CN114502721A - 用于制备类器官组合物的改进方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了通过使肠内胚层单层聚集和培养所得肠内胚层聚集体的过程产生的类器官或其组合物。这些聚集的类器官的实例包含但不限于聚集的肝脏类器官、聚集的胃类器官、聚集的肠类器官和聚集的结肠类器官。

Description

用于制备类器官组合物的改进方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年8月13日提交的美国临时专利申请第62/885,903号的优先权的权益，所述美国临时专利申请特此通过引用整体明确并入本文。

技术领域

本公开的各方面总体上涉及类器官组合物和其制备方法，涉及前体细胞的聚集，例如在形成板中。

背景技术

人多能干细胞(hPSC；包含胚胎干细胞和诱导多能干细胞两者)表示用于生成人类3维胃肠组织(例如人肠类器官；HIO)的可再生资源，所述胃肠组织被组织成离散的上皮和间充质层。例如，在HIO中，上皮含有所有已知的肠上皮细胞类型，并且表现出功能性肠组织的若干种性质，包含吸收、肠激素合成和粘液分泌。在移植到实验动物模型之后，HIO经历了显著的生长和成熟，类似于含有粘膜、粘膜下层和固有肌层的出生后人类肠道。上皮细胞布置成隐窝-绒毛结构，在隐窝和成熟的上皮细胞中含有成体干细胞活性/祖区，具有如营养吸收和刷状缘酶活性等功能。因此，源自多能干细胞的类器官表示用于研究肠发育和疾病的生理相关且强大的工具，并且也为药物开发提供了新的平台。此外，鉴于诱导多能干细胞可以源自任何个体，包含那些患有肠疾病的个体，因此有可能产生疾病/患者特异性类器官，如用于个性化医疗应用的HIO。持续需要更接近体内组织的改进的类器官组合物以及制备更稳健、可扩展、更快和成本效益更高的类器官组合物的方法。

发明内容

本文公开了产生一个或多个聚集的类器官的方法。在一些实施例中，所述方法包括：将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体；将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；将所述肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是粘附的，并且所述肠球状体被分离并悬浮在生长培养基中。在一些实施例中，所述定形内胚层已经从多能干细胞分化而来。在一些实施例中，所述定形内胚层已经从胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而来。在一些实施例中，所述定形内胚层是人定形内胚层。在一些实施例中，所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。在一些实施例中，所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是用Accutase、Accumax、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express或TrypLE Select或其任何组合酶促解离的。在一些实施例中，所述聚集步骤包括在悬滴中聚集所述单细胞悬浮液，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。在一些实施例中，所述形成板是Aggrewell板。在一些实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括约250、约500、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500、约7000、约7500、约8000、约8500、约9000、约9500或约10000个肠内胚层细胞，或在由上述细胞数量中的任何两个所限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞。在一些实施例中，所述培养步骤包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与胞外基质或其模拟物或衍生物接触。在一些实施例中，所述胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶(Matrigel)。

在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述肠内胚层单层是前肠内胚层单层并且所述肠球状体是前肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述前肠内胚层单层和所述前肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或者所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白(Noggin)，或其任何组合。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肝脏类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF2，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP4，或两者。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的胃类器官。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的胃类器官。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的胃类器官是聚集的胃窦类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的胃窦类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。

在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述肠内胚层单层是后肠内胚层单层并且所述肠球状体是后肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述后肠内胚层单层和所述后肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，或所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或两者。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肠类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白，或两者。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的结肠类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的结肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP2，或其任何组合。

在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体包括至少1、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个肠内胚层聚集体，或在由上述肠内胚层聚集体数量中的任何两个限定的数量内的任何数量的肠内胚层聚集体。在一些实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括：在距所述一个或多个肠内胚层聚集体的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径；或者在距所述一个或多个肠内胚层聚集体的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积；或两者。

在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述方法进一步包括将所述一个或多个聚集的类器官移植到接受者受试者。在一些实施例中，所述接受者受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述接受者受试者是人。

