CN110809625A - 用于获得类器官的组合物和方法 - Google Patents

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R·康德
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Abstract

提供了用于获得上皮类器官的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在基础培养基的存在下培养与细胞外基质接触的一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干细胞，其中所述培养基不含FGF和/或烟酰胺。还提供了通过本文描述的方法获得的类器官及其用途。

Description

用于获得类器官的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本公开要求于2017年5月29日提交的美国临时申请第62/512,138号的权益，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及细胞培养方法，并且涉及用于所述细胞培养方法的细胞培养基制剂。更具体地，本公开涉及用于培养原代组织或其细胞以及维持前述原代组织或其细胞，使其扩增、分化并自组织成上皮三维(3D)结构的细胞培养方法和细胞培养基。
背景
自发现成体干细胞和祖细胞以来，科学界一直致力于确定支持此类细胞离体繁殖和分化所需的分子线索。成体干细胞的衍生避免了与利用胚胎干细胞相关的伦理担忧。干细胞通常在2D培养系统下培养和分化。不幸的是，这些干细胞的2D培养物在用作体外内源性组织的代表时具有很多缺陷。例如，2D培养物在体外产生细胞极化、获取细胞功能以及概括人类生理学的能力方面受到限制。这降低了其作为制药药物筛选和治疗性开发的细胞模型的精确性。因此，需要更精确地复制体内目标组织的经改进的干细胞及其衍生细胞类型的培养系统。
基于天然存在的粘附蛋白(诸如胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白)的人工细胞外基质的设计，为3D环境中朝向培养系统的研究方向提供了支持。这种天然的和人工的细胞外基质努力模拟细胞体内小生境。
类器官是体内生物材料和过程的3D体外模型，并用作为一个新型平台来解决与胚胎发育、组织再生和组织功能、药物毒性和药物敏感性、疾病建模以及成体干细胞生物学有关的各种研究问题。上皮类器官是通过从器官的干细胞小生境中分离和扩增干细胞和祖细胞而获得的，并且包括保留了其来源器官的关键生理特征的上皮单层或多层的干/祖细胞和分化的细胞。上皮类器官依赖于紧密模拟体内环境的体外系统。一旦建立，上皮类器官使科学家能够在生理相关的背景下研究其特定的研究问题。
有兴趣开发用于衍生代表某些组织的类器官的细胞培养方法。虽然一些上皮器官含有衰老和静止的组织，但是其他上皮组织包括以在内稳态下的连续周转率和在暴露于损伤刺激时更快的周转率为特征的上皮。因此，此类组织使其自身特别适合于类器官的衍生。
肠上皮是最早建立的类器官系统之一。然而，人们也越来越关注开发用于从其他组织衍生类器官的细胞培养方法。这些组织的实例包括肝和胰腺。类似于肠上皮，肝脏具有很高的再生潜力，尤其是在急性或慢性损伤的情况下。不同的细胞类型(包括卵圆细胞、肝祖细胞和成熟肝细胞)已被归因于肝组织在内稳态和损伤期间更新和周转。定位至赫林管和胆小管的兼性干细胞也被认为是这些功能中自我更新细胞类型的来源。此类细胞的离体培养和繁殖优于原代肝细胞，所述原代肝细胞从肝脏分离出来后，其增殖能力和功能是有限的并且受到限制。
最近，表达成体干细胞标记物Lgr5或Epcam的单细胞已经从受损和未受损的小鼠肝脏组织中分离出，并被证明当在扩增培养基中培养时能够在体外产生模拟内源性体内肝上皮结构的肝类器官(Huch等人,2013,Nature,494(7436):247-50；Huch等人2015,Cell,160(1-2):299-312)。可以以许多方式来改进相关专利申请(US 20130189327)中概述的方法。第一，如US 20130189327中所述的毒素介导的实验性肝损伤可能会受到动物福利标准的挑战。第二，即使可以进入受损伤的肝组织，也可能希望避免通过人工采摘来隔离肝管的繁重且具技术挑战性的任务。第三，US 20130189327中公开的扩增培养基是复杂且昂贵的，因此可能需要滴定和/或去除包括各种生长因子、小分子、维生素和化学物质在内的多种组分。第四，由于US 20130189327需要在制备技术上具有挑战性的不确定的条件化培养基，因此使用非条件化培养基可能会带来某些益处。
因此，需要用于产生上皮类器官的简化的细胞培养基和方法。进一步需要可以支持上皮类器官的较高扩增速率的细胞培养基。最重要的是，需要这样的方法，其可用于提高来自上皮衬里器官的上皮管和上皮管碎片的产量，允许在细胞培养基中形成类器官，从而提供上述益处。还需要建立可在各种上皮器官中用来建立器官特异性类器官的培养基和方案。
发明内容
本发明人已经开发了能够从未受损伤的上皮组织中分离大量细胞的方法，所述细胞可以在最低培养条件下进行长期扩增和培养并且可适合于下游分化为成熟细胞类型。
本公开包括用于获得衍生自从上皮组织分离的一种或多种细胞的类器官的方法，其中所述方法包括在本公开的培养基中培养所述一种或多种细胞。
在一个实施方案中，用于获得高产量的可扩增细胞的方法包括将上皮组织酶促消化成上皮管和/或上皮管碎片，任选地对消化组织进行频繁的机械破坏，以及任选地随后通过细胞过滤器过滤经消化的组织以除去单个细胞(而不是在显微镜下手动拾取管)。可以在本公开的培养基中培养产生的上皮管和/或上皮管碎片。
在另一个实施方案中，用于获得高产量的可扩增细胞的方法包括将上皮组织酶促消化成单个上皮干和/或祖细胞，任选地对消化组织进行频繁的机械破坏，以及任选地随后通过细胞过滤器过滤经消化的组织以将较大的碎片从单个上皮干和/或祖细胞中分离出来。可以在本公开的培养基中培养产生的细胞。
任选地，上皮管和/或上皮管碎片和/或上皮干和/或祖细胞也可以由本公开的培养基与细胞外基质的混合物来支持。
在一实施方案中，可将上皮管和/或上皮管碎片和/或上皮干和/或祖细胞接种在基础培养基中。此类基础培养基的特征可以在于不存在EGF、R-脊椎蛋白、成纤维细胞生长因子和烟酰胺中的一种、一些或全部。
在另一个实施方案中，基础扩增培养基包含Wnt-β-连环蛋白途径的激活剂。
在另一个实施方案中，扩增培养基包含表皮生长因子(EGF)和Wnt-β-连环蛋白途径的激活剂。
在另一个实施方案中，扩增培养基包含头蛋白(Noggin)或不同的骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂、BMP下游信号传导抑制剂(诸如LDN193189)、EGF和Wnt-β-连环蛋白途径的激活剂。
因此，本公开提供了用于获得上皮类器官的方法，所述方法包括在基础培养基的存在下培养一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干或祖细胞，其中所述培养基不含FGF和/或烟酰胺。
在一个实施方案中，培养基包含Wnt激动剂(任选地为CHIR99021)和/或选自Wnt、Wnt3a、Norrin、R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4和GSK抑制剂中的一种或多种的Wnt激动剂。
在一个实施方案中，培养基包含EGF。在另一个实施方案中，培养基包含B27组分和/或N2组分和/或N-乙酰半胱氨酸。
在另一个实施方案中，上皮干或祖细胞是人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、肝上皮干细胞、胰腺上皮干细胞或肠上皮干细胞。
在另一个实施方案中，该培养基对于上皮类器官的长期培养是有效的，其中长期培养为约50次或更多次传代。
在另一个实施方案中，该方法还包括培养与细胞外基质接触的一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或上皮干或祖细胞。
在另一个实施方案中，该方法还包括培养与减少的来自细胞外基质的支持物接触的一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或上皮干或祖细胞。
在一个实施方案中，细胞外基质浓度范围为0.1％至50％(v/v)。
在另一个实施方案中，该方法还包括培养处于悬浮液形式的来自上皮管和/或上皮管碎片的上皮干或祖细胞。在一个实施方案中，细胞外基质浓度为约0.1％(v/v)或更小。
在另一个实施方案中，细胞外基质包含MatrigelTM。
在另一个实施方案中，上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干或祖细胞是从未受损伤的组织获得的。
在另一个实施方案中，该方法还包括使所述上皮类器官经受成熟和/或分化条件。
本公开还提供了肝类器官，其中所述肝类器官是根据本文公开的方法获得的。
本公开还提供了胰腺类器官，其中所述胰腺类器官是根据本文公开的方法获得的。
本公开还提供了肠类器官，其中所述肠类器官是根据本文公开的方法获得的。
本公开还提供了进行药物发现筛选；测定毒性；研究胚胎学、细胞谱系和分化途径；研究包括重组基因表达在内的基因表达；研究损伤和修复所涉及的机制；研究炎性和传染性疾病；研究细胞转化的致病机制和癌症病因的方法，其包括根据本文公开的方法获得上皮类器官。
本公开还提供了治疗受试者的肝病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文公开的肝类器官。
本公开还提供了治疗受试者的胰腺病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文公开的胰腺类器官。
本公开还提供了治疗受试者的肠病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文公开的肠类器官。
本公开还提供了用于获得上皮类器官的方法，该方法包括：
分离包含上皮组织或其一部分的器官；
机械切割和破坏经分离的器官或其部分，以产生一片或多片上皮组织；
酶促消化所述一片或多片上皮组织，以产生上皮管和/或管碎片；
通过细胞过滤器收集经消化的上皮管和/或管碎片；
涂铺经收集的上皮管和/或管碎片；和
在基础培养基的存在下培养经涂铺的上皮管和/或管碎片，其中所述培养基不含FGF和/或烟酰胺。
在一个实施方案中，培养基包含Wnt激动剂，Wnt激动剂任选地为CHIR99021，或者Wnt激动剂选自Wnt、Wnt3a、Norrin、R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4和GSK抑制剂中的一种或多种。
在一个实施方案中，培养基包含EGF。
