ES2961154T3

ES2961154T3 - Medio de cultivo celular y método para la generación de organoides epiteliales a partir de células madre epiteliales

Info

Publication number: ES2961154T3
Application number: ES20704323T
Authority: ES
Inventors: David Agorku; Olaf Hardt; Andreas Bosio; Kristin Becker; Dominik Eckardt
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2019-02-19
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2040-02-18
Also published as: WO2020169551A1; EP3927812B1; EP3927812C0; US20220135943A1; EP3927812A1

Abstract

La presente invención proporciona un cultivo celular para la obtención de un organoide epitelial, comprendiendo el cultivo celular i) células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, ii) un medio basal para células animales o humanas, iii) una Proteína Morfogenética Ósea (BMP), iv) un factor de crecimiento mitogénico seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), v) al menos un potenciador de cultivo soluble, en el que dicho al menos un potenciador de cultivo induce la polarización correcta de las células en dicho cultivo celular dentro del organoide en desarrollo tal como un complejo de laminina/entactina o entactina, y vi) un agonista de Wnt si dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales son células sanas, en el que dicho al menos un potenciador de cultivo soluble en dicho cultivo celular es un complejo de laminina/entactina en una concentración entre 0,2 mg/ml y 3,4 mg/ml. También se divulgan un medio de cultivo celular, un método in vitro para obtener un organoide epitelial y un organoide epitelial obtenido mediante dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Medio de cultivo celular y método para la generación de organoides epiteliales a partir de células madre epiteliales

Campo de la invención

La invención se refiere en general a un cultivo celular, a un medio de cultivo celular y a un método para cultivar células madre epiteliales para la obtención de organoides epiteliales. La invención se refiere particularmente al uso de potenciadores de cultivo solubles dentro de dichos cultivos celulares que permiten obtener dichos organoides sin la necesidad de una estructura tridimensional (3D) como una matriz extracelular.

Antecedentes de la invención

Con el fin de estudiar la biología de los tejidos, el desarrollo de enfermedades y realizar pruebas farmacéuticas, los modelosin vitrodesempeñan un papel central, especialmente en términos de complementar potencialmente o incluso reemplazar los modelos animales. Para los tejidos epiteliales, se han descrito métodos de cultivo tridimensionales (3D) que se basan en embeber células en hidrogeles sólidos que funcionan como matrices extracelulares (ECM) con el fin de hacer crecer los llamados "organoides epiteliales". Estos cultivos 3D se asemejan a la composición celular y la arquitectura de los tejidos epiteliales parentales. En particular, los protocolos publicados sólo permiten una expansión del compartimento epitelial. Otra característica importante es la polaridad celular que se asemeja al embeberse en matrices extracelulares sólidas o análogos de ECM artificiales sólidas. La polaridad celular de las células juega un papel estructural y funcional importante, especialmente en muchos tejidos epiteliales. El cultivo de estos 'organoides' en ECM sólidas conduce a la recapitulaciónin vitrode la estructura del tejido epitelial. Sin embargo, dado que los 'organoides' deben pasarse y volver a sembrarse y, por lo tanto, recuperarse de los geles sólidos, estos cultivos integrados dificultan significativamente el manejo conveniente y, lo que es más importante, la automatización del cultivo de organoides. Lo mismo ocurre con el análisis aguas abajo o la manipulación de organoides, ya que casi todas las etapas de manipulación requieren la recuperación del gel sólido. Además, la etapa de embeber provoca una falta de reproducibilidad provocada por un crecimiento muy heterogéneo de los organoides correspondientes.

Por otro lado, se han descrito cultivos 3D cultivados en suspensión, p. ej., para células madre neurales o tumorales (Ricci-Vitiani et al., 2007, Nature 445, 111-115). Estos cultivos permiten la expansión de las células madre como densas agrupaciones de células. Sin embargo, no se asemejan a las características de los tejidos, como la heterogeneidad celular y la polarización de las células.

Los organoides epiteliales fueron descritos por primera vez por Satoet al.(2009, Nature 459, 262) para organoides epiteliales intestinales basados en embeber criptas individuales o células madre en una ECM sólida o en un hidrogel similar a la ECM (Sato et al., 2009, Nature 459, 262) y luego se adaptó a otros tejidos epiteliales (Barker et al., 2010, Cell stem cell 6, 25-36; Sato et al., 2011, Gastroenterology 141, 1762-1772). Las células o subunidades de tejidos epiteliales se embeben en geles solidificantes y luego se recubren con un medio que contiene factores de crecimiento mitogénicos (p. ej., EGF), inhibidores de BMP (p. ej., Nogina) y, en el caso de organoides de tejidos sanos, agonistas de Wnt. WO2010090513A2 divulga un método para organoides epiteliales de criptas y vellosidades, que comprenden una luz, cuando se embeben células madre epiteliales aisladas o fragmentos de tejido en una matriz extracelular natural o sintética y se les proporciona un medio que comprende dichos factores de crecimiento, inhibidores y agonistas. A medida que las células crecen en ECM sólidas o geles derivados de ECM, el manejo como el subcultivo se ve significativamente obstaculizado. Este método está bien descrito (Mahe, M.M., Aihara, E., Schumacher, M.A., Zavros, Y., Montrose, MH, Helmrath, M.A., Sato, T. y Shroyer, NF. (2013). Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids, Current protocols in mouse biology 3, 217-240) y permaneció ampliamente sin modificaciones para los organoides epiteliales en los últimos años. En particular, se han hecho intentos de reemplazar las ECM ampliamente indefinidas por las llamadas "matrices de diseño" (Gjorevski et al., 2016, Nature 539, 560-564) o soportes (DiMarco et al., 2015, Biomaterials science 3, 1376-1385). Sin embargo, ambos intentos sugirieron que la rigidez de la ECM proporcionada es clave para la formación exitosa de organoides epiteliales y que las células o subunidades de tejidos epiteliales deben embeberse para proporcionar suficiente rigidez. Hasta ahora, todos los intentos de cultivar organoides epiteliales en suspensión han fracasado. Actualmente, también se ha sugerido un nuevo método de cultivo para epitelios intestinales, el sistema MimEX™ (R&D Systems, Inc., EE. UU.; Número de Catálogo MIM001). Este método se basa en la generación de cultivos 2D en una capa alimentadora y la posterior transferencia de estos cultivos a insertos Transwell, lo que provoca una transición a cultivos similares a 3D. Sin embargo, este modelo sólo muestra una accesibilidad limitada para los enfoques de manipulación y automatización.

WO2014131033 divulgaun método para cultivo líquido de (a) células madre epiteliales y/o (b) fragmentos de tejido epitelial aislados que comprenden células madre epiteliales, comprendiendo el método incubar las células madre epiteliales y/o los fragmentos de tejido aislados en un cultivo celular líquido que comprende un medio basal para células animales o humanas al que se añade (i) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), (ii) un factor de crecimiento mitogénico, (iii) un agonista de Wnt y (iv) al menos aproximadamente un 4 % p/v de matriz extracelular (ECM). La ECM que se añade al cultivo líquido es una ECM sólida o una estructura presolidificada.

En WO2018218344 se divulga un método que comprende cultivar las células madre epiteliales o progenitoras del conducto epitelial y/o fragmento del conducto epitelial en suspensión, la concentración de la matriz extracelular puede ser aproximadamente un 0,1 % (v/v) o menos. En otras realizaciones, la concentración de la matriz extracelular varía entre un 0,1 y un 50 % (v/v). Se divulga que los medios también se pueden combinar con un enorme rango de Matrigel™ al 0,1-100 % (v/v). WO2018218344 divulga que la matriz extracelular se refiere a una colección de moléculas extracelulares que proporcionan soporte estructural y bioquímico a las células circundantes.

WO2017220586 divulga ECM estándar, es decir, células en contacto con ECM para la generación de organoides. También se divulgan ECM en suspensión en un sistema de suspensión sin relación con la generación de organoides. La concentración de la ECM en suspensión puede ser al menos del 1 %. EP0218065A2 divulga extractos de EHS, especialmente un método para preparar "Matrigel" y promover el crecimiento y la diferenciación celular en el mismo.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un cultivo celular o medio de cultivo celular mejorado o alternativo para la generación de organoides epiteliales a partir de células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales y/o métodos para cultivar células madre epiteliales. o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales para obtener organoides epiteliales.

Resumen de la invención

Hasta ahora, los organoides epiteliales solo se pueden cultivar embebiendo subunidades funcionales de tejidos o células madre individuales en matrices extracelulares artificiales o de origen animal o componentes de matrices que se solidifican y forman un gel. Además, en el medio de cultivo deben proporcionarse factores de crecimiento mitogénicos (p. ej. EGF), inhibidores de BMP (p. ej. Nogina) y, en el caso de organoides de tejidos sanos, agonistas de Wnt. El medio de cultivo se aplica después de la solidificación del gel.

Por el contrario, hemos resuspendido y sembrado en placas directamente subunidades funcionales o células madre de tejidos epiteliales humanos y murinos en dicho medio de cultivo sin embeberlas en ECM sólidas. Además, hemos añadido un potenciador de cultivo soluble, que permitió la generación, expansión y cultivo de organoides epiteliales en cultivos de células en suspensión. Es importante destacar que estos potenciadores de cultivo solubles conducen a una polarización basal-apical correcta y, por lo tanto, a un crecimiento exitoso de los organoides en suspensión, mientras que en ausencia de estos potenciadores de cultivo solubles solo se forman esferas despolarizadas que mueren en 2-4 días. La invención es el uso del complejo potenciador de cultivo soluble laminina/entactina en una concentración entre 0,2 mg/ml y 1 mg/ml en el cultivo celular; también se divulgan en la presente memoria otros potenciadores de cultivo solubles, pero no forman parte de la invención. Además, estos cultivos se caracterizan por tasas de expansión mejoradas en comparación con los métodos conocidos en la técnica: los organoides epiteliales generados en presencia de potenciadores del cultivo y cultivados en suspensión alcanzan un tamaño de aprox. 400 -650 pm después de 3-4 días, mientras que los organoides epiteliales embebidos en la ECM alcanzan un tamaño comparable sólo después de 5-8 días.

