技术已经存在了较长时间，在体外用各种必要的生长因子来模拟机体内环境的条件下，提取细胞加入到3D基质胶中培养从而得到了细胞团块样组织，其包含了不同组织来源的上皮细胞结构，这种能不断自我增殖及分化的细胞团被称之为类器官。这种高效率的类器官培养可以用来研究肿瘤的分子信号通路转导和抗肿瘤药物的研发与筛选以及肿瘤患者的靶向治疗。
现有技术中，研究较多的类器官有结肠(SATO T，2011；CN105754948A；CN108396010A)、胃(BARTFELD S，2015)、前列腺(GAO D，2014)、胰腺(2015)、肝(CN1013237888A；BROUTIER L，2018)等，但对于鼻咽癌组织，还主要是普通的2D原代培养技术以及常规原代鉴定方法。在二维培养过程中鼻咽癌组织难以或不能充分表达出鼻咽癌组织的特性，使得培养的鼻咽癌组织原代细胞与患者来源亲本鼻咽癌组织有所差异，不利于研究的进行，同时，常规免疫组化、HE染色不能证明所培养的原代鼻咽癌细胞与患者体内的肿瘤细胞基因组相匹配。而在3D培养中，缺少必要的适宜的培养基的情况下，鼻咽癌组织的培养同样不利，难以充分模拟出体内鼻咽部粘膜组织及鼻咽癌组织细胞生理特点。目前暂无关于鼻咽癌组织类器官培养方法以及鉴定的研究及报道，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、即培养基配方以及鼻咽癌类器官鉴定技术尚无尝试及报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种鼻咽癌类器官的培养基、培养方法及鉴定方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种鼻咽癌类器官的培养基，上述培养基包括以下组分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、ProstaglandinE2、SB202190和FGF-7。
进一步地，培养基各成分的含量如下：B27，40-60X稀释；N-acetylcysteine 0.5-10mM；EGF 1-10ng/ml；Noggin 10-500ng/ml、R-spondin 1 50-500ng/ml；A83-01 100-1000nM；HGF 1-100ng/ml；Nicotinamide 1-100mM；Y-27632 1-50μM；Wnt3a 50-500ng/ml；Glutmax 50-200X稀释；Heregulinβ-1 5-100ng/ml；Gastrin 0.1-10nM；FGF-10 1-100ng/ml；Prostaglandin E2 0.1-10μM；SB202190 1-100μM；FGF-7 1-100ng/ml。
进一步地，培养基各成分的含量如下：B27，50X稀释；N-acetylcysteine 1mM；EGF5ng/ml；Noggin 100ng/ml、R-spondin 1 250ng/ml；A83-01 500nM；HGF 10ng/ml；Nicotinamide 10mM；Y-27632 10μM；Wnt3a 250ng/ml；Glutmax 100X稀释；Heregulinβ-120ng/ml；Gastrin 1nM；FGF-10 10ng/ml；Prostaglandin E2 1μM；SB202190 10μM；FGF-710ng/ml。
本发明还提供了一种根据上述培养基培养鼻咽癌类器官的方法，具体方法如下：
将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移恒温摇床消化；第一次消化结束后，离心弃上清，加消化酶II吹打重悬，将离心管放入恒温摇床消化，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取红细胞裂解液重悬细胞后加入HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,将胶滴接种至培养皿中；将培养皿静置，观察胶滴是否流动，若不流动，放入恒温孵箱，倒置；加入已预热好的鼻咽癌类器官培养基；定期更换培养基，培养出鼻咽癌类器官。
进一步地，上述培养方法具体为：
将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移至37℃、220rpm恒温摇床消化1.5小时左右；第一次消化结束后，离心弃上清，加2ml消化酶II吹打重悬，将离心管放入37℃、220rpm恒温摇床消化10min，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加2ml Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用70μm细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取1ml红细胞裂解液重悬细胞2-3min后加入1mlHBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,3000细胞每50μl胶滴混合液，用100μl移液枪将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约30μl；将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃,5％CO2恒温孵箱，倒置45min；加入已预热好的鼻咽癌类器官培养基，约2ml；每间隔2-3天更换一次培养基，培养出鼻咽癌类器官。