在另一个实施方案中，培养基包含B27组分和/或N2组分和/或N-乙酰半胱氨酸。
在另一个实施方案中，该方法还包括在消化期间保持管结构的完整性。
在另一个实施方案中，该方法还包括在与所述一片或多片上皮组织接触之前，用表面活性剂处理表面或工具。
在另一个实施方案中，该方法还包括涂铺与细胞外基质接触的经收集的上皮管和/或上皮管碎片。
在另一个实施方案中，该方法还包括涂铺与减少的来自细胞外基质的支持物接触的经收集的上皮管和/或上皮管碎片。
在另一个实施方案中，细胞外基质浓度范围为0.1％至50％(v/v)。
在另一个实施方案中，该方法还包括涂铺处于悬浮液形式的经收集的上皮管和/或上皮管碎片。
在另一个实施方案中，细胞外基质浓度为约0.1％(v/v)或更小。
在另一个实施方案中，细胞外基质包含MatrigelTM。
在另一个实施方案中，该方法还包括使所述上皮类器官经受成熟和/或分化条件。
本公开还提供了用于获得上皮类器官的培养基，所述培养基包含不含FGF和/或烟酰胺的基础培养基。
在一个实施方案中，培养基还包含Wnt激动剂，任选地为CHIR99021。
在另一个实施方案中，Wnt激动剂选自Wnt、Wnt3a、Norrin、R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4和GSK抑制剂中的一种或多种。
在另一个实施方案中，培养基还包含EGF。
在另一个实施方案中，培养基还包含B27组分和/或N2组分和/或N-乙酰半胱氨酸。
在另一个实施方案中，培养基还包含细胞外基质。
在一个实施方案中，细胞外基质的浓度范围为0.1％至50％(v/v)。
在另一个实施方案中，细胞外基质的浓度为约0.1％(v/v)或更小。
在另一个实施方案中，细胞外基质包含MatrigelTM。
本公开还提供了一种培养基，其包含基础培养基、HEPES、碳酸氢钠、Rh胰岛素、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、人脱铁-转铁蛋白、皮质酮、D-(+)-半乳糖和BSA。
在一个实施方案中，培养基还包含R-脊椎蛋白-1和/或CHIR99021。
在另一个实施方案中，养基还包含EGF。
在另一个实施方案中，养基还包含BMP拮抗剂。
根据以下详述，本公开的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，虽然详述和具体实施例指示了本公开的优选实施方案,但是它们仅以说明的方式给出，因为根据此详述，在本公开的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
现在将结合附图描述本公开，在附图中：
图1示出了从鼠肝、胰腺和肠中分离的上皮组织分别向(a)肝类器官、(b)胰腺类器官和(c)肠类器官的扩增。
图2示出了展现出单个上皮、空心管腔并展现出特征性的细胞-细胞连接和形态的上皮类器官。
图3示出了上皮器官的处理。(a)用于处理包含上皮的器官以产生上皮管、上皮管碎片和/或包含在上皮管和/或上皮管碎片中的上皮干细胞的通用方案。EDC＝酶促消化混合液。(b)以分钟计的时程，显示在依序消化的样品中包含一种或多种消化酶的缓冲液的浊度逐渐降低。
图4示出了过滤上皮管和/或上皮管碎片，示出了用于滤除较大碎片的任选的第一预净化步骤。
图5示出了近汇合涂铺的上皮管和/或上皮管碎片。
图6示出了上皮类器官的逐渐退化。(a)第4天第15代的健康类器官。(b)表现出管腔变暗迹象的类器官。(c)表现出管腔变暗和塌陷迹象的类器官。
图7示出了用包含一种或多种消化酶的缓冲液进行的重复消化。(a)上皮组织可以在包含一种或多种消化酶的缓冲液的存在下进行消化。如果消化不完全，则可将上清液取出并保存，并对沉淀物再进行一轮或多轮消化。(b)在包含一种或多种消化酶的缓冲液中消化上皮组织后上皮管和/或上皮管碎片的外观的示例性照片。
图8显示了，无论涂铺的材料是肝管和/或肝管碎片、机械破坏和/或酶促消化的肝类器官，或肝管和/或肝管碎片内所包含的单个上皮干和/或祖细胞，肝类器官都可以得到维持和扩增。
图9显示了，肝类器官可以被长期继代培养和扩增。
图10示出了通过RT-PCR对肝类器官、肝管和/或管碎片以及原代小鼠肝细胞进行的基因表达谱分析。(a)Wnt靶基因表达的评估。(b)肝祖细胞基因表达的评估。(c)胆管基因表达的评估。(d)肝基因表达的评估。
图11示出了使用免疫细胞化学进行的肝类器官的蛋白质合成。
图12显示了，无论涂铺的材料是胰腺管和/或胰腺管碎片、机械破坏和/或酶促消化的胰腺类器官，或胰腺管和/或胰腺管碎片中包含的单个上皮干和/或祖细胞，胰腺类器官都可以得到维持和扩增。
图13显示了胰腺类器官可以被长期继代培养和扩增。
图14示出了通过RT-PCR对胰腺类器官、小鼠成纤维细胞和肝类器官进行的基因表达谱分析。(a)Wnt靶基因表达的评估。(b)胰腺祖基因表达的评估。(c)管基因表达的评估。(d)增殖和非管基因表达的评估。
图15示出了使用免疫细胞化学进行的胰腺类器官的蛋白质合成。
图16显示了可以从肠隐窝中维持和扩增肠类器官。
图17显示了可以从隐窝或单个细胞中扩增肠类器官。
图18示出了肠和结肠类器官的基因表达。
图19示出了小肠类器官中肠标记物的蛋白质合成。(a)Lgr5–干细胞标记物，R-脊椎蛋白受体，(b)溶菌酶–Paneth细胞，(c)Villen–肠上皮细胞，(d)嗜铬粒蛋白A–肠内分泌细胞。
图20示出了结肠类器官中结肠标记物的蛋白质合成。溶菌酶–Paneth细胞；绒毛蛋白–肠上皮细胞；嗜铬粒蛋白A–肠内分泌细胞。
具体实施方式
本公开描述了用于培养上皮类器官的培养基和方法。本公开还描述了用于形成上皮类器官的培养基和方法。根据本文公开的方法并且在存在本文公开的培养基的情况下，本公开的上皮类器官可以衍生自一种或多种上皮器官或其部分、上皮组织、上皮管、上皮管碎片和/或上皮干/祖细胞。
所公开的培养基和方法允许包括但不限于以下的上皮类器官的始发和维持：衍生自肝、胰腺、肺和肠组织的类器官。上皮类器官可以衍生自人或动物组织。
细胞培养基
在一方面，本公开提供了用于衍生和/或获得上皮类器官的培养基。上皮类器官可根据下文所述的方法衍生和/或获得。
在一个实施方案中，通过在下述培养基的存在下培养一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干细胞来获得上皮类器官。
在一个实施方案中，用于形成和/或培养上皮类器官的培养基(在此也称为“培养基”或“扩增培养基”)是基础培养基。如本文所用，术语“基础培养基”是指含有动物或人类细胞生长所需的要素，即碳源、水、盐以及氨基酸和氮源(例如牛或酵母提取物)的培养基。示例性基础培养基包括但不限于，杜尔贝科氏改良的伊戈尔培养基(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium，DMEM)、DMEM/营养混合物F-12(DMEM/F-12)、高级DMEM/F-12、RPMI 1640、伊斯科夫氏改良的杜尔贝科氏培养基(IMDM)、最低基本培养基(MEM)和/或基础培养基伊戈尔(BME)。在一个实施方案中，基础培养基包括各种比例的上述示例性基础培养基的组合。
本发明人已经证明，可以通过在缺乏FGF和/或烟酰胺的培养基中培养一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干或祖细胞来获得上皮类器官。在本公开的培养基中培养的一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干或祖细胞已被证明能产生能够经受初始扩增的类器官(图1)。此类类器官可展现出上皮细胞层、中空内腔以及典型的细胞-细胞连接和形态(图2)。
因此，在一个实施方案中，培养基不含或缺乏FGF和/或其衍生物或激动剂。如本文所用，术语“FGF”或“成纤维细胞生长因子”是指信号传导分子的成纤维细胞生长因子家族的成员。FGF可以是天然或合成的FGF。在一个实施方案中，FGF是重组FGF。例如，在人类中已知22种FGF。在另一个实施方案中，培养基不含或缺乏烟酰胺和/或其衍生物或激动剂。在另一个实施方案中，培养基不含FGF(和/或其衍生物或激动剂)和/或烟酰胺(和/或其衍生物或激动剂)。在另一个实施方案中，培养基不含或缺乏FGF和烟酰胺和/或其衍生物或激动剂。在又一个实施方案中，培养基具有不可检测量的FGF和/或烟酰胺，或不具有外源添加的FGF和/或烟酰胺。
在一个实施方案中，培养基是未补充的培养基。在另一个实施方案中，培养基是补充有氨基酸、维生素、有机/无机盐、糖和/或抗氧化剂的培养基。
在另一个实施方案中，培养基补充有L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺是一种必需氨基酸，其在液体培养基中在生理pH值下是不稳定的。用于补充细胞培养基的L-谷氨酰胺是可商购获得的。在一个实施方案中，向培养基中补充0.5mM至10mM谷氨酰胺，或1mM至5mM谷氨酰胺，或2mM至4mM谷氨酰胺。在某些实施方案中，L-谷氨酰胺是L-谷氨酰胺的稳定形式。L-谷氨酰胺的稳定形式的实例是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。
培养基还可以包含用于维持培养基的适当pH的缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂是HEPES。任选地，培养基包含至多25mM HEPES、约20mM HEPES、约15mM HEPES、约10mMHEPES、约5mM HEPES、约1mM HEPES或更少的HEPES。在另一个实施方案中，缓冲剂是碳酸氢钠。原则上，碳酸氢钠可以在细胞培养条件下以每4-10％的CO2约1.0g/L至5.0g/L提供在培养基中。在一个实施方案中，针对在5％CO2中生长的细胞向培养基中补充约1.5g/L碳酸氢钠，或针对在5％CO2中生长的细胞向培养基中补充约2g/L碳酸氢钠，或针对在5％CO2中生长的细胞向培养基中补充约3g/L碳酸氢钠，或针对在5％CO2中生长的细胞向培养基中补充约4g/L碳酸氢钠。在另一个实施方案中，向基础培养基中补充多于一种缓冲剂，例如HEPES和碳酸氢钠。在一个特定的此类实施方案中，基础培养基包含小于约25mM的HEPES和小于约5g/L的碳酸氢钠。
在另一个实施方案中，培养基包含至少一种B-27和/或N2补充剂。此类补充剂及其组分在哺乳动物细胞培养领域是众所周知的。B-27和N2可以从许多供应商处商购获得。在另一个实施方案中，培养基包含B-27和/或N2的一种或多种子组分。在一个具体的实施方案中，培养基包含以下B-27和/或N2子组分中的一种或多种：Rh胰岛素；孕酮；腐胺；亚硒酸钠；人脱铁转铁蛋白；皮质酮；D-(+)-半乳糖；和BSA。另外，如果培养基包含某些B-27和/或N2子组分，则可能需要偏离完整B-27和N2的工作浓度。例如，在一个具体的实施方案中，培养基包含较低浓度的B-27和/或N2子组分。在培养基的一个实施方案中，B-27和/或N2子组分可以在以下最终浓度范围内使用：0.01-100μg/mL Rh胰岛素；2nM至400μM孕酮；0.1-10mM腐胺；1ng/mL至100μg/mL亚硒酸钠；0.2-200μg/mL人脱铁转铁蛋白；1-500ng/mL皮质酮；30μM至30mM D-(+)-半乳糖；和0.5μg/mL至5mg/mL BSA。