Por lo tanto, el cultivo celular como se divulga en la presente memoria, el medio de cultivo celular como se divulga en la presente memoria y los métodos como se divulgan en la presente memoria permiten la generación y propagación de organoides epiteliales en cultivos celulares con los siguientes beneficios:

- Los potenciadores de cultivo solubles como se divulgan en la presente memoria no incrementan significativamente la viscosidad del medio

- Los potenciadores de cultivo como se divulgan en la presente memoria inducen la polarización correcta de las células dentro de los organoides epiteliales, necesaria para la generación y expansión de organoides epiteliales y la formación de una luz

- Los cultivos celulares se caracterizan por tasas de crecimiento mejoradas en comparación con los métodos utilizados en la técnica.

Fue sorprendente que ciertas moléculas de la matriz extracelular o complejos de moléculas de la matriz extracelular normalmente utilizadas para estructuras 3D solidificadas para generar organoides epiteliales en medios de cultivo celular puedan inducir en concentraciones muy por debajo de la fase de solidificación de las ECM la polarización correcta de las células dentro de los organoides epiteliales derivados a partir de células madre epiteliales. Por tanto, el uso de estructuras tridimensionales presolidificadas no es necesario cuando se utilizan estas moléculas. Dichas moléculas o complejos de moléculas (denominados en la presente memoria potenciadores de cultivo solubles) que pueden inducir dicha polarización correcta son, p. ej., laminina/entactina (complejo de laminina/entactina) y un complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglucano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina (tal complejo de proteínas se pueden extraer como un extracto de proteínas, p. ej., del tumor Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) o de la placenta humana o dicho complejo de proteínas se puede componer artificialmente). Curiosamente, no todas las moléculas de las moléculas de la matriz extracelular utilizadas normalmente para estructuras 3D solidificadas pueden inducir dicha polarización correcta y, por lo tanto, no son adecuadas como potenciadores de cultivo como se divulga en la presente memoria. Tales moléculas que no inducen la polarización correcta son, por ejemplo, laminina (véase el Ejemplo 1), colágeno o entactina como únicas moléculas (véase el Ejemplo 7). Además, sorprendentemente, se descubrió que la combinación de dos moléculas de la matriz extracelular funciona como potenciador del cultivo soluble como se divulga en la presente memoria en la combinación de laminina y entactina (complejo de laminina/entactina), pero otras combinaciones no funcionan, como la laminina junto con diferentes colágenos (véase el Ejemplo 7).

Por lo tanto, era completamente inesperado que ninguna combinación de moléculas de ECM y combinaciones de lamininas y colágenos en particular pudieran inducir una polarización correcta, como lo sugiere la abundancia de esas moléculas en las ECM derivadas de tumores de EHS, el consenso en el campo de los organoides y diferentes publicaciones. En cambio, la formación y polarización exitosa de organoides dependía de la presencia de al menos laminina y entactina (como complejo), mientras que ni siquiera ambas moléculas por sí solas eran suficientes.

Sorprendentemente, los organoides epiteliales generados mediante los métodos divulgados en la presente memoria son comparables a los generados en un medio de cultivo celular que contiene ECM y que utilizan métodos de la técnica anterior con respecto a las características morfológicas y la composición celular. Pero los organoides epiteliales que se desarrollan en el medio de cultivo celular y/o cultivo celular como se divulga en la presente memoria muestran un crecimiento mejorado y una manipulación/procesamiento facilitado.

Por lo tanto, la presente invención comprende un cultivo celular para obtener un organoide epitelial, un medio de cultivo celular para cultivar células madre epiteliales para obtener un organoide epitelial, un método para obtener un organoide epitelial, mediante el uso de un potenciador de cultivo soluble, respectivamente, y en donde dicho potenciador de cultivo soluble es un complejo de laminina/entactina en una concentración entre 0,2 mg/ml y 1 mg/ml.

Breve descripción de los dibujos

La FIG 1 muestra que al cultivar criptas del intestino delgado en medio de cultivo solo sin embeberlas en una ECM sólida o un análogo de ECM no se obtienen organoides intestinales con dominios cripta-vellosidad. Además, un medio de cultivo con rigidez incrementada, p. ej., mediante la adición de 2 o 1 % de metilcelulosa, tampoco es suficiente para generar organoides típicos de cripta-vellosidad. Además, la adición de 300 pg de laminina (laminina derivada de la membrana basal del sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm; Merck, No. de Cat. L2020-1MG) no fue suficiente para inducir la formación de organoides polarizados y formados correctamente. Sin embargo, en presencia de un potenciador de cultivo soluble, como una matriz al 2,5 %, se pueden formar con éxito organoides de cripta-vellosidad. Además, estos organoides ya alcanzan un tamaño de aprox. 400 - 650 pm de diámetro después de 3,5 días y ya se pueden subcultivar.

La FIG 2 demuestra que en lugar de usar matrigel, también la adición de una combinación de colágeno, laminina, entactina, fibroconexión y ácido hialurónico puede funcionar como potenciador de cultivo, produciendo organoides de cripta-vellosidad. Además, también la combinación de colágeno IV y complejo de laminina/entactina o complejo de laminina/entactina solo es suficiente para la generación de organoides en cultivos en suspensión.

La FIG 3 muestra que, si bien las criptas cultivadas en medio de cultivo sin embeberlas en ECM o análogo de ECM dan como resultado una polarización "de adentro hacia afuera" de las esferas en formación, la adición de potenciadores de cultivo, tales como bajas concentraciones de matrigel, complejo de laminina/entactina o la combinación del complejo de laminina/entactina y colágeno IV, induce una correcta polarización y formación de criptavellosidad en las criptas intestinales. En consecuencia, los cultivos solubles permiten la generación de organoides en suspensión.

La FIG 4 muestra las curvas de viscosidad del medio de cultivo sin potenciadores de cultivo (DMEM, rojo), medio que contiene 2,5 % de matrigel (azul), 10 % de matrigel (verde), 20 % de matrigel (naranja) y 100 % de matrigel (púrpura) a 37 °C, lo que demuestra que el medio de cultivo que incluye potenciadores de cultivo representa un medio de suspensión líquido en lugar de un medio semisólido o un hidrogel utilizado para un enfoque de "embeber". Por consiguiente, nuestro método utiliza un medio líquido definido por una viscosidad al menos aprox. 100 veces menor (Pa a una tasa de cizalla definida) que matrigel en el ensayo presentado.

La FIG 5 muestra organoides de colon de ratón sano (A; aumento de 10x) y tumor de colon humano (B; aumento de 10x) generados en suspensión añadiendo potenciadores de cultivo al medio de cultivo respectivo.

La FIG 6 compara el cultivo de organoide embebido del estado de la técnica de criptas intestinales (A) con el cultivo en suspensión utilizando un potenciador de cultivo (B). Para ambos cultivos, se aislaron criptas del intestino delgado frescas de los mismos ratones C57B16 y se sembraron en placas según el protocolo respectivo. El día 3,5, los organoides de ambos cultivos se inspeccionaron con el mismo aumento. Este ejemplo muestra claramente que con protocolos estándar de cultivo embebido, los organoides alcanzan un tamaño de aprox. 200 pm (diámetro) después de 3,5 días (A; aumento de 10x), mientras que los organoides propagados en cultivos en suspensión en presencia de potenciadores de cultivo alcanzan un tamaño de aprox. 400 - 650 pm (diámetro) al mismo tiempo (B; aumento de 10x) y utilizando el mismo medio de cultivo.

La FIG 7 muestra que, si bien las criptas cultivadas en medio de cultivo completo sin potenciadores de cultivo no pueden formar y mantener el crecimiento como esferas u organoides, la adición de potenciadores de cultivo, tales como bajas concentraciones de matrigel o complejo de laminina/entactina induce la formación de cultivos 3D. En consecuencia, los cultivos solubles permiten la generación de organoides en suspensión. Curiosamente, las moléculas de colágeno y laminina de la ECM, ambas derivadas de tumores EHS como matrigel o el complejo de laminina/entactina, solas o en combinación, tampoco logran inducir la formación de organoides en suspensión. Lo mismo se observa cuando la entactina recombinante se usa sola en lugar de en complejo con laminina. En consecuencia, esto sugiere que ninguna molécula de ECM puede inducir una polarización y formación de organoides correctas; la presencia de laminina y entactina como complejo es crucial.

Descripción detallada del invento

Hasta ahora se ha pensado que el desarrolloin vitrode organoides epiteliales se basa en las propiedades mecánicas del entornoin vitro.Se ha descrito que la diferenciación y expansión de las células madre depende en gran medida de la rigidez de la matriz. Para los organoides epiteliales intestinales y colónicos, por ejemplo, una rigidez de la matriz de 1,3 kPa se ha descrito como ideal para la expansión de células madre y la formación de organoides, mientras que 300 Pa solo condujeron a una proliferación y formación deficientes de organoides que en la mayoría de los casos estaban despolarizados. Sin embargo, sorprendentemente, pudimos identificar potenciadores de cultivo solubles que permiten la generación y el mantenimiento de organoides epiteliales en cultivos celulares, preferiblemente en cultivos celulares en suspensión. Estos organoides exhiben la polaridad celular correcta y, por lo tanto, también se parecen mucho a muchas características de los tejidos epiteliales. Fue absolutamente sorprendente que no sea esencial una cierta rigidez del medio de cultivo celular, sino que la o las moléculas adecuadas, es decir, el potenciador de cultivo soluble, induzcan la señalización a las células para una polarización correcta.