本文还公开了通过本文所公开的方法中的任何一种方法产生的所述一个或多个聚集的类器官中的任何一种。本文还公开了多个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，所述多个肠内胚层聚集体包括至少1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个肠内胚层聚集体，或在由上述肠内胚层聚集体数量中的任何两个限定的数量内的任何数量的肠内胚层聚集体；其中所述多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括：在距所述多个肠内胚层聚集体的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径；或者在距所述多个肠内胚层聚集体的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的体积，或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积；或两者。在一些实施例中，所述多个肠内胚层聚集体源自同一受试者。本文还公开了一种形成板。在一些实施例中，所述形成板包括多个微孔和根据权利要求38或39所述的多个肠内胚层聚集体，其中所述多个微孔中的每个微孔包括所述多个肠内胚层聚集体的单个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，对于本文所公开的多个肠内胚层聚集体中的任一个或本文所公开的形成板中的任一个，根据本文所公开的方法中的任一种方法产生多个肠内胚层聚集体。

本文提供的本公开的实施例通过以下编号的替代方案描述：

1.一种用于制备类器官组合物的方法，所述方法包括：

解离后肠内胚层(HGE)以形成HGE衍生的单细胞群体；

将所述HGE衍生的单细胞群体聚集在形成板中；

在所述形成板中培养所述HGE衍生的单细胞群体以形成聚集体；以及

将所述聚集体与EGF、BMP信号传导通路激活剂和Wnt信号传导通路激活剂一起培养，直到形成肠类器官。

2.根据替代方案1所述的方法，其中所述后肠内胚层(HGE)是从定形内胚层(DE)中获得的。

3.根据替代方案2所述的方法，其中所述DE与FGF信号传导通路激活剂和Wnt信号传导通路激活剂一起培养以形成所述后肠内胚层(HGE)。

4.根据前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述类器官是从前体细胞中获得的。

5.根据前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述前体细胞是诱导多能干细胞。

6.根据替代方案1所述的方法，其中所述HGE衍生的单细胞群体包括后肠内胚层细胞。

7.根据前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述聚集体包括约1000个后肠内胚层细胞、或约2000个后肠内胚层细胞、或约3000个后肠内胚层细胞、或约4000个后肠内胚层细胞或约5000个后肠内胚层细胞。

