CN116490618A - 具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种二维小肠类器官的制造方法，上述二维小肠类器官具有绒毛结构，上述制造方法包括：工序1，在细胞外基质中培养来自小肠上皮的细胞，得到三维小肠类器官；工序2，使上述三维小肠类器官分散，在细胞外基质上进行单层培养，得到二维小肠类器官；以及工序3，一边使上述二维小肠类器官的培养基流动一边进一步培养，其结果，上述二维小肠类器官形成绒毛结构。

Description

具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造方法
技术领域
本发明涉及具有绒毛(villus)结构的二维小肠类器官的制造方法。更详细而言，本发明涉及具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造方法、具有绒毛结构的二维小肠类器官、小肠疾病的机制的阐明、小肠中的营养素或药物的吸收控制剂的筛选方法、小肠中的绒毛结构的形成控制剂的筛选方法、小肠中的对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂的筛选方法、调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质的筛选方法和移植材料。本申请基于2020年12月3日在日本提出申请的日本特愿2020－201332号而要求优先权，在此引用其内容。另外，本申请在2021年2月24日在以下的论文(Sugimoto S.,et al.,An organoid－based organ－repurposing approach to treat short bowel syndrome,Nature,592(7852),99－104,2021.)中被公开，在此援引其内容。
背景技术
已知有正常小肠类器官、消化道肿瘤类器官、大肠类器官等的使用肠道组织而得的三维类器官的制造方法(例如参照专利文献1、2)。另外，发明人等在以前开发了通过使来自人肠道上皮的三维类器官分散并进行单层培养而制造二维类器官的技术(例如参照专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2017/142069号
专利文献2：国际公开第2017/199811号
专利文献3：国际公开第2018/038042号
发明内容
根据专利文献3中记载的方法，由肠道组织制造模拟了成熟肠道组织的三维类器官，将该三维类器官分散并进行二维培养，从而能够制造包含构成成熟肠道的细胞的二维类器官。
专利文献3中记载的二维类器官具有构成成熟肠道的细胞展开在二维平面上的结构，能够感染诺如病毒等感染感染肠组织的病毒并使其增殖。
但是，专利文献3中记载的二维类器官是平坦的结构，不具有带来作为肠道的生理功能的营养素吸收等功能的绒毛结构。因此，难以使用专利文献3中记载的二维类器官来调查肠道中的吸收等与原本的肠道内腔结构有关的机制。
因此，本发明的目的在于提供一种制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的技术。
本发明包含以下的方式。
[1]一种二维小肠类器官的制造方法，上述二维小肠类器官具有绒毛结构，上述制造方法包括：工序1，在细胞外基质中培养来自小肠上皮的细胞，得到三维小肠类器官；工序2，使上述三维小肠类器官分散，在细胞外基质上进行单层培养，得到二维小肠类器官；以及工序3，一边使上述二维小肠类器官的培养基流动一边进一步培养，其结果，上述二维小肠类器官形成绒毛结构。
[2]一种二维小肠类器官，具有绒毛结构。
[3]根据[2]所述的二维小肠类器官，其是由来自小肠功能障碍或小肠疾病的患者的细胞而制造的。
[4]根据[2]所述的二维小肠类器官，其是由来自正常小肠的细胞而制造的。
[5]一种小肠中的营养素或药物的吸收控制剂的筛选方法，包括在受试物质的存在下，测定基于具有绒毛结构的二维小肠类器官的营养素或药物的吸收量的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述吸收量显著变化的情况下，表示上述受试物质为小肠中的营养素或药物的吸收控制剂。
[6]一种小肠中的绒毛结构的形成控制剂的筛选方法，包括：在受试物质的存在下，制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的工序；以及评价所制造的上述二维小肠类器官的绒毛结构的形态的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述形态显著变化的情况下，表示上述受试物质为小肠中的绒毛结构的形成控制剂。
[7]一种小肠中的对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂的筛选方法，包括：在受试物质的存在下，制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的工序；以及测定所制造的上述二维小肠类器官中的对象物质的消化、吸收或代谢而得到测定值的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述测定值显著变化的情况下，表示上述受试物质为小肠中的上述对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂。
[8]一种调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质的筛选方法，包括在受试物质的存在下，测定具有绒毛结构的二维小肠类器官中的肠内细菌和/或病毒的生长的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述肠内细菌和/或病毒的生长显著变化的情况下，表示上述受试物质为调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质。
[9]一种移植材料，是包含小肠类器官的移植材料，用于以如下方式进行移植：移植到生物体的大肠，使肠液流动，从而在大肠中形成具有小肠功能的组织。
根据本发明，能够提供一种制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的技术和小肠疾病治疗用类器官。
附图说明
图1是表示实验例1中将人回肠类器官或人大肠类器官移植到免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的大肠的步骤的示意图。
图2是实验例1中的人回肠类器官移植片的组织切片的苏木精·伊红染色的结果的显微镜照片。
图3是实验例1中拍摄的人回肠类器官移植片的组织切片的透射型电子显微镜照片。
图4是表示实验例2中检测人回肠类器官移植片和人大肠类器官移植片中的、人细胞角蛋白和蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达而得的结果的照片。
图5是表示实验例3中检测人回肠类器官移植片和人大肠类器官移植片中的淋巴管内皮透明质酸受体1(Lyve－1)的表达而得的结果的照片。
图6中左部是表示实验例3中检测人回肠类器官移植片中的NBD－胆固醇和Lyve－1的存在而得的结果的照片。图6中右部是表示在与图6中左部相同的视野中检测表示人回肠类器官移植片的存在的RFP和Lyve－1的存在而得的结果的照片。