在一个实施方案中，培养基包含DMEM/F-12或高级DMEM/F-12和：10-20mM HEPES，0.5至1.5g/L碳酸氢钠，55-75μg/mL Rh胰岛素，35-45nM孕酮，0.1至0.8mM腐胺，5-15ng/mL亚硒酸钠，60-100μg/mL人脱铁转铁蛋白，10-30ng/mL皮质酮，10-20μg/mL D-(+)-半乳糖和1-4mg/mL BSA。在另一个实施方案中，培养基包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：DMEM/F-12或高级DMEM/F-12和约：15mM HEPES，1.2g/L碳酸氢钠，62μg/mL Rh胰岛素，38nM孕酮，0.4mM腐胺，10ng/mL亚硒酸钠，80μg/mL人脱铁转铁蛋白，20ng/mL皮质酮，15μg/mL D-(+)-半乳糖和2.6mg/mL BSA。该培养基在本文中称为“培养基A”。
在一个实施方案中，将在培养基A存在下形成的上皮类器官培养约5代或更多代。例如，根据本文描述的方法并且在培养基A的存在下形成的肝类器官可以经受朝向类器官的初始扩增。
在其他实施方案中，用于获得上皮类器官的培养基包含如上所述的基础培养基，诸如培养基A，并且还包含Wnt-β-连环蛋白途径的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种激活剂。如本文所用，术语“Wnt-β-连环蛋白途径的激活剂”是指导致任何β-连环蛋白-和/或YAP/TAZ-诱导的转录改变的任何分子、抗体、化合物或遗传修饰剂(如，siRNA)。例如，Wnt-β-连环蛋白途径的至少一种或多种激活剂可以是能正向调节卷曲家族受体信号传导的任何分子或化合物。正向调节卷曲家族受体的信号传导的分子或化合物的非限制性实例包括Wnt蛋白或激动剂；和/或Norrin蛋白或激动剂；和/或与Lgr4/5和RNF43/ZNRF3结合的R-脊椎蛋白蛋白或R-脊椎蛋白激动剂。
在一个实施方案中，Wnt-β-连环蛋白途径的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种激活剂是或包含螯合Wnt-β-连环蛋白途径的负调节剂的分子或化合物。螯合Wnt-β-连环蛋白途径的负调节剂的分子或化合物的非限制性实例包括但不限于SB-216763、CHIR99021和CAS 853220-52-7。
在另一个实施方案中，螯合Wnt-β-连环蛋白途径的负调节剂的分子或化合物是小分子抑制剂。在特定的实施方案中，小分子抑制剂是GSK-3的抑制剂。例如，GSK-3的抑制剂可以是CHIR99021。在特定的实施方案中，CHIR99021的存在浓度范围为1μM至10μM，或范围为3uM至8uM，或范围为4um至7uM，或范围为5uM至6uM。
在一个实施方案中，Wnt蛋白是Wnt1、Wnt2、Wnt2B、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A、Wnt9B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11或Wnt16。在另一个实施方案中，Wnt蛋白是Wnt3a。Wnt3a可以是重组蛋白，或作为条件培养基添加。在另一个实施方案中，可以将Wnt3a与稳定蛋白质例如其翻译后修饰构型从而增强其信号传导能力的分子和化合物一起补充到培养基中。
在另一个实施方案中，R-脊椎蛋白蛋白或激动剂是R-脊椎蛋白-1、R-脊椎蛋白-2、R-脊椎蛋白-3或R-脊椎蛋白-4。在特定的实施方案中，R-脊椎蛋白蛋白或激动剂是重组的。培养基中的R-脊椎蛋白蛋白或激动剂可存在的浓度范围为约0.1ng/mL至1mg/mL，或约1ng/mL至1μg/mL，或约3ng/mL至150ng/mL或约5ng/mL至100ng/mL或约10ng/mL至50ng/mL。在特定的实施方案中，R-脊椎蛋白是R-脊椎蛋白-1。
在一个实施方案中，培养基包含Wnt–β-连环蛋白途径的多于一种激活剂。在另一个实施方案中，培养基包含R-脊椎蛋白1和CHIR99021。
在另一个实施方案中，Norrin蛋白或激动剂是无脊椎动物burs和pburs基因的直向同源物。在另一个实施方案中，Norrin蛋白或激动剂充当LGR4、Fzl4、LGR5和LGR6的同源配体。在另一个实施方案中，Norrin蛋白或激动剂抑制通过BMP进行的信号传导。在特定的实施方案中，Norrin蛋白或激动剂是重组的。在另一个实施方案中，培养基的Norrin蛋白或激动剂存在的浓度范围为约0.1ng/mL至1mg/mL，或约1ng/mL至1μg/mL，或约3ng/mL至150ng/mL，或约5ng/mL至100ng/mL，或约10ng/mL至50ng/mL。
在一个实施方案中，培养基包含高级DMEM/F-12或DMEM/F-12，和：10-20mM HEPES，0.5g/L至1.5g/L碳酸氢钠，0.005-0.025μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或2.5-4.5μM CHIR99021，55-75μg/mL Rh胰岛素，35-45nM孕酮，0.1mM至0.8mM腐胺，5-15ng/mL亚硒酸钠，60-100μg/mL人脱铁转铁蛋白，10-30ng/mL皮质酮，10-20μg/mL D-(+)-半乳糖和1-4mg/mL BSA。在另一个实施方案中，培养基包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：高级DMEM/F-12或DMEM/F-12和约：15mM HEPES，1.2g/L碳酸氢钠，0.015μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或3.75μMCHIR99021，62μg/mL Rh胰岛素，38nM孕酮，0.4mM腐胺，10ng/mL亚硒酸钠，80μg/mL人脱铁转铁蛋白，20ng/mL皮质酮，15μg/mL D-(+)-半乳糖和2.6mg/mL BSA。该培养基在本文中称为“培养基B”。
在一个实施方案中，将在培养基B存在下形成的上皮类器官培养约10代或更多代。例如，根据本文描述的方法并且在培养基B的存在下形成的肝类器官可以经受初始扩增，并且它们的培养物可被支持至少10代。总之，培养基B可用于上皮类器官的形成和培养。
在其他的实施方案中，用于形成和/或培养上皮类器官的培养基包含如上所述的基础培养基(例如，培养基A)。在另一个实施方案中，培养基还包含如上所述的Wnt-β-连环蛋白途径的至少一种激活剂(例如，培养基B)。在另一个实施方案中，培养基还包含表皮生长因子(EGF)家族的一个或多个成员，诸如EGF、TGF-α、两性调节蛋白、β细胞素、上皮调节蛋白、肝素结合性EGF样生长因子、epigen和神经调节蛋白-1、-2、-3和-4。
在特定的实施方案中，EGF家族成员存在的浓度范围为约0.1ng/mL至1mg/mL，或约1ng/mL至1μg/mL，或约3ng/mL至150ng/mL，或约5ng/mL至100ng/mL，或约10ng/mL至50ng/mL。
在一个实施方案中，培养基包含高级DMEM/F-12或DMEM/F-12，和：10-20mM HEPES，0.5g/L至1.5g/L碳酸氢钠，0.005-0.025μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或2.5-4.5μM CHIR99021，0.01-1.0μg/mL EGF，55-75μg/mL Rh胰岛素，35-45nM孕酮，0.1mM至0.8mM腐胺，5-15ng/mL亚硒酸钠，60-100μg/mL人脱铁转铁蛋白，10-30ng/mL皮质酮，10-20μg/mL D-(+)-半乳糖和1-4mg/mL BSA。在另一个实施方案中，培养基包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：高级DMEM/F-12或DMEM/F-12和约：15mM HEPES，1.2g/L碳酸氢钠，0.015μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或3.75μM CHIR99021，0.05μg/mL EGF，62μg/mL Rh胰岛素，38nM孕酮，0.4mM腐胺，10ng/mL亚硒酸钠，80μg/mL人脱铁转铁蛋白，20ng/mL皮质酮，15μg/mL D-(+)-半乳糖和2.6mg/mL BSA。该培养基在本文中称为“培养基C”。
在一个实施方案中，将在培养基C存在下形成的上皮类器官培养约40代或更多代。例如，根据本文描述的方法并且在培养基C的存在下形成的肝类器官可以经受初始扩增，并且它们的培养物可被支持约40代或更多代。总之，培养基C可用于上皮类器官的形成和培养以及上皮类器官的较长期的培养。
在其他的实施方案中，用于获得上皮类器官的培养基包含如上所述的基础培养基(例如，培养基A)。培养基还可以包含如上所述的Wnt-β-连环蛋白途径的至少一种或多于一种激活剂(例如，培养基B)和如上所述的EGF家族的一个或多个成员(例如，培养基C)。在另一个实施方案中，培养基还包含BMP或BMP信号传导的一种或多种抑制剂或拮抗剂。
在一个实施方案中，BMP的一种或多种抑制剂或拮抗剂是蛋白质，诸如作为非限制性实例，头蛋白、腱蛋白、卵泡抑素、硬化蛋白、CTGF/CCN2、gremlin、Cerberus、DAN、PRDC、饰胶蛋白聚糖(decorin)、α-2巨球蛋白蛋白及其衍生物。
在特定的实施方案中，用于抑制BMP的蛋白质诸如头蛋白的存在浓度范围为约0.1ng/mL至1mg/mL，或约1ng/mL至1μg/mL，或约3ng/mL至150ng/mL，或约5ng/mL至100ng/mL，或约10ng/mL至50ng/mL。
在另一个实施方案中，BMP信号传导的一种或多种抑制剂或拮抗剂是如上所述的蛋白质和/或可抑制BMP下游信号传导的小分子抑制剂，诸如作为非限制性实例，LDN193189或Dorsomorphin。
在其中BMP或BMP信号传导的一种或多种抑制剂或拮抗剂可以用来补充培养基的实施方案中，此类抑制剂存在的浓度范围可为0.001nM至10mM，任选地为0.0001μM至0.2μM。在其中培养基补充有LDN 193189的特定实施方案中，其可以0.001nM至10mM、任选0.001μM至1μM的浓度存在。