En consecuencia, la manipulación de dicho organoide epitelial se facilita significativamente cuando el organoide en desarrollo está en suspensión. Además, este sistema de cultivo allana el camino para una automatización sencilla del cultivo de organoides epiteliales y su aplicación más amplia en entornos farmacéuticos. Más sorprendentemente, los organoides epiteliales correspondientes se forman mucho antes tras la siembra y muestran tasas de proliferación significativamente mayores.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un cultivo celular para obtener un organoide epitelial, comprendiendo el cultivo celular

i) células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales

ii) un medio basal para células animales o humanas,

iii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP),

iv) un factor de crecimiento mitogénico seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y factor de crecimiento de queratinocitos. (KGF),

v) al menos un potenciador de cultivo soluble, en donde dicho al menos un potenciador de cultivo induce la polarización correcta de las células en dicho cultivo celular dentro del organoide en desarrollo, y

vi) un agonista de Wnt si dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales son células sanas,

en donde dicho al menos un potenciador de cultivo soluble en dicho cultivo celular es un complejo de laminina/entactina en una concentración entre 0,2 mg/ml y 1 mg/ml.

Dicho cultivo celular puede ser un cultivo celular en suspensión.

Es bien conocido en la técnica que un complejo de laminina/entactina se solidifica para formar un gel firme a aproximadamente 3,5 mg/ml en un medio (Corning, Inc., EE. UU., "Certificate of Analysis High Concentration Laminin/Entactin Complex", 2013, URL: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/product-informationsheets/SPC-354259.pdf). Por lo tanto, la laminina/entactina permanece fluida en un medio por debajo de una concentración de 3,5 mg/ml. La concentración de 0,2 mg/ml del complejo de laminina/entactina es suficiente para inducir la polarización correcta como se muestra en el Ejemplo 2 y la FIG 2.

En una divulgación, pero que no forma parte de la invención, dicho al menos un potenciador de cultivo soluble del cultivo celular es un complejo de moléculas (proteínas) que comprende en partes en peso aproximadamente un 60 85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglucano de heparán sulfato y un 2-15 % de entactina.

Como la entactina es una molécula puente que interactúa con la laminina, al menos partes de laminina y entactina pueden existir en dicho complejo de moléculas como un complejo de laminina/entactina.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde en dicho cultivo celular dicho complejo de moléculas está al menos en una concentración de 0,2 mg/ml.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde en dicho cultivo celular dicho complejo de moléculas está al menos en una concentración entre 0,2 mg/ml y 3,2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 3 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2,5 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 1,5 mg /ml, o 0,2 mg/ml y 1 mg/ml.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde dicho complejo puede derivarse de un extracto proteico de tumor EHS o placenta humana.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde dicho complejo puede ser un extracto proteico de tumor EHS o placenta humana. Los métodos de extracción que dan como resultado dicho complejo de moléculas que comprenden en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5 30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde dicho complejo puede ser un extracto proteico de tumor EHS o placenta humana son bien conocidos en la técnica y se divulgan, p. ej., en US482900.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde dicho complejo puede proporcionarse como una composición de proteínas individuales. de laminina, colágeno IV, proteoglicano de sulfato de heparán y entactina añadiendo dichas proteínas individuales, p. ej., mediante el uso de una fuente de proteínas individuales disponibles comercialmente, en dicho cultivo celular.

Es bien conocido en la técnica que un complejo de moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), p. ej., Matrigel® (Corning) solidifica a aproximadamente 3,4 mg/ml en un medio (Corning, Inc., EE. UU., SPC-356231 Rev 6.0 "Guidelines for Use", 2013, URL: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/product-informationsheets/SPC-356231.pdf o Corning, Inc., CLS-Dl-CC-026 REV1 "Corning® Matrigel® Matrix "FAQ", 2016, URL: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/faqs/faq DL 026 Corning Matrigel Matrix.pdf). Por tanto, dicho complejo de moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) permanece de forma fluida en un medio por debajo de una concentración de 3,4 mg/ml. La concentración de 0,2 mg/ml del complejo de moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) es suficiente para inducir la polarización correcta como se muestra en el Ejemplo 1 y la FIG 1.

Dicho cultivo celular como se divulga en la presente memoria, en donde dicho cultivo celular tiene una viscosidad igual o inferior a 1 Pa*s a una tasa de cizallamiento de 1 -100 Hz. ;;Dicho cultivo celular como se divulga en la presente memoria, en donde dicho cultivo celular tiene una viscosidad igual o inferior a 1 Pa*s a una tasa de cizallamiento de 1 -100 Hz, en donde la concentración más baja del potenciador del cultivo soluble en dicho cultivo celular es al menos en una concentración de 0,2 mg/ml de dicho complejo de laminina/entactina o 0,2 mg/ml de dicho complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina. Dicho cultivo celular, en donde dicho cultivo celular no incluye ni contiene una estructura 3D presolidificada tal como una ECM tal como Matrigel® (Corning).

El complejo de laminina/entactina se puede extraer de tejido animal apropiado mediante métodos bien conocidos en la técnica o se puede usar el complejo de laminina/entactina disponible comercialmente (p. ej., Corning, No. de Producto 354359).

La entactina se puede extraer del tejido animal apropiado mediante métodos bien conocidos en la técnica o se puede usar entactina disponible comercialmente (p. ej., R&D systems, No. de Cat. 2570-ND-050). Preferiblemente, dicho complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina puede ser un extracto proteico de tumor EHS.

El complejo de moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), en donde dicho complejo de moléculas derivadas de tumores EHS comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5 30 % de colágeno IV, un 1-10 % de nidogen, un 1-10 % de proteoglucano de sulfato de heparán y un 1-5 % de entactina se puede extraer del tejido animal apropiado mediante métodos bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., US4829000) o se puede utilizar un complejo de este tipo disponible comercialmente. Un complejo disponible comercialmente de moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) es, p. ej., Matrigel® (Corning), Cultrex® Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (Trevigen), gel ECM calificado para células madre (Merck) o Geltrex™ Matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido sin LDEV (ThermoFisher Scientific).

Dichos fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales pueden ser, por ejemplo, criptas de colon aisladas o criptas del intestino delgado. Dichas células madre epiteliales o dichos fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales pueden ser células humanas o murinas.

Los medios basales para células animales o humanas son bien conocidos en la técnica. Dicho medio basal para células animales o humanas puede ser cualquier medio de cultivo celular que contenga aminoácidos, vitaminas, sales inorgánicas, tampones, antioxidantes y fuentes de energía tales como DMEM, DMEM/F12 avanzado, F12 o RPMI 1640.

Los inhibidores de la proteína morfogenética ósea (BMP) y las concentraciones utilizadas de los mismos en un cultivo celular o en un medio de cultivo celular para obtener un organoide son bien conocidos en la técnica como se describe, p. ej., en WO2010090513A2. Dicho inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP) se puede seleccionar del grupo que consiste en Nogina, DAN y proteínas similares a DAN, incluidas Cerberus y Gremlin. La concentración de dichos inhibidores de la proteína morfogenética ósea (BMP) en cultivos celulares y/o medio de cultivo celular puede ser de al menos 10 ng/ml, al menos 20 ng/ml, al menos 50 ng/ml o al menos 100 ng/ml. La concentración más preferida puede ser 100 ng/ml.

Los factores de crecimiento mitogénicos y las concentraciones utilizadas de los mismos en un cultivo celular o un medio de cultivo celular para obtener un organoide son bien conocidos en la técnica como se divulga, p. ej., en WO2010090513A2.

Dicho factor de crecimiento mitogénico puede seleccionarse del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF). Las concentraciones de dichos factores de crecimiento mitogénicos pueden ser entre 5 y 500 ng/ml, preferentemente entre 50 y 100 ng/ml.

Los agonistas de Wnt y las concentraciones utilizadas de los mismos en un cultivo celular o en un medio de cultivo celular para obtener un organoide son bien conocidos en la técnica como se divulga, p. ej., en WO2010090513A2.

Dicho agonista de Wnt puede seleccionarse del grupo que consiste en un miembro de la familia Wnt, familia de R-espondinas R, Norrin y un inhibidor de GSK.

El miembro de la familia Wnt incluye Wnt-1/Int-1; Wnt-2/Irp (proteína relacionada con Int-1);

Wnt-2b/13; Wnt-3/Int-4; Wnt-3a; Wnt-4; Wnt-5a; Wnt-5b; Wnt-6; Wnt-7a; Wnt-7b; Wnt-8a/8d;

Wnt-8b; Wnt-9a/14; Wnt-9b/14b/15; Wnt-10a; Wnt-10b/12; Wnt-11; y Wnt-16.

La familia R-espondina comprende R-espondina-1, R-espondina-2, R-espondina-3 y R-espondina-4. Los inhibidores de GSK conocidos comprenden ARN pequeños de interferencia (ARNsi), litio, kenpaulona, SB 216763 y SB 415286 (Sigma-Aldrich), y miembros de la familia FRAT y péptidos derivados de FRAT que previenen la interacción de GSK-3 con la axina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un medio de cultivo celular para cultivar células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, para obtener un organoide epitelial, comprendiendo dicho medio de cultivo celular

i) un medio basal para células animales o humanas,

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP),

iii) un factor de crecimiento mitogénico seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y factor de crecimiento de queratinocitos. (KGF),

iv) al menos un potenciador de cultivo soluble, en donde dicho al menos un potenciador de cultivo induce la polarización correcta de las células en dicho cultivo celular dentro del organoide en desarrollo, y

v) un agonista de Wnt si dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, son células sanas,

en donde dicho al menos un potenciador de cultivo soluble en dicho medio de cultivo celular es un complejo de laminina/entactina en una concentración entre 0,2 mg/ml y 1 mg/ml.

