CN105452446A - 用于体外培养干细胞的方法和培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于成体干细胞培养的无血清培养基，其包含Wnt蛋白和脂质。本发明还包括用于使用此方法培养成体干细胞的方法以及干细胞治疗的方法，其中所述干细胞在所述培养基中培养。

Description

用于体外培养干细胞的方法和培养基
技术领域
本发明涉及组织培养领域，更重要的是成体组织特异性干细胞的培养和干细胞用于治疗的用途。
背景技术
成体干细胞可用于产生成体干细胞之组织的治疗性处理。然而，培养成体干细胞通常是非常有挑战性的。该方面中的一个难点是其环境经常可成为分化的原因。这种表型的不稳定性代表了用于在体外维持成体干细胞培养的主要挑战。
组织工程中的环境因子主要由培养基形成并且在干细胞培养的情况下，这种培养基通常会含有哺乳动物来源的血清。所述血清在定义上是未知因子(如血清蛋白和其他已经被分泌到血液和/或被血液转运的影响性化合物)的来源。非常重要的是在干细胞的治疗性应用中使未知组分的量尽可能的小，因为引入到患者体内的生物材料应当尽可能受控。在此期间已经开发了用于胚胎干细胞的无血清培养基(参见例如Vallier，L.，2011Meth.Molec.Biol.，690：57-66)。仍未提出用于成体人干细胞系的无血清培养基。
此外，干细胞培养基应当能够提供所有营养物和干细胞扩增所必须的其他化合物，但它们不含将对干细胞的生长或扩增有害的或者将导致干细胞进一步不明确地分化成特定细胞的化合物。在过去15年中，已经示出Wnt信号转导通路调节胚胎干细胞和多种成体组织干细胞(例如来自于胃肠系统、皮肤和头发以及神经系统的那些)二者的自我更新和细胞命运选择(Clevers，H.和Nusse，R.，2012，Cell149：1192-1205)。这些数据表明Wnt信号对于培养物中干细胞的自我更新将是有益的并且可以提供在其重新引入患者中之前体外扩增干细胞的途径。最近已经定义了用于数种人和小鼠成体干细胞的培养系统(Huch，M.等，2013，Nature494：247-250)。这些系统依赖于Wnt通路的激动剂(R-Spondin1)，其通过结合Lgr5受体起作用并且由此通过Wnt蛋白增强了Wnt信号转导通路的激活。对于结肠、胃、肝和人干细胞，内源Wnt信号是不足够的并且需要外源Wnt3a。然而，注意到与经Wnt3a条件化(condition)的含血清培养基相比，经纯化的Wnt3a在维持胃样器官方面提供较低的效力(Barker，N.等，2010，CellStemCell6：25-36)。然而，如上所指出的，在临床应用中，不希望存在血清。
Wnt蛋白是一组长度为350-400个氨基酸之分泌的经脂质修饰的(棕榈酰化)信号转导蛋白。在信号序列之后，它们携带20-24个半胱氨酸残基的保守模式，其上发生对半胱氨酸残基的棕榈酰化。这些蛋白质激活细胞中的多个通路，所述通路可被归类为经典的和非经典的Wnt通路。通过这些信号转导通路，Wnt蛋白在胚胎发育、细胞分化和细胞极性产生中发挥多种重要作用。人Wnt3a基因是WNT基因家族的成员。其编码示出与小鼠Wnt3A蛋白96％氨基酸同一性的蛋白质，以及与人WNT3蛋白质(另一WNT基因产物)84％氨基酸同一性的蛋白质。Wnt3a基因与WNT14基因(另一个家族成员，在染色体1q42区中)成簇。
Wnt蛋白是可溶的信号转导分子，其需要连接脂质部分以获得活性，并且由于这个原因是疏水的(Willert，K.等，2003，Nature423：448-452)。因此，在存在维持其溶解性的去污剂的存在下对其进行纯化。然而，在细胞培养基中稀释之后，特别是在不存在血清的情况下，去污剂的浓度不足以维持Wnt溶解性，然后其迅速失去活性(Fuerer，C.等，2010，Dev.Dyn.239：184-190)。
最近，在不存在血清的情况下，人成体干细胞不能被有效地获得和/或维持，因为这导致培养物中Wnt活性不足。可以以数种方式维持干细胞培养物中的高Wnt活性：
-频繁地补充培养基，这极大地增加了成本并且还干扰了培养，这通常是不期望的；
-添加血清，血清是未明确限定的产品，其干扰临床应用并且诱导许多干细胞的分化；
-使用Wnt条件化的培养基(参加定义的实验部分)替代经纯化的Wnt。然而，条件化培养基中的Wnt与血清具有相同的缺点；
-可能添加稳定Wnt的化合物，例如葡糖胺聚糖。除了极端昂贵之外，也未证明添加葡糖胺聚糖的有益效果。
因此，有需要开发用于培养成体人干细胞的更明确限定的培养基，其中增强细胞的增殖并抑制细胞的分化。这样的培养基将优选地包含将维持长时间活性的一种或更多种Wnt蛋白，并且这种培养基将需要没有血清或者其他未限定的组分。此类无血清成体人干细胞培养基的可用性还将使得能够进一步使用此类成体干细胞。
发明内容
本发明涉及用于体外培养干细胞的方法，其中将所述细胞保持在包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基中，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.1mM。优选地，在所述方法中，所述脂质为脂质体或胶束的形式，更优选地，所述脂质和所述Wnt蛋白缔合成复合物。优选地，这样的脂质体由二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-丙三醇)(DMPG)和胆固醇构成，优选DMPC∶DMPG∶胆固醇的比为10∶1∶10。
在另一个优选的实施方案中，所述Wnt蛋白选自人Wnt蛋白，其中所述蛋白优选Wnt3a。在又一个优选的实施方案中，所述干细胞是成体干细胞，优选肠干细胞，更优选从十二指肠和/或回肠获得的干细胞。还优选的是根据本发明的方法，其中所述干细胞培养物是器官样组织(organoid)培养物。
本发明还涵盖用于干细胞培养的无血清培养基，其包含Wnt蛋白和脂质，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.1mM，优选其中所述脂质是脂质体或胶束的形式。
本发明的另一方面是用于干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象分离干细胞；