在一个实施方案中，培养基包含高级DMEM/F-12或DMEM/F-12，和：10-20mM HEPES，0.5g/L至1.5g/L碳酸氢钠，0.005-0.025μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或2.5-10μM CHIR99021，0.01-1.0μg/mL EGF，0.0.05-0.30μg/mL头蛋白，0.05-0.15μM LDN，55-75μg/mL Rh胰岛素，35-45nM孕酮，0.1mM至0.8mM腐胺，5-15ng/mL亚硒酸钠，60-100μg/mL人脱铁转铁蛋白，10-30ng/mL皮质酮，10-20μg/mL D-(+)-半乳糖和1-4mg/mL BSA。
在另一个实施方案中，培养基包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：高级DMEM/F-12或DMEM/F-12和约：15mM HEPES，1.2g/L碳酸氢钠，0.015μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或7.5μM CHIR99021，0.05μg/mL EGF，0.015μg/mL头蛋白，0.1μM LDN，62μg/mL Rh胰岛素，38nM孕酮，0.4mM腐胺，10ng/mL亚硒酸钠，80μg/mL人脱铁转铁蛋白，20ng/mL皮质酮，15μg/mL D-(+)-半乳糖和2.6mg/mL BSA。该培养基在本文中称为“培养基D”。
在一个实施方案中，在培养基D存在下形成的上皮类器官被培养约50代或更多代，并且支持约1:30的分裂比。例如，根据本文所述的方法并且在培养基D的存在下形成的肝类器官可以经受初始扩增，并且其培养物可被支持约50代或更多代。总之，培养基D可用于上皮类器官的形成和培养以及上皮类器官的较长期的培养。
在另外其他的实施方案中，本文所述的培养基(包括但不限于培养基A、培养基B、培养基C和/或培养基D)还补充有支持人或动物细胞的培养的其他化合物或分子。例如，在一个实施方案中，培养基补充有N-乙酰基-L-半胱氨酸。在特定的实施方案中，N-乙酰基-L-半胱氨酸以在750μM至1500μM范围内的浓度存在。
在进一步的实施方案中，培养基补充有肝细胞生长因子(HGF)。在特定的实施方案中，HGF存在的浓度范围为约0.1ng/mL至1mg/mL，或约1ng/mL至1μg/mL，或约5ng/mL至150ng/mL，或约10ng/mL至100ng/mL。在不同的实施方案中，培养基缺乏HGF。
在又一个进一步的实施方案中，培养基补充有胃泌素。在特定的实施方案中，胃泌素存在的浓度范围为0.001μM至0.2μM。在不同的实施方案中，培养基缺乏胃泌素。
在涂铺类器官之前，也可以将本文所述的培养基(例如但不限于培养基A、培养基B、培养基C和培养基D)与0.1-100％(v/v)MatrigelTM或其他细胞外基质或者细胞外基质组分组合(即层粘连蛋白、胶原蛋白、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白)组合在一起。
本公开的培养基，例如但不限于培养基A、培养基B、培养基C和培养基D，可以补充有适合于特定应用的浓度的前述额外补充物中的一些、可以不补充前述额外补充物中的任一种，或补充有适合于特定应用的浓度的前述额外补充物中的全部。此外，本文所述的任何补充物，如果没有特别列举小分子类似物，则可以用适合于特定应用的浓度的相应蛋白质的小分子类似物代替。
添加到本文描述的培养基中的任何前述补充物都可以被制备为2-1000x原液并储存在-20℃下。可以将冷冻原液解冻，并在适当情况下添加至所公开的培养基中。完全培养基可在4℃下储存大约1-3个月。
方法
本公开提供了用于获得上皮类器官的方法。该方法包括在存在培养基的情况下与细胞外基质接触地培养一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从中分离的上皮干细胞。在一个实施方案中，培养基是如上所述的基础培养基，不含FGF和/或烟酰胺，或包含不可检测水平的FGF和/或烟酰胺，或不含外源添加的FGF和/或烟酰胺。
动物器官、腺体和血管的表面、空腔和管都衬有上皮组织。上皮包括紧密堆积的细胞片，其一般被极化成相对的顶膜和基膜。上皮的一种功能是保护两种不同环境之间的界面。上皮组织可以含有干细胞小生境，所述干细胞小生境可以在常规组织维持期间补充分化的体细胞类型并在损伤响应期间以增加的速率补充分化的体细胞类型。
特别地，上皮的管显微解剖结构通常是器官干细胞小生境的所在地，并且包括已知具有克隆形成潜能的干/祖细胞(Sato等人,2009,Nature；Huch等人,2013Nature)。因此，上皮干/祖细胞(在本文中也称为“上皮干细胞”)是在适当的培养条件下产生上皮类器官的良好底物。
如本文所用，术语“类器官”是指器官的三维体外模型。类器官可以提供类器官衍生自的器官的真实微观解剖结构。因此，术语“上皮类器官”是指从一种或多种上皮干/祖细胞获得的类器官。一种或多种上皮干/祖细胞可以来自任何器官，包括但不限于肝、肺、胰腺或肠。从一种或多种肝上皮干/祖细胞获得的类器官在本文中也称为“肝类器官”，从一种或多种胰腺上皮干/祖细胞获得的类器官在本文中也称为“胰腺类器官”，而从一种或多种肠上皮干/祖细胞获得的类器官在本文中也称为“肠类器官”。
在一个实施方案中，从单个上皮干/祖细胞建立上皮类器官。任选地，可以通过对经消化的上皮组织进行荧光激活的细胞分选来分离单个上皮干/祖细胞。但是，如果将上皮干/祖细胞作为上皮碎片涂铺，则建立类器官的效率可提高。如本文所用，术语“上皮碎片”是指上皮组织的碎片或部分。上皮碎片可以通过上皮组织的部分酶促或机械分解而获得。不受理论的束缚，整合在上皮碎片中的上皮干/祖细胞可能仍会嵌入在其体内干细胞小生境中，并可能在类器官培养的始发过程中受益于旁分泌信号传导。
在一个实施方案中，上皮碎片是上皮管或其碎片。如本文所用，术语“上皮管”是指衬有上皮细胞并运输分泌物或其他物质的身体通道或管。如上所述，上皮管含有干/祖细胞(Sato等人,2009,Nature；Huch等人,2013Nature)。
可以使用组织解剖领域的技术人员已知的任何方法从受试者分离包含上皮的器官或其部分。例如，可以使用常规解剖从新近死亡的受试者中移除器官。或者，可通过活检从受试者获得器官的一部分。尽管使用了用于分离器官或其部分的方法，但是可以及时开始器官或其部分的后续处理。受试者可以是人类或动物，诸如啮齿动物。
分离的器官或其部分及其衍生物—诸如上皮组织、上皮管、上皮管碎片或上皮细胞—或已建立的类器官本身可能具有粘附性，并可能倾向于粘附至用于处理上皮器官或其部分的表面或工具，诸如塑料制品和/或移液器或移液器头。在所公开的方法的任何阶段，可能都需要用表面活性剂冲洗与分离的上皮或其衍生物，或建立的类器官接触的表面或工具。使用表面活性剂(诸如AggreWellTM冲洗液)有助于防止上述物质粘附到表面或工具。用表面活性剂冲洗表面或工具后，可能还需要用基础培养基(诸如高级DMEM/F-12或DMEM/F-12)洗涤经冲洗的表面或工具。
下文描述的通用方案示于图3中。用于培养原代组织或其细胞以及将前述原代组织或其细胞维持、扩增、分化和自组织为上皮3D结构的方法的另外的细节可能描述在本文的相关部分中，或者是本领域技术人员已知的。
为了从上皮组织获得碎片，可以将新鲜器官或其一部分切成较小的组织片。可以使用任何适当的工具诸如刀片或刀刃来切割新鲜的器官或其部分，而不管是否与一对镊子或类似物组合使用。可以将器官或其一部分的组织切成适用于下游处理的尺寸。例如，具有适当尺寸的组织可对应于大约1-5mm3或大约2-4mm3或大约3mm3的体积。
在将器官或其部分处理成上皮组织时，可以将器官或其部分以及上皮组织都浸入冰冷的溶液中。冰冷溶液可以是缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水，或者是标准组织培养基，诸如高级DMEM/F-12或DMEM/F-12。冰冷溶液可以是使器官或其部分以及上皮组织保持冷态并适于下游处理的任何溶液。
可以将含有上皮组织的冰冷溶液转移到容器中，在容器中上皮碎片可能会沉降到容器的底部。一旦大多数或基本上所有组织都沉降到容器的底部，就可以除去冰冷溶液。上皮组织的沉淀物可以迅速浸没在适当体积的包含一种或多种消化酶的缓冲液中。在一个实施方案中，包含消化酶的缓冲液可以是酶消化混合液。在一个具体的实施方案中，酶消化混合液可以包含分散酶和/或胶原酶。如果酶消化混合液包含胶原酶，则胶原酶可以是XI型胶原酶或IV型胶原酶，或任何其他可以消化上皮组织的胶原酶。在进一步的实施方案中，酶促消化混合液可以补充有1％胎牛血清。在另一个实施方案中，酶促消化混合液可以补充有浓度为约0.1μg/mL至100μg/mL、或约1μg/mL至约50μg/mL、或约5μg/mL至20μg/mL的DNA酶I。消化酶的浓度可以根据所用酶的一种或多种类型而变化。例如，浓度可以为0.0001至10％(w/v)。
可以将包含上皮组织和含一种或多种消化酶的缓冲液的管放置在消化酶可以起作用的条件下，持续一段足够长的时间。例如，某些消化酶在约37℃(诸如20℃至40℃)的温度下最佳工作。可能需要可维持消化酶起作用的温度的任何环境。例如，可以将包含上皮组织和含一种或多种消化酶的缓冲液的管放置在加热的水浴或加热的烤箱中，直到上皮组织被充分消化。消化可以在静态条件下或在运动中进行，如通过组织的旋转或振荡来进行。孵育时间可能取决于此类诸如但不限于上皮组织的复杂性和尺寸以及消化酶缓冲液的体积的因素。例如，一批约3mm3上皮组织可能需要5至60分钟、10至50分钟、20至40分钟或大约10、20、30、40或50分钟的初始孵育时间。
孵育上皮组织足以使其消化的时间后，可剧烈搅动包含经消化的上皮组织的溶液。可以使用任何剧烈搅动的方法，条件是不会对所消化的上皮组织产生不可挽回的损害并且不会使得所消化的上皮组织对于下游应用无效。例如，可以将包含经消化的上皮组织的溶液上下吸移足够次数。作为另一个实例，可以诸如通过涡旋剧烈混合包含经消化的上皮组织的溶液。
在对包含一种或多种消化酶的缓冲液中所含的经消化的上皮组织进行充分剧烈搅动之后，经搅动的未消化的上皮组织可能会沉降到容器的底部。可以从搅动的半消化的上皮组织中去除掉包含一种或多种消化酶的缓冲液，如下文进一步描述。
经去除的包含一种或多种消化酶的溶液还可能包含悬浮的经消化的上皮管、上皮管碎片和单细胞，它们在包含一种或多种消化酶的缓冲液中可能可见或不可见。可能需要多次重复上述消化循环，直到所有或基本上所有的上皮组织都被消化并分解以产生上皮管。因此，可以将去除的包含悬浮在其中的颗粒物质的溶液汇集并储存在冰上，同时可以对其余的上皮组织沉淀物执行进一步的消化循环，对消化的组织进行间歇性机械破坏并收集上清液。在继续收获和汇集消化酶上清液的同时，可以重复消化循环直到没有更多的未消化组织痕迹残留。