图7中上部是表示实验例3中在受者的大肠与人回肠类器官移植片的边界检测表示人回肠类器官移植片的存在的RFP而得的结果的照片。图7中下部是在与图7中上部相同的视野中检测NBD－胆固醇而得的结果的照片。
图8是表示实验例4中的实验的概要的示意图。
图9是表示实验例4中将经二维培养的人十二指肠类器官和经二维培养的人大肠类器官在培养基的流动的存在下和不存在下进行培养而得的结果的显微镜照片。
图10是实验例4中将经二维培养的十二指肠类器官在培养基的流动的存在下培养4天，然后固定，将核用Hoechst33342染色后，使用双光子显微镜拍摄，在高度上进行上色处理而得的结果的3D图像。
图11是表示实验例5中的RNAseq解析的结果的MA图。
图12是表示实验例6中的免疫染色的结果的照片。
图13是实验例6中拍摄的电子显微镜照片。
图14是表示基于图13的电子显微镜照片而测定的微绒毛的长度的图表。
具体实施方式
[具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造方法]
一个实施方式中，本发明提供一种二维小肠类器官的制造方法，上述二维小肠类器官具有绒毛结构，上述制造方法包括：工序1，在细胞外基质中培养来自小肠上皮的细胞，得到三维小肠类器官；工序2，使上述三维小肠类器官分散，在细胞外基质上进行单层培养，得到二维小肠类器官；以及工序3，一边使上述二维小肠类器官的培养基流动一边进一步培养，其结果，上述二维小肠类器官形成绒毛结构。
实施例中，如后所述，根据本实施方式的制造方法，能够在体外(in vitro)制造具有绒毛结构的二维小肠类器官。另外，实施例中，如后所述，发明人等明确了在通过本实施方式的制造方法而得到的二维小肠类器官中，构成绒毛结构的细胞表达了与肠道消化吸收作用有关的分子，显示小肠功能。
＜工序1＞
工序1中，在细胞外基质中培养来自小肠上皮的细胞，得到三维小肠类器官。来自小肠上皮的细胞可以为正常细胞，也可以为肿瘤细胞。
本说明书中，小肠是指具有带来营养素吸收等功能的绒毛结构的肠道，包含十二指肠、空肠和回肠。小肠是具有将胃中消化的食物进一步分解并吸收营养素的功能的脏器。
另外，本说明书中，上皮细胞包含从上皮组织取得的已分化的上皮细胞和上皮干细胞。上皮干细胞是指具有长期的自我复制功能和向上皮分化细胞的分化能力的细胞，是指来自上皮组织的干细胞。
作为从小肠上皮组织分离细胞的方法，可举出本技术领域中公知的方法。例如，通过将螯合剂和组织恒温放置，从而能够分离隐窝。清洗该组织后，用载玻片将上皮细胞层从粘膜下层剥离，切碎。然后，在包含胰蛋白酶以及优选EDTA和EGTA中的至少一者的液体中恒温放置，使用过滤和离心机中的至少任一者将未消化的组织碎片与来自隐窝的单一细胞分离。也可以使用其它蛋白质分解酶，例如胶原酶、分散酶I等代替胰蛋白酶。
本说明书中，三维类器官是指通过使细胞在经控制的空间内高密度地聚集而自组织化的立体的细胞组织体。另外，二维类器官是通过使三维类器官分散并进行单层培养而得到的平面的细胞组织体。
现有的三维小肠类器官是球状且绒毛结构在其表面突出，但肠道内腔为球状的内侧的结构。因此，为了使用三维小肠类器官对介由绒毛的吸收等进行研究，需要进一步的实验方法。与此相对，通过本实施方式的制造方法而得到的二维小肠类器官为在其培养上表面具有肠道内腔的绒毛结构的二维的细胞组织体，因此，适于在体外研究模拟了原本的肠道内腔的介由绒毛组织的吸收·代谢机制、药剂对绒毛结构的影响、肠内细菌或病毒的生长。
细胞外基质(Extra Cellular Matrix：ECM)是指在生物体的细胞外存在的超分子结构。细胞外基质成为用于细胞增殖的基础。细胞外基质包含各种多糖、水、弹性蛋白、糖蛋白等。作为糖蛋白，例如可举出胶原、巢蛋白(Nidogen)、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
细胞外基质可以为市售品，也可以制备。作为市售的细胞外基质，例如可举出来自Engelbreth－Holm－Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基底膜制备物(例如，Matrigel(注册商标，康宁公司))。此外，也可以使用细胞外基质蛋白质(Thermo Fisher Scientific公司)、ProNectin(Sigma公司)等合成细胞外基质。另外，还可以使用天然细胞外基质和合成细胞外基质的混合物。
作为细胞外基质的制备方法，例如可举出使用结缔组织细胞的方法等。更具体而言，可以在培养细胞外基质产生细胞、例如成纤维细胞后，取出这些细胞，回收细胞外基质。
作为细胞外基质产生细胞，例如可举出主要产生胶原和蛋白多糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质前胶原和纤连蛋白的成纤维细胞，主要产生胶原(I型、III型、V型)、硫酸软骨素蛋白多糖、透明质酸、纤连蛋白和生腱蛋白－C的结肠肌成纤维细胞等。
将细胞外基质与来自小肠上皮的细胞混合，使其在37℃凝固，从而能够将来自小肠上皮的细胞包埋于细胞外基质中。接下来，在包含细胞的细胞外基质重叠培养基，从而可以进行三维培养，得到三维小肠类器官。
作为用于制造三维小肠类器官的培养基，优选在基本培养基中添加了下述i)～v)的成分中的至少1种的培养基。培养基可以包含血清，但优选为无血清。
i)Wnt激动剂
ii)选自胰岛素样生长因子1(Insulin－like Growth Factor1：IGF1)、成纤维细胞生长因子2(Fibroblast Growth Factor2：FGF2)、EGF(Epidermal Growth Factor)和表皮调节素(Epiregulin：EREG)中的至少1种
iii)骨形成因子(Bone Morphogenetic Protein：BMP)抑制剂
iv)转化生长因子－β(Transforming Growth Factor－β：TGF－β)抑制剂
v)γ分泌酶抑制剂
用于制造三维小肠类器官的培养基优选包含选自IGF1、FGF2、EGF和表皮调节素(EREG)中的至少1种。是否含有IGF1、FGF2、EGF和表皮调节素中的任一者可以适当地选择。用于制造三维小肠类器官的培养基优选包含IGF1和表皮调节素、FGF2和表皮调节素、或者IGF1和FGF2，更优选包含IGF1和FGF2。
作为基本培养基，可以使用所有无血清的细胞培养基本培养基。例如，可举出用碳酸系的缓冲液缓冲化为pH7.2～pH7.6的规定的合成培养基等。更具体而言，可举出补充了谷氨酰胺、胰岛素、B27补充剂(Thermo Fisher Scientific公司)、N－乙酰基－L－半胱氨酸(富士胶片和光纯药)、青霉素、链霉素、转铁蛋白等的改良型达尔伯克改良伊格尔培养基(Advanced－Dulbecco’s Modified Eagle Medium)/汉姆氏(Ham’s)F－12混合培养基(DMEM/F12)等。另外，也可以使用RPMI1640培养基、Advanced－RPMI培养基等代替DMEM/F12培养基。
(Wnt激动剂)
Wnt激动剂是指在细胞内将T细胞因子(T－cell factor)(以下也称为TCF)/淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor)(以下也称为LEF)介导的转录激活的药剂。因此，Wnt激动剂不限于Wnt家族蛋白质，包含与Frizzled受体家族成员结合来激活的Wnt激动剂、细胞内β－连环蛋白分解的抑制剂、TCF/LEF的激活物质。Wnt激动剂优选为选自Wnt蛋白质、R－海绵硬蛋白和GSK－3β抑制剂中的至少1种。