进一步地，胶滴混合液中，DMEM/F12培养基与matrigel的比例为1:2；消化酶I为collagenase type II和分散酶；消化酶II为TrypLE Express和DNaseI酶。
本发明还提供了一种鉴定上述鼻咽癌类器官的方法，具体方法如下步骤：
(1)鼻咽癌组织做肿瘤全外显子测序，患者血液做EBV全基因测序；
(2)类器官培养成功第一代并传代后，分别将类器官第一代、第三代、第五代、第七代、第九代做肿瘤全外显子和EBV全基因测序；
(3)若患者病理诊断结果为非角化未分化鼻咽癌，则第一代类器官做HE染色证实其为肿瘤细胞；若患者病理诊断结果为分化的鼻咽癌，则需HE染色及免疫组化检测上皮标志物角蛋白的表达；
(4)判断类器官第一代肿瘤全外显子测序结果与患者肿瘤组织测序结果比较是否一致、患者血液中EBV测序和类器官EBV测序结果是否一致；上述两种测序比较结果一致时，则证明该类器官是该患者来源的鼻咽癌肿瘤细胞；
(5)类器官第一、三、五、七、九测序结果比对，观察基因突变是否一致，以鉴定类器官遗传的稳定性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的鼻咽癌组织类器官的培养与鉴定方法针对鼻咽癌组织原代培养特性以及鼻咽癌类器官的病理生理学特征设计了最佳的实验操作流程与鉴定方法。根据鼻咽癌来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，鼻咽癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。本发明的培养与鉴定方法以及特有的鼻咽癌类器官培养基，可以成功稳定的培养出与亲本肿瘤病理生理学特征、基因分型高度一致，组织形态高度相似的鼻咽癌类器官。除了满足科学研究的需要，在临床用药指导方面，目前复发难治性鼻咽癌患者没有合适的靶向药物，活检样本的体外3D培养为患者的药物用药指导提供了很好的一个有益的选择。此外，本发明培养方法流程也可用于其余癌种类器官的培养，形成一个标准规范化肿瘤类器官培养体系。同时，本发明的培养基可以完成鼻咽部粘膜/鼻咽癌组织的传代培养，达到大规模复制鼻咽癌类器官的需求，控制培养得到的类器官具有高度的一致性。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
DMEM：购自GIBCO公司，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。正常卵巢组织短途运输用DMEM4度低温保存。
DMEM/F12：购自GIBCO公司，F12培养基Ham’s F 12nutrient medium动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的，现在常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1:1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。
Matrigel：从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出Matrigel基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸卵巢素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。Matrigel基底膜基质在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
B27：购自GIBCO公司,即B27补充剂，可维持原代大鼠、小鼠和人PSC来源及胚胎来源的神经元，使人PSC来源和胚胎来源的神经干细胞(NSC)分化成神经元。
N-acetylcysteine：购自SIGMA公司,N-乙酰半胱氨酸。
EGF：购自R&D公司，表皮生长因子。
Noggin：购自Peprotech公司，细胞生长蛋白成分。
R-sponding 1：购自R&D Systems公司，WNT信号通路激活因子
A83-01：购买自Tocris Bioscience
HGF：购自Peprotech公司，肿瘤生长因子
FGF10：购自Peprotech公司,成纤维细胞生长因子。
Prostaglandin E2：Tocris Bioscience公司，肿瘤干细胞生长因子
Nicotinamide：购自SIGMA公司，烟酰胺。
Y-27632 dihydrochloride：购自Abmole Bioscience，ROCK特异性通路阻断剂。
WNT3a：WNT信号通路激动剂，购自Peprotech公司。
Glutmax：谷氨酰胺，购自GIBCO公司。
SB202190：购自Sigma-Aldrich公司，小分子抑制剂。
TrypLE Express购自Life Technologies，无血清培养基培养细胞消化酶。
Collagenase type II胶原酶，购自Life Technologies。
FGF-7：购自Peprotech公司,上皮细胞生长因子
转铁蛋白Transferrin：购自Sigma-Aldrich公司，小蛋白分子。