消化循环的重复可能是必要的，这取决于此类诸如但不限于以下的因素：上皮组织的复杂性和体积、包含一种或多种消化酶的缓冲液体积、一种或多种消化酶的浓度和组成、在包含一种或多种消化酶的缓冲液中孵育的持续时间、或在包含一种或多种消化酶的缓冲液中孵育的温度。在某些实施方案中，可能需要多达5个或更多个约10、20、30、40或50分钟的消化循环，以将上皮组织充分消化成上皮管和/或上皮管碎片。在另一个实施方案中，代替几个消化循环，也可以选择单个延长的消化。图3b描绘了在连续的消化循环之后，包含一种或多种消化酶和消化物质的缓冲液的上清液外观逐渐变浅。
可能需要获得在上清液中仅包含上皮管和/或上皮管碎片的溶液，或基本上仅包含上皮管和/或上皮管碎片的上清液。上皮管和/或上皮管碎片的外观对于处理上皮组织领域的技术人员是已知的。例如，上皮管和/或上皮管碎片的某些特征可以包括发白的颜料，其不易通过重力沉降在水溶液中，并因此可以在上述消化循环中被捕获并汇集在废酶促上清液中。较小的上皮管碎片通常用肉眼不可见。
为了从包含一种或多种消化酶的缓冲液中分离并富集上皮管和/或上皮管碎片，可以使该溶液通过具有足够筛目尺寸的过滤器(图4)。完整的上皮管的尺寸通常可为约70μm或更大的数量级。上皮管碎片的尺寸通常可以为37-70μm的数量级。因此，在某些实施方案中，提供具有大约30μm至80μm的筛目尺寸的过滤器以仅去除单个细胞，但是捕获所有上皮管和/或上皮管碎片可能就足够了。在另一个实施方案中，可能需要使包含一种或多种消化酶的缓冲液中的上皮管和/或上皮管碎片通过40μm过滤器。在进一步的实施方案中，可能需要通过使该溶液通过具有相对较大筛目尺寸的过滤器而从包含一种或多种消化酶的缓冲液中预先净化较大的碎片。例如，可以将具有约70-80μm的筛目尺寸的过滤器用于该目的。尽管如此，用于预净化步骤的过滤器的筛目尺寸应具有适当的尺寸，以允许所有上皮管和/或上皮管碎片通过，同时保留较大的碎片，诸如未消化的上皮组织。在该特定的实施方案中，随后可以使不含较大碎片的流过物通过第二个较小的筛目尺寸的过滤器(即约40μm)，以捕获滤留物(filtrant)中的管碎片，如上所指示。
可以从过滤器表面收集滤留物或预净化的滤留物。本公开考虑了从过滤器表面去除滤出物(filtrate)或预净化的滤出物的任何方法。在从过滤器表面去除滤留物或预净化的滤留物的示例性方法中，可以将过滤器表面颠倒或倒置，并且可以通过将颠倒或倒置的过滤器表面放置在容器上方并且用适当的溶液冲洗过滤器表面的另一侧而将过滤器表面上的内含物收集在适当的容器中。适当的溶液可以包括缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水，或另一种溶液，诸如基础培养基或细胞培养基。收集的滤留物或预净化的滤留物应沉降到容器的底部，并将溶液从包含滤留物或预净化的滤留物的沉淀物中移出。可能有必要使容器及其内含物经受足以使滤留物或预净化的滤留物沉淀的离心力，但不以其他方式损坏滤留物或预净化的滤留物，以使其对下游应用无效。在一个实施方案中，可以将滤留物和预净化的滤留物以约300x g离心约5分钟。
一旦上皮管和/或上皮管碎片沉淀物已沉降到容器底部并且已经与上清液分离开，则可以将上皮管和/或上皮管碎片或其一部分的沉淀物涂铺在培养容器中。培养容器可以是用于培养细胞的任何培养容器。例如，培养容器可以是培养皿、培养瓶或6-孔、12-孔、24-孔、48-孔或96-孔格式的培养板。涂铺在培养容器中的上皮管和/或上皮管碎片的数量/密度可能取决于所使用的培养容器的特定类型。在上皮管和/或上皮管碎片被涂铺在24孔板中的实施方案中，可能需要将一个小鼠上皮器官的上皮管和管碎片分到例如3-10个孔中。本领域技术人员将理解，每个器官收获的上皮管和/或上皮管碎片的数量可以变化，但是在某些实施方案中，上皮管和/或上皮管碎片可以以使得上皮管和/或上皮管碎片在随后的培养期间不融合的密度涂铺。图5描绘了涂铺的碎片或单个细胞的示例性近汇合密度。
在涂铺之前，可能需要将上皮管和/或上皮管碎片悬浮在细胞外基质中。如本文所用，术语“细胞外基质”是指向周围细胞提供结构和生化支持的细胞外分子的集合体。天然和合成的细胞外基质均在本公开的考虑之内。在一个实施方案中，基质包含细胞外基质蛋白。细胞外基质蛋白的实例包括但不限于层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和巢蛋白。包含细胞外基质蛋白的各种基质是可商购获得的，诸如MatrigelTM。
在一个实施方案中，可将来自一个小鼠肝脏的上皮管和/或上皮管碎片的沉淀物与约100μL细胞外基质(例如，MatrigelTM)组合在一起，并可将5-100μL或10-90μL或20-80μL或30-70μL或40-60μL的悬浮液涂铺在24孔培养板的孔中心中。在另一个实施方案中，可以将多于一种的包含上皮管和上皮管碎片(如上那样制备)的细胞外基质液滴(dome)涂铺在单个孔中。技术人员可以理解，可以将任何数量的由任何体积的细胞外基质组成的细胞外基质液滴涂铺在培养容器中，条件是每个细胞外基质液滴是不同的或基本上不同的。
在另一个实施方案中，可以使上皮管和/或上皮碎片与如本文公开的培养基和细胞外基质以约1:2比率混合的混合物接触。但是，细胞外基质(例如MatrigelTM)的最终浓度可在10-99.9％(v/v)之间变化。然后可以如上所述的那样将得到的悬浮液涂铺。
在又一个实施方案中，可以如本文所公开的那样将上皮管和/或上皮管碎片添加到培养基中，其中培养基包含0.1-50％(v/v)细胞外基质，任选地1-20％(v/v)或5-10％(v/v)细胞外基质，诸如MatrigelTM。特别地，将上皮管和/或上皮管碎片与包含0.1-50％(v/v)细胞外基质，任选地1-20％(v/v)或5-10％(v/v)细胞外基质的培养基的混合物涂铺在适当的培养容器中可以允许在存在减少的细胞外基质支持物的情况下(即在细胞外基质支持物的悬浮液或类似悬浮液的条件下)培养类器官。减少的细胞外基质支持物为类器官提供了其中培养基与细胞外基质以适当的比率组合在一起的半固体环境。在此类实施方案中，培养容器可以是低粘附力培养容器，诸如低粘附力的6孔板、12孔板、24孔板或其他。在一个实施方案中，可首先将培养基冷添加到每个冷孔中，然后添加并混合解冻的细胞外基质。作为下一步，可以将从器官中分离出的含干细胞的材料(例如上皮管和/或上皮管碎片)添加到孔中。可以将含有经涂铺的上皮管和/或上皮管碎片与包含0.1-50％(v/v)细胞外基质的培养基的混合物的6孔板以约70rpm放置在例如1.9cm直径的摇床上，并在37℃下培养。可以将含有经涂铺的上皮管和/或上皮管碎片与包含0.1-50％(v/v)细胞外基质的培养基的混合物的12孔板以约80rpm放置在例如1.9cm直径的摇床上。一般而言，与在静态细胞外基质液滴中培养的类器官相比，在存在减少的细胞外基质支持物的情况下培养的类器官支持更快的扩增速率并支持类器官在更短的时间内产生。
在又一个实施方案中，可以如本文所公开的那样将上皮管和/或上皮管碎片添加到培养基中，其中培养基包含约0.1％(v/v)或更少的细胞外基质，诸如MatrigelTM。特别地，将上皮管和/或上皮管碎片与包含约0.1％(v/v)或更少的细胞外基质的培养基的混合物涂铺在适当的培养容器中可以允许类器官的悬浮培养。
在使用≥10％(v/v)细胞外基质的实施方案中，一旦包含上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干/祖细胞的一种或多种细胞外基质液滴已经聚合，则可添加足够量的培养基到孔中。用于培养包含上皮管、上皮管碎片或从中分离或其中新生的上皮干/祖细胞的液滴的培养基可以是如本文所述的任何培养基，例如培养基A、培养基B、培养基C或培养基D。可以向培养容器中添加足够体积的培养基，以覆盖液滴并确保上皮管、上皮管碎片和/或上皮干/祖细胞得到充分营养。
类器官碎片的接种效率一般可以接近50％。尽管低密度的类器官碎片可以在本公开的培养基中有效地扩增，但是接种200个碎片一般导致在MatrigelTM液滴中掺入100个碎片。此类碎片密度可能非常适合在例如30μL MatrigelTM液滴提供的体积内扩增5-7天。但是，具有不同体积的MatrigelTM液滴也可能适用于特定应用。作为非限制性实例，可以根据需要使用对应于10μL至1mL体积的MatrigelTM液滴。
在需要从单个上皮干和/或祖细胞形成和扩增上皮类器官的实施方案中，可以将包含上皮管和/或上皮管碎片的上述经过滤级分暴露于单细胞解离酶，诸如AccutaseTM、胰蛋白酶、温和的细胞解离试剂(Gentle Cell Dissociation Reagent)或TrypLETM中。所述酶可以在基础培养基中，以与暴露于所述酶中的材料量相适应的浓度和持续时间来递送。单细胞解离酶也可以补充有DNA酶I。消化完成后，可通过添加含FBS的基础培养基和/或稀释掉酶来消除酶促活性。可以使单细胞消化的悬浮液另外通过单细胞过滤器，以去除尚未完全解离为单个单元的任何细胞。在一个实施方案中，上皮碎片可以从一个小鼠器官中收获，并作为滤留物捕获在40μm过滤器上，进行沉淀，并在37℃下用约1-10mL TrypLETM和约0.1μg/mL至100μg/mL、或约1μg/mL至50μg/mL、或约5μg/mL至20μg/mL DNA酶I消化约3-45分钟。可以通过添加补充有10％FBS的DMEM/F-12来停止酶促消化反应。然后可以使细胞悬浮液通过40μm过滤器过滤，进行沉淀并作为细胞-MatrigelTM混合物涂铺。
可以将以这种方式制备的单个上皮干/祖细胞涂铺在>10％(v/v)细胞外基质的液滴中；涂铺在具有减少的0.1-50％(v/v)细胞外基质的支持物的悬浮液中；或者涂铺在具有约0.1％(v/v)或更少的如上所述的细胞外基质的悬浮液中。例如，可以将5,000-50,000个细胞接种到由100％(v/v)细胞外基质组成的液滴中或接种到含有10％(v/v)细胞外基质的悬浮液孔中。
可以每天监测类器官从上皮管和/或上皮管碎片或从单个上皮干/祖细胞的扩增，以追踪它们的生长。一般而言，可能会在一周内并且在类器官的内腔变暗并塌陷之前对类器官进行继代培养(图6)，从而防止类器官形成黑色的密集细胞簇。在早期传代期间，类器官的内腔可能在大约第4-6天变暗并塌陷。在后面的传代期间，类器官的内腔可能在大约第6-7天变暗并塌陷。已建立的类器官可以机械地继代培养成类器官碎片，或酶促地继代培养成类器官碎片或单个细胞。如果对建立的类器官进行机械地继代培养并作为类器官碎片接种，则类器官产量可能更高。
对于液滴培养物的机械分离，可以使用光学显微镜验证细胞外基质液滴的完整性。如果包含上皮类器官的细胞外基质液滴基本上是完整的，则可以诸如通过抽吸从培养容器中去除培养基。使用p1000移液器，可以将大约1000μL的冷培养基，诸如基础培养基(即高级DMEM/F-12)强行近似地引导到每个细胞外基质液滴的中心。可将一定体积的冷培养基在培养容器中剧烈上下吸移约5、10、15、20或30次，以将细胞外基质液滴和类器官破坏成碎片，但要避免将类器官完全破坏为单个细胞。可将所得悬浮液的一部分转移至空的培养容器中以进行计数。