En una divulgación, pero que no forma parte de la invención, dicho al menos un potenciador de cultivo soluble de dicho medio de cultivo celular es un complejo de moléculas (proteínas) que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina. Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde en dicho medio de cultivo celular dicho complejo de moléculas está al menos en una concentración de 0,2 mg/ml.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde en dicho medio de cultivo celular dicho complejo de moléculas está en al menos en una concentración entre 0,2 mg/ml y 3,2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 3 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2,5 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 1,5 mg/ml, o 0,2 mg/ml y 1 mg/ml.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro para obtener un organoide epitelial, comprendiendo el método cultivar células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales en un medio de cultivo celular (en suspensión) en presencia de (que comprende)

i) un medio basal para células animales o humanas

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP);

En una divulgación, pero que no forma parte de la invención, dicho al menos un potenciador de cultivo soluble usado en dicho método es un complejo de moléculas (proteínas) que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina.

Dicho complejo de moléculas comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina, en donde en dicho medio de cultivo celular dicho complejo de moléculas está al menos en una concentración de 0,2 mg/ml.

Dichos métodos, en donde dicho método no comprende una etapa de proporcionar una estructura tridimensional (3-D) presolidificada a dicho medio de cultivo celular.

Dicho método, en donde el método comprende la etapa de subcultivar las células en dicho medio de cultivo celular, y en donde dicho subcultivo se realiza de manera automatizada, tal como subcultivo o siembra dirigida de los organoides mediante un robot de manipulación de líquidos o un sistema de cultivo celular automatizado alternativo.

En otro aspecto, la presente divulgación, pero que no forma parte de la invención, proporciona el uso de un complejo de laminina/entactina soluble o un complejo soluble de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina como potenciador de cultivo soluble en un cultivo celular (suspensión) o un medio de cultivo celular para obtener un organoide epitelial derivado de células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales.

Como dichos potenciadores de cultivo están en forma soluble en dicho cultivo celular en suspensión o dicho medio de cultivo celular, esto evita una solidificación del cultivo celular en suspensión o del medio de cultivo celular.

En un aspecto adicional, la presente divulgación, pero no que forma parte de la invención, proporciona un organoide epitelial, en donde dicho organoide epitelial se puede obtener mediante los métodos divulgados en la presente memoria. Dicho organoide epitelial, en donde dicho organoide crece a partir de células madre epiteliales o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales hasta un tamaño de aproximadamente 400 - 650 pm después de 3 a 4 días. Los organoides epiteliales embebidos en ECM como se describe, p. ej., en WO2010090513A2 alcanzan un tamaño comparable sólo después de 5-8 días.

El organoide epitelial que se puede obtener mediante los métodos divulgados en la presente memoria, en donde dicho organoide epitelial alcanza un tamaño de aproximadamente 400 - 650 pm en el 90 %, 80 %, 70 %, 60 % o 50 % del tiempo en comparación con los organoides epiteliales que se desarrollan sin dichos potenciadores de cultivo solubles, pero en presencia de una estructura 3D tal como ECM.

Es evidente que el organoide epitelial desarrollado mediante el método de la presente invención tiene una distinción bioquímica con respecto a los organoides epiteliales desarrollados mediante los métodos de la técnica anterior que necesitan la presencia de una ECM tal como se divulga en WO2010090513A2. Esto es indicativo, p. ej., por la tasa de crecimiento más rápida de las células del organoide epitelial como se divulga y/o la falta de un área de contacto entre las células del organoide como se divulga en la presente memoria y una ECM.

El organoide epitelial obtenido mediante el método divulgado en la presente memoria puede tener una de las siguientes disposiciones:

El organoide epitelial puede ser un organoide tridimensional, que comprende dominios similares a criptas que rodean una luz central revestido por dominios epiteliales similares a vellosidades y llenos de cuerpos celulares apoptóticos o una estructura similar a un quiste, con capas celulares que rodean una luz central y llenas de célula apoptótica. Si los organoides se derivan de tejidos neoplásicos, pueden ser una estructura tridimensional de dicha apariencia similar a cripta-vellosidad o quiste o estructuras de tipo esferoide de forma redonda o irregular, que carecen de una luz central. Además, dichos organoides epiteliales contienen células madre o similares a células madre que pueden dividirse activamente y dar lugar a todos los principales linajes celulares diferenciados presentes en las estructuras epiteliales parentales. Las células dentro de los organoides derivados de tejidos sanos están polarizadas, como lo indica, por ejemplo, la expresión desigual de ciertas moléculas de superficie en el lado apical y basal. Las células dentro de organoides epiteliales derivados de tejido neoplásico pueden mostrar dicha polarización o pueden consistir en células no polarizadas. Además, el organoide epitelial puede ser un organoide tridimensional, que comprende dichas estructuras, que son dominios epiteliales que comprenden tipos de células diferenciadas, y en donde las células no epiteliales están ausentes en dicho organoide.

En un aspecto adicional, la presente divulgación, pero que no forma parte de la invención, proporciona el uso de un organoide epitelial como se divulga en la presente memoria en un cribado de descubrimiento de fármacos o en medicina regenerativa.

Para fines de alto rendimiento (p. ej., para el cribado de descubrimiento de fármacos), dichos organoides epiteliales se cultivan en placas de múltiples pocillos tales como, por ejemplo, placas de 96 pocillos o placas de 384 pocillos. Se utilizan bibliotecas de moléculas para identificar una molécula que afecta a dichos organoides. Preferiblemente, las células se exponen a múltiples concentraciones de un agente de prueba durante un cierto período de tiempo. Al final del período de exposición, se evalúan los cultivos. El término "que afecta" se utiliza para cubrir cualquier cambio en una célula, incluyendo, pero no limitado a, una reducción en, o pérdida de, la proliferación, un cambio morfológico y la muerte celular. Dichos organoides también se pueden usar para identificar fármacos que se dirigen específicamente a células de carcinoma epitelial, pero no dichos organoides derivados de tejidos sanos.

Los cultivos que comprenden organoides son útiles en medicina regenerativa, por ejemplo, en la reparación del epitelio intestinal después de la radiación y/o después de la cirugía, en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que padecen de enfermedades inflamatorias del intestino tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, y en la reparación del epitelio intestinal en pacientes que padecen de síndrome del intestino corto.

Todas las definiciones, características y realizaciones definidas en la presente memoria con respecto al primer aspecto de la invención como se divulga en la presente memoria también se aplican mutatis mutandis en el contexto de los otros aspectos de la invención como se divulga en la presente memoria.

Además de las aplicaciones y realizaciones de la invención descritas anteriormente, a continuación, se describen otras realizaciones de la invención sin intención de limitarse a estas realizaciones.

Realizaciones

En una realización de la invención, se genera un cultivo celular en suspensión para la obtención de un organoide epitelial. El cultivo en suspensión puede comprender

i) células madre epiteliales sanas, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales

i) un medio basal para células animales o humanas, p. ej., DMEM/F12 avanzado

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), p. ej., Nogina

iii) un factor de crecimiento mitogénico, p. ej., EGF

iv) un potenciador de cultivo soluble que induce la polarización correcta de las células como se divulga en la presente memoria, en donde dicho potenciador de cultivo soluble es laminina/entactina en una concentración de 0,3 mg/ml, y

v) un agonista de Wnt, p. ej., R-espondina 1 y/o Wnt-3.

El cultivo en suspensión desarrolla en 2-4 días un organoide que flota en el cultivo celular. El organoide epitelial generado se puede utilizar, p. ej., para analizar la biología de tejidos epiteliales sanos, cribado de la toxicidad de fármacos o su aplicación en medicina regenerativa.

En una realización de la invención, se genera un cultivo celular en suspensión para la obtención de un organoide. El cultivo en suspensión puede comprender

i) células madre epiteliales de un tejido enfermo, p. ej., enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de Crohn, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales

i) un medio basal para células animales o humanas, p. ej., DMEM/F12 avanzado

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), p. ej., Nogina

iii) un factor de crecimiento mitogénico, p. ej., EGF

v) un agonista de Wnt, p. ej., R-espondina 1 y/o Wnt-3.

El cultivo en suspensión desarrolla en 2-4 días organoides que flotan en el cultivo celular. Los organoides generados se pueden utilizar, p. ej., para analizar la biología de tejidos epiteliales enfermos o el cribado de fármacos.

i) células madre epiteliales de adenoma o carcinoma, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales de adenoma o carcinoma

i) un medio basal para células animales o humanas, p. ej., DMEM/F12 avanzado

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), p. ej., Nogina

iii) un factor de crecimiento mitogénico, p. ej., EGF

iv) un potenciador de cultivo soluble que induce la polarización correcta de las células como se divulga en la presente memoria, en donde dicho potenciador de cultivo soluble es laminina/entactina en una concentración de 0,3 mg/ml.

El cultivo en suspensión desarrolla en 2-4 días organoides que flotan en el cultivo celular. El organoide generado se puede utilizar, p. ej., para el análisis de la biología de tejidos epiteliales neoplásicos, el cribado de fármacos o la generación de modelos de enfermedades en animales.