8.根据前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述聚集体与抗粘附冲洗溶液接触。

9.根据前述替代方案中任一项所述的方法，其包括将所述聚集体与3D结构，优选地基质胶(基底膜基质)接触，并且进一步培养所述聚集体直至形成类器官。

10.根据前述替代方案中任一项所述的方法，其中所述形成板选自微孔培养板、V底微孔培养板、悬滴培养板或能够物理聚集细胞群体的板。

附图说明

除了本文所描述的特征之外，另外的特征和变化将通过以下对附图和示例性实施例的描述而变得显而易见。应当理解，这些附图描绘实施方式并且不旨在限制范围。

图1描绘了hPSC到HIO分化和发育的时间线的实施例。

图2A-C描绘了用于单细胞解离和聚集的肠内胚层单层的制剂的实施例。

图3A-B描绘了形成板和细胞聚集以形成聚集体的实施例。

图4-6描绘了形成板或其组件的实施例。

图7A描绘了用于人肠类器官(HIO)产生的现有球状体产生方案的示意图的实施例。

图7B描绘了使用现有方案的实施例的球状体产生的实验间可变性的实施例。

图7C描绘了使用现有方案的实施例的球状体产生的系间可变性的实施例。

图7D描绘了对应于图7C的示例性图像的实施例。

图8描绘了通过现有方案的实施例产生的均匀CDX2+后肠内胚层的实施例。

图9A描绘了用于HIO产生的基于聚集的球状体产生方案的示意图的实施例。

图9B描绘了多个hPSC系成功、均匀聚集的实施例。

图9C描绘了图像的实施例，所述图像描绘了通过聚集方法产生的均匀球状体的显著增加的产量。

图9D描绘了根据HGE聚集每孔球状体产量显著增加的实施例，

图9E描绘了分离的自发球状体和聚集的球状体中的上皮细胞和间充质细胞的不同组织的实施例。

图10A描绘了图像的实施例，所述图像示出了分离的自发球状体和聚集的球状体在基质胶中生长之后在形态上无法区分。

图10B描绘了图像的实施例，所述图像示出了在包埋基质胶中之后3天，分离的自发球状体和聚集的球状体中的上皮细胞和间充质细胞的组织无法区分。

图11A描绘了图像的实施例，所述图像示出了aggHIO的生长和形态与自发HIO无法区分。

图11B描绘了图像的实施实施例，所述图像示出了AggHIO包括CDX2+肠上皮和界面蛋白1+间充质。

图11C描绘了图像的实施例，所述图像示出了自发分离的HIO和AggHIO两者都被图案化到小肠近端。

图12A描绘了示出了AggHIO在体内移植后经历稳健生长和成熟的图像的实施例。

图12B描绘了对成熟小肠标志物的免疫荧光分析的实施例。

图13A描绘了用于通过聚集产生人胃窦状器官(aHGO)的示意图的实施例。

图13B描绘了示出了源自聚集的前肠内胚层的aHGO在形态学上与自发性aHGO无法区分的图像的实施例。

图13C描绘了示出了胃上皮标志物的表达在自发aHGO与聚集的aHGO之间无法区分的图像的实施例。

图14A描绘了用于通过聚集产生人结肠类器官(HCO)的示意图的实施例。

图14B描绘了示出了源自聚集的后肠内胚层球状体的HCO与源自自发球状体的HCO在形态上无法区分的图像的实施例。

图14C描绘了示出了结肠上皮标志物SATB2的表达在源自自发或聚集的后肠内胚层的HCO之间无法区分的图像的实施例。

图15描绘了用于通过聚集产生人肝脏类器官(HLO)的示意图的实施例。

图16A描绘了示出了从PSC中分化的定形内胚层培养物中的中胚层(如通过T表达检测的)和定形内胚层(如通过FOXA2表达检测的)的群体密度的图像的实施例。

图16B描绘了对图16A的培养物中的中胚层和定形内胚层群体百分比的定量的实施例。

图16C描绘了示出了从PSC衍生的定形内胚层中分化的前肠和后肠内胚层单层培养物中的间充质(如通过FOXF1表达检测的)和肠内胚层(如通过FOXA2表达检测的)的群体密度的图像的实施例。

图16D描绘了对图16C的培养物中的间充质和内胚层群体百分比的定量的实施例。

图16E描绘了通过比较第3天定形内胚层和第7天后肠内胚层培养物而对增殖中胚层和增殖内胚层的定量的实施例。

具体实施方式

目前的类器官产生技术依赖于hPSC向器官组织谱系的逐步体外分化。例如，对于胃肠类器官，干细胞首先分化为定形内胚层(DE)细胞，并且然后分化为前肠内胚层(FGE)或后肠内胚层(HGE)中间体(培养约7天)，在此期间自发形态发生并导致类似于胚胎肠管的3D球状体的形成和分离。这些球状体被包埋在胞外基质或其模拟物或衍生物(例如基质胶)中，并且在促进生长和器官分化的培养基中培养。在这些条件下(总共培养第35天)约28天之后，可以采集人类器官，并且将其用于如研究器官功能和形态、药物筛选或植入动物模型以进一步生长和成熟等目的。

然而，当前的类器官产生方法存在一些限制。具体地，不同hPSC系之间的自发球状体产生和分离的效率存在显著可变性。即使已知具有产生自发球状体的强大能力的系，自发球状体的产生和分离也存在显著的实验到实验可变性。在特定的类器官产生实验中，自发球状体产生和从孔到孔的分离效率也存在显著可变性。自发球状体形成通常发生在多个连接球状体的大“链”中。从系到系产生的自发球状体的大小可能会显著变化。因此，对自发形态发生的依赖与低效和不一致的球状体产生相关联。此外，这些方法不太适合生物制药制造应用所需的增加的可扩展性。

本文提供了制备类器官或其组合物的改进方法，所述方法克服了现有方法的一个或多个限制。在一些实施例中，所公开的方法消除或降低与系到系、实验到实验和孔到孔的可变性相关联的自发球状体产生的低效率，并进一步提供用于改进可扩展性的方法。

本文公开的方法利用了hPSC衍生的细胞在聚集时自组织的能力。对于胃肠类器官，使用标准方法和仍然附着于细胞培养板的细胞，hPSC被分化为DE，并且然后FGE或HGE，包含在没有检测到自发形态发生和球状体形成和分离的情况下，并且然后进行解离成单细胞。在一些实施例中，然后将单FGE或HGE细胞聚集在形成板中，例如过夜。在一些实施例中，形成板是Aggrewell板(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies))。在一些实施例中，然后采集聚集体并且包埋在基质胶中用于生长和分化为类器官(例如肠类器官)。对通过改进的聚集方法获得的HIO的分析证明，与在同一实验中通过自发球状体产生获得的HIO相比，没有显著差异。此外，源自聚集的HGE的FIFO保留了在植入到小鼠模型后成长为成熟人肠组织的能力。在一些实施例中，用于分化本领域已知的其它类型的类器官的过程可以与本文所描述的方法一起使用。