在示例性的实施方案中，可以将三个10μL体积的细胞悬浮液作为单个体积液滴涂铺到6孔板的空孔中。使用光学显微镜，可以对每个10μL体积液滴中的类器官团块的数目进行计数，并确定细胞悬浮液中类器官团块的数目。一旦确定了细胞悬浮液中类器官团块的密度，就可以将包含约200个团块的体积添加到装有1mL如本文所公开的培养基(诸如基础培养基)的管中，并可以在300x g下离心5分钟。在不干扰沉淀物的情况下，可以小心抽吸上清液，并将沉淀物重新悬浮在至少10μL至约100μL的细胞外基质中。可以将包含类器官团块的细胞外基质的悬浮液涂铺在预热的24孔板的一个孔中并使其聚合。一旦包含类器官团块的细胞外基质液滴聚合，就可以将约750μL如本文所公开的预热培养基添加到每个液滴(即孔)。为了不干扰细胞外基质液滴，可能优选靠在孔的侧面添加预热的培养基。对于完全确立的类器官培养物，可通过以适合且恒定的分裂比(例如1:30)继代培养类器官而省去孔中类器官碎片密度的量化。
对于酶促分裂，可以使用光学显微镜验证细胞外基质液滴的完整性。如果包含上皮类器官的细胞外基质液滴基本上是完整的，则可以诸如通过抽吸从培养容器中去除培养基。使用p1000移液器，可以将大约500μL的冷培养基，诸如基础培养基(即高级DMEM/F-12)强行近似地引导到每个细胞外基质液滴的中心，并使其静置约1个分钟。使用p1000移液器尖端，可将细胞外基质液滴带至溶液中(诸如通过向上和向下吸移和/或压紧)，并将所述体积转移到新管。可以用额外体积的培养基冲洗其中细胞外基质液滴破裂的孔，并将其与新管的内含物汇集在一起。
新管中的内含物可以剧烈上下吸移约5、10、15或20次。可以将剧烈吸移的溶液以大约300x g离心5分钟，然后小心地去除并丢弃上清液。随后可以将沉淀物与适合的酶促溶液接触，以用于将类器官或其部分基本上解离为单个细胞，并在一种或多种消化酶可以起作用的条件下放置足够长的一段时间。例如，某些消化酶在约37℃(诸如20℃至40℃)的温度下最佳工作。可能需要可维持消化酶功能的温度的任何环境。此外，消化可以在静态条件下或在运动中进行，如通过组织的旋转或振荡来进行。例如，可以将管放置在加热水浴或加热炉中，直到类器官或其部分充分解离。在一个实施方案中，将在单细胞解离缓冲液中的类器官或其部分在37℃水浴中孵育约10或20分钟可足以将类器官或其部分解离为单个细胞。
一旦类器官或其部分已经充分暴露于酶促溶液中，就可以将该溶液与约3mL培养基(诸如如本文所述的基础培养基)组合在一起，并可以使用血细胞计数器测定其中的细胞数目。可以将所需数量的活细胞转移到含有培养基，诸如本文所述的基础培养基的管中，并以大约300x g离心5分钟。可以将包含单个细胞的沉淀物重悬于任何适当体积的细胞外基质中，并以单个或多个液滴的形式涂铺在预热的24孔板的一个孔中并使其聚合。一旦包含解离的单个细胞的细胞外基质液滴聚合，就可以向每个液滴(即孔)中添加约750μL如本文所公开的预热培养基。可优选靠在孔的侧面添加预热的培养基，以免干扰MatrigelTM液滴。
对于悬浮培养物的机械分裂，可以使用细胞刮刀来剥离类器官和MatrigelTM，并转移至新容器。在一个实施方案中，容器可以是15mL Falcon管。使用p1000移液器，可将约1000μL的冷培养基，诸如基础培养基(即高级DMEM/F-12)强行引导到含有沉降的类器官的管底部。可将一定体积的冷培养基在培养容器中剧烈上下吸移约5、10、15、20或30次，以将细胞外基质液滴和类器官破坏成碎片，但要避免将类器官完全破坏为单个细胞。可将所得悬浮液的一部分转移至空的培养容器中以进行计数。然后可以将所需数量的类器官碎片转移到已经含有冷培养基和细胞外基质的新培养板中。然后可以将培养基放回到37℃的轨道振荡器中。
已在本公开的培养基中并根据本文所述的方法涂铺的经继代培养的类器官可以大约每2-7天或在适当的时候经受培养基更换，以避免类器内腔塌陷。但是，如果类器官已嵌入到细胞外基质中，则有可能使塌陷的类器官的内腔恢复到膨胀状态。值得注意的是，即使已经培养了一个月或更长时间而没有进行继代培养或培养基改变的坍塌的类器官，也可以使用所公开的培养基来复活。
在某些实施方案中，可能需要在培养的不同阶段使用不同的培养基。例如，可能需要在一种类型的培养基中，例如在培养基A、培养基B、培养基C或培养基D中的一种中开始培养。经过一定次数的传代或传代一定时间后，可能需要使用不同类型的培养基，例如，培养基A、培养基B、培养基C或培养基D中的不同培养基。在另一个实施方案中，在不同的培养阶段期间，可能需要在一种类型的培养基(诸如培养基A、培养基B、培养基C或培养基D)和不同类型的培养基(诸如培养基A、培养基B、培养基C或培养基D中的不同培养基)之间循环。
特别地，关于肝类器官，肝类器官的始发可能取决于Lgr5+细胞和/或代表干/祖细胞的其他阳性标记物表达。然而，上皮干细胞标记物Lgr5在内稳态条件下一般没有活性。相反，上皮干细胞标记物Lgr5通常可以在组织经受阻塞性、机械性或毒性损伤后被激活。因此，上皮类器官通常是从遭受损伤的肝组织获得的。在本公开的一个实施方案中，从未受损伤的组织获得上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干细胞。如本文所用，术语“未受损伤的组织”是指尚未经受阻塞性、机械性或毒性损伤的组织。
在本公开的一个实施方案中，上皮类器官衍生自一种或多种新鲜分离的上皮管、上皮管碎片和/或上皮干/祖细胞或包含上皮干/祖细胞的上皮碎片，其来自从尚未经受在先损伤的约1年龄或更小的雄性或雌性小鼠获得的小鼠组织。
在一个实施方案中，通过本文所述方法获得的上皮类器官进一步经受成熟和/或分化条件。如本文所用，术语“成熟和/或分化条件”是指促进上皮类器官成熟并分化为成熟细胞类型的培养条件。各种成熟和分化条件是本领域已知的，并且可以根据目标成熟细胞类型来具体选择。在一个实施方案中，通过本文所述方法获得的肝和/或胰腺类器官进一步经受成熟和/或分化条件。
类器官及其用途
本公开提供了通过本文描述的方法获得的上皮类器官。在一个实施方案中，类器官是肝、胰腺或肠类器官。
通过本文描述的方法获得的类器官任选地是人类器官。本文还考虑了非人类动物类器官。
使用本文描述的方法形成的上皮类器官可表达该类器官从其衍生的上皮组织特有的一种或多种基因或蛋白质标记物。例如，肝类器官可以表达一种或多种以下基因：Lgr5、Axin2、Hnf4a、Epcam、ZO1、Krt19和Sox9。作为另一个实例，胰腺类器官可以表达一种或多种以下基因：Lgr5、Sox9、Pdx1、Krt7、Muc1和Car2。作为另一个实例，肠类器官可以表达一种或多种以下基因：Lgr5、Lyz、Vil1、ChgA和Muc2。
使用本文所述方法和培养基形成的肝类器官的自我更新可能主要由Axin2而非Lgr5驱动，为肝内稳态提供了生理相关的培养系统(Wang等人，2015Nature)。
本公开还提供了药物组合物，其包含本文所述的类器官和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，术语“药学上可接受的载体”意在包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。以引用的方式并入本文的本领域中的标准参考文本Remington’s Pharmaceutical Sciences的最新版本中描述了适合的载体。此类载体或稀释剂的任选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液以及5％人血清白蛋白。
将药物组合物配制为与其预定施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，如静脉内、真皮内、皮下、经口(如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和经直肠施用。
上皮类器官的各种用途是本领域已知的。
特别地，本公开的类器官和/或药物组合物可用于治疗受试者的病症、疾患或疾病或可用于受试者的再生医疗。
在一个实施方案中，本公开的类器官用在用于治疗病症、疾患或疾病或用于再生医疗的方法中，该方法包括向有需要的受试者施用类器官。
在另一个实施方案中，提供了治疗受试者的肝病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其中该方法包括向受试者施用通过本文所述的方法获得的肝类器官。在一个实施方案中，肝病症、疾患或疾病是阿拉格氏综合征、威尔逊病、1型糖原贮积病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、纤维化、肝硬化、新生儿/病毒(A、B、C)/自身免疫/中毒性肝炎、脂肪肝病、酪氨酸血症、结节病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、肝肿瘤、肝囊性病、胆道闭锁、半乳糖血症、原发性胆管性胆管炎、卟啉症、雷伊氏综合征、血色素沉着症、吉尔伯特氏综合征、肝脏脂肪变性和胆囊结石。
在另一个实施方案中，提供了治疗受试者的胰腺病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其中该方法包括向受试者施用通过本文所述的方法获得的胰腺类器官。在一个实施方案中，胰腺病症、疾患或疾病是急性/慢性/遗传性胰腺炎、胰腺肿瘤、糖尿病、囊性纤维化、外分泌性胰腺功能不全、先天性畸形(胰腺分裂、环状胰腺)、佐林格-埃里森综合征和胰腺囊肿/假性囊肿。
在另一个实施方案中，提供了治疗受试者的肠病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其中该方法包括向受试者施用通过本文所述的方法获得的肠类器官。在一个实施方案中，肠病症、疾患或疾病是囊性纤维化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、结肠直肠癌、结肠息肉、肠易激综合征、乳糜泻、粪便失禁、乳糖不耐症、憩室症/憩室炎、胃酸反流、腹泻、消化性溃疡、短肠综合征、柯林氏溃疡、盲袢综合征、米洛病(Milroy Disease)、惠普耳氏病、类癌综合征、希什斯普隆氏病(Hirschsrung's Disease)和肛门癌。
在另一个实施方案中，有效量的本文公开的类器官用于制备用于治疗病症、疾患或疾病或用于再生医疗的药物。本公开的类器官的有效量一般是指达到治疗目的所需的量。
如本文所用，术语“受试者”包括动物界的所有成员，在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，受试者是人类。