HE染色所需试剂材料：伊红：购自赛默飞公司，细胞浆染料；苏木精：购自赛默飞公司，细胞质染料；无水乙醇：购自赛默飞公司；硫酸铝钾：购自赛默飞公司；碘酸钠：购自赛默飞公司；冰醋酸：购自赛默飞公司；甘油：购自赛默飞公司。
实施例1：
一种鼻咽癌类器官的培养基，上述培养基包括以下组分：B27，50X稀释；N-acetylcysteine 1mM；EGF 5ng/ml；Noggin 100ng/ml、R-spondin 1 250ng/ml；A83-01500nM；HGF 10ng/ml；Nicotinamide 10mM；Y-27632 10μM；Wnt3a 250ng/ml；Glutmax 100X稀释；Heregulinβ-1 20ng/ml；Gastrin 1nM；FGF-10 10ng/ml；Prostaglandin E2 1μM；SB202190 10μM；FGF-7 10ng/ml。
实施例2
根据实施例1的培养基培养鼻咽癌类器官的方法，具体方法如下：
将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移至37℃、220rpm恒温摇床消化1.5小时左右；第一次消化结束后，离心弃上清，加2ml消化酶II吹打重悬，将离心管放入37℃、220rpm恒温摇床消化10min，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加2ml Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用70μm细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取1ml红细胞裂解液重悬细胞2-3min后加入1mlHBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,3000细胞每50μl胶滴混合液，用100μl移液枪将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约30μl；将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃,5％CO2恒温孵箱，倒置45min；加入已预热好的鼻咽癌类器官培养基，约2ml；每间隔2-3天更换一次培养基，培养出鼻咽癌类器官。
其中，胶滴混合液中，DMEM/F12培养基与matrigel的比例为1:2；消化酶I为collagenase type II和分散酶；消化酶II为TrypLE Express和DNaseI酶。
实施例3
对实施例2所培养出的类器官进行鉴定，具体的鉴定方法如下：
收集类器官，滴入事先准备好的OCT包埋剂中，-80℃冰冻后切片(染色常规)，鉴定细胞种类以及细胞来源。免疫荧光染色，Q-PCR检测组织中的细胞来源鼻咽粘膜组织相关基因的表达。将类器官与患者肿瘤组织与血液送往华大基因做肿瘤全外显子及EB病毒全基因测序，证实肿瘤组织与鼻咽癌类器官的同源性。体外利用CRISPR/Cas9技术进行基因突变，研究相关基因在鼻咽癌相关疾病中发生发展中的作用。
同源性和稳定性鉴定具体步骤如下：
(1)鼻咽癌组织做肿瘤全外显子测序，患者血液做EBV全基因测序；
(2)类器官培养成功第一代并传代后，分别将类器官第一代、第三代、第五代、第七代、第九代做肿瘤全外显子和EBV全基因测序；
(3)若患者病理诊断结果为非角化未分化鼻咽癌，则第一代类器官做HE染色证实其为肿瘤细胞；若患者病理诊断结果为分化的鼻咽癌，则需HE染色及免疫组化检测上皮标志物角蛋白的表达；
(4)判断类器官第一代肿瘤全外显子测序结果与患者肿瘤组织测序结果比较是否一致、患者血液中EBV测序和类器官EBV测序结果是否一致；上述两种测序比较结果一致时，则证明该类器官是该患者来源的鼻咽癌肿瘤细胞；
(5)类器官第一、三、五、七、九测序结果比对，观察基因突变是否一致，以鉴定类器官遗传的稳定性。
对比例1
对比普通原代培养方法。
采用传统的肿瘤组织原代培养方法，采用普通的培养基(DMEM+10％FBS)2D条件下培养的分散的鼻咽部粘膜及鼻咽癌细胞，37℃,5％CO2细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基，结果发现鼻咽部粘膜及鼻咽癌细胞贴壁效果不佳，生长缓慢，成活率低，无法形成有结构的、多细胞成份的类器官。
对比例2
对比CD-DST胶滴培养方法。
采用CD-DST特有的培养基，37℃,5％CO2细胞培养箱3D条件下培养，每间隔2-3天更换一次培养基。该培养方法对肿瘤细胞数量要求较高，所需较大肿瘤组织。通过亲本肿瘤与类器官测序结果对比发现，鼻咽癌类器官基因突变序列与亲本肿瘤突变序列差异较大。同时该方法培养的类器官无法传代、冻存与复苏。不适合做进一步的研究。鼻咽部粘膜及鼻咽癌组织类器官形成缓慢，Q-PCR检测鼻咽部粘膜及鼻咽癌组织类器官相关基因表达发现其中相关基因表达水平低于来源的鼻咽部粘膜及鼻咽癌组织。