b.任选地处理所述干细胞，其中所述处理可以选自：分化、去分化、再分化、重编程、引入突变、遗传修饰；
c.在根据本发明的无血清培养基中培养所述干细胞；
d.将所述经培养的干细胞引入到有此需要的对象中。
本发明还包括用于自体成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象分离成体干细胞；
b.在根据本发明的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
本发明还包括用于自体成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a).从对象分离成体干细胞；
b).对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c).在根据本发明的无血清培养基中培养所述经遗传修饰的成体干细胞；
d).将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
本发明还包括用于成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象的器官分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.在根据本发明的无血清培养基中培养所述经遗传修饰的成体干细胞；
d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中，
其中以这样的方式遗传修饰所述成体干细胞使得它们产生用于治疗疾病的治疗性化合物，其中所述疾病与步骤a中得到的所述成体干细胞所来源的器官或器官系统无关或仅部分相关。
本发明还包括用于成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象的器官分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中，
其中以这样的方式遗传修饰所述成体干细胞使得它们产生用于治疗疾病的治疗性化合物，其中所述疾病与步骤a中得到的所述成体干细胞所来源的器官或器官系统无关或仅部分相关。
本发明还包括包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基，其用于成体干细胞治疗，其中所述成体干细胞治疗包括：
a.从对象分离成体干细胞；
b.在根据本发明的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
本发明还包括包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基，其用于成体干细胞治疗，其中所述成体干细胞治疗包括：
a.从对象分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.在根据本发明的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
附图说明
图1：经Wnt3a条件化的培养基，而非经纯化的Wnt3a蛋白支持得到肠干细胞器官样组织。在经Wnt3a条件化的培养基、经纯化的Wnt3a或者经纯化的Wnt3a和血清的存在下，得到人十二指肠和回肠器官样组织培养物。自得到起的第一次传代之后，从器官样组织培养物获取照片。
图2：在无血清细胞培养基中Wnt3a蛋白活性迅速丧失。在存在或不存在指定的10％胎牛血清的情况下，在DMEM中孵育经Wnt3a条件化的培养基(50％)或经纯化的Wnt3a(250ng/ml)，在37℃持续指定量的时间。然后使用LSL测定确定剩余的Wnt3a活性。CM：条件化的培养基。
图3：短半衰期和去污剂相关的毒性限制了经纯化的Wnt3a支持干细胞自我更新的用途。A)无血清ES细胞自我更新测定比较每日或者在每3天传代后添加250ng/ml经纯化Wnt3a对自我更新的作用。当在每次传代后添加Wnt3a时自我更新大幅降低，表明无血清培养物中Wnt3a活性的迅速丧失限制了自我更新并且必须频繁补充新鲜Wnt3a。B)当存在的浓度为500ng/ml以上时，经纯化Wnt3a蛋白似乎抑制ES细胞自我更新。然而，这似乎是由去污剂相关的毒性造成的，因为具有等量去污剂CHAPS的较低浓度Wnt3a也抑制自我更新。
图4：Wnt3a蛋白与脂质体有效地缔合，这增强了其稳定性。A)与通过超速离心来旋转沉降与Wnt3a蛋白缔合的多种组成的脂质体，并且通过Western印迹来分析沉淀的脂质体和上清液中Wnt3a的存在。B)在图A)中示出的Western印迹的定量。C)透析之后在Wnt3a脂质体中CHAPS的残余水平。D)不同组成的Wnt脂质体的Wnt3a活性半衰期测定。
图5：ESC自我更新测定对经纯化Wnt3a和Wnt3a脂质体进行比较。当培养基每日更新时，Wnt3a脂质体与经纯化Wnt3a蛋白的表现类似。然而，当仅在每3天传代之后更新培养基时，与经纯化Wnt3a相比，Wnt3a脂质体支持更高水平的ES细胞自我更新。在所有条件中，Wnt3a蛋白的终浓度为250ng/ml。
图6：A)在添加250ng/ml经纯化的Wnt3a、Wnt3a脂质体(Wnt3a的终浓度为250ng/ml)或载剂脂质体之后，培养3天的R1-7xTcf-eGFP细胞的表面荧光图像(epifluorescenceimage)。虽然使用经纯化Wnt3a蛋白时的报道基因活性下降，但Wnt3a脂质体维持强报道基因活性。B)在250ng/ml经纯化的Wnt3a蛋白、Wnt3a脂质体(Wnt3a的终浓度为250ng/ml)或载剂脂质体的存在下，将R1-7xTcf-eGFP细胞培养指定量的时间，并通过流式细胞术对eGFP表达进行分析。当每日更新试剂时，经纯化Wnt3a和Wnt3a脂质体二者都维持强的报道基因表达。然而，当不更新试剂时，添加经纯化Wnt3a两天后，报道基因活性开始降低，而Wnt3a脂质体即使在4天后仍维持强报道基因活性。
图7：Wnt3a脂质体极大地增强了肠干细胞器官样组织的建立并抑制自发的分化。在经Wnt3a条件化的培养基、经纯化Wnt3a和血清或者Wnt3a脂质体的存在下，得到人十二指肠和回肠器官样组织培养物。当使用Wnt3a脂质体时，获得多得多的器官样组织。此外，在含有Wnt3a脂质体的无血清条件中，分化的标志(例如器官样组织的粗糙外观、出芽的标志和不规则形状)也极大地减少。自得到起的第一次传代之后，从器官样组织培养物获取照片。