用于制造三维小肠类器官的培养基优选包含Wnt激动剂。作为Wnt激动剂，更优选包含Wnt蛋白质和作为其稳定化物质的阿法敏(Afamin)的复合物，进一步优选包含Wnt蛋白质与阿法敏的复合物以及R－海绵硬蛋白。通过在培养基中包含Wnt蛋白质与阿法敏的复合物以及R－海绵硬蛋白，能够以更高的效率形成三维小肠类器官。
《Wnt蛋白质》
作为Wnt蛋白质，来源没有特别限定，可以使用来自各种生物的Wnt蛋白质。其中，优选为来自哺乳动物的Wnt蛋白质。作为哺乳动物，例如可举出人、小鼠、大鼠、牛、猪、兔等。作为哺乳动物的Wnt蛋白质，可举出Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16等。在用于制造三维小肠类器官的培养基中，可以组合多种Wnt蛋白质来使用。
作为制备Wnt蛋白质的方法，例如可举出使用Wnt蛋白质表达细胞来制备的方法等。在Wnt蛋白质表达细胞中，细胞的来源(生物种、培养形态等)没有特别限定，只要是稳定表达Wnt蛋白质的细胞即可，可以为暂时表达Wnt蛋白质的细胞。作为Wnt蛋白质表达细胞，例如可举出稳定表达小鼠Wnt3a的L细胞(ATCC CRL－2647)、稳定表达小鼠Wnt5a的L细胞(ATCC CRL－2814)等。另外，Wnt蛋白质表达细胞可以使用公知的基因重组技术制作。即，通过将编码期望的Wnt蛋白质的DNA插入公知的表达载体，将所得到的表达载体导入适当的宿主细胞，从而能够制作Wnt蛋白质表达细胞。编码期望的Wnt蛋白质的基因的碱基序列例如可以从GenBank(R)等公知的碱基序列数据库取得。
通过Wnt蛋白质表达细胞而表达的Wnt蛋白质只要具有Wnt活性，则可以为Wnt蛋白质的片段，也可以包含除Wnt蛋白质的氨基酸序列以外的氨基酸序列。对除Wnt蛋白质的氨基酸序列以外的氨基酸序列没有特别限定，例如可举出亲和标签的氨基酸序列等。另外，Wnt蛋白质的氨基酸序列不需要与能够从GenBank(R)等公知的数据库取得的氨基酸序列完全一致，只要具有Wnt活性，则可以为与能够从公知的数据库取得的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列。
作为与能够从GenBank(R)等公知的数据库取得的Wnt蛋白质的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列，例如，可举出能够从公知的数据库取得的氨基酸序列中缺失、置换或附加1～几个氨基酸而得的氨基酸序列等。
缺失、置换或附加1～几个氨基酸而得的氨基酸序列是指例如通过定向诱变法等公知的变异肽制作法等，使能够缺失、置换或附加的程度的数量(优选为10个以下，更优选为7个以下，进一步优选为6个以下)的氨基酸缺失、置换或附加。
另外，作为实质上相同的氨基酸序列，例如可举出与能够从公知的数据库取得的氨基酸序列的同源性为至少80％以上、优选为至少85％以上、更优选为至少90％以上、进一步优选为至少92％以上、特别优选为至少95％以上、最优选为至少99％以上的氨基酸序列等。
Wnt蛋白质的浓度优选为50ng/mL以上，更优选为100ng/mL～10μg/mL，进一步优选为200ng/mL～1μg/mL，特别优选为300ng/mL～1μg/mL。
《R－海绵硬蛋白》
作为R－海绵硬蛋白，可举出由R－海绵硬蛋白1、R－海绵硬蛋白2、R－海绵硬蛋白3和R－海绵硬蛋白4构成的R－海绵硬蛋白家族。已知R－海绵硬蛋白家族为分泌蛋白质，与Wnt信号转导通路的激活和控制有关。本实施方式的细胞培养培养基中，可以组合多种R－海绵硬蛋白来使用。
只要具有R－海绵硬蛋白活性，则可以为R－海绵硬蛋白的片段，也可以包含除R－海绵硬蛋白的氨基酸序列以外的氨基酸序列。
《GSK－3β(糖原合酶激酶(Glycogen synthase kinase)－3β)抑制剂》
作为GSK－3β抑制剂，例如可举出CHIR－99021(CAS号：252917－06－9)、CHIR－98014(CAS号：252935－94－7)、锂、肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS号：142273－20－9)、6－溴靛玉红－30－丙酮肟、SB216763(CAS号：280744－09－4)、SB415286(CAS号：264218－23－7)、阻止GSK－3与axin的相互作用的FRAT家族成员、来自FRAT的肽等。
《阿法敏》
阿法敏是指属于白蛋白家族的糖蛋白，已知存在于血液或体液中。在通常添加于培养基的血清中包含来自采取该血清的动物的阿法敏。由于血清中包含阿法敏以外的杂质等，因此，优选不使用血清而单独使用阿法敏。
培养基中包含的阿法敏的来源没有特别限定，可以使用来自各种生物的阿法敏。其中，优选为来自哺乳动物的阿法敏。作为哺乳动物，可举出与上述的哺乳动物同样的哺乳动物。主要的哺乳动物的阿法敏的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的基因的碱基序列例如可以从GenBank(R)等公知的数据库取得。例如，GenBank(R)中，人阿法敏的氨基酸序列以AAA21612的登录号登录，编码该氨基酸序列的基因的碱基序列以L32140的登录号登录，牛阿法敏的氨基酸序列以DAA28569的登录号登录，编码该氨基酸序列的基因的碱基序列以GJ060968的登录号登录。
培养基中包含的阿法敏可以为利用公知的方法将血清等中包含的天然的阿法敏纯化而得的阿法敏，也可以为重组阿法敏。重组阿法敏可以适当地使用公知的基因重组技术而制造。
作为重组阿法敏的制造方法，例如可以通过将编码阿法敏的DNA插入公知的表达载体，将所得到的表达载体导入适当的宿主细胞，使重组阿法敏表达，使用公知的纯化方法进行纯化来制造。重组阿法敏可以为附加了亲和标签的阿法敏。附加的亲和标签没有特别限定，可以从公知的亲和标签中适当地选择而使用。作为亲和标签，优选为由特异的抗体识别的亲和标签，例如可举出FLAG标签、MYC标签、HA标签、V5标签等。
上述Wnt蛋白质由于特定的丝氨酸残基被脂肪酸(棕榈油酸)修饰，因此，具有强疏水性。因此，熟知的是Wnt蛋白质容易在水溶液中凝聚或变性，因此，非常难以纯化和保存。
另一方面，报告了该特定的丝氨酸残基的基于脂肪酸的修饰是Wnt蛋白质的生理活性所必需的，参与与Frizzled受体家族成员的结合。
另外，已知在水溶液中，Wnt蛋白质与阿法敏以1：1结合，形成复合物，在保持高生理活性的同时增溶。可以通过培养表达Wnt蛋白质和阿法敏这两者的细胞的方法来制造Wnt蛋白质－阿法敏复合物，也可以通过共培养Wnt蛋白质表达细胞和阿法敏表达细胞的方法来制造Wnt蛋白质－阿法敏复合物。
培养基中包含的阿法敏的浓度没有特别限定，优选为50ng/mL～10μg/mL，更优选为100ng/mL～1μg/mL，进一步优选为300μg/mL～1μg/mL。
(IGF1)
IGF1的别名也被称为生长调节素C，是主要在肝脏中通过成长激素(GH)产生的刺激而分泌的因子。已知人体的大部分细胞(特别是肌肉、骨、肝脏、肾脏、神经、皮肤和肺等的细胞)会受到IGF1的影响。IGF1除胰岛素样效果之外，还具有调节细胞生长(特别是神经细胞)和发育以及细胞DNA合成的功能。
培养基中包含的IGF1的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL，更优选为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL。
(FGF2)