如本文所用，“治疗病症、疾患或疾病”包括但不限于逆转、减轻或抑制病症、疾患或疾病的进展或者与病症、疾患或疾病相关的症状或病状。
本文所述的类器官也可用于以下的方法中：进行药物发现筛选；测定毒性；研究胚胎学、细胞谱系和分化途径；研究包括重组基因表达在内的基因表达；研究损伤和修复所涉及的机制；研究炎性和传染性疾病；和研究细胞转化的致病机制和癌症病因。
以下非限制性实施例说明了本公开：
实施例1–消化器官或其部分
将雄性和雌性小鼠(即C57BL/6)的包含上皮的整个器官解剖，并切成约1-3mm3组织片。将约1-3mm3上皮组织片浸入约25mL冰冷的DMEM/F-12中。使用25mL血清移液管将一定体积的含有上皮碎片的冰冷DMEM/F-12转移到50mL Falcon管中。使上皮组织片在重力的作用下沉降约2分钟，并丢弃上清液。随后使上皮组织片沉淀物与5mL的包含分散酶(0.0125％(w/v))和胶原酶(0.0125％(w/v))的酶消化混合液接触。将上皮组织片在酶消化混合液中在37℃水浴中孵育20分钟。20分钟孵育后，使用10mL血清移液管将溶液剧烈吸移约7次，并且使经搅动的消化的上皮组织片在重力的作用下沉降约1分钟。丢弃第一上清液。
如上所述的那样进行重复的消化循环以便从上皮组织片产生上皮管和/或上皮管碎片(图7a)。早在第二个消化循环后，上清液中可能存在上皮管和/或上皮管碎片(图7b)。一旦上清液中存在上皮管和/或上皮管碎片，则将上清液移出并放置在适当的管中。汇集来自其余上皮组织片的连续消化循环的上清液。
5-7个每个20分钟的消化循环将基本上所有的上皮组织片消化成上皮管和/或上皮管碎片。
实施例2–消化器官或其部分后的产物
对放置一旁的汇集的上清液进行过滤(如图4所示)，以便从单个细胞(诸如终末分化的细胞和碎屑)中分离出上皮管和/或上皮管碎片。使汇集的上清液通过40μm过滤器，并丢弃流过物。通过小心地颠倒过滤器表面并将其置于50mL Falcon管的顶部上方来收集过滤器表面上的滤留物。使约10mL冰冷的高级DMEM/F-12从过滤器表面的底表面上通过，从而将滤留物从过滤器表面冲走并收集在管内。重复洗涤直到将所有或基本上所有的滤留物从过滤器上洗掉为止。可以通过刮擦过滤器帮助收集。将管以300x g离心5分钟以沉淀上皮管和/或上皮管碎片，并弃去上清液。任选地，在离心之前，将10mL的包含上皮管和/或上皮管碎片的滤留物悬浮液等分到3-10个管中。
实施例3–对消化器官或其部分后的产物进行预先净化
对放置一旁的汇集的上清液进行过滤(如图4所示)，以便从单个细胞(诸如终末分化的细胞和碎屑)中分离出上皮管和/或上皮管碎片。首先使汇集的上清液通过70μm过滤器，并保留流过物。丢弃包含诸如未消化的组织和管的碎屑的滤留物(或可替代地，可将它暴露于进一步消化和/或包埋在细胞外基质中，如实施例4或5中所概述的)。然后，如实施例2中所述的那样，使通过70μm过滤器的汇集的上清液部分通过40μm过滤器。通过小心地颠倒过滤器表面并将其置于50mL Falcon管的顶部上方来收集过滤器表面上的滤留物。使约10mL冰冷的高级DMEM/F-12从过滤器表面的底表面上通过，从而将滤留物从过滤器表面冲走并收集在管内。重复洗涤直到将所有或基本上所有的滤留物从过滤器上洗掉为止。通过刮擦过滤器帮助收集。将管以300x g离心5分钟以沉淀上皮管和/或上皮管碎片，并弃去上清液。任选地，在离心之前，将10mL的包含上皮管和/或上皮管碎片的滤出物悬浮液等量等分到3-10个管中。
实施例4–将上皮管和/或上皮管碎片涂铺在MatrigelTM液滴中
将沉淀的上皮管和/或上皮管碎片重悬在适当体积的解冻的MatrigelTM中。如果从一个小鼠器官获得的上皮管和/或上皮管碎片未被等量等分至3-10个管中，则使用大约30μL至300μL的MatrigelTM重悬所述上皮管和/或上皮管碎片。否则，使用约10μL至30μL体积的MatrigelTM重悬已被等分至3-10个管中的每一个中的上皮管和/或上皮管碎片。
也可以稀释MatrigelTM和上皮材料的混合物，以使其含有高达90％(v/v)细胞培养基，而不会损害随后涂铺的MatrigelTM液滴的稳定性。
将上皮管和/或管碎片的悬浮液以25-60μL小滴沉积在预热的24孔板的底部表面上，并使其在37℃下聚合10分钟而形成液滴。24孔板中央的8个孔最适合沉积MatrigelTM小滴，因为它们的倾斜度最小。
在分配上皮管和/或上皮管碎片的悬浮液时，将移液器尖端逐渐向上移动，以避免上皮管和/或上皮管碎片粘附到移液器尖端的外部，并使上皮管和/或上皮管碎片均匀地分布在液滴内。
实施例5–将上皮管和/或上皮管碎片以含有减少的细胞外基质支持物的悬浮液形式涂铺
使上皮管和/或上皮管碎片以含有减少的来自细胞外基质的支持物的悬浮液形式生长。将如实施例2或实施例3中所概述的那样获得的上皮管和/或上皮管碎片与培养基混合。该混合物在与减少的细胞外基质(如浓度为0.1％至50％(v/v)的MatrigelTM)组合时被冷却至4℃。使用低粘附力板(如12孔板)，将悬浮在细胞培养基(和降低的浓度的MatrigelTM)中的上皮材料添加到每个孔中，并在70-80rpm旋转下保持在37℃。
实施例6–在培养基中培养上皮管和/或上皮碎片
在不干扰聚合的MatrigelTM液滴的情况下，靠着含有一个或多个MatrigelTM液滴的孔的侧壁添加约750μL培养基。任何不包含MatrigelTM液滴的孔都接受750μL无菌液体诸如PBS、培养基等。
每个MatrigelTM液滴的图像在第0天拍摄，之后定期拍摄(图1)。通过从每个孔中小心去除培养基来每2-7天更换培养基，持续多达一周。向每个孔中添加750μL预热(即20-37℃)的培养基。
实施例7–在培养基A中培养上皮管或上皮碎片
利用实施例6中所述的方法使用包含以下的培养基形成和扩增肝类器官：DMEM/F-12和约：15mM HEPES、1.2g/L碳酸氢钠、0.5mM L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺、61.5μg/mL Rh胰岛素、0.012μg/mL孕酮、64μg/mL腐胺、0.0104μg/mL亚硒酸钠、80μg/mL人脱铁转铁蛋白、0.02μg/mL皮质酮、15μg/mL D-(+)-半乳糖和2600μg/mL BSA。
此类培养基支持肝类器官形成和扩增约5代。
实施例8–在培养基B中培养上皮管或上皮碎片
利用实施例6中所述的方法，使用其中添加有0.016μg/mL R-脊椎蛋白-1和/或3.75μM CHIR 99021的实施例7的培养基A形成和扩增上皮类器官。
在存在R-脊椎蛋白-1和CHIR 99021的情况下，上皮类器官的形成和扩增能被支持约20代或更多代。在存在仅R-脊椎蛋白-1或CHIR99021中的一种的情况下，上皮类器官的形成和扩增能被支持约10代或更多代。
实施例9–在培养基C中培养上皮管或上皮碎片
利用实施例6中所述的方法，使用其中添加有0.05μg/mL EGF的实施例8的培养基形成和扩增上皮类器官。
此类培养基支持上皮类器官的形成和扩增约40代或更多代。
实施例10–在培养基D中培养上皮管或上皮碎片
利用实施例6中所述的方法，使用其中添加有0.016μg/mL头蛋白和0.1μM LDN193189的实施例9的培养基C形成和扩增上皮类器官。
此类培养基支持上皮类器官的形成和扩增约50代或更多代。
实施例11–肝类器官的形成及其标记物的表达
当将肝脏根据实施例1和2，以及任选地根据实施例3处理，根据实施例4或5涂铺，并在实施例7-10中所述的培养基的存在下培养时，肝类器官形成并扩增。在一个实例中，根据实施例1、4和7处理肝脏。
不管涂铺肝管、肝管碎片、单个上皮干和/或祖细胞，还是机械破坏或酶促消化的肝类器官，均会发生肝类器官的形成和扩增(图8)。一旦形成，肝类器官就可以通过传代得到长期维持和扩增(图9)。
形成并扩增的肝类器官表现出肝胆基因表达，如图10所示。进一步地，根据本文公开的方法和培养基形成并扩增的肝类器官合成肝和管蛋白(图11)。
实施例12–胰腺类器官的形成及其标记物的表达
当将胰腺根据实施例1和2以及任选地根据实施例3处理、根据实施例4或5涂铺，并在实施例7-10中所述的培养基的存在下培养时，胰腺类器官形成并扩增。在一个实例中，根据实施例1、4和7处理胰腺。
不管涂铺胰腺管、胰腺管碎片、单个上皮干和/或祖细胞，还是机械破坏或酶促消化的胰腺类器官，均会发生胰腺类器官的形成和扩增(图12)。一旦形成，胰腺类器官就可以通过传代得到长期维持和扩增(图13)。
形成和扩增的胰腺类器官表现出胰腺管基因的表达，如图14所示。进一步地，根据本文公开的方法和培养基形成和扩增的胰腺类器官合成胰腺管蛋白(图15)。
实施例13–小肠和结肠类器官的形成及其标记物的表达
当将小肠或结肠根据实施例1和2以及任选地根据实施例3处理、根据实施例4或5涂铺并在实施例7或8中所述的培养基的存在下培养时，小肠或结肠类器官形成并扩增(图16)。在一个实例中，根据实施例1、4和7处理肠。
不管涂铺肠隐窝、肠隐窝碎片、单个上皮干和/或祖细胞，还是机械破坏或酶促消化的肠类器官，均会发生肠类器官的形成和扩增(图17)。
如图18-20所示，形成并扩增的肠和结肠类器官表达肠和结肠标记物。
实施例14–使用机械破坏对类器官进行继代培养
每天使用光学显微镜监测根据实施例4或5涂铺的类器官的扩增，以追踪它们的生长，并且特别是类器官的内腔没有变暗和塌陷。
如果在MatrigelTM液滴中培养，则抽吸覆盖在MatrigelTM液滴上的培养基。将大约1000μL的高级DMEM/F-12强制引导到每个MatrigelTM液滴的中心。剧烈上下吸移该体积的高级DMEM/F-12 15次。
如果以悬浮液(即不含细胞外基质或含有减少的细胞外基质支持物的悬浮液)形式培养，则将类器官悬浮液剧烈上下吸移15次。
将三个10μL体积的细胞悬浮液以单个体积液滴的形式涂铺到6孔板的空孔中进行计数。将一定体积的含有大约200个团块的细胞悬浮液转移到含有1mL高级DMEM/F-12的管，并以300x g离心5分钟。在不干扰沉淀物的情况下，小心抽吸上清液。根据实施例4或5将沉淀物重悬并涂铺。如实施例6所述的那样并且具体地使用具有如实施例7至10中任一项所述的配方的培养基，向含有MatrigelTM液滴的每个孔中添加培养基。
实施例15–使用酶促消化对类器官进行继代培养
每天使用光学显微镜监测根据实施例4或5涂铺的类器官的扩增，以追踪它们的生长，并且特别是类器官的内腔没有变暗和塌陷。
如果在MatrigelTM液滴内培养，则抽吸覆盖在MatrigelTM液滴上的培养基。将约500μL冷的高级DMEM/F-12强制添加至每个MatrigelTM液滴的中央，并使其静置约1分钟。使用p1000移液器尖端，可通过向上和向下吸移和/或压紧而将MatrigelTM液滴带至溶液中，并将所述体积转移到新管中。用500μL高级DMEM/F-12冲洗孔，并将该体积与新管内含物汇集。
