CN104017771A

CN104017771A - 一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基及其使用方法

Info

Publication number: CN104017771A
Application number: CN201410288590.2A
Authority: CN
Inventors: 李志远; 邓思浩; 薛志琴; 贺旭; 钟小林; 胡杏
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2014-06-24
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: CN104017771B

Abstract

本发明公开了一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基及其使用方法。该培养基是在Neurobasal-A medium中含有B-27 Supplement without retinoic acid，L-Glutamine，FBS，β-NGF，BDNF，RA，维生素E。该培养基不仅成本低，而且关键是解决了现有的神经干细胞分化效率低的问题，明显提高了神经干细胞分化成神经元的效率。

Description

一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基及其使用方法

技术领域

本发明属于神经干细胞培养分化的技术领域，具体涉及一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基及其使用方法。

背景技术

传统观点普遍认为，中枢神经系统的自我修复能力有限，损伤后的神经元将不能再生。尽管如此，全世界的学者们都在努力试图挑战这种传统的观念。自从Reynolds和Weiss在20世纪90年代从小鼠的纹状体组织中分离、培养出神经干细胞以来，人们不仅从各类动物及人的胚胎，而且从成年动物及人的中枢神经系统组织内分离、培养出了神经干细胞，并且证明其具有很强的增殖及自我更新能力，打破了这一传统观念。学术界目前将神经干细胞的特性概括描述为一类具有增殖、自我更新和多向分化潜能力的母细胞，它通过不对等的分裂方式进行增殖，并且根据培养条件的不同，可分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经组织的各类细胞。

神经干细胞向神经细胞的分化不仅可以应用于临床治疗各种神经系统的疾病，如帕金森症、脑卒中、脊髓病变等；另外也可以作为体外研究哺乳动物神经系统发育的模型，不但能获得均匀大量的细胞,而且能控制增殖速度和分化方向,易与宿主细胞形成正常的细胞联系。目前基于神经细胞的替代疗法主要有两类，一类是通过调控体内神经干细胞的增殖分化来实现；另一类是通过神经干细胞移植来替代丢失的神经组织。大脑损伤后，新生的神经元数量非常少，而且可能不具有功能，不能整合到宿主的大脑环路中。这时候可以选择移植神经干细胞到损伤区域，使其定向分化成神经元，但是，移植的细胞面临着同样的问题，那就是神经元样分化、成熟以及如何整合到宿主的神经功能网络中。因此，如何诱导神经干细胞增生并分化为神经元，提高神经干细胞分化成神经元的效率成为干细胞移植前非常关键的基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基及其使用方法，解决现有的神经干细胞分化效率低的问题，提高神经干细胞分化成神经元的效率。

一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基，是在Neurobasal-A medium中含有

所述的促进大鼠神经干细胞分化的培养基，优选是在Neurobasal-A medium中含有

所述的促进大鼠神经干细胞分化的培养基的使用方法，初始状态的细胞数为5×10⁵-2×10⁶个细胞/ml培养液，37℃、5％CO₂条件下进行培养，分化培养时间为5-7天，培养过程中隔天半量换液。

上述使用时是在25cm²培养瓶中培养基用量为5-6ml。

本发明从新生大鼠分离出脑组织，培养出神经干细胞，然后用一种成本较低，分化效率高的培养基诱导神经干细胞分化，并用免疫荧光化学染色方法予以鉴定，进行细胞计数后明确该培养基具有很高的体外诱导神经干细胞分化的效率。