图8：以宽浓度范围存在的脂质体稳定Wnt3a蛋白活性。向无血清培养基添加不同量的DMPC∶DMPG∶胆固醇10∶1∶10脂质体，并且单独添加终浓度为500ng/ml的经纯化Wnt3a蛋白。半衰期活性测定示出脂质体在所测试的整个浓度范围内稳定Wnt3a蛋白活性。
发明详述
本文所用的“成体干细胞”或“器官干细胞”是在发育后在整个身体内发现的并且能够繁殖、维持组织内稳态和再生受损组织的干细胞。它们能够延长自我复制并且可分化成所述干细胞来源之器官的全部或大部分细胞类型。为了表示这一特征，也将它们称作“多能干细胞”。一些成体干细胞是单能的，例如精原干细胞。在培养物中，它们有时能够形成所谓的“器官样组织”，其模拟起源组织的组织结构，并且其含有干细胞和分化的后代。一些经分化的后代产生促进干细胞自我更新和扩增的生长因子，从而使得它们扩增和繁殖。在某些培养条件下，一些干细胞可以不形成器官样组织，但仍可在有利的培养条件下扩增。原因是这些干细胞或者含有干细胞的器官样组织可以从单个干细胞无限地扩增，这种技术能够代表基因治疗的安全道路。特别是因为单独干细胞的后代可以在克隆水平进行分析，这给出了这样的机会：干细胞可以被遗传改变以及培养并且可以对不含有有害突变的那些干细胞进行后代的选择，继而对其进行扩增以用于随后的移植。
Wnt信号转导通路调节脊椎动物和无脊椎动物发育过程中的多种细胞过程，包括细胞增殖和分化，细胞命运和器官发生。此外，所述通路在斑马鱼、爪蟾(Xenopus)、涡虫(planarian)和包括成人在内的哺乳动物中控制组织内稳态和响应于损伤的再生。
Wnt信号转导由Wnt蛋白与多种受体(包括跨膜受体的Frizzled(Fz)家族之成员和低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density-lipoproteinreceptor-relatedprotein，LRP)家族的成员，例如LRP5/LRP6)相互作用起始。胞外Wnt信号刺激了包括经典通路(其调节核中的基因表达(参见LoganCY和Nusse，R.Annu.Rev.CellDev.Biol.，20：781-810，2004))以及数种非经典通路(由Kohn，AD和Moon，RT，CellCalcium，38：439-446，2005综述)的胞内信号转导级联。简而言之，Wnt信号转导通过经典途径导致β联蛋白的稳定和核定位，其与转录因子之T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)家族的成员组装以形成通常激活转录的复合物。在不存在Wnt信号转导的情况下，β联蛋白反而被靶向以通过β联蛋白破坏复合物来降解，并且TCF/LEF形成通常抑制转录的复合物。在不存在Wnt信号转导的情况下，激酶(例如糖原合酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3，GSK3)和酪蛋白激酶1(CK1))磷酸化β联蛋白，结果其被泛素化并且被靶向以被蛋白酶体破坏。因此Wnt通路的激活导致β联蛋白的磷酸化消失，从而导致其稳定。已经鉴定了数种内源蛋白质作为Wnt信号转导的抑制剂，包括Dickkopf(Dkk)、断裂点成簇区蛋白(breakpointclusterregionprotein，Bcr)、包含WIF(Wnt抑制因子)结构域的蛋白质等。
术语“Wnt”或“Wnt蛋白”指具有Wnt蛋白质之天然氨基酸序列的多肽，或者至少部分保留天然蛋白质之与Wnt受体结合和激活Wnt信号转导之能力的其片段、变体或衍生物。除了可在群体中存在的Wnt序列的天然等位基因变体之外，应当理解，实际上对于所有蛋白质，可以向序列引入多种变化而基本上不改变多肽的功能(生物学)活性。这样的变体包含在术语“Wnt”和“Wnt蛋白”等的范围内。Wnt彼此之间在序列上相关并且在结构上高度保守并且功能跨越多个物种。因此，在一种物种中表现出活性的Wnt蛋白可以用于其他物种以激活此类物种中的Wnt通路并且可以预期表现出类似的活性。Wnt家族成员包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b(也称作Wntl3)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt9a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15或Wntl。Wnt基因和蛋白质的序列是本领域已知的。本领域技术人员可在公开可得的数据库中容易地发现Wnt家族成员以及本文中感兴趣的其他基因和蛋白质的GeneID、登录号和序列信息。Wnt蛋白可以从天然来源分离(例如天然产生该蛋白的哺乳动物或昆虫细胞)分离，使用重组表达技术或化学合成在真核或原核细胞中产生。可以使用本领域中已知的方法以纯化的形式制备可溶的生物活性Wnt蛋白。参见例如美国专利公开No.20040248803和Willert，K.，等，Nature，423：448-52，2003。在某些实施方案中，可溶的生物活性Wnt蛋白是Wnt3a。在某些实施方案中，Wnt蛋白被共转录修饰或转录后修饰，如同在天然表达Wnt蛋白的宿主细胞中产生Wnt蛋白时发生的。在另一些实施方案中，Wnt蛋白未像自然中的那样被共转录修饰或转录后修饰。在某些实施方案中，用脂质部分修饰(例如棕榈酰化)可溶的生物活性Wnt蛋白。脂质部分可以连接至保守的半胱氨酸。例如，在某些实施方案中，本领域已知在保守的半胱氨酸上对Wnt蛋白进行棕榈酰化。在某些实施方案中，如同在天然表达Wnt蛋白的哺乳动物宿主细胞中产生Wnt蛋白那样对Wnt蛋白进行糖基化。在另一些实施方案中，如在自然中发现的，Wnt蛋白没有糖基化。重组小鼠Wnt3a是市售可得的(例如来自Millipore货号GF145或者R&DSystems货号1324-WN-002)。
优选地在细胞培养物(如在使用昆虫细胞或者使用哺乳动物细胞的系统(Willert，K.等，如上)中或者如在US7,153,832中描述的系统中)中产生Wnt3a，其通过引用并入本文。然后可以从这些分离该蛋白质。