FGF2为碱性的成纤维细胞生长因子，与成纤维细胞生长因子受体(FibroblastGrowthfactor Receptor：FGFR)结合，具有促进血管内皮细胞的增殖和向筒状结构的组织化、即血管新生的功能。另外，已知人FGF2具有低分子量型(LWL)和高分子量型(HWL)这2种同源异构体。LWL主要存在于细胞质，在自分泌(autocrine)中发挥作用，另一方面，HWL位于核内，以在细胞内起作用的胞内分泌机制显示活性。
培养基中包含的FGF2的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL，更优选为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL。
(EGF)
EGF为针对各种培养外胚层性细胞和中胚层性细胞的强力的分裂促进因子，对一部分的成纤维细胞的特异性细胞的分化具有显著的影响。EGF前体通过蛋白质分解而被切断，作为使刺激细胞的53－氨基酸肽激素生成的膜结合分子而存在。
培养基中包含的EGF的浓度优选为5ng/mL～500ng/mL，更优选为10ng/mL～400ng/mL，进一步优选为50ng/mL～200ng/mL。
(EREG)
EREG是与酪氨酸激酶(ErbB)家族受体(ErbB1～4)中的ErbB1和ErbB4特异性结合的EGF样生长因子。已知刺激角蛋白生成细胞、肝细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖。另外，EREG主要是在膀胱、肺、肾脏、大肠等的恶性肿瘤、胎盘和外周血白细胞中表达。
培养基中包含的EREG的浓度没有特别限定，优选为5ng/mL～1μg/mL，更优选为10ng/mL～1μg/mL，进一步优选为50ng/mL～500ng/mL。
(BMP抑制剂)
BMP作为二聚体配体与由2种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶、I型和II型受体形成的受体复合体结合。II型受体将I型受体磷酸化，其结果，该受体激酶被激活。该I型受体接着将特异性受体底物(SMAD)磷酸化，其结果，通过信号转导通路而导入转录活性。一般而言，BMP抑制剂例如阻止或抑制BMP分子与BMP受体结合，是为了形成中和BMP活性的复合物而与BMP分子结合的药剂。另外，BMP抑制剂例如与BMP受体结合，阻止或抑制BMP分子与受体的结合，是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的药剂。
BMP抑制剂与在不存在该抑制剂的条件下的BMP活性水平相比，优选具有50％以上的抑制活性，更优选具有70％以上的抑制活性，进一步优选具有80％以上的抑制活性，特别优选具有90％以上的抑制活性。
BMP抑制剂优选为天然的BMP结合蛋白质，例如可举出头蛋白(Noggin)、格林雷(Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、腱蛋白结构域等腱蛋白样蛋白质；卵泡抑素(Follistatin)、卵泡抑素结构域等卵泡抑素相关蛋白质；DAN、DAN半胱氨酸－结结构域等DAN样蛋白质；硬化蛋白/SOST、核心蛋白聚糖、α－2巨球蛋白等。
作为培养基中包含的BMP抑制剂，其中，优选为腱蛋白样蛋白质或DAN样蛋白质，更优选为腱蛋白样蛋白质。作为腱蛋白样蛋白质，优选为头蛋白。腱蛋白样蛋白质、DAN样蛋白质为扩散性蛋白质，以各种亲和度与BMP分子结合，能够抑制BMP分子向信号转导受体接近。在培养上皮干细胞的情况下，通过将这些BMP抑制剂添加到细胞培养培养基中，能够防止干细胞的丧失。
培养基中包含的BMP抑制剂的浓度优选为10ng/mL～100ng/mL，更优选为20ng/mL～100ng/mL，进一步优选为50ng/mL～100ng/mL。
(TGF－β抑制剂)
TGF－β为生长因子的一种，在肾脏、骨髓、血小板等大致所有的细胞中产生。TGF－β中存在5种亚型(β1～β5)。另外，已知TGF－β促进成骨细胞的增殖、以及胶原这样的结缔组织的合成和增殖，对上皮细胞的增殖、破骨细胞发挥抑制性作用。一般而言，TGF－β抑制剂例如阻止或抑制TGF－β分子与TGF－β受体结合，是为了形成中和TGF－β活性的复合物而与TGF－β分子结合的药剂。另外，TGF－β抑制剂例如与TGF－β受体结合，阻止或抑制与TGF－β分子的受体的结合，是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的药剂。
作为TGF－β抑制剂，例如可举出A83－01(CAS号：909910－43－6)、ALK5抑制剂I(3－(吡啶－2－基)－4－(4－醌基)－1H－吡唑)、LDN193189(CAS号：1062368－24－4)、SB－431542(CAS号：301836－41－9)、SB－505124(CAS号：694433－59－5)、SD－208(CAS号：627536－09－8)、SB－525334(CAS号：356559－20－1)、LY364947(CAS号：396129－53－6)、LY2157299(CAS号：700874－72－2)、TGF－βRI激酶抑制剂II 616452(CAS号：446859－33－2)、TGF－βRI激酶抑制剂III 616453(CAS号：356559－13－2)、TGF－βRI激酶抑制剂IX616463(4－((4－((2,6－二甲基吡啶－3－基)氧基)吡啶－2－基)氨基)苯磺酰胺)、TGF－βRI激酶抑制剂VII 616458(CAS号：666729－57－3)、TGF－βRI激酶抑制剂VIII 616459(CAS号：356559－20－1)、AP12009(TGF－β2反义化合物“Trabedersen”)、Belagenpumatucel－L(TGF－β2反义基因修饰同种异体肿瘤细胞疫苗)、CAT－152(青光眼－乐地单抗(Glaucoma－lerdelimumab)(抗－TGF－β－2单克隆抗体))、CAT－192(美替木单抗(Metelimumab)(中和TGFβ1的人IgG4单克隆抗体)、GC－1008(抗－TGF－β单克隆抗体)等。作为TGF－β抑制剂，其中优选为A83－01。
培养基中包含的TGF－β抑制剂的浓度优选为100nM～10μM，更优选为500nM～5μM，进一步优选为500nM～2μM。
(γ分泌酶抑制剂)
作为γ分泌酶，例如可举出BMS299897(CAS号：290315－45－6)、DAPT(CAS号：208255－80－5)、DBZ(CAS号：209984－56－5)、JLK6(CAS号：62252－26－0)、L－685458(CAS号：292632－98－5)、LY411575(CAS号：209984－57－6)等。其中，优选为LY411575。
培养基中包含的γ分泌酶抑制剂的浓度优选为1nM～10μM，进一步优选为100nM～1μM。
(其它成分)
培养基可以进一步包含Rho－激酶(Rock)抑制剂。作为Rock抑制剂，例如可举出Y－27632(CAS号：129830－38－2)、法舒地尔(HA1077)(CAS号：103745－39－7)、H－1152(CAS号：871543－07－6)等。在使用Y－27632作为Rock抑制剂的情况下，优选在分散为单一细胞的干细胞的培养的最初2天添加。培养基中包含的Y－27632优选为约10μM。
培养基可以进一步添加胃泌素(或Leu15－胃泌素等适当的代替物)。培养基中包含的胃泌素或适当的代替物的浓度可以为例如1ng/mL～10μg/mL，也可以为例如1ng/mL～1μg/mL，还可以为例如5ng/mL～100ng/mL。