En otra realización de la invención, se genera un medio de cultivo celular para cultivar células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, para la obtención de un organoide epitelial. Dicho medio de cultivo celular puede comprender

i) un medio basal para células animales o humanas, p. ej., DMEM/F12 avanzado

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), p. ej., Nogina

iii) un factor de crecimiento mitogénico, p. ej., EGF

iv) un potenciador de cultivo soluble que induce la polarización correcta de las células como se divulga en la presente memoria, en donde dicho potenciador de cultivo soluble es laminina/entactina en una concentración de 0,3 mg/ml

v) un agonista de Wnt, p. ej., R-espondina 1 y/o Wnt-3 si dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales son células sanas.

Después de la adición de células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, se pueden desarrollar organoides epiteliales en 2-4 días.

Este medio de cultivo celular puede no tener una ECM o puede comprender de forma temporal durante el cultivo una ECM o puede tener constantemente durante el cultivo una ECM, aunque el organoide también crecería sin la ECM. En una realización adicional de la invención, las células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, se cultivan en presencia de

i) un medio de cultivo celular sin una ECM, que comprende un medio basal para células animales o humanas, p. ej., DMEM/F12 avanzado

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP), p. ej., Nogina

iii) un factor de crecimiento mitogénico, p. ej., EGF

El cultivo de dichas células en dicho medio de cultivo puede comprender el subcultivo de células, p. ej., después de 3 días. En una variante de esta realización, el subcultivo de células se realiza en un proceso automatizado, p. ej., mediante el uso de un robot de manipulación de líquidos o un sistema de cultivo celular automatizado alternativo para el subcultivo o la siembra dirigida de los organoides.

En una realización de la invención, se usa un potenciador de cultivo soluble, en donde dicho potenciador de cultivo soluble es laminina/entactina en una concentración entre 0,2 mg/ml y 1 mg/ml, en un cultivo celular en suspensión o un medio de cultivo celular para obtener un organoide epitelial derivado de células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales. El uso de laminina/entactina soluble permite la ausencia de una ECM para generar un organoide epitelial derivado de células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales.

En una divulgación adicional, pero que no forma parte de la invención, se obtiene un organoide epitelial mediante los métodos divulgados en la presente memoria. Este organoide epitelial se puede utilizar, p. ej., para el análisis de la biología de tejidos epiteliales sanos o neoplásicos, el cribado de fármacos, la medicina regenerativa o la generación de modelos de enfermedades en animales.

Definiciones

A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Como se usa en la presente memoria, el término "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos, que son esenciales para el método o composición, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.

El término "aproximadamente", como se usa en la presente memoria con respecto a medido, se refiere a un rango alrededor del número indicado. El término "aproximadamente" puede referirse a más o menos el 10 % del valor indicado.

Muchos órganos de humanos adultos y ratones contienen poblaciones distintas de células madre. Estas células madre adultas pueden mostrar características variables y específicas de cada tejido, pero comparten ciertas características que las definen como células madre. Las características esenciales son: autorrenovación, capacidad de generar descendencia capaz de diferenciarse en todos los linajes (más especializados) del tejido respectivo y, por lo tanto, la capacidad de regenerar el tejido en un grado específico del tejido, por ejemplo, después de una lesión. Con el fin de mantener dichas características, las células madre residen en el nicho de células madre respectivo, un microambiente especializado dentro de los tejidos que proporciona todas las señales relevantes.

Las células madre epiteliales son capaces de regenerar epitelios, incluidos distintos tipos de células epiteliales especializadas. Las células madre epiteliales pueden ser células que pueden dar lugar a epitelio sin importar de dónde se deriven, aíslen o generen, p. ej., pueden derivarse o generarse a partir de células iPS o células transdiferenciadas. Como las funciones y la composición de los epitelios varían en diferentes órganos, también el recambio celular y, por lo tanto, la tasa de proliferación de dichas células madre epiteliales es diferente. Los ejemplos bien conocidos de epitelios con recambio rápido son la piel y el intestino, mientras que el páncreas y el hígado representan epitelios con tasas de recambio lento. Los nichos de células madre epiteliales se ubican en subunidades específicas de los tejidos, por lo que los protocolos para la preparación de dichas células madre varían entre diferentes tejidos.

En el intestino delgado y grueso, las células madre epiteliales residen en criptas. Los expertos en la técnica conocen los protocolos para el aislamiento de criptas. El aislamiento puede realizarse, por ejemplo, mediante incubación de tejido colónico o intestinal lavado en tampones quelantes como EDTA o EGTA, con el fin de interrumpir las uniones entre células y entre células y membranas basales dependientes de calcio y magnesio. Después de lavar cuidadosamente el tejido con tampón sin agentes quelantes, las criptas se pueden liberar cortando las criptas mediante un pipeteo vigoroso. Los fragmentos de tejido más grandes se pueden eliminar utilizando un colador de malla de 70 pm para obtener criptas "purificadas". Con el fin de obtener una suspensión de células individuales (que contenga células madre epiteliales), las criptas se pueden incubar posteriormente en enzimas proteolíticas diluidas, como colagenasa, dispasa, tripsina o preferiblemente papaína. Se puede utilizar una etapa de filtración posterior para eliminar trozos de tejido remanentes no digeridos. Se pueden utilizar métodos similares para aislar fragmentos o células del estómago, páncreas o glándula salival. Además, se pueden utilizar kits y métodos de enzimas comerciales para obtener dichas células.

Los fragmentos o células adecuados para dicha generación de organoides a partir de tejidos epiteliales neoplásicos se pueden aislar mediante protocolos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, dichos tejidos pueden triturarse en trozos de 4-6 mm e incubarse en enzimas proteolíticas diluidas tales como dispasa, tripsina, papaína o preferiblemente colagenasa. Se pueden generar fragmentos de tejido mediante un corte posterior mediante pipeteo vigoroso. La eliminación de trozos de tejido más grandes y no digeridos se puede lograr mediante filtración utilizando un colador de malla de 100 pm. Con el fin de obtener una suspensión de células individuales, los fragmentos de tejido se pueden incubar posteriormente en enzimas proteolíticas diluidas, como colagenasa, dispasa, tripsina o papaína. Se puede utilizar una etapa de filtración posterior para eliminar trozos de tejido remanentes no digeridos. Además, se pueden utilizar kits y métodos de enzimas comerciales para obtener dichas células.

Las células madre epiteliales o células similares a células madre dentro de dichos tejidos se pueden aislar usando métodos conocidos por un experto en la técnica. Un método preferido se basa en el hecho de que ciertas moléculas de superficie son expresadas por dichas células madre o similares a células madre de una manera específica, como se conoce en la técnica. Un método preferido es preparar una suspensión de células individuales a partir de dichos tejidos epiteliales mediante métodos conocidos en la técnica y ponerlos en contacto con compuestos que se unen a dichas moléculas de superficie, tales como anticuerpos monoclonales. Luego, se aíslan dichas células madre aislando dicho compuesto, por ejemplo, usando perlas magnéticas o clasificación de células activadas por fluorescencia, como sabe un experto en la técnica. Los compuestos preferidos son anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a Lgr5 y/o Lgr6 para células madre epiteliales intestinales o colónicas o Lgr5 y/o CD133 para células similares a células madre colorrectales.

El término "tumor" se conoce médicamente como neoplasia. No todos los tumores son cancerosos; los tumores benignos no invaden los tejidos vecinos y no se diseminan por todo el cuerpo.

El término "cáncer" se conoce médicamente como neoplasma maligno. El cáncer es un amplio grupo de enfermedades que implican un crecimiento celular desregulado. En el cáncer, las células (células cancerosas) se dividen y crecen sin control, formando tumores malignos e invadiendo partes cercanas del cuerpo. El cáncer también puede propagarse a partes más distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Hay más de 200 tipos de cáncer diferentes conocidos que afectan a los seres humanos.

El término "adenoma" describe un tumor benigno de tejido epitelial con origen glandular, características glandulares o ambos. Los adenomas pueden crecer en muchos órganos glandulares, incluidas las glándulas suprarrenales, la glándula pituitaria, la tiroides, la próstata y otros. Algunos adenomas crecen a partir de tejido epitelial en áreas no glandulares, pero expresan tejido glandular. Aunque los adenomas son benignos, con el tiempo pueden transformarse y volverse malignos, momento en el que se denominan adenocarcinomas.

El término "matriz extracelular" (ECM) como se usa en la presente memoria se refiere a una colección de moléculas extracelulares secretadas por tejido conectivo que proporciona soporte estructural y bioquímico a las células circundantes (ECM de origen natural) y/o se refiere a biomateriales o mezclas de los mismos naturales, semisintéticos y sintéticos que pueden construir matrices o soportes que imitan un nicho celular, p. ej., de células madre durante su cultivo. Todos estos soportes estructurales, matrices y andamios tienen la característica inherente de que células tales como células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, pueden unirse a estas estructuras, es decir, a la ECM, y por lo tanto dichas células no están en suspensión en un medio de cultivo celular.

Un soporte proporciona redes o estructuras tridimensionales. Los materiales sintéticos adecuados para dicho soporte comprenden polímeros seleccionados entre sólidos porosos, nanofibras e hidrogeles tales como, por ejemplo, péptidos que incluyen péptidos que se pueden autoensamblar, hidrogeles compuestos de fosfato de polietilenglicol, fumarato de polietilenglicol, poliacrilamida, metacrilato de polihidroxietilo, acetato de policelulosa y/o copolímeros de los mismos. La ECM está compuesta por una variedad de polisacáridos, agua, elastina y glicoproteínas, en donde las glicoproteínas comprenden colágeno, entactina (nidógeno), fibronectina y laminina. La ECM es secretada por células del tejido conectivo. Se conocen diferentes tipos de ECM, que comprenden diferentes composiciones que incluyen diferentes tipos de glicoproteínas y/o diferentes combinaciones de glicoproteínas. Dicha ECM puede proporcionarse cultivando células productoras de ECM, tales como, por ejemplo, células de fibroblastos, en un receptáculo, antes de la eliminación de estas células y la adición de, por ejemplo, células madre de criptas aisladas o células madre epiteliales. Los ejemplos de células productoras de matriz extracelular son los condrocitos, que producen principalmente colágeno y proteoglicanos, las células de fibroblastos, que producen principalmente colágeno tipo IV, laminina, procolágenos intersticiales y fibronectina, y miofibroblastos colónicos que producen principalmente colágenos (tipo I, III y V), proteoglicano de sulfato de condroitina, ácido hialurónico, fibronectina y tenascina-C.