Wnt3a可以以下面的浓度存在：约1、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约260、约270、约280、约290、约300、约325、约350、约375、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950或约1000ng/ml。也可以以更高浓度存在。
Wnt3a是在成体干细胞的培养中非常有利地使用的蛋白质。然而，当在无血清条件下向人十二指肠和回肠器官样组织培养物添加经纯化的Wnt3a蛋白时，在2次传代之后这些培养物丧失。当使用Wnt条件化的培养基(即，含有血清的培养基)时，成功地建立并维持了器官样组织培养物(图1)。由于Wnt3a条件化的培养基含有高百分比的血清，因此进一步测试添加血清是否将改进使用经纯化的Wnt3a的器官样组织的建立。实际上，添加具有经纯化Wnt3a蛋白的血清改进了十二指肠和回肠器官样组织培养物二者的得到效率，尽管未达到用Wnt3a条件化培养基实现的水平(图1)。这些数据表明血清与Wnt3a组合促进器官样组织培养物。最近的数据表明血清稳定Wnt3a蛋白活性(Fuerer等，如上)，因此进一步研究了在无血清条件下降低的Wnt活性是否解释了其不能支持器官样组织的得到。
似乎可能通过向Wnt蛋白(包含在培养基中)添加浓度为至少0.1mM的脂肪物质来建立和维持成体干细胞培养物。这样的脂肪物质优选为磷脂或具有去污活性的脂质，即两性分子，以脂质体或胶束形式提供。不仅如果将脂质体或胶束与Wnt蛋白缔合然后添加至培养基可实现生物学作用(即Wnt蛋白活性的稳定)，而且在单独向培养基添加蛋白质和脂肪物质时也可实现生物学作用。至于胶束，应当强调，当添加胶束形式的去污剂时应当小心，其浓度是这样的，以使得当引入到更大体积的培养基中时维持胶束。这意味着给出的胶束应当具有相对低的临界胶束浓度。技术人员应当知道用此低临界胶束浓度如何制备胶束。
可以使用多种脂质制造脂质体或胶束。可以使用通常用于脂质体制备的脂质和磷脂。特别适合形成脂质体的组分是磷脂酰胆碱，例如1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)，1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)及其组合。如在Morrell等(PLosONE2008，3：e2930)中所示，DMPC似乎是以上提到的脂质中的最优选择。虽然如此，认为其他脂质，例如溶血磷脂酰胆碱(lysophophatidylcholine)、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、固醇类(如胆固醇)或鞘脂类(如鞘磷脂)、糖脂类(saccharolipids)和PEG化的磷脂，以及以上提到的脂质的其他变体，在酰基链长度上的变化，饱和的量，极性头部基团的性质和电荷等等将可以替代地使用。至于可以以胶束形式使用的脂质分子，可以使用任何种类的表面活性剂或去污剂，例如肥皂、线性烷基苯磺酸盐、硫酸木质素、脂肪醇和烷基酚化合物。该类别的实例为SDS、辛基硫代葡萄糖苷(octylthioglucoside)和CTAB(西曲溴铵(cetrimoniumbromide)。
还可以通过以上提及的脂质分子的组合来形成本发明中使用的脂质体、胶束或其他脂质聚集体。例如，非常常见的，脂质体由两种或三种不同的脂质分子制得。一般来说，包含的组分将是磷脂酰胆碱化合物，作为被磷脂酰甘油化合物和固醇(例如胆固醇)稳定的基础。不同形式的脂质体及如何制备它们的好的综述在Akbarzadeh，A.等，NanoscaleRes.Lett.2013，8：102，doi：10.1186/1556-276X-8-102中给出。
生产方法、脂质体或胶束的尺寸、Wnt蛋白与脂质体或胶束之间的浓度比，以及是否存在另外的去污剂、冷冻保护剂和用于稳定蛋白质结构的另外赋形剂不被认为是关键的。明显这些可以在大范围内变化。然而，当组织培养基中的最终脂质浓度超过0.1mM时，Wnt蛋白最稳定。因此，组织培养物中的脂质浓度可以大于0.1mM、大于0.2mM、大于0.3mM、大于0.4mM、大于0.5mM、大于0.6mM、大于0.7mM、大于0.8mM、大于0.9mM或更高。甚至可以使用大于1.0mM至大于2mm至大于3mM以及多达10mM的值，而不妨碍脂质对Wnt蛋白稳定性的有益作用。
可以使用天然或重组的Wnt蛋白或者模拟Wnt蛋白活性的多肽或其变体。Wnt蛋白可以与其他蛋白(例如脂蛋白或糖蛋白)缔合或者与支持其活性或溶解度的其他分子缔合。
供应有以上提到的脂质组合物的培养基与Wnt蛋白缔合或独立于Wnt蛋白添加，将进一步含有在干细胞培养基中发现的正常成分，除了血清。因此，培养基还可以含有缓冲化合物、去污剂、膨胀剂(bulkingagent)、营养化合物、生长因子以及其他化学化合物或生物化合物，其可以是维持和/或增殖干细胞(特别是成体干细胞)所需的。培养物还可以含有生物的或合成来源的胞外基质组分，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白以及其他巨大分子或者其混合物，例如基质胶(matrigel)、透明质酸(hyalyronicacid)、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)纤维基质、polyglactin纤维、海藻酸钙凝胶、水凝胶、硅酮化合物或其他合成聚合物。
如上所述，用脂质体或其他脂质聚集体来稳定成体干细胞，使得现在在没有血清的培养基中培养所述干细胞成为可能。这将极大地提高用于治疗目的的此类干细胞的可用性，特别是在干细胞治疗领域中。因此，本发明包括用于在根据本发明的培养基(即其中包含Wnt蛋白和脂质的培养基)中培养成体干细胞的方法。