培养基可以进一步包含至少1种氨基酸。作为氨基酸，例如可举出L－丙氨酸、L－精氨酸、L－天冬酰胺、L－天冬氨酸、L－半胱氨酸、L－胱氨酸、L－谷氨酸、L－谷氨酰胺、L－甘氨酸、L－组氨酸、L－异亮氨酸、L－亮氨酸、L－赖氨酸、L－甲硫氨酸、L－苯丙氨酸、L－脯氨酸、L－丝氨酸、L－苏氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸、L－缬氨酸和它们的组合等。培养基中包含的L－谷氨酰胺的浓度为0.05g/L～1g/L(通常为0.1g/L～0.75g/L)。培养基中包含的其它氨基酸为0.001g/L～1g/L(通常为0.01g/L～0.15g/L)。氨基酸可以为合成的氨基酸。
培养基可以进一步包含至少1种维生素。作为维生素，例如可举出硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、烟酸(维生素B3)、D－泛酸钙(维生素B5)、吡哆醛/吡哆胺/吡哆醇(维生素B6)、叶酸(维生素B9)、氰钴胺素(维生素B12)、抗坏血酸(维生素C)、钙化醇(维生素D2)、DL－α生育酚(维生素E)、生物素(维生素H)、甲萘醌(维生素K)等。
培养基可以进一步包含至少1种无机盐。无机盐用于帮助维持细胞的渗透压平衡以及用于帮助调节膜电位。作为无机盐的具体例，可举出钙、铜、铁、镁、钾、钠、锌的盐。盐通常以氯化物、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐和碳酸氢盐的形态使用。进一步具体的盐可举出CaCl2、CuSO4－5H2O、Fe(NO3)－9H2O、FeSO4－7H2O、MgCl、MgSO4、KCl、NaHCO3、NaCl、Na2HPO4、Na2HPO4－H2O、ZnSO4－7H2O等。
培养基可以进一步包含至少1种可成为碳能量源的糖。作为糖，例如可举出葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、果糖等。其中，优选为葡萄糖，特别优选为D－葡萄糖(右旋糖)。培养基中包含的糖的浓度优选为1g/L～10g/L。
培养基可以进一步包含至少1种微量元素。作为微量元素，例如可举出钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌、铝或它们的离子等。
培养基可以进一步包含至少1种附加药剂。作为该药剂，可举出报道了改善干细胞培养的营养素或生长因子，例如胆固醇、转铁蛋白、白蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺、亚硒酸盐等。
＜工序2＞
工序2中，使工序1中得到的三维小肠类器官分散，在细胞外基质上进行单层培养，得到二维小肠类器官。本工序中，使三维小肠类器官分散至1个～几个细胞。作为使三维小肠类器官分散的方法，可举出物理方法、酶处理法等，但从不损伤细胞的观点考虑，优选为酶处理法。作为用于酶处理法的酶，可举出胰蛋白酶、胶原酶、分散酶I等。
接下来，将分散的细胞接种到细胞外基质上。例如，在细胞培养插入物(Cellculture insert)的表面涂布细胞外基质，在该细胞外基质上接种分散的细胞即可。所接种的细胞通过与细胞外基质的表面结构进行相互作用，例如通过与整联蛋白相互作用，从而粘附于细胞外基质。对于细胞外基质，与上述同样。
另外，也可以在细胞培养插入物上接种成纤维细胞、内皮细胞等细胞进行培养，在该培养细胞上接种上述分散的细胞。
作为细胞培养插入物，可以使用在底面具有膜(membrane)的细胞培养插入物。膜的材质只要是聚酯(PET)、聚碳酸酯、涂布胶原的聚四氟乙烯(PTFE)等能够用于细胞培养的材质即可。另外，膜的孔尺寸没有特别限定，只要为0.1～10μm，例如0.1～1.0μm即可。膜的孔尺寸即便在上述的范围外，也可以使用。
接下来，在细胞接种后，在细胞未干燥时添加培养基，进行单层培养。由此，可得到二维类器官。作为培养基，可以使用与上述用于制造三维小肠类器官的培养基同样的培养基。
＜工序3＞
接下来，工序3中，一边使工序2中得到的二维小肠类器官的培养基流动一边进一步培养。其结果，二维小肠类器官形成绒毛结构。培养基的流动优选在二维类器官达到汇合(confluence)后开始。
培养基的流动模仿了生物体的小肠中的肠液的流动。因此，培养基的流动优选通过肠液的流动而对二维小肠类器官给予与小肠上皮受到的刺激相同程度的刺激。
例如，可以通过使细胞培养容器在振荡器上振荡(Shake)来使培养基流动。振荡器可以为旋转振荡器。如实施例中后述所示，通过使培养基的流动的速度为150rpm左右，能够促进二维小肠类器官中的绒毛结构的形成。
[具有绒毛结构的二维小肠类器官]
一个实施方式中，本发明提供一种具有绒毛结构的二维小肠类器官。以往无法制造具有绒毛结构的二维小肠类器官。与此相对，如实施例中后述所示，发明人等明确了通过上述的制造方法，能够在体外制造具有绒毛结构的二维小肠类器官。本实施方式的二维小肠类器官可以通过上述的制造方法而得到。
通过使用本实施方式的二维小肠类器官，能够调查与肠道中的吸收等有关的机制。另外，通过使用本实施方式的二维小肠类器官，能够进行小肠功能障碍的治疗药的筛选等。
本实施方式的二维小肠类器官可以由来自正常小肠的细胞制造，也可以由来自小肠功能障碍的患者的细胞制造，还可以由来自小肠疾病患者的细胞制造。作为来自正常小肠的细胞，可以使用从胃肿瘤或大肠肿瘤的患者的正常十二指肠或回肠组织采取的正常细胞等。由来自小肠功能障碍的患者的细胞制造的二维小肠类器官可以用作小肠功能障碍模型。由来自小肠疾病患者的细胞制造的二维小肠类器官可以用作小肠疾病模型。例如，由来自炎症性肠疾病的细胞制造的二维小肠类器官可以用作炎症性肠疾病模型。
[小肠中的营养素或药物的吸收控制剂的筛选方法]
一个实施方式中，本发明提供一种小肠中的营养素或药物的吸收控制剂的筛选方法，包括在受试物质的存在下，测定基于具有绒毛结构的二维小肠类器官的营养素或药物的吸收量的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述吸收量显著变化的情况下，表示上述受试物质为小肠中的营养素或药物的吸收控制剂。
作为受试物质，没有特别限定，例如可举出天然化合物库、合成化合物库、现有药库和代谢物库。
作为营养素，可举出脂质、糖、氨基酸等。营养素的吸收量的测定方法只要根据测定对象的营养素而适当地选择即可。例如，使二维小肠类器官吸收经荧光标记的营养素，基于其荧光显微镜照片来测定荧光强度，从而能够对营养素的吸收量进行定量。另外，作为药物，没有特别限定，例如为医疗用医药品等。
小肠中的营养素或药物的吸收控制剂可以为促进小肠中的营养素或药物的吸收的物质，也可以为抑制小肠中的营养素或药物的吸收的物质。
促进小肠中的营养素的吸收的物质例如可以用作小肠功能障碍的治疗药。另外，抑制小肠中的营养素的吸收的物质例如可以用作抗肥胖药等。
现有的三维小肠类器官虽然绒毛结构在其表面突出，但为球状的结构，构成肠道内腔的细胞存在于类器官的内腔。因此，为了使用三维小肠类器官来研究肠道内腔中产生的现象、消化吸收、肠道微生物的培养等，需要进一步的实验方法。
与此相对，根据本实施方式的筛选方法，二维小肠类器官为在其培养上表面具有模拟了肠道内腔的绒毛结构的二维的细胞组织体，因此，适于在体外解析介由绒毛组织的吸收机制等肠道内腔中产生的现象。
[小肠中的绒毛结构的形成控制剂的筛选方法]
一个实施方式中，本发明提供一种小肠中的绒毛结构的形成控制剂的筛选方法，包括：在受试物质的存在下，制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的工序；以及评价所制造的上述二维小肠类器官的绒毛结构的形态的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述形态显著变化的情况下，表示上述受试物质为小肠中的绒毛结构的形成控制剂。