本文公开了聚集的类器官和其组合物以及制备其的方法，所述方法涉及聚集肠内胚层单层(与肠球状体相反)的单细胞悬浮液并且随后培养聚集体以形成聚集体类器官。本文公开的方法产生的类器官比本领域已知的传统方法具有更高的可靠性和再现性，并且对扩大类器官制造的可行性具有影响。这些聚集的类器官可以用于如药物筛选或个性化医疗等目的，并且适用于例如自体或同种异体移植到受试者，如人或其它哺乳动物，或异种移植到免疫功能低下的动物中。在一些实施例中，聚集体类器官是肝脏、胃、胃窦、胃底、肠或结肠类器官。在一些实施例中，聚集体类器官源自从患者分离的细胞。产生类器官的方法可以见于美国专利9,719,068和10,174,289以及PCT公开WO 2016/061464、WO 2017/192997、WO2018/106628、WO 2018/200481、WO 2018/085615、WO 2018/085622、WO 2018/085623、WO2018/226267、WO 2020/023245，所述文献中的每个文献特此通过引用整体明确地并入。

在以下详细描述中，参考了附图，所述附图形成详细描述的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号通常标识类似部件。在详细描述、附图以及权利要求中所描述的说明性实施例并不旨在是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其它实施例，并且可做出其它改变。容易理解的是，如本文总体描述的和在附图中示出的，本公开的各方面可以按各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，在本文中明确设想了所有这些配置。

除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员根据本公开阅读时通常理解的相同含义。出于本公开的目的，以下术语解释如下。

在本文中使用的冠词“一个和一种(a/an)”指代所述冠词的语法宾语的一个或多于一个(例如，至少一个)。举例来说，“要素”意指一个/种要素或多于一个/种要素。

“约”意指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达10％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或要素或步骤或要素组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素组。“由……组成”意指包含并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素是需要或必需的，并可能不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本公开中指定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列元件是必需的或强制性的，但是其它元件是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列元件的活动或作用。

为了本公开的清楚起见，就本文在参考附图中使用如“上”、“下”、“纵向”、“侧向”、“横向”、“向内”、“向外”等空间术语而言，应当理解，此类术语仅用于示例性描述的目的，而不旨在是限制性的或绝对的。在这方面，应当理解，如本文公开的那些仪器等仪器可以以多朝取向和位置使用，不限于本文所示出和描述的那些。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”或“患者”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指人或非人哺乳动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物，或鸟，例如鸡，以及任何其它脊椎动物或无脊椎动物。术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，所述哺乳动物具体包含但不限于灵长类动物，包含猿猴(黑猩猩、猿、猴子)和人、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿类动物、大鼠、小鼠、豚鼠等。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指导致可观察的效果的所述组合物或化合物的量。本发明所公开的主题的活性组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定受试者和/或应用的期望反应的量的活性组合物或化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包含但不限于组合物的活性、调配物、施用途径、与其它药物或治疗的组合、所治疗病状的严重程度，以及所治疗受试者的身体状况和之前病史。在一些实施例中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下将剂量逐步增加至最小有效量。本文设想了对有效剂量的确定和调整，以及对何时和如何进行这种调整的评估。

如本文所用，术语“功能(function)”和“功能性(functional)”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指生物功能、酶促功能或治疗功能。

如本文所用，术语“抑制”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且可以指生物活性的降低或防止。减少可以是为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的百分比，或在由上述值中的任何两个限定的范围内的量。如本文所用，术语“延迟”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指将生物事件减慢、延缓或推迟到比以其它方式所预期的更晚的时间。延迟可以是一定百分比的延迟，所述百分比为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或在由上述值中的任何两个限定的范围内的量。术语抑制和延迟不一定指示100％抑制或延迟。可以实现部分抑制或延迟。

如本文所用，术语“分离的”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指物质和/或实体已经(1)与最初产生时(无论是在自然界和/或在实验环境中)与其相关联的至少一些组分分离，和/或(2)通过人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与等于、大约、至少、至少约、不超过、或不超过约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％的最初与其相关的其它组分分离(或包含和/或跨越上述值的范围)。在一些实施例中，分离的试剂为、大约为、至少为、至少大约为、不超过、或不超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％纯(或包含和/或跨越上述值的范围)。如本文所用，“分离的”物质可以是“纯的”(例如，基本上不含其它组分)。如本文所用，术语“分离的细胞”可以指不包含在多细胞生物体或组织中的细胞。