在过去已经示出可以植入到接受者中的数种干细胞。此类经移植的干细胞可以永久性的移植并执行其正常功能。已经存在的临床应用是骨髓(其含有造血干细胞)移植到白血病患者中。经移植的干细胞产生健康的血细胞，其替代癌组织，最终永久性地治愈患者。对于实体组织干细胞进行的研究没有得到与造血干细胞相同的过程，因为难以重现实体器官中存在之必要且精确的3D排列以及紧密的细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用。另外，组织干细胞在宿主微环境和发育线索(developmentalcue)的控制之下同化到组织细胞结构中的能力，使得它们对于细胞替代治疗是理想的。数种其他类型的(成体)干细胞的移植和植入已经在动物模型中被证明并且目前正在被测试以用于人治疗。
其中可以使用此类干细胞治疗的疾病和领域(并且已经证明在动物研究中或附带的人治疗中起作用)是数目众多的。现在，对于干细胞治疗的维基百科文章列出了多种成体干细胞所来源的区域或器官并且用于治愈影响这些器官的疾病，例如用于治疗失明的角膜干细胞、用于治疗耳聋的耳蜗干细胞、用于治疗帕金森病或阿尔茨海默病的神经干细胞、用于治疗心肌梗死的脂肪来源干细胞、用于治疗骨骼缺陷的间充质干细胞等。当然，所有这些治疗也将适合于兽医应用。
因此，本发明包括用于使用成体干细胞的干细胞治疗的方法，其中所述成体干细胞已经在根据本发明的培养基中进行培养。
干细胞治疗领域中的主要缺点之一是可由施加干细胞所导致的免疫反应形成的。因此，日益增加地，尝试发展利用患者自身干细胞的疗法，也成为自体干细胞移植。应当清楚，使用患者自身干细胞的此类疗法也将被本发明增强。使用本发明的培养基，从取自患者的组织活检物分离并培养干细胞将被极大改进并且更容易。
因此，本发明包括用于自体干细胞移植的方法，其包括以下步骤：从对象分离干细胞(其中所述对象可以是动物或人)，在根据本发明的培养基中体外培养所述干细胞，并将所述经培养的干细胞再引入回到同一对象中。
所有这些疗法也可以使用同种异体干细胞，尽管因为潜在的免疫原性反应不太期望。
另外，组织特异性干细胞可以来源于胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞，其能够产生身体的所有组织，包括成体干细胞。可以通过在来自人或动物供体的细胞中表达重编程因子(通常是Oct4、Sox2和Klf4，但也可能是其他)获得诱导的多潜能干细胞。以这种方式，来自患者或供体的细胞可被重编程为多潜能细胞，然后这些细胞可以分化成组织特异性干细胞。
Wnt脂质体不仅可帮助建立和维持成体干细胞培养物，还可以将胚胎干细胞、诱导的多潜能干细胞或其他干细胞定向分化为成熟细胞类型或其他干细胞类型。
在自体干细胞移植中，还可能处理已经从身体分离的干细胞以修饰它们。在许多情况下，这样的处理将是特定遗传修饰。这样的干细胞依赖性基因治疗已经描述在文献(例如对于造血干细胞，Watts，K.等，2011，Cytotherapy13：1164-1171和Kohn，D.等，2013，Biol.BloodMarrow，Transplant，19：S64-S69以及对于内皮前体细胞，San，S.等，2010，Hum.GeneTher.21：1327-1334)中。如在Kohn等的文章中已经很好记载的，目前为止的努力都集中在稳定添加替换基因(cDNA、-球蛋白微基因座或基因组片段)或者内源基因的原位修饰。靶向的疾病主要是免疫缺陷，血红蛋白病和溶酶体贮积病。应当清楚根据本发明的培养干细胞的方法还能够使得自体干细胞疗法更好并提供分离和培养用于遗传修饰之干细胞的机会。
本发明的培养方法在这方面是特别有利地，因为其允许容易地分离具有正确遗传修饰的克隆以及验证没有遗传异常。根据本发明的自体干细胞治疗的方法，可以另外地进行这些步骤。
不考虑培养方法，假定经遗传修饰的成体干细胞将不仅可用于与干细胞所来源之器官相关的疾病的治疗，而且此类干细胞还将可用于产生对其他器官中的疾病有效的化合物。因此，本发明的一部分是用于自体成体干细胞治疗的方法，其中所述成体干细胞分离自对象(可以是人或动物)的器官，随后经遗传修饰并再引入到所述对象中，由此所述遗传修饰引起所述干细胞产生治疗性化合物，其中所述化合物针对所述干细胞所起源之器官之外的另一器官的疾病有效。应当理解，本文所用的术语“器官”用于指示组织或组织集合，其发挥常见功能并且其可以以结构单元(structuralunit)连接。术语“结构单元”应当解释为比结构更宽泛，因为一些器官(例如皮肤或血液)不形成单个、界定的结构。器官连接成更广泛的功能单元，器官系统在血液由心血管系统形成的血液情况下还包含心脏和血管。在更加限制的含义中，本发明包括用于自体成体干细胞治疗的方法，其中所述成体干细胞分离自对象(可以是人或动物)的器官，随后经遗传修饰并再引入到所述对象中，由此所述遗传修饰引起所述干细胞产生治疗性化合物，其中所述化合物针对所述干细胞所来源之器官所属系统之外的另一器官系统的疾病有效。
由经遗传修饰的干细胞产生的治疗性因子可以是任何治疗有效的化合物并且可以由蛋白质形成，但也可通过次级代谢形成。根据其药理学活性，可以将它们分成五组：(a)替代缺乏或异常的蛋白质；(b)加强现有的通路；(c)提供新的功能或活性；(d)干扰分子或器官；以及(e)用于之前效应蛋白组的靶向部分。还可以根据治疗性蛋白质的分子类型将其分组，其包括基于抗体的药物、Fc融合蛋白、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白、经改造的蛋白质骨架、酶、生长因子、激素、干扰素、白介素和溶血栓剂。还可以根据它们活性的分子机制将其分类为(a)与靶标非共价结合，例如mAb；(b)影响共价键，例如酶；和(c)发挥没有特异性相互作用的活性，例如血清白蛋白。干细胞可以被遗传修饰以产生这样的治疗性蛋白。当再引入到身体中时，干细胞将发育成接受者器官中的细胞并开始生产蛋白质。然后所述蛋白质将进入淋巴流和/或血液并将达到也可通过“正常”施用(例如经口或肠胃外施用)生物化合物所达到的血液水平。在干细胞的帮助下，治疗性蛋白的提供可导致疾病的永久性治愈，因为干细胞可以保留在身体中持续接受者的余生。用可由经遗传改变的成年人干细胞产生之蛋白质的干细胞治疗的一个具体实例是使用经遗传修饰以能够产生称为酸性α葡糖苷酶(acidalpha-glucosidase，GAA)之酶的肠干细胞，其用作庞皮病(II型糖原贮积病)的治疗。因此在这种情况下，源自肠的成体干细胞被遗传改变并用于治愈与该细胞所来源之器官(肠)根本不相关的疾病。庞皮病通常主要影响不相关的骨骼肌和心肌细胞。对其他常染色体或其他继承性疾病可采用类似的方案，其中通过用正常基因产物治疗可形成治疗，例如糖尿病(施用胰岛素)、苯丙酮尿症(施用酶苯丙氨酸裂合酶，PAL)和生长激素缺乏，其中通过施用生长激素来形成治疗。明显地，治疗可以解决经培养干细胞所位于的器官和不相关之器官二者的问题。