Alternativamente, dicha ECM se proporciona comercialmente. Los ejemplos de matrices extracelulares disponibles comercialmente son las proteínas de la matriz extracelular (Invitrogen) y Matrigel™ (Corning).

Nuevamente, la ECM tiene una estructura solidificada que permite la unión/adhesión de las células en cultivo. La expresión "estructura tridimensional (3D) presolidificada" en el contexto de proporcionar o no proporcionar dicha estructura tridimensional (3D) presolidificada a un medio de cultivo celular como se divulga significa que una estructura 3D prefabricada tal como Matrigel® (Corning) se mezcla con dichas células y se incuba a 37 °C para formar un gel firme. Alternativamente, una estructura 3D prefabricada como Matrigel® (Corning) se incuba a 37 °C para formar un gel firme sin células. Esas estructuras sólidas podrían añadirse a un medio de cultivo celular, que representa estructuras tridimensionales (3D) presolidificadas flotantes en un cultivo en suspensión.

El cultivo celular es el proceso mediante el cual las células se cultivan en condiciones controladas, generalmente fuera de su entorno natural. Una vez aisladas las células de interés del tejido vivo, se pueden mantener posteriormente en condiciones cuidadosamente controladas. Estas condiciones varían para cada tipo de célula, pero generalmente consisten en un recipiente adecuado con un sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases (CO2, O2) y regula el entorno fisicoquímico (tampón de pH, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células requieren una superficie o un sustrato artificial (cultivo adherente o en monocapa), mientras que otras pueden crecer flotando libremente en un medio de cultivo (cultivo en suspensión). Por lo tanto, el término "cultivo (celular) en suspensión" significa que las células o unidades multicelulares de un cultivo crecen flotando libremente en el medio de cultivo, es decir, están en suspensión. La clave es que estas células o unidades multicelulares se cultivan en un medio con una viscosidad no significativamente mayor en comparación con los medios basales para células animales o humanas. El término "medio basal para células animales o humanas" como se usa en la presente memoria se refiere a un medio sintético definido para células animales o humanas que está tamponado preferiblemente a un pH entre 7,2 y 7,6, preferiblemente a aproximadamente un pH de 7,4 con un tampón basado en carbonato, mientras que las células se cultivan en una atmósfera que comprende entre 5 % y 10 % de CO2, preferiblemente aproximadamente 5 % de CO2. Los medios basales para células animales o humanas son bien conocidos en la técnica. Un medio basal preferido adecuado para células animales o humanas puede seleccionarse entre DMEM/F12 y RPMI 1640 suplementados con glutamina, insulina, penicilina/estreptomicina y transferrina. En una realización preferida adicional, se utiliza DMEM/F12 avanzado o RPMI avanzado, que está optimizado para cultivo libre de suero y ya incluye insulina. En este caso, dicho medio DMEM/F12 avanzado o RPMI avanzado se suplementa preferiblemente con glutamina y penicilina/estreptomicina. Además, se prefiere que dicho medio se suplemente con un factor de crecimiento purificado, natural, semisintético y/o sintético y que no comprenda un componente indefinido tal como suero fetal bovino o suero fetal de ternera. Los suplementos tales como, por ejemplo, B27, N-Acetilcisteína y N2 estimulan la proliferación de algunas células y se pueden añadir al medio, si es necesario.

El término "medio de cultivo celular" es sinónimo de medio, medio de cultivo o medio celular. Un organoide es una versión miniaturizada y simplificada de un órgano producido in vitro en tres dimensiones que muestra una microanatomía realista. Se derivan de una o unas pocas células de un tejido, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas, que pueden autoorganizarse en cultivos tridimensionales gracias a sus capacidades de autorrenovación y diferenciación. Las células madre embrionarias humanas pueden aislarse de embriones sin destrucción como se describe, p. ej., en WO 03/046141. Los organoides epiteliales se derivan de células madre epiteliales o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales. Los organoides epiteliales obtenidos mediante los métodos divulgados en la presente memoria son organoides epiteliales artificiales, no son organoides cultivados de forma natural in vivo.

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) interaccionan con receptores específicos de la superficie celular, denominados receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR). La transducción de señales a través de los BMPR da como resultado la movilización de miembros de la familia de proteínas SMAD. Las rutas de señalización que involucran BMP, BMPR y SMAD son importantes en el desarrollo de varios órganos.

El término "inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP)" se define como un agente que se une a una molécula de BMP para formar un complejo en donde se neutraliza la actividad de BMP, por ejemplo, previniendo o inhibiendo la unión de la molécula de BMP a un receptor de BMP. Alternativamente, el inhibidor de BMP es un agente que actúa como antagonista o agonista inverso. Este tipo de inhibidor se une a un receptor de BMP y evita la unión de una BMP a dicho receptor. Un ejemplo de un último agente es un anticuerpo que se une a un receptor de BMP y evita la unión de BMP al receptor unido al anticuerpo.

Se conocen varias clases de proteínas naturales de unión a BMP, incluidas Nogina, Cordina y proteínas similares a cordina que comprenden dominios de cordina, folistatina y proteínas relacionadas con folistatina que comprenden un dominio de folistatina, DAN y proteínas similares a DAN que comprenden un dominio de nudo de cisteína de DAN, esclerostina. /SOST, decorina y alfa-2 macroglobulina. El inhibidor de BMP preferido es Nogina. Preferentemente, se añade Noggin al medio de cultivo celular en una concentración de al menos 10 ng/ml, más preferentemente al menos 20 ng/ml, más preferentemente al menos 50 ng/ml, más preferentemente al menos 100 ng/ml. Una concentración más preferida es aproximadamente 100 ng/ml o 100 ng/ml. Durante el cultivo de células madre, dicho inhibidor de BMP se añade preferentemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se renueva preferentemente cada cuatro días.

Un factor de crecimiento mitogénico es un factor de crecimiento que desencadena la mitosis de una célula. El factor de crecimiento mitogénico puede seleccionarse de una familia de factores de crecimiento que comprende el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF). Un factor de crecimiento mitogénico preferido es EGF. Preferiblemente, el EGF se añade al medio de cultivo basal en una concentración de entre 5 y 500 ng/ml o de al menos 5 y no superior a 500 ng/ml. Una concentración preferida es al menos 10, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 ng/ml y no superior a 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 ng/ml. Una concentración más preferida es al menos 50 y no superior a 100 ng/ml. Una concentración aún más preferida es 50 ng/ml. Se podrían usar las mismas concentraciones para un FGF, preferiblemente para FGF10 o FGF7. También se puede añadir más de un factor de crecimiento mitogénico al medio de cultivo.

Durante el cultivo de células madre, dicho factor de crecimiento mitogénico se añade preferentemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se renueva preferentemente cada cuatro días.

Los términos "potenciador de cultivo soluble" o "potenciador de cultivo" como se usan en la presente memoria se refieren a una molécula o un complejo de moléculas en solución (en un medio de cultivo celular o cultivo celular en suspensión) que permite la generación, expansión y cultivo de organoides en cultivos en suspensión. El potenciador del cultivo (soluble) no forma ni contribuye a una estructura, matriz o soporte solidificado macroscópico al que podrían unirse las células de un cultivo celular. Dichos "potenciadores de cultivo" conducen a una polarización basal-apical correcta y, por tanto, a un crecimiento exitoso de organoides en cultivos en suspensión, mientras que en ausencia de dichos potenciadores de cultivo solubles en medios libres de ECM sólo se forman esferas despolarizadas que mueren en 2-4 días. Los términos "potenciadores de cultivo solubles" y "potenciadores de cultivo" pueden usarse indistintamente.

El potenciador del cultivo puede ser un complejo de laminina/entactina o un complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina.

Los términos "complejo de laminina/entactina" o "laminina/entactina" se pueden usar indistintamente. La laminina y la entactina son componentes de las membranas basales de las células. La entactina es una molécula puente que interacciona con la laminina; ambas moléculas se ensamblan intracelularmente antes de ser secretadas. Una buena fuente para extraer la laminina/entactina es, p. ej., el tumor de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Los métodos para extraer el complejo de laminina/entactina son bien conocidos en la técnica. La laminina/entactina también está disponible comercialmente, p. ej., en Corning.

El tumor Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) produce grandes cantidades de componentes de la membrana basal (BM), que se utilizan ampliamente como sustratos de cultivos celulares que imitan las funciones de la BM. El tumor EHS surgió espontáneamente en un ratón de la cepa ST/Eh y se propagó mediante trasplante.

Los términos "complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina" y "complejo de proteínas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina" se pueden usar indistintamente.

El término "dicho complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina se deriva de un extracto proteico de tumor EHS significa un extracto (o extracto proteico) de moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), en donde dicho extracto (o extracto proteico) de moléculas derivadas de tumores EHS comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina". US482900 divulga dicha composición de extractos proteicos: un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de nidogen, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 1-5 % de entactina. Posteriormente se identificó que nidogen es idéntico a entactina, por lo tanto, en la presente memoria los valores se han sumado a un 2-15 % de entactina.