附图说明

图1为神经原代细胞培养图；

图2为神经球nestin免疫荧光染色鉴定结果；

图3为本发明培养基培养后分化的神经干细胞。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

1)神经干细胞完全培养基的配制：

100ml Neurobasal-A medium神经干细胞专用培养基中含有以下组分：

B-27Supplement B27添加物 2ml (终浓度2％体积比)；

L-Glutamine谷氨酰胺 (母液浓度为200mM)1ml (终浓度2mM)；

EGF 表皮生长因子 (母液浓度为100μg/ml)20μl (终浓度50ng/ml)；

bFGF碱性成纤维细胞生长因子(母液浓度为25μg/ml)80μl (终浓度50ng/ml)；

肝素钠 (母液浓度为5mg/ml) 100μl (终浓度50μg/ml)；

先配好母液，-20度保存，然后每次配制的时候再加到终浓度。

2)新生大鼠神经干细胞的分离培养：新生1天SD大鼠取脑组织，用眼科剪将脑组织剪碎后加入木瓜蛋白酶，置于37℃、5％CO₂培养箱中消化20min。用200μl移液枪轻柔吹打组织6-8次，吸出上清液并转移至离心管中。重新往含有组织块的培养皿中加入1ml木瓜蛋白酶，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续消化20min。再次吸取上清液加入上述离心管中，反复轻柔吹打成小的细胞团及单细胞悬液。过400目不锈钢滤筛，制成单细胞悬液。低速离心，1000rpm/min，离心5min。弃上清液，加入1)中的神经干细胞完全培养基2ml，用细吸管轻柔吹打，使细胞沉淀与培养液混合均匀，形成单细胞悬液。加入1)中的神经干细胞完全培养基，调整细胞密度为5×10⁵个细胞/ml，接种到25cm²培养瓶进行原代及传代培养，待克隆形成后，收集悬浮生长的神经干细胞球进行传代培养。

3)Nestin免疫细胞化学检测：将无菌盖玻片放置进24孔板，并用Matrigel包被30min以上，每孔200μl。晾干备用。收集生长良好的第3代神经干细胞球，接种至预先放置Matrigel包被的无菌盖玻片的24孔板，贴壁培养4h(此时大部分克隆球贴壁)。用0.01mol/L PBS(pH＝7.4)清洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次，每次5min。0.2％TritonX-100通透细胞20min，PBS液漂洗3次，每次5min。用含有5％驴血清的PBS预孵育2小时。滴加兔抗nestin单克隆抗体(1:500)，放入湿盒内，4℃低温过夜。次日，PBS漂洗3次，每次5min。与Alexa Fluor594偶联驴抗兔IgG(1:200)37℃孵育2小时。PBS洗3次，每次5min。Bisbenzimide(Hoechst33258，1:50,000)染细胞核。50％缓冲甘油(PBS配制)封片。

4)PBS取代一抗做阴性对照，其余步骤相同。OLYMPUS BX60荧光显微镜下观察，NikonDXM 1200c5.30成像系统拍照。

5)本发明神经干细胞分化培养基的制备:100ml Neurobasal-A medium神经干细胞分化专用培养基中含有以下组分：

B-27Supplement without retinoic acid B27添加物 2ml (2％)体积比；

L-Glutamine 谷氨酰胺(母液浓度为200mM)1ml (终浓度2mM)；

FBS 胎牛血清 1ml (1％)体积比；

β-NGF神经生长因子 (母液浓度为200μg/ml) 25μl (终浓度50ng/ml)；

BDNF脑源性生长因子 (母液浓度为20μg/ml) 100μl (终浓度20ng/ml)；

RA 全反式维甲酸 (母液浓度为10mM) 10μl(终浓度1μM)；

维生素E (母液浓度为1mM) 1ml(终浓度10μM)。

6)神经干细胞的诱导分化：将无菌盖玻片放置进24孔板，并用Matrigel包被30min以上，每孔200μl。晾干备用。用吸管在原代培养瓶中轻轻吹打，使沉聚于瓶底的细胞球浮起。将原代培养形成的神经干细胞球悬液移至离心管，800rpm/min，离心3min.弃上清，加入2ml木瓜蛋白酶，混匀，37℃消化20min。1000r/min离心5min。弃上清，加入0.5ml本发明神经干细胞分化培养液，用吸管反复吹打60～70次。计数后，用本发明分化培养基调整细胞密度为5×10⁵个细胞/ml，接种至预先放置Matrigel包被的无菌盖玻片的24孔板，每孔0.5ml，隔天半量换培养液1次，37℃、5％CO₂条件下分化培养5-7天，并随时观察NSCs分化状态、生长状况及细胞形态。