本文对蛋白质所描述的相同作用还可通过干细胞的遗传转化获得，其中所述遗传转化导致次级代谢物的产生和分泌。可以以这样的方式产生的化合物是激素(如雌激素)，其可用于乳腺癌或卵巢癌的治疗，以及用于更年期和变性治疗期间和之后的激素调节。或者，产生激素拮抗剂可导致长持续时间的绝育或甚至化学阉割。产生皮质醇和醛固酮还可以用于例如治疗艾迪生病(Addison′sdisease)。
通过以下实施例进一步举例说明本发明。实施例不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
得到肠干细胞培养物
按照(Sato，T.等，2011，Gastroenterol.141：1762-1772)所述，从新鲜的人十二指肠和回肠组织样品建立器官样组织培养物。简短来说，洗涤肠组织并用外科剪剥掉下面的肌肉层。将组织切成大约5mm的块并用冷PSB进一步洗涤。接下来，将组织碎片在2mmol/LEDTA冷螯合缓冲液(含有5.6mmol/LNa2HPO4、8.0mmol/LKH2PO4、96.2mmol/LNaCl、1.6mmol/LKCl、43.4mmol/L蔗糖、54.9mmol/Ld-山梨醇、0.5mmol/Ldl-二硫苏糖醇的蒸馏水)中在冰上孵育30分钟。移除EDTA缓冲液之后，使用10-mL移液管使组织碎片在冷螯合缓冲液中剧烈重悬以分离肠隐窝(crypt)。然后使组织碎片在正常重力下沉降1分钟并移除上清液，通过倒置显微术观察。重悬/沉降过程通常进行6至8次，并且弃掉不含隐窝的上清液。将含有隐窝的上清液收集到包被有牛血清白蛋白的50-mLFalcon管中。沉淀经分离的隐窝，用冷螯合缓冲液洗涤，并在150-200g下离心3分钟以将隐窝与单细胞分离。然后将它们包埋在冰上的基质胶(生长因子减少、无酚红，BDBiosciences)中并接种到48孔板中(每孔每25μL基质胶500个隐窝/碎片或者1000个单细胞)。使基质胶在37℃聚合10分钟，然后用含有50ng/ml鼠EGF、100ng/ml鼠noggin、1μg/ml人R-spondin-1，1mM胃泌素、10mM烟酰胺、500nMA83-01、10μMSB202190的250μl/孔基础培养基(补充有青霉素/链霉素、10mmol/LHEPES、Glutamax、1×N2，1×B27[均来自Invitrogen]，以及1mmol/LN-乙酰半胱氨酸[Sigma]的高级Dulbecco改良Eagle培养基/F12)淹没。如所指定的，进一步向培养基补充50％Wnt3a条件化的培养基或250ng/ml经纯化Wnt3a蛋白或具有250ng/ml经纯化Wnt3a蛋白的10％胎牛血清。
每2天更换全部培养基并每周以1∶5传代器官样组织。对于传代，用新鲜的基础培养基替换培养基。使用P1000移液管机械扰动器官样组织和基质胶并转移到15-mlfalcon管中。使用火琢的(firepolished)巴斯德移液管实现进一步的机械解离。用10ml基础培养基洗涤解离的器官样组织并在200g下离心2分钟。弃掉上清液，用基质胶重悬沉淀并如上所述添加培养基。
产生Wnt3a条件化的培养基
为产生Wnt3a条件化的培养基，使L-Wnt3a细胞(ATCCCRL-2647)生长至汇合，用胰蛋白酶处理，然后再铺板在补充有10％胎牛血清之DMEM培养基中的6倍更大表面上。一周后，收集培养基，在15000rpm下离心5分钟以移除漂浮的细胞，通过0.22微米滤器过滤，并在4℃储存直到使用。
纯化Wnt3a蛋白
在悬浮培养物中生长的果蝇S2细胞中产生重组小鼠Wnt3a蛋白，并通过所述的BlueSepharose亲和与凝胶过滤色谱法进行纯化(Willert，Brown等2003)。
经纯化的和脂质体Wnt3a试剂的活性测定
在有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中，在37℃和5％CO2下培养小鼠LSL细胞(响应于Wnt通路的激活而表达荧光素酶)(Mikels，A.和Nusse，R.，2006，PLosBiol.4：e115)。对于活性测定，将25,000个LSL细胞/孔铺板到96孔板中并培养24小时。然后用Wnt试剂处理细胞，其分别于37℃在96孔板中在有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中或在有1％青霉素/链霉素的DMEM中孵育不同的时间段。与指定的试剂再孵育过夜之后，使用荧光素酶测定试剂(Promega)根据制造商的说明测量荧光素酶活性。按照3个样品的平均，相对于对照LSL细胞对活性作图。
胚胎干细胞测定
将ES细胞维持在首先用明胶包被，然后用胎牛血清包被之板上的N2B27培养基中。N2B27培养基(Ying，Q.等，2003，Nat.Biotechnol.21：183-186)由1体积的DMEM/F12与1体积的Neurobasal培养基组合组成，补充有0.5％N2补充剂、1％B27补充剂、0.033％牛血清白蛋白7.5％溶液、50μMβ巯基乙醇、2mMGlutamax、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(均来自Invitrogen)。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA以单细胞混悬液传代细胞。传代以后，使用大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)淬灭胰蛋白酶。
为了定量多次传代期间的自我更新，将单细胞以100个细胞/cm2的密度铺板到明胶和血清包被的6孔板中以及明胶和血清包被的24孔板中，一式三份。每3天，用胰蛋白酶将6孔板处理成单细胞，并以将导致不高于但尽可能接近100个细胞/cm2密度的稀释度传代至新的一组板。同时，使用SCR004试剂盒(Millipore)对24孔板的碱性磷酸酶染色。用水润洗染色的板，干燥并对阳性集落的数目进行手工计数。通过将集落计数乘以用于传代的稀释因子，来确定累积的集落数目。将结果绘制成3个孔的平均值+/-s.e.m.。