如果以悬浮液(即不含或含有减少的细胞外基质支持物的悬浮液)的形式培养，则将类器官悬浮液转移至新管中。用500μL高级DMEM/F-12冲洗孔，并将该体积与新管内含物汇集。
将新管中的内含物剧烈吸移15次，并以300x g离心5分钟，小心去除并弃去上清液。使沉淀物与3mL单细胞解离缓冲液接触，并在37℃水浴中孵育10-20分钟。孵育期后，将3mL高级DMEM/F-12添加到管中，并使用血细胞计数器测定悬浮液中的细胞数目。将含有约1000-8000个活细胞的体积转移至15mL Falcon管中，并以300x g离心5分钟。根据实施例4或5将沉淀物重悬并涂铺。如实施例6所述的那样并且具体地使用具有如实施例7至10中任一项所述的配方的培养基，向含有MatrigelTM液滴的每个孔中添加培养基。
实施例16–冷冻保存和回收上皮类器官
将上皮类器官在液氮中冷冻保存至少一年。如实施例14或15中概述的那样收获类器官，并将其重悬于含有多达10％DMSO的冷冻保存培养基中。冷冻保存培养基的非DMSO级分包含实施例7-10中所述的任一种培养基，商业基础培养基或PBS。使用受控冷冻方法，将含有上皮类器官或类器官碎片的冷冻保存培养基小瓶首先冷冻至-80℃，然后转移至液氮进行长期储存。为了解冻，将小瓶从液氮中移出并置于37℃水浴中。将内含物逐滴添加至实施例7-10的培养基中，并以300x g离心5分钟。用BSA补充回收培养基增加了回收的类器官或类器官碎片的数量。如实施例4或5所述的那样，去除上清液并将沉淀的上皮材料重悬并涂铺。
表1用于形成和扩增上皮类器官的不含FGF和/或烟酰胺的培养基的选定组分。
“x”表示相应因子的存在。

Claims (53)

1.一种用于获得上皮类器官的方法，所述方法包括在基础培养基的存在下培养一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干或祖细胞，其中所述培养基不含FGF和/或烟酰胺。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含Wnt激动剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述Wnt激动剂是CHIR99021。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述Wnt激动剂选自Wnt、Wnt3a、Norrin、R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4和GSK抑制剂中的一种或多种。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述培养基包含EGF。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述培养基包含B27组分和/或N2组分和/或N-乙酰半胱氨酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述上皮或祖干细胞是人细胞。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述上皮干或祖细胞是小鼠细胞。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述上皮干或祖细胞是大鼠细胞。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述上皮干或祖细胞是肝上皮干细胞。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述上皮干或祖细胞是胰腺上皮干细胞。
12.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述上皮干或祖细胞是肠上皮干细胞。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述培养基对于所述上皮类器官的长期培养是有效的，其中所述长期培养为约50次或更多次传代。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其还包括培养与细胞外基质接触的一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或上皮干或祖细胞。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其还包括培养与减少的来自细胞外基质的支持物接触的一种或多种上皮管、上皮管碎片和/或上皮干或祖细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞外基质浓度范围为0.1％至50％(v/v)。
17.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其还包括培养处于悬浮液形式的来自所述上皮管和/或上皮管碎片的所述上皮干或祖细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述细胞外基质浓度为约0.1％(v/v)或更小。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含MatrigelTM。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述上皮管、上皮管碎片和/或从其分离的上皮干或祖细胞是从未受损伤的组织获得的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述上皮类器官经受成熟和/或分化条件。
22.一种肝类器官，其中所述肝类器官是根据权利要求10所述的方法获得的。
23.一种胰腺类器官，其中所述胰腺类器官是根据权利要求11所述的方法获得的。
24.一种肠类器官，其中所述肠类器官是根据权利要求12所述的方法获得的。
25.一种进行药物发现筛选；测定毒性；研究胚胎学、细胞谱系和分化途径；研究包括重组基因表达在内的基因表达；研究损伤和修复所涉及的机制；研究炎性和传染性疾病；研究细胞转化的致病机制和癌症病因的方法，所述方法包括获得根据权利要求1-21中任一项所述的上皮类器官。
26.一种治疗受试者的肝脏病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求22所述的肝类器官。
27.一种治疗受试者的胰腺病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求23所述的胰腺类器官。
28.一种治疗受试者的肠病症、疾患或疾病或用于受试者的再生医疗的方法，其包括向有需要的受试者施用根据权利要求24所述的肠类器官。
29.一种用于获得上皮类器官的方法，所述方法包括：
分离包含上皮组织的器官或其一部分；
机械切割和破坏经分离的器官或其部分，以产生一片或多片上皮组织；
酶促消化所述一片或多片上皮组织，以产生上皮管和/或管碎片；
通过细胞过滤器收集经消化的上皮管和/或管碎片；
涂铺经收集的上皮管和/或管碎片；和
在基础培养基的存在下培养经涂铺的上皮管和/或管碎片，其中所述培养基不含FGF和/或烟酰胺。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述培养基包含Wnt激动剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述Wnt激动剂是CHIR99021。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述Wnt激动剂选自Wnt、Wnt3a、Norrin、R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4和GSK抑制剂中的一种或多种。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述培养基包含EGF。
34.如权利要求29-33中任一项所述的方法，其中所述培养基包含B27组分、N2组分和/或N-乙酰半胱氨酸。
35.如权利要求29-34中任一项所述的方法，所述方法还包括在消化期间维持管结构的完整性。
36.如权利要求29-35中任一项所述的方法，所述方法还包括在与所述一片或多片上皮组织接触之前，用表面活性剂处理表面或工具。
37.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其还包括涂铺与细胞外基质接触的经收集的上皮管和/或上皮管碎片。
38.如权利要求29-37中任一项所述的方法，其还包括涂铺与减少的来自细胞外基质的支持物接触的经收集的上皮管和/或上皮管碎片。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述细胞外基质浓度范围为0.1％至50％(v/v)。
40.如权利要求29-36中任一项所述的方法，其还包括涂铺处于悬浮液形式的经收集的上皮管和/或上皮管碎片。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞外基质浓度为约0.1％(v/v)或更小。
42.如权利要求29-41中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含MatrigelTM。
43.如权利要求29-42中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述上皮类器官经受成熟和/或分化条件。
44.一种用于获得上皮类器官的培养基，所述培养基包含不含FGF和/或烟酰胺的基础培养基。
45.如权利要求44所述的培养基，其还包含Wnt激动剂。
46.如权利要求45所述的培养基，其中所述Wnt激动剂是CHIR99021。
47.如权利要求45所述的培养基，其中所述Wnt激动剂选自Wnt、Wnt3a、Norrin、R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4和GSK抑制剂中的一种或多种。
48.如权利要求44-47中任一项所述的培养基，其还包含EGF。
49.如权利要求44-48中任一项所述的培养基，其还包含B27组分和/或N2组分和/或N-乙酰半胱氨酸。
50.如权利要求44-49中任一项所述的培养基，其还包含细胞外基质。
51.如权利要求50所述的培养基，其中所述细胞外基质的浓度范围为0.1％至50％(v/v)。
52.如权利要求50所述的培养基，其中所述细胞外基质的浓度为约0.1％(v/v)或更小。
53.如权利要求50至52中任一项所述的培养基，其中所述细胞外基质包含MatrigelTM。
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