作为受试物质，可以使用与上述的受试物质同样的受试物质。另外，具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造工序与上述二维小肠类器官的制造方法同样。
受试物质可以在二维小肠类器官的制造工序的整体中添加于培养基，也可以在二维小肠类器官的制造工序的一部分中添加于培养基。
作为绒毛结构的形态，例如可举出绒毛结构的密度、绒毛结构的高度、微绒毛的密度、微绒毛的长度等。绒毛结构可以用光学显微镜等进行观察。另外，微绒毛可以用电子显微镜等进行观察。
绒毛结构的形成控制剂可以为促进绒毛结构的形成的物质，也可以为抑制绒毛结构的形成的物质。
促进绒毛结构的形成的物质例如可以用作小肠功能障碍的治疗药。另外，抑制绒毛结构的形成的物质例如可以用作抗肥胖药等。
[小肠中的对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂的筛选方法]
一个实施方式中，本发明提供一种小肠中的对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂的筛选方法，包括：在受试物质的存在下，制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的工序；以及测定所制造的上述二维小肠类器官中的对象物质的消化、吸收或代谢而得到测定值的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述测定值显著变化的情况下，表示上述受试物质为小肠中的上述对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂。
作为受试物质，可以使用与上述的受试物质同样的受试物质。另外，具有绒毛结构的二维小肠类器官的制造工序与上述的二维小肠类器官的制造方法同样。
受试物质可以在二维小肠类器官的制造工序的整体中添加于培养基，也可以在二维小肠类器官的制造工序的一部分中添加于培养基。
作为对象物质，没有特别限定，例如可举出营养素、药物等。作为营养素和药物，可举出与上述的营养素和药物同样的营养素和药物。对象物质的消化、吸收或代谢的测定方法只要根据对象物质而适当地选择即可。例如，可举出液相色谱(LC)、液相色谱质谱仪(LC－MS)等。
对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂例如可以用作小肠功能障碍的治疗药。
[调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质的筛选方法]
一个实施方式中，本发明提供一种调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质的筛选方法，包括在受试物质的存在下，测定具有绒毛结构的二维小肠类器官中的肠内细菌和/或病毒的生长的工序，在与不存在上述受试物质的条件下相比、上述肠内细菌和/或病毒的生长显著变化的情况下，表示上述受试物质为调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质(生长调节剂)。
肠内细菌和/或病毒的生长的测定方法只要适当地选择即可。例如可举出菌落计数法、噬菌斑测定法、定量PCR法等。
调节肠内细菌和/或病毒的生长的物质不仅可以用作小肠的功能调节剂，还可以用作基于肠内细菌丛的变化的免疫功能的调节剂、病毒的感染控制剂(抗病毒剂)等。
[移植材料]
一个实施方式中，本发明提供一种移植材料，是包含小肠类器官的移植材料，其用于以如下方式进行移植：移植到生物体的大肠，使肠液流动，从而在大肠中形成具有小肠功能的组织。
如实施例中后述所示，将小肠类器官移植于生物体的大肠，使肠液在类器官上流动，从而能够在大肠中形成具有小肠功能的组织。
另外，通过将小肠类器官移植于大鼠短肠综合征模型的大肠而制作的具有小肠功能的移植片能够显著改善小肠功能障碍的症状。与此相对，在使用将大肠类器官移植于大鼠短肠综合征模型的大肠的移植片的情况下，大鼠死亡。因此，本实施方式的移植材料向大肠的移植作为小肠功能障碍的治疗法是有用的。
移植的小肠类器官可以为三维类器官，也可以为三维类器官的分散物。在将小肠移植于大肠之前，优选预先剥离除去大肠上皮。大肠上皮的剥离例如可以通过使用EDTA而进行。
[其它实施方式]
一个实施方式中，本发明提供一种小肠功能障碍的治疗方法，包括将有效量的小肠类器官移植于需要治疗的患者的大肠并使肠液流动，从而在大肠中形成具有小肠功能的组织。本实施方式的治疗方法中，对于小肠类器官，与上述的小肠类器官同样。
实施例
接着，示出实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明不限定于以下的实施例。
[方法]
(动物)
所有的动物实验得到了庆应义塾大学医学部实验动物中心和日本兽医生命科学大学的机构内审查委员会的批准而实施。
NOD.Cg－PrkdcscidIl2rgtm1Sug/Jic(NOG)小鼠(雄性，6～12周龄)从公益财团法人实验动物中央研究所(CIEA)获得。另外，路易斯(LEW/Crl)大鼠(雄性，7～10周龄)从Charles River公司获得。
小鼠在无特定病原菌环境下饲育，大鼠在铺有木屑的通常的大鼠用笼中饲育。所有的动物均按照机构的指南和规定操作。
(人和大鼠肠类器官的建立和培养)
与人组织相关的所有实验得到了庆应义塾大学医学部和东京大学的伦理委员会的批准而实施。
人肠类器官由得到了基于书面的知情同意书的患者建立。
大鼠肠样品从表达荧光素酶的LEW转基因大鼠(LEW－Tg((ROSA)26Sor－luc)11Jmsk；luc－LEW Tg)采取。
通过常规方法分离来自大鼠回肠和结肠的隐窝。将分离的隐窝与25μL的Matrigel(注册商标，康宁公司)混合，接种于48孔板。在Matrigel(注册商标)聚合物化后，在包埋的隐窝上重叠250μL的培养基。将培养基的组成示于下述表1。每2～3天更换培养基。另外，每5～7天用TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific公司)处理所得到的肠类器官，然后平缓地移液，从而进行传代。
[表1]
培养基的组成
Advanced DMEM/F-12培养基
10mM HEPES
2mM GlutaMAX
100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific公司)
1mM N-乙酰半胱氨酸(富士胶片和光纯药)
1×B27(Thermo Fisher Scientific公司)
10nM胃泌素I(Sigma-Aldrich公司)
25％阿法敏-Wnt-3A无血清条件培养基
50ng/mL小鼠重组EGF(Thermo Fisher Scientific公司)
100ng/mL小鼠重组头蛋白(Peprotech公司)
10％R-海绵硬蛋白1条件培养基
500nM A83-01(R&D Systems Company)
10μM Y-27632(富士胶片和光纯药)
50μg/mL-1人FGF-2(Peprotech公司)
100μg/mL人IGF-1(BioLegend公司)
(人肠类器官的异种移植)