制备Wnt3a脂质体
为了制备脂质体，测试了不同种类的磷脂。在所有情况下，磷脂的终浓度(不包括胆固醇)保持相同。二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、DMPG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-丙三醇)获自LipoidAG(Ludwigshaven，Germany)。胆固醇获自SigmaAldrichCo.LLC(st.Louis，MO.USA)。
为了制备Wnt3a脂质体，首先将脂质以括号中指定的某些摩尔比混合：DMPC/DMPG(10∶1)、DMPC/DMPG/胆固醇(10∶1∶1)、DMPC/DMPG/胆固醇(10∶1∶4)、DMPC/DMPG/胆固醇(10∶1∶10)。将脂质混合物溶解在比为9/1(v/v)的氯仿/甲醇中。然后在旋转蒸发仪上于真空下逐渐蒸发有机相，直到形成膜层。通过氮气吹洗来移除残余的有机溶剂。然后将脂质膜以88mM磷脂的浓度悬浮在HBS中。在氮气压力下使用Lipex高压压出机将脂质混悬液通过两个堆叠的孔径分别为200nm和100nm的聚碳酸酯滤器挤出10次。通过磷酸盐测定来确定最终的磷脂浓度。通过动态光散射来确定脂质体的尺寸和分散度。
对于与脂质体缔合，将含1％CHAPS的PBS中的50-80ug/ml经纯化Wnt3a蛋白与脂质体和PBS混合以达到总浓度为7-10ug/mlWnt3a和18.5mM磷脂。然后，于4℃将混合物在旋转仪(rollercoaster)上孵育1小时。在4℃，使用分子量截断值为10kD的透析膜在PBS中通过透析从Wnt脂质体移出CHAPS，每次持续一小时，共3次。
确定CHAPS含量
使用反向色谱法和在210nm处的UV检测(双λ吸光度探测仪，Waters，USA)，在HPLC(AlianceWaters2695，Waters，USA)上确定CHAPS浓度。柱是LiChrospher100，RP-18(5μM)。使用4％乙腈(Acetonitril)，95.9％水和0.1％高氯酸作为移动相，流量为1.0ml/分钟。校准曲线的范围从50μg/ml至1000μg/ml。
实施例1-Wnt3a蛋白在无血清培养基中迅速丧失活性
为了评估其稳定性，将Wnt3a蛋白在细胞培养基中于37℃下孵育不同的时间，并且使用LSL报道基因测定来测定剩余的活性(MikelsA.和NusseR.，2006，PLosBiol.4：e115)。LSL细胞含有由Wnt响应性启动子驱动的荧光素酶报道基因，允许定量读出Wnt活性。这些测定证明了经纯化Wnt3a在无血清培养基中在几个小时内丧失其活性，而在血清存在的情况下，此时段延长至超过1天(图2)。此外，经Wnt3a条件化的培养基维持其活性持续数天(图2)。因此，无血清条件下Wnt3a活性的迅速丧失可以解释为什么这些条件不能支持器官样组织培养物。
为了定量Wnt半衰期对于干细胞自我更新的作用，我们使用了无血清小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)自我更新测定，其对于培养物中Wnt活性的水平极度敏感(tenBerge，D.等，2011，Nat.CellBiol.13：1070-1075)。我们发现，当每3天而不是每天添加Wnt3a时，ESC自我更新显著降低(图3a)，表明Wnt3a蛋白的短半衰期限制了其支持ESC自我更新的能力。当我们尝试通过增加培养物中Wnt3a蛋白的量来克服这一限制时，我们观察到在某个阈值以上，更大浓度的Wnt3a抑制自我更新(图3b)。然而，这似乎是由于去污剂CHAPS的毒性作用(图3b)，其在经纯化Wnt3a蛋白中以高浓度存在并且是维持Wnt3a蛋白之活性所需的(Willert，K.等，2003，Nature423：448-452)。因此，Wnt3a活性不仅在无血清细胞培养物中迅速降低，而且在Wnt蛋白制备物中CHAPS的存在对可以添加至细胞培养物的Wnt3a蛋白的量设置了严格的上限，并阻止频繁添加新鲜Wnt3a蛋白以维持活性。
实施例2：与脂质囊泡缔合稳定了Wnt3a蛋白活性
为了制备Wnt3a脂质体，首先挤出不同脂质的混悬液以获得均匀尺寸的脂质体。然后将这些与Wnt3a蛋白混合以允许蛋白质与脂质体缔合。我们之前示出脂质体中磷脂DMPC的存在对于维持Wnt3a活性是有益的(Morell，N.等，2008，PLosOne3：e2930)。由于不存在电荷，纯DMPC脂质体倾向于聚集，这可通过添加带电荷的磷脂来阻止，例如DMPG。胆固醇的存在可以进一步增强脂质体的物理稳定性。制备之后，分析脂质体的尺寸、多分散指数、Wnt3a含量，CHAPS含量和Wnt3a活性。
尺寸和多分散指数测量示出与Wnt3a缔合没有影响脂质体的这些物理性质。为确定Wnt3a蛋白的并入，通过超速离心使脂质体旋转沉降，并通过western印迹定量上清液和脂质体的Wnt3a含量(图4a)。发现总Wnt3a蛋白的82％至87％与脂质体缔合(图4a，b)，与之前的测量一致(Morell等，如上)。随后Wnt3a脂质体的透析成功地将CHAPS浓度降低至可忽略的水平(图4c)。此外，使用LSL测定的活性测量示出与脂质体缔合明显地延长了无血清培养基中Wnt3a的活性，特别是当使用为10∶1∶10的比之DMPC∶DMPG∶胆固醇的混合物构成的脂质体时(图4d)。这些数据表明将Wnt3a蛋白并入到脂质囊泡中稳定了其活性(甚至在不存在CHAPS的情况下)，潜在地使得我们能够向细胞提供持续更长的Wnt刺激。另外，通过消除对于毒性去污剂CHAPS的需要，使得向培养物添加更大量的Wnt3a成为可能。
脂质体稳定的Wnt配体为无血清干细胞培养物提供了优异的支持
我们最初评估了Wnt3a脂质体在ESC自我更新测定中的功能表现。这示出在细胞的每三天传代之后向细胞单次添加Wnt3a脂质体，与经纯化Wnt3a相比，促使3倍高的未分化细胞的扩增(图5)。此外，通过使用R1-7xTcf-eGFP细胞(所述细胞携带Wnt响应性GFP报道基因(tenBerge，D.等，2008，CellStemCell3：508-518))，我们发现Wnt3a-脂质体维持强报道基因活性，即使在添加之后4天也是如此，而在添加经纯化Wnt3a的第一天之后报道基因活性开始稳定地下降(图6a，b)。这些数据示出新Wnt3a脂质体延长的活性转变成明显提高的维持靶基因活化和支持干细胞扩增的能力。