Matrigel® es un producto disponible comercialmente de Corning. Matrigel® es una preparación de membrana basal reconstituida que se extrae del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumor rico en proteínas de la matriz extracelular. Este material, una vez aislado, tiene aproximadamente un 60 % de laminina, un 30 % de colágeno IV y un 8 % de entactina. La entactina es una molécula puente que interacciona con la laminina y el colágeno IV y contribuye a la organización estructural de estas moléculas de la matriz extracelular. Matrigel® también contiene proteoglicano de sulfato de heparán y otras moléculas.

Un método para la extracción de dicho complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina se puede realizar, p. ej., de la siguiente manera. En primer lugar, el tumor Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) crecido en ratones se extirpa de animales según las aprobaciones éticas locales. El tejido se homogeneiza en NaCl al 20 % (p/p) que contiene EDTA 4 mM, NEM 2 mM y TRIS-HCl 20 mM a pH 7,4. Dicho tampón se denominará en lo sucesivo tampón NaCl al 20 %. Con el fin de eliminar las proteínas que se originan en las células y el suero, el homogenado se mezcla bien y se centrifuga a 10.000 g durante 15 minutos. Este procedimiento se repite dos veces más. A continuación, el material residual se extrae con urea 2 M en Tris-HCl 50 mM y tampón NaCl 150 mM a pH 7,4 incubándolo durante la noche a 4 °C y luego se centrifuga a 10.000 g y 4 °C durante al menos 30 min. A continuación, el sobrenadante se puede dializar frente a un tampón adecuado, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Con el fin de eliminar aún más los residuos insolubles, la fracción dializada se puede centrifugar nuevamente a 10.000 g y 4 °C durante al menos 30 min. Esta fracción contiene dichas moléculas derivadas de tumores Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).

Los potenciadores de cultivo solubles se pueden usar en el cultivo celular en suspensión o en el medio de cultivo celular en las siguientes concentraciones:

Entre 0,2 mg/ml y 3,4 mg/ml, 0,2 mg/ml y 3 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2,5 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 1,5 mg/ml, o 0,2 mg/ml y 1 mg/ml si dicho potenciador del cultivo es el complejo de laminina/entactina.

Entre 0,2 mg/ml y 3,2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 3 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2,5 mg/ml, 0,2 mg/ml y 2 mg/ml, 0,2 mg/ml y 1,5 mg/ml, 0,2 mg/ml y 1 mg/ml, o 0,2 mg/ml y 0,5 mg/ml si dicho potenciador del cultivo es un complejo de moléculas que comprende en partes en peso aproximadamente un 60-85 % de laminina, un 5-30 % de colágeno IV, un 1-10 % de proteoglicano de sulfato de heparán y un 2-15 % de entactina. La expresión "induce la polarización correcta de las células en dicho cultivo celular (en suspensión)" en el contexto de un potenciador de cultivo soluble en un medio celular para generar un organoide epitelial significa que dicho potenciador de cultivo desencadena la formación de células polarizadas que expresan marcadores específicos de la membrana basal (como EpCAM en organoides intestinales) en la interfaz del medio y las células, mientras que los marcadores apicales (como la actina F) se expresan en la membrana luminal de los organoides que desarrollan una luzin vitro.En particular, debido a la naturaleza de las células neoplásicas, esta polarización no necesariamente puede observarse en los organoides derivados de las mismas.

Durante el cultivo de células madre epiteliales, dicho potenciador de cultivo soluble se añade preferiblemente al medio de cultivo cada dos días, mientras que el medio de cultivo se renueva preferiblemente cada cuatro días.

En el caso de que no se trate de adenomas ni de carcinomas (es decir, células madre epiteliales sanas o criptas aisladas), se deben proporcionar agonistas de Wnt en el medio de cultivo para la proliferación de las células. En la conclusión inversa, si el organoide se basa en adenoma (célula de adenoma epitelial) y/o células tumorales de células madre epiteliales (de colon o intestino delgado), entonces no es necesario proporcionar un agonista de Wnt en el cultivo en suspensión y/o en el medio de cultivo celular como se divulga en la presente memoria ya que estas células tienen regularmente una mutación que activa la señalización Wnt de las células, por ejemplo, una mutación de poliposis coli adenomatosa (APC).

La expresión "dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales son células sanas" significa que las células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, son células normales o células de un tejido enfermo que no es adenoma ni carcinoma, como la enfermedad inflamatoria intestinal o la enfermedad de Crohn, que muestran un estado patológico, pero no son neoplásicas. Por el contrario, existen células anormales que podrían ser adenomas o células tumorales. El término "tejido enfermo" como se usa en la presente memoria significa células y/o tejido que no está sano, pero que no comprende células neoplásicas o cancerosas. Los ejemplos de tejidos enfermos son la enfermedad inflamatoria intestinal o la enfermedad de Crohn.

La ruta de señalización Wnt se define por una serie de eventos que ocurren cuando una proteína Wnt se une a un receptor de la superficie celular de un miembro de la familia de receptores Frizzled. Esto da como resultado la activación de proteínas de la familia Disheveled que inhiben un complejo de proteínas que incluye axina, GSK-3 y la proteína APC para degradar la p-catenina intracelular. La p-catenina nuclear enriquecida resultante potencia la transcripción mediante factores de transcripción de la familia TCF/LEF.

Un agonista de Wnt se define en la presente memoria como un agente que activa la transcripción mediada por TCF/LEF en una célula. Por lo tanto, los agonistas de Wnt se seleccionan entre agonistas de Wnt verdaderos que se unen a y activan un miembro de la familia de receptores Frizzled que incluye todas y cada una de las proteínas de la familia Wnt, un inhibidor de la degradación de p-catenina intracelular y activadores de TCF/LEF.

Dicho agonista de Wnt puede seleccionarse del grupo que consiste en un miembro de la familia Wnt, familia de R-espondinas, Norrina y un inhibidor de GSK.

El miembro de la familia Wnt incluye Wnt-1 /I nt-1; Wnt-2/Irp (proteína relacionada con Int-1);

Wnt-2b/13; Wnt-3/Int-4; Wnt-3a; Wnt-4; Wnt-5a; Wnt-5b; Wnt-6; Wnt-7a; Wnt-7b; Wnt-8a/8d; Wnt-8b; Wnt-9a/14; Wnt-9b/14b/15; Wnt-10a; Wnt-10b/12; Wnt-11; y Wnt-16.

La familia de R-espondinas comprende R-espondina-1, R-espondina-2, R-espondina-3 y R-espondina-4. Los inhibidores de GSK conocidos comprenden ARN pequeños de interferencia (ARNsi), litio, kenpaulona, SB 216763 y SB 415286 (Sigma-Aldrich), y miembros de la familia FRAT y péptidos derivados de FRAT que previenen la interacción de GSK-3 con la axina.

En una realización de la invención, dicho agonista de Wnt comprende o consiste en R-espondina 1. La R-espondina 1 se puede añadir preferiblemente al medio de cultivo celular en una concentración de al menos 50 ng/ml, más preferiblemente al menos 100 ng/ml, más preferiblemente al menos 200 ng/ml, más preferiblemente al menos 300 ng/ml, más preferiblemente al menos 500 ng/ml. Una concentración más preferida de R-espondina 1 es aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml. Durante el cultivo de células madre, dicho miembro de la familia Wnt se añade preferentemente al medio de cultivo celular cada dos días, mientras que el medio de cultivo se renueva preferentemente cada cuatro días.

En otra realización de la invención, un agonista de Wnt se selecciona del grupo que consiste en: R-espondina, Wnt-3a y Wnt-6. Más preferiblemente, se usan R-espondina y Wnt-3a como agonistas de Wnt. Las concentraciones preferidas pueden ser aproximadamente 500 ng/ml o 500 ng/ml para Respondina y aproximadamente 100 ng/ml o 100 ng/ml para Wnt3a.

Ejemplos

Ejemplo 1: Los potenciadores del cultivo permiten la formación de organoides independientemente de la viscosidad del medio

Con el fin de cultivar organoides del intestino delgado a partir de criptas del intestino delgado, las criptas se recogieron del intestino delgado de ratones C57B16 según los procedimientos publicados. En resumen, después de la disección del intestino delgado, se lavó con tampón, se abrió longitudinalmente y se cortó en trozos de aprox. 4 mm y se incubaron en D-PBS que contenía EDTA 7 mM durante 30 minutos en hielo. A continuación, las criptas se liberaron mediante pipeteo repetido y se recogieron dejando que los trozos de tejido remanentes se asentaran por gravedad y recogiendo el sobrenadante que contenía las criptas y algunas vellosidades. Las vellosidades se eliminaron mediante filtración a través de un SmartStrainer (Miltenyi Biotec) de 70 gm de tamaño de malla. Las criptas aisladas se centrifugaron, se resuspendieron en medio organoide del intestino delgado y se sembraron en placas de unión ultrabaja. Para probar la capacidad de apoyar la formación y el crecimiento de organoides, se añadieron diferentes suplementos. Las criptas incubadas sin suplementos adicionales o en medio que contenía un 1 - 2 % de metilcelulosa o 300 gg/ml de laminina (laminina derivada de la membrana basal del sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm; Merck, No. de Cat. L2020-1MG) no formaron organoides, como se representa en la FIG 1. En cambio, formaron estructuras similares a quistes que murieron en 2-3 días. Sorprendentemente, cuando se añadió Matrigel a una concentración final del 2,5 % se formaron organoides en gemación en 3,5 días, aunque las criptas no estaban embebidas en una matriz sólida, sino en un cultivo en suspensión. En particular, esto corresponde a una tasa de crecimiento más alta que la presentada en diferentes publicaciones donde los organoides se cultivan en una cúpula sólida de Matrigel.