如本文所用，“体内”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在活生物体(通常是动物、哺乳动物，包含人和植物)而不是组织提取物或死生物体内部执行方法。

如本文所用，“离体”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在自然条件几乎没有改变的情况下在活生物体外部执行方法。

如本文所用，“体外”被赋予如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在生物条件外部例如在培养皿或试管中执行方法。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、自然出现在细胞中的那些、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段，以及通过任何连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以由是天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)的单体或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映异构形式)或两者的组合构成。经修饰的核苷酸可以在糖部分中和/或在嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包含例如用卤素、烷基、胺和叠氮基置换一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以被空间和电子类似的结构(如氮杂糖和碳环糖类似物)置换。碱基部分中的修饰的实例包含烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶或其它众所周知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包含硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)。术语“核酸分子”还包含所谓的“肽核酸”，其包括附着到聚酰胺主链的天然存在或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。“寡核苷酸”可以与核酸互换使用并且可以指双链或单链DNA或RNA。一种或多种核酸可以包含在可以用于在各种生物系统中扩增和/或表达一种或多种核酸的核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、逆转录病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、养粒(fosmid)、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)，或人类人工染色体(HAC))中。通常，载体或构建体还将含有包含但不限于以下的元件：启动子、增强子、终止子、诱导子、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多克隆位点、限制酶位点、表位、报告基因、选择标志物、抗生素选择标志物、靶向序列、肽纯化标签或附属基因，或其任何组合。

核酸或核酸分子可以包括一个或多个编码不同的肽、多肽或蛋白质的序列。这一个或多个序列可以相邻地接合在相同的核酸或核酸分子中，或在它们之间具有额外的核酸，例如接头、重复序列或限制酶位点，或长度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基，或在由上述长度中的任何两个限定的范围内的任何长度的任何其它序列。如本文所用，术语核酸上的“下游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于先前序列的3'端之后。如本文所用，术语核酸上的“上游”具有如根据本说明书所理解的其普通而惯用的含义，并且是指在核酸为双链时，序列在包含编码序列的链(有义链)上处于后续序列的5'端之前。如本文所用，术语“分组”在核酸上具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指两个或两个以上直接在附近发生或在其之间具有额外核酸(例如接头、重复序列或限制酶位点)的序列，或任何其它序列，其长度是、约是、至少是、至少约是、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长的序列，或在上述长度中的任何两个长度所限定的范围内的任何长度，但通常其间不具有可编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列。

本文所描述的核酸包括核碱基。主要的、规范的、天然的或未修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其它核碱基包含但不限于嘌呤、嘧啶、经修饰的核碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨烯丙基碱基、染料标记的碱基、荧光碱基或生物素标记的碱基。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”具有其根据本说明书理解的普通而惯用的含义，并且是指包含通过肽键连接的氨基酸的大分子。肽、多肽和蛋白质的许多功能是本领域已知的，并且包含但不限于酶、结构、转运、防御、激素或信号传导。尽管化学合成也是可用的，但是肽、多肽和蛋白质通常(但不总是)由核糖体复合物通过使用核酸模板以生物学方式产生。通过使用核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质突变，例如一种以上肽、多肽或蛋白质的取代、缺失、截短、添加、复制或融合。多于一种肽、多肽或蛋白质的这些融合可以在同一分子中相邻结合，或者在其间具有额外的氨基酸(例如接头、重复序列、表位或标签)，或者任何其它序列，其长度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300个碱基长，或在上述长度中的任何两个长度所限定的范围内的任何长度。如本文所用，多肽上的术语“下游”具有其根据本说明书理解的普通且惯用的含义，并且是指在先前序列的C端之后的序列。如本文所用，多肽上的术语“上游”具有其根据本说明书理解的普通且惯用的含义，并且是指在后续序列的N端之前的序列。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”具有其根据本说明书理解的普通且惯用的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期丰度的实际丰度。例如，物质、化合物或材料的纯度可以为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包含其间的所有小数。纯度可能会受到多余杂质的影响，包含但不限于核酸、DNA、RNA、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、载体、媒介物或污染物，或其任何组合。在一些实施例中，所述物质、化合物或材料基本上不含宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、质粒DNA、污染性病毒、蛋白酶体、宿主细胞培养物组分、过程相关组分、支原体、热原、细菌内毒素和外来物质。可以使用包含但不限于以下的技术来测量纯度：电泳、SDS-PAGE、毛细管电泳、PCR、rtPCR、qPCR、色谱法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、光谱法、UV-可见光谱法、红外光谱法、质谱法、核磁共振、重量法或滴定，或其任何组合。