最后，我们测试了Wnt3a脂质体支持人十二指肠和回肠器官样组织培养物之得到和维持的能力。相比于经纯化Wnt3a，Wnt3a脂质体支持在无血清条件下从这两种组织有效建立和维持器官样组织培养物(图7)。此外，相对于经Wnt3a条件化的培养基或与血清组合的经纯化Wnt3a，Wnt3a脂质体还强烈地增强了器官样组织的得到，并且示出明显地减少了分化的迹象(图7)。这表明血清和经Wnt3a条件化的培养基中的因子促进器官样组织干细胞的分化。这些数据示出Wnt3a脂质体不仅使得能够在限定的条件下建立器官样组织培养物，还能够通过消除来自培养物系统的分化诱导因子来提高得到和培养的效率。
与脂质囊泡缔合稳定了Wnt3a蛋白活性
我们进一步测试了在将其添加至培养基之前将Wnt3a蛋白与脂质体复合是否是必要的。我们发现，当分开向细胞培养基添加时，脂质体也稳定Wnt3a蛋白活性(图8)。此外，我们发现，当以总磷脂0.1mM至3.2mM的浓度范围存在时，脂质体在稳定Wnt3a蛋白方面是有效的(图8)，并且在这个范围之外的浓度很可能也是有效的。

Claims (15)

1.用于体外培养干细胞的方法，其中将所述细胞保持在包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基中并且其中所述脂质的可利用浓度为至少0.1mM。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂质是脂质体或胶束的形式。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述脂质和所述Wnt蛋白缔合成复合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述脂质体由二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-Fac-丙三醇)(DMPG)和胆固醇构成，优选DMPC：DMPG：胆固醇的比为10：1：10。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt蛋白选自人Wnt蛋白，其中所述蛋白优选Wnt3a。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞是成体干细胞，优选肠干细胞，更优选从十二指肠和/或回肠获得的干细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞培养物是器官样组织培养物。
8.用于干细胞培养的无血清培养基，其包含Wnt蛋白和脂质，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.1mM，优选其中所述脂质是脂质体或胶束的形式。
9.用于干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象分离干细胞；
b.任选地处理所述干细胞，其中所述处理可以选自：分化、去分化、再分化、重编程、引入突变、遗传修饰；
c.在如权利要求8所述的无血清培养基中培养所述干细胞；
d.将所述经培养的干细胞引入到有此需要的对象中。
10.用于自体成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象分离成体干细胞；
b.在如权利要求8中所述的无血清培养基中培养所述成体干细胞；
c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
11.用于自体成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.在如权利要求8中所述的无血清培养基中培养所述经遗传修饰的成体干细胞；
d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
12.用于成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象的器官分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.在如权利要求8中所述的无血清培养基中培养所述经遗传修饰的成体干细胞；
d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中，
其中以这样的方式遗传修饰所述成体干细胞使得它们产生用于治疗疾病的治疗性化合物，其中所述疾病与步骤a中得到的所述成体干细胞所来源的器官或器官系统无关或仅部分相关。
13.用于成体干细胞治疗的方法，其包括以下步骤：
a.从对象的器官分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中，
其中以这样的方式遗传修饰所述成体干细胞使得它们产生用于治疗疾病的治疗性化合物，其中所述疾病与步骤a中得到的所述成体干细胞所来源的器官或器官系统无关或仅部分相关。
14.包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.1mM，其中所述脂质优选为脂质体或胶束的形式，所述无血清培养基用于成体干细胞治疗，其中所述成体干细胞治疗包括：
a.从对象分离成体干细胞；
b.在所述无血清培养基中培养所述成体干细胞；
c.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
15.包含Wnt蛋白和脂质的无血清培养基，其中所述脂质的可利用浓度为至少0.1mM，其中所述脂质优选为脂质体或胶束的形式，所述无血清培养基用于成体干细胞治疗，其中所述成体干细胞治疗包括：
a.从对象分离成体干细胞；
b.对所述成体干细胞进行遗传修饰；
c.在所述无血清培养基中培养所述成体干细胞；
d.将所述经培养的成体干细胞再引入到所述对象中。
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