将GFP-puro PiggyBac载体(System Biosciences Inc.)或RFP-puro PiggyBac载体(System Biosciences Inc.)分别通过电穿孔导入独立的2个人回肠类器官株，从而以绿色荧光蛋白质(GFP：Green Fluorescent Protein)或红色荧光蛋白质(RFP：RedFluorescent Protein)进行了标记。另外，还使用经GFP标记的人大肠类器官。
使人大肠类器官或人回肠类器官传代，进一步扩大培养3～4天。接下来，将NOG小鼠麻醉，用EDTA剥离一部分大肠上皮。接下来，通过经肛门注入将人大肠类器官或人回肠类器官移植于NOG小鼠的大肠。
(人肠类器官的单层培养)
将人十二指肠类器官、人回肠类器官和人大肠类器官在Matrigel(注册商标)中扩大培养5～7天。接下来，使各类器官解离，接种在用20％Matrigel(注册商标)涂布过的孔尺寸0.4μm的ThinCert 24孔板(Greiner公司)上。将2×105个细胞分别接种于ThinCert插入物，在扩大培养基中进行培养。
接下来，从从接种起至少3天后，在细胞达到汇合后，使用旋转振荡器(ThermoFisher Scientific公司)，以150rpm使培养基流动。在从培养基开始流动起4天后对二维类器官进行解析。
[实验例1]
(人回肠类器官或人大肠类器官的异种移植)
图1为表示将人回肠类器官或人大肠类器官移植于免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的大肠的步骤的示意图。如图1所示，将人小肠类器官异种移植于NOG小鼠的结肠直肠表面，研究人小肠上皮是否具有将脏器重塑的能力。另外，为了比较，也进行了人大肠类器官向NOG小鼠的异种移植。
其结果，人大肠类器官作为异种移植片形成了在组织学上与人大肠的隐窝结构相匹敌的隐窝结构。与此相对，异种移植的人回肠类器官构建了让人联想到小肠上皮的新生绒毛结构。
图2是人回肠类器官移植片的组织切片的苏木精·伊红染色的结果的显微镜照片。比例尺表示200μm。
另外，图3是人回肠类器官移植片的组织切片的透射型电子显微镜照片。比例尺为4μm。如图3所示，明确了人回肠类器官的移植片形成了成熟的微绒毛结构。
[实验例2]
(移植片中的标记蛋白质的表达的研究)
研究实验例1中得到的人回肠类器官移植片和人大肠类器官移植片中的标记蛋白质的表达。
图4是表示检测人回肠类器官移植片和人大肠类器官移植片中的、人细胞角蛋白和蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达而得的结果的照片。比例尺表示100μm。细胞角蛋白为上皮组织的标志物。另外，蔗糖酶－异麦芽糖酶为小肠特有的标志物。
上段左部表示检测人回肠类器官移植片中的人细胞角蛋白的表达而得的结果，下段左部表示检测人大肠类器官移植片中的人细胞角蛋白的表达而得的结果。
另外，上段中央表示检测人回肠类器官移植片中的蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达而得的结果，上段右部表示作为参考的检测人回肠道组织中的蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达而得的结果。
另外，下段中央表示检测人大肠类器官移植片中的蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达而得的结果，下段右部表示作为参考的检测人大肠道组织中的蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达而得的结果。
其结果，明确了蔗糖酶－异麦芽糖酶仅在人回肠类器官移植片中表达，在人大肠类器官移植片中未确认到表达。以上的结果表示人的小肠上皮类器官具有在小鼠肠道内重建人小肠上皮结构的能力。
[实验例3]
(移植片中的乳糜管样结构的解析)
对实验例1中得到的人回肠类器官移植片和人大肠类器官移植片的结构和功能进行解析。
图5是表示检测人回肠类器官移植片和人大肠类器官移植片中的淋巴管内皮透明质酸受体1(Lyve－1)的表达而得的结果的照片。比例尺表示200μm。
其结果，明确了在小鼠大肠中，人回肠类器官移植片在隐窝(Crypt)－绒毛(Villus)样结构的内部形成了被称为Lyve－1阳性的乳糜管(Chyle vessel)的小肠特有的结构。与此相对，在人大肠类器官移植片中，淋巴管主要存在于粘膜下层，未确认到乳糜管的形成。
接下来，对具有移植片的小鼠给予荧光标记胆固醇即NBD－胆固醇，研究乳糜管样结构是否具有吸收脂质的淋巴管的功能。
图6中左部是表示检测人回肠类器官移植片中的NBD－胆固醇和Lyve－1的存在而得的结果的照片。比例尺表示100μm。图6中右部是表示在与图6中左部相同的视野中检测表示人回肠类器官移植片的存在的RFP和Lyve－1的存在而得的结果的照片。比例尺表示100μm。
图7中上部是表示在受者的大肠与人回肠类器官移植片的边界检测表示人回肠类器官移植片的存在的RFP而得的结果的照片。比例尺表示50μm。图7中下部是在与图7中上部相同的视野中检测NBD－胆固醇而得的结果的照片。比例尺表示50μm。
其结果，明确了人回肠类器官移植片所形成的乳糜管样结构具有吸收脂质的功能。
以上的结果表示异种移植的人回肠类器官能够再构成具有吸收相关机制的小肠上皮。
[实验例4]
(培养基的流动对基于人小肠类器官的绒毛结构的形成造成的影响的研究)
研究培养基的流动对基于人小肠类器官的绒毛结构的形成造成的影响。图8是表示实验的概要的示意图。首先，人大肠类器官和人小肠类器官形成了具有极化的单层细胞的二维类器官。接下来，将培养板置于旋转器上，使细胞上的培养基产生恒定的流动。
二维类器官的形成如下进行。将人十二指肠类器官和人大肠类器官在Matrigel(注册商标)中扩大培养5～7天。接下来，使各类器官解离，接种在用20％Matrigel(注册商标)涂布过的孔尺寸0.4μm的ThinCert 24孔板(Greiner公司)上。将2×105个的细胞分别接种于ThinCert插入物，在扩大培养基中进行培养。
接下来，从接种起3天后，在细胞达到汇合后，使用旋转振荡器(Thermo FisherScientific公司)，以150rpm使培养基流动。在从培养基开始流动起4天后对二维类器官进行解析。
图9是将经二维培养的人十二指肠类器官和经二维培养的人大肠类器官在培养基的流动的存在下和不存在下培养4天，进行固定，在石蜡包埋后制作的切片的苏木精·伊红染色图像和显微镜照片。比例尺为200μm。图9中，流动(－)表示在不存在培养基的流动的条件下进行培养，流动(+)表示在培养基的流动的存在下进行培养。
图9中左上部是在不存在培养基的流动的条件下培养的人十二指肠类器官的结果。上部示出二维类器官的截面的苏木精·伊红染色图像，下部示出显微镜照片。
图9中左下部为在不存在培养基的流动的条件下培养的人十二指肠类器官的结果。上部示出二维类器官的截面的苏木精·伊红染色图像，下部示出显微镜照片。
图9右上部为在不存在培养基的流动的条件下培养的人大肠类器官的结果。上部示出二维类器官的截面的苏木精·伊红染色图像，下部示出显微镜照片。
图9右下部为在培养基的流动的存在下培养的人大肠类器官的结果。上部示出二维类器官的截面的苏木精·伊红染色图像，下部示出显微镜照片。
其结果，明确了在经二维培养的小肠(十二指肠)类器官中，在培养基的流动的存在下可促进绒毛结构的形成。另一方面，明确了在经二维培养的大肠类器官中，即便在培养基的流动的存在下，也没有形成绒毛结构。
另外，使用经二维培养的回肠类器官进行了同样的实验，结果可得到与二维十二指肠类器官同样的结果，明确了在培养基的流动的存在下可促进绒毛结构的形成。