7)分化贴壁培养7～14d取出盖玻片，对分化后的细胞进行免疫荧光染色。0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次，每次5min。0.2％TritonX-100通透细胞20min，PBS液漂洗3次，每次5min。用含有5％驴血清的PBS预孵育2h。吸弃血清，加一抗，分别为小鼠抗β-III-Tubulin(1:200)和兔抗GFAP(1:500)，放入湿盒内，4℃冰箱过夜。次日，PBS漂洗3次，每次5min，与Alexa Fluor594偶联驴抗小鼠和AlexaFluor488偶联驴抗兔IgG(1:200)共孵育2h。Bisbenzimide(Hoechst33258，1:50,000)对染。50％缓冲甘油(PBS配制)封片。阴性对照不加一抗以0.01mol/L PBS代替，其余步骤相同。OLYMPUS BX60荧光显微镜下观察，Nikon DXM1200c5.30成像系统拍照。

结果：

a.原代细胞取材之后，培养24h后可见三五个单细胞聚集成团块，3天后可见神经球，呈现漂浮的细胞团，见图1A；培养7天后，神经球的数量也逐渐增多，大小不等，边界清晰整齐，见图1B.

b.神经球nestin免疫荧光染色鉴定结果见图2.

c.在大鼠新生神经干细胞分化培养基中加入维生素E,神经干细胞向神经元分化的比例明显提高，特别是当维生素E的浓度为10μM时，免疫荧光双标检测显示神经元的比例从对照组的18.29±3.78％上升到27.51±3.91％，差异具有统计学意义(P<0.05)。证实维生素E可诱导大鼠新生神经干细胞向神经元的分化，具有良好的应用效果。见图3。

本发明培养基成分的部分探索过程见下表1：每种成分都做了单因素试验，以确定最优的浓度范围.

表1

由上表1可知DMEM/F12+2％B27+10％胎牛血清+2mM谷氨酰胺分化，发现分化出来的主要是神经胶质细胞，神经元比例非常小(1.68±0.25％),星形胶质细胞的比例达到82.04±3.26％。然后就把DMEM/F12换成了neurobasal-A medium(神经干细胞专用培养基)，即neurobasal-A medium+2％B27+10％血清+2mM谷氨酰胺，发现分化出来的神经元比例上升，但是仍然只有2.25±1.13％，星形胶质细胞的比例为81.36±4.02％接着换成neurobasal-Amedium+2％B27+1％血清+2mM谷氨酰胺，分化效率提升到6.25±1.28％，星形胶质细胞的比例降低为75.27±4.13％。随后加入了50ng/mlβ-NGF+20ng/ml BDNF+1μM RA,神经元比例上升到18.29±3.78％，星形胶质细胞的比例为62.99±4.16％。最后在前面的基础上加入了5μM维生素E，神经元比例继续上升到22.34±3.34％,星形胶质细胞的比例为60.34±3.08％,维生素E浓度达到10μM时，神经元比例上升到27.51±3.91％，星形胶质细胞的比例则下降至59.09±3.09％，分化效率显著提升。而当其浓度大于10μM时，β-III-tubulin阳性神经元比例则随着维生素E浓度的增加反而降低，当浓度达到50μM，神经元的比例降低到15.31±3.01％，与对照组相比较有显著性差异(P<0.05)，这可能与高浓度的维生素E产生的细胞毒性有关。

Claims

1.一种促进大鼠神经干细胞分化的培养基，其特征在于，是在Neurobasal-A medium中含有

2.根据权利要求1所述的促进大鼠神经干细胞分化的培养基，其特征在于，是在Neurobasal-A medium中含有

3.权利要求1所述的促进大鼠神经干细胞分化的培养基的使用方法，其特征在于，初始状态的细胞数为5×10⁵-2×10⁶个细胞/ml培养液，37℃、5％CO₂条件下进行培养，分化培养时间为5-7天，培养过程中隔天半量换液。

4.根据权利要求3所述的促进大鼠神经干细胞分化的培养基的使用方法，其特征在于，25cm²培养瓶中培养基用量为5-6ml。