以上所述仅为本发明的优选实施例，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的相关技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，其中所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鼻咽癌类器官的培养基，其特征在于，上述培养基包括以下组分：B27、N-acetylcysteine、EGF、Noggin、R-spondin 1、A83-01、HGF、Nicotinamide、Y-27632、Wnt3a、Glutmax、Heregulinβ-1、Gastrin、FGF-10、Prostaglandin E2、SB202190和FGF-7。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，各组分的含量为：B27，40-60X稀释；N-acetylcysteine 0.5-10mM；EGF 1-10ng/ml；Noggin 10-500ng/ml、R-spondin 150-500ng/ml；A83-01 100-1000nM；HGF 1-100ng/ml；Nicotinamide 1-100mM；Y-27632 1-50μM；Wnt3a50-500ng/ml；Glutmax 50-200X稀释；Heregulin β-1 5-100ng/ml；Gastrin 0.1-10nM；FGF-10 1-100ng/ml；Prostaglandin E2 0.1-10μM；SB202190 1-100μM；FGF-7 1-100ng/ml。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，各组分的含量为：B27，50X稀释；N-acetylcysteine 1mM；EGF 5ng/ml；Noggin 100ng/ml、R-spondin 1250ng/ml；A83-01500nM；HGF 10ng/ml；Nicotinamide 10mM；Y-27632 10μM；Wnt3a 250ng/ml；Glutmax 100X稀释；Heregulin β-1 20ng/ml；Gastrin 1nM；FGF-10 10ng/ml；Prostaglandin E2 1μM；SB202190 10μM；FGF-7 10ng/ml。
4.一种鼻咽癌类器官的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移恒温摇床消化；第一次消化结束后，离心弃上清，加消化酶II吹打重悬，将离心管放入恒温摇床消化，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取红细胞裂解液重悬细胞后加入HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,将胶滴接种至培养皿中；将培养皿静置，观察胶滴是否流动，若不流动，放入恒温孵箱，倒置；加入权利要求1-3任一项的鼻咽癌类器官培养基；定期更换培养基，培养出鼻咽癌类器官。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将肿瘤组织在冰上剪碎，加入类器官消化酶I重悬，转移至37℃、220rpm恒温摇床消化1.5小时左右；第一次消化结束后，离心弃上清，加2ml消化酶II吹打重悬，将离心管放入37℃、220rpm恒温摇床消化10min，加入Hanks液终止消化，经消化酶II消化后为单细胞；第二次消化结束后，离心弃上清，获得细胞沉淀，再加2ml Hanks液吹打重悬消化的组织沉淀；用70μm细胞筛网过滤细胞，离心弃上清；取1ml红细胞裂解液重悬细胞2-3min后加入1ml HBSS终止；再进行细胞计数，离心得鼻咽癌单细胞沉淀；全程低温冰上操作,加入计算量的预冷DMEM/F12培养基,再混合matrigel,3000细胞每50μl胶滴混合液，用100μl移液枪将胶滴接种至6cm培养皿中，每个胶滴大小约30μl；将培养皿静置2min，观察胶滴是否流动，若不流动，放入37℃,5％CO2恒温孵箱，倒置45min；加入权利要求1-3任一项的鼻咽癌类器官培养基(预热好的)，约2ml；每间隔2-3天更换一次培养基，培养出鼻咽癌类器官。
6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，胶滴混合液中，DMEM/F12培养基与matrigel的比例为1:2；和/或,消化酶I为collagenase type II和分散酶；和/或,消化酶II为TrypLE Express和DNaseI酶。
7.一种权利要求4-6任一项培养的鼻咽癌类器官的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)鼻咽癌组织做肿瘤全外显子测序，患者血液做EBV全基因测序；
(2)类器官培养成功第一代并传代后，分别将类器官第一代、第三代、第五代、第七代、第九代做肿瘤全外显子和EBV全基因测序；
(3)若患者病理诊断结果为非角化未分化鼻咽癌，则第一代类器官做HE染色证实其为肿瘤细胞；若患者病理诊断结果为分化的鼻咽癌，则需HE染色及免疫组化检测上皮标志物角蛋白的表达；
(4)判断类器官第一代肿瘤全外显子测序结果与患者肿瘤组织测序结果比较是否一致、患者血液中EBV测序和类器官EBV测序结果是否一致；上述两种测序比较结果一致时，则证明该类器官是该患者来源的鼻咽癌肿瘤细胞；
(5)类器官第一、三、五、七、九测序结果比对，观察基因突变是否一致，以鉴定类器官遗传的稳定性。
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