图10是表示将经二维培养的十二指肠类器官在培养基的流动的存在下培养4天，然后固定，将核用Hoechst33342染色后，使用双光子显微镜拍摄，在高度上进行上色处理而得的结果的3D图像。其结果，确认到在体外形成了绒毛样结构。
[实验例5]
(人十二指肠类器官的RNAseq解析)
将经二维培养的人十二指肠类器官在培养基的流动的存在下和不存在下培养4天后，回收RNA，进行RNAseq解析。序列库使用TruSeq RNA Library Prep Kit v2(Illumina公司)制作。测序使用HiSeq X Ten(Illumina公司)进行。
使用STAR(version 2.6.1b)软件将读数与参考人类基因组序列即hg38对齐，基因表达水平使用RSEM(version 1.3.3)软件推定。基因表达解析使用RBioconductor封装DESeq2进行。
图11是表示RNAseq解析的结果的MA图。图11中，虚线表示log2(倍率变化)的值为1和－1。图11中，“Enterocyte”表示吸收上皮细胞标志物，“Secretory”表示内分泌标志物，“Stem”表示干细胞标志物。
其结果，明确了与不存在培养基的流动的条件下相比，在培养基的流动的存在下，吸收上皮细胞标志物的表达上升。
[实验例6]
(经二维培养的回肠类器官的解析)
将经二维培养的人回肠类器官在培养基的流动的存在下和不存在下培养4天，然后进行固定，进行石蜡包埋，进行免疫染色。作为一次抗体，使用兔抗SLC10A2抗体(1：1000，目录号“HPA004795”，Atlas Antibodies公司)、小鼠抗蔗糖酶－异麦芽糖酶抗体(1：50，目录号“sc－393470”，Santa Cruz Biotechnology公司)进行DAB染色。SLC10A2(也称为IBAT)和蔗糖酶－异麦芽糖酶为小肠特异性标志物。
图12是表示免疫染色的结果的照片。图12上部表示检测进行二维培养后的人回肠类器官的截面中的蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达的结果。Flow(－)表示在不存在培养基的流动的条件下的结果，Flow(+)表示在存在培养基的流动的条件下的结果。比例尺为200μm。
图12上部表示检测经二维培养的人回肠类器官的截面中的IBAT(SLC10A2)的表达而得的结果。流动(－)表示在不存在培养基的流动的条件下的结果，流动(+)表示在存在培养基的流动的条件下的结果。比例尺为200μm。
其结果，明确了在不存在培养基的流动的条件下得到的平坦结构的类器官中，没有确认到蔗糖酶－异麦芽糖酶的表达和IBAT(SLC10A2)的表达。
与此相对，明确了在培养基的流动的存在下确认到绒毛结构的形成，在绒毛结构部中确认到蔗糖酶－异麦芽糖酶和IBAT(SLC10A2)的表达。
接下来，将经二维培养的人回肠类器官在培养基的流动的存在下和不存在下培养4天，然后固定，用电子显微镜观察。电子显微镜照片如下拍摄。首先，将经二维培养的人回肠类器官在2％戊二醛中，在4℃浸渍一晩，从而固定。接下来，将试样在2％OsO4中固定2小时，阶段性地在一系列乙醇中脱水，包埋于Epon812中。接下来，用甲苯胺蓝对半薄切片进行染色，指导用于透射电子显微镜的进一步的剪切(trimming)。接下来，使用超薄切片机制作超薄切片(80～90nm)，配置在铜载网上。接下来，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色后，使用H－7600TEM(日立制作所)以100kV得到电子显微镜照片。所有的电子显微镜照片使用XR16S－R CCD照相机(Advanced Microscopy Technique公司)记录。
图13是拍摄的电子显微镜照片。图13中，流动(+)表示在培养基的流动的存在下的结果，流动(－)表示在不存在培养基的流动的条件下的结果。左侧的照片的比例尺为4μm，右侧的照片的比例尺为1μm。
另外，图14是表示基于图13的电子显微镜照片而测定的微绒毛的长度的图表。图14中，纵轴表示微绒毛的长度(μm)。另外，流动(－)表示在不存在培养基的流动的条件下的结果，流动(+)表示在存在培养基的流动的条件下的结果。另外，“底部”表示绒毛结构的基部(平坦部)的结果，“顶部”表示绒毛结构的顶部的结果。另外，“***”表示在p＜0.001时存在显著性差异。
其结果，明确了在培养基的流动的存在下，在绒毛结构的顶部显著促进了微绒毛的生长
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的技术和小肠疾病治疗用类器官。

Claims (12)

1.一种二维小肠类器官的制造方法，所述二维小肠类器官具有绒毛结构，所述制造方法包括：
工序1，在细胞外基质中培养来自小肠上皮的细胞，得到三维小肠类器官；
工序2，使所述三维小肠类器官分散，在细胞外基质上进行单层培养，得到二维小肠类器官；以及
工序3，一边使所述二维小肠类器官的培养基流动一边进一步培养，其结果，所述二维小肠类器官形成绒毛结构。
2.一种二维小肠类器官，具有绒毛结构。
3.根据权利要求2所述的二维小肠类器官，其是由来自小肠功能障碍或小肠疾病的患者的细胞而制造的。
4.根据权利要求2所述的二维小肠类器官，其是由来自正常小肠的细胞而制造的。
5.一种小肠中的营养素或药物的吸收控制剂的筛选方法，包括在受试物质的存在下，测定基于具有绒毛结构的二维小肠类器官的营养素或药物的吸收量的工序，
在与不存在所述受试物质的条件下相比、所述吸收量显著变化的情况下，表示所述受试物质为小肠中的营养素或药物的吸收控制剂。
6.一种小肠中的绒毛结构的形成控制剂的筛选方法，包括：在受试物质的存在下，制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的工序；以及
评价所制造的所述二维小肠类器官的绒毛结构的形态的工序，
在与不存在所述受试物质的条件下相比、所述形态显著变化的情况下，表示所述受试物质为小肠中的绒毛结构的形成控制剂。
7.一种小肠中的对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂的筛选方法，包括：在受试物质的存在下，制造具有绒毛结构的二维小肠类器官的工序；以及
测定所制造的所述二维小肠类器官中的对象物质的消化、吸收或代谢而得到测定值的工序，
在与不存在所述受试物质的条件下相比、所述测定值显著变化的情况下，表示所述受试物质为小肠中的所述对象物质的消化、吸收或代谢的调节剂。
8.一种调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质的筛选方法，包括在受试物质的存在下，测定具有绒毛结构的二维小肠类器官中的肠内细菌和/或病毒的生长的工序，
在与不存在所述受试物质的条件下相比、所述肠内细菌和/或病毒的生长显著变化的情况下，表示所述受试物质为调节小肠中的肠内细菌和/或病毒的生长的物质。
9.一种移植材料，是包含小肠类器官的移植材料，其用于以如下方式进行移植：移植到生物体的大肠并使肠液流动，从而在大肠中形成具有小肠功能的组织。
10.根据权利要求9所述的移植材料，其用于在剥离并除去所述大肠的上皮后进行移植。
11.一种移植材料，是包含小肠上皮类器官的移植材料，其用于以如下方式进行移植：在剥离生物体的大肠的上皮后进行移植并使肠液流动，从而在大肠中形成具有小肠功能的组织。
12.一种小肠功能障碍的治疗方法，包括将有效量的小肠类器官移植到需要治疗的患者的大肠并使肠液流动，从而在大肠中形成具有小肠功能的组织。
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