Ejemplo 2: La laminina/entactina y las moléculas derivadas de tumores EHS pueden funcionar como potenciadores del cultivo

El Matrigel es una mezcla compleja y menos definida de diferentes componentes de la ECM, como colágenos y lamininas, así como algunos factores de crecimiento como el EGF. Con el fin de identificar los componentes de Matrigel que apoyan la formación y el crecimiento de los organoides del intestino delgado, se aislaron criptas del intestino delgado de ratones C57B16 y se resuspendieron en medio de organoide del intestino delgado. Las criptas se sembraron en placas de unión ultrabaja. La adición de "Matrigel compuesto" que consiste en colágeno, laminina, entactina, fibronectina y ácido hialurónico, imitando la adición de Matrigel, conduce a la formación de organoides en gemación. Sorprendentemente, también la adición de colágeno IV y el complejo de laminina/entactina, así como la adición de laminina/entactina solo dio lugar a la formación de organoides en gemación, como se muestra en la FIG 2.

Ejemplo 3: Los potenciadores de cultivo inducen una polarización celular correcta en cultivos en suspensión

La caracterización adicional de los organoides cultivados en suspensión se realizó mediante imagenología de inmunofluorescencia. Los organoides se generaron en suspensión resuspendiendo únicamente las criptas del intestino delgado en organoides sin añadir más componentes, añadiendo Matrigel a una concentración final del 2,5 %, añadiendo solo el complejo de laminina/entactina o añadiendo el complejo de laminina/entactina y colágeno IV. Los organoides en gemación en formación se fijaron con PFA al 4 %, se permeabilizaron y se tiñeron con EpCAM como marcador basal, faloidina como marcador apical y DRAQ5 como marcador de núcleos, como se muestra en la FIG 3. Como se mencionó anteriormente, las criptas crecidas en suspensión sin adición adicional de potenciadores de cultivo sólo forman estructuras parecidas a quistes que dejan de crecer y mueren en 2-3 días. El análisis de inmunofluorescencia reveló que las estructuras similares a quistes en formación muestran una estructura "de adentro hacia afuera" con marcadores apicales en el exterior de los organoides. Sin embargo, la adición de potenciadores de cultivo induce una polarización correcta y permite la formación de organoides en gemación, como se muestra por la tinción basal con EpCAM en el exterior de los organoides y la tinción apical de faloidina en el interior dirigida a la luz de los organoides.

Ejemplo 4: Los potenciadores del cultivo no aumentan significativamente la viscosidad de los medios líquidos

El nuevo método de cultivo de organoides contrasta claramente con los protocolos tradicionales de cultivo de organoides en una cúpula de ECM solidificadas, ya que estos últimos no se pueden utilizar para generar cultivos en suspensión reales. Con el fin de demostrar que los cultivos son verdaderos cultivos en suspensión, se compararon mediante reología las propiedades mecánicas de Matrigel y el medio que contiene potenciadores de cultivo en las concentraciones necesarias. Las propiedades mecánicas del medio para cultivos de organoides en suspensión se compararon con el medio DMEM sin suplementos adicionales y Matrigel realizando un barrido de amplitud (1e0 - 1e6 de tensión de cizalla) y frecuencia (1e0 - 1e2 rad/s) ambos a 37 °C. Luego, se compararon los medios basándose en las curvas de viscosidad como se muestra en la FIG 4. Los datos muestran que DMEM y el medio organoide en suspensión muestran curvas comparables, mientras que Matrigel muestra una viscosidad claramente mayor en todas las velocidades de cizalla representadas. Nuestros datos indican que el medio de organoides en suspensión es un medio líquido con una viscosidad comparable a DMEM en lugar de un hidrogel como Matrigel. En consecuencia, el nuevo método permite un verdadero cultivo en suspensión de organoides, en lugar de depender de embeber células o trozos de tejido en un gel.

Ejemplo 5: El potenciador del cultivo promueve la formación de organoides en suspensión para diferentes tejidos epiteliales humanos y de ratón

Con el fin de probar que el concepto de cultivo en suspensión de organoides utilizando potenciadores de cultivo también funciona en otros tejidos, se aislaron criptas de colon del colon de ratones C57B16 según los procedimientos publicados. Luego, las criptas se cultivaron en placas de unión ultrabaja con potenciadores de cultivo, como se representa en la FIG 5A. El día 4, las criptas del colon ya habían formado organoides quísticos, comparables a los generados en las respectivas publicaciones.

Además, se cultivaron células de líneas celulares primarias de carcinoma de colon humano en placas de unión ultrabaja en presencia de potenciadores del cultivo. En las primeras 24 horas, se formaron estructuras similares a organoides que podían subcultivarse múltiples veces y continuar creciendo como cultivos 3D similares a organoides (véase la FIG. 5B). Esto demuestra que la presencia de potenciador de cultivo también permite el cultivo en suspensión de organoides de otros tejidos y especies.

Ejemplo 6: El cultivo en suspensión de organoides permite mejorar las tasas de crecimiento

Con el fin de comparar la formación de organoides en cultivos embebidos con los organoides generados en cultivos en suspensión en presencia de potenciadores de cultivo, se prepararon criptas frescas del intestino delgado de ratones C57B16 según los procedimientos publicados. Luego, las criptas se embebieron en una cúpula de Matrigel y se cubrieron con medio de cultivo después de la solidificación como se representa en la FIG 6A, o se cultivaron en placas de unión ultrabaja con el mismo medio de cultivo con la adición de potenciadores de cultivo, como se muestra en la FIG 6B. Después de 3,5 días, se comparó el tamaño de los organoides mediante microscopía utilizando el mismo aumento. En 3,5 días, siguiendo los procedimientos publicados (FIG. 6A), los organoides crecen hasta un tamaño de aprox. 200 gm de diámetro y comienzan a formar dominios tipo cripta. Los organoides propagados en cultivo en suspensión crecen hasta un tamaño de 400 - 650 gm de diámetro en el mismo tiempo de cultivo. En particular, también forman ya múltiples dominios similares a criptas. Esto sugiere una tasa de desarrollo mejorada y acelerada en cultivos en suspensión. Esto podría acelerar potencialmente los protocolos para la expansión de organoides, allanando el camino para procedimientos acelerados y facilitados para los cribadosin vitro,por ejemplo.

Ejemplo 7: La presencia de laminina y entactina como complejo es crucial para el cultivo en suspensión

Los componentes principales de las matrices derivadas de tumores EHS, como matrigel, son laminina, colágeno IV, entactina y proteoglicanos de sulfato de heparina. Se ha mostrado que un "matrigel compuesto", así como laminina/entactina con o sin colágeno IV, pueden inducir la formación de organoides. Para identificar el principal inductor de la formación de organoides en cultivos en suspensión, se aislaron criptas intestinales del intestino delgado de ratones C57B16 según los procedimientos publicados. Las criptas se sembraron en placas de unión ultrabaja con medio de cultivo completo y diferentes moléculas de ECM que también se encuentran en matrigel. Como se muestra en la FIG 7, solo una baja concentración de matrigel y el complejo de laminina entactina fueron potentes para inducir la formación de organoides, mientras que, sorprendentemente, la entactina sola o el colágeno IV y la laminina derivada de tumores EHS solos o en combinación no lograron inducir el crecimiento de organoides. Sorprendentemente, esto demuestra que cualquier (glico)proteína derivada de ECM sola o en combinación no es suficiente para reemplazar una ECM para permitir la formación de organoides. En cambio, se requiere el complejo de laminina y entactina, mientras que ambas solas o en combinación con otra proteína de la ECM tampoco logran favorecer el crecimiento de organoides en suspensión. Este notable hallazgo allana el camino para el desarrollo de protocolos más definidos para la generación y el mantenimiento de organoides, así como para estudiar la polarización de las células epiteliales con más detalle.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un cultivo celular para obtener un organoide epitelial, comprendiendo el cultivo celular

i) células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales ii) un medio basal para células animales o humanas,

iii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP),

v) al menos un potenciador de cultivo soluble, en donde dicho al menos un potenciador de cultivo induce la polarización correcta de las células en dicho cultivo celular dentro del organoide en desarrollo, y vi) un agonista de Wnt si dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales son células sanas,

2. El cultivo celular según la reivindicación 1, en donde dicho cultivo celular no contiene una estructura 3D presolidificada.

3. Un medio de cultivo celular para cultivar células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, para obtener un organoide epitelial, comprendiendo dicho medio de cultivo celular

i) un medio basal para células animales o humanas,

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP),

iv) al menos un potenciador de cultivo soluble, en donde dicho al menos un potenciador de cultivo induce la polarización correcta de las células en dicho cultivo celular dentro del organoide en desarrollo, y v) un agonista de Wnt si dichas células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales, son células sanas,

4. El medio de cultivo celular según la reivindicación 3, en donde dicho cultivo celular no contiene una estructura 3D presolidificada.

5. Un método in vitro para obtener un organoide epitelial, comprendiendo el método cultivar células madre epiteliales, o fragmentos de tejido que comprenden dichas células madre epiteliales en presencia de

i) un medio basal para células animales o humanas

ii) un inhibidor de la proteína morfogenética ósea (BMP);

6. El método según la reivindicación 5, en donde dicho método no comprende una etapa de proporcionar una estructura tridimensional (3-D) presolidificada a dicho medio.

7. El método según la reivindicación 5 o 6, en donde el método comprende la etapa de subcultivar las células en dicho medio de cultivo celular, y en donde dicho subcultivo se realiza en un proceso automatizado.