如本文所用，任何给定物质、化合物或材料的术语“产量”具有其根据说明书理解的普通且惯用的含义，并且指物质、化合物或材料相对于预期总量的实际总量。例如，物质、化合物或材料的产量占预期总量的比例为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包含其间的所有小数。在生产的任何步骤中，产率可能会受到以下因素的影响：反应或过程的效率、多余的副反应、降解、输入物质、化合物或材料的质量或所需物质、化合物或材料的损失。

如本文所用，术语“w/w％”或“wt/wt％”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且指以成分或试剂的重量占组合物总重量的百分比乘以100表示。如本文所用，术语“v/v％”或“vol/vol％”具有其根据说明书理解的平常且普通的含义，并且是指以化合物、物质、成分或药剂的液体体积占组合物总液体体积的百分比乘以100表示。

干细胞

如本文所用，术语“全能干细胞”(也称为万能干细胞)具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是可以分化成胚胎细胞和胚胎外细胞类型的干细胞。此类细胞可以构建一个完整的、有活力的有机体。这些细胞由卵和精细胞融合产生。受精卵头几次分裂产生的细胞也是全能的。

如本文所用，术语“胚胎干细胞(ESC)”，通常也缩写为ES细胞，具有根据说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且是指为多能的并且源自胚泡(即早期胚胎)的内细胞团的细胞。出于本公开的目的，术语“ESC”有时也广泛用于涵盖胚胎生殖细胞。

如本文所用，术语“多能干细胞(PSC)”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且涵盖可以分化成身体的几乎所有细胞类型的任何细胞，即衍生自三个胚层(生发上皮)中的任何一个的细胞，包含内胚层(内部胃壁、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)和外胚层(表皮组织和神经系统)。PSC可以是植入前胚泡的内细胞团细胞的后代，或者通过强迫某些基因的表达诱导非多能细胞，如成体体细胞而获得。多能干细胞可以衍生自任何合适的来源。多能干细胞来源的实例包含哺乳动物来源，包含人、啮齿动物、猪和牛。

如本文所用，术语“诱导多能干细胞(iPSC)”，通常也缩写为iPS细胞，具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指通过诱导某些基因的“强迫”表达而人工衍生自通常非多能细胞如成体体细胞的多能干细胞类型。hiPSC是指人iPSC。在本领域已知的一些方法中，通过将某些干细胞相关基因转染到非多能细胞如成体成纤维细胞中来获得iPSC。转染可以通过使用病毒如逆转录病毒或慢病毒进行病毒转导来实现。经转染的基因可以包含主转录调节因子Oct-3/4(POU5F1)和Sox2，但是其它基因也可以增强诱导效率。3周到4周之后，少量转染细胞开始在形态学和生物化学上类似于多能干细胞，并且通常通过形态学选择、倍增时间或通过报告基因和抗生素选择分离。如本文所用，iPSC包含小鼠中的第一代iPSC、第二代iPSC，以及人类诱导多能干细胞。在一些方法中，逆转录病毒系统用于使用四种关键基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将人成纤维细胞转化为多能干细胞。在其它方法中，慢病毒系统用于用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28转化体细胞。在iPSC中诱导表达的基因包含但不限于Oct-3/4(POU5F1)；Sox基因家族的某些成员(例如，Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)；Klf家族的某些成员(例如，K1fl、K1f2、K1f4和K1f5)、Myc家族的某些成员(例如，C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog、LIN28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcll、β-连环蛋白、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Fth117、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2或E-钙粘着蛋白，或其任何组合。

如本文所用，术语“前体细胞”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且涵盖可以用于本文所描述的方法中的任何细胞，通过所述细胞，一种或多种前体细胞获得自我更新或分化成一种或多种特化细胞类型的能力。在一些实施例中，前体细胞是多能的或具有变成多能的能力。在一些实施例中，对前体细胞进行外部因子(例如生长因子)的处理以获得多能性。在一些实施例中，前体细胞可以是全能(或全能)干细胞；多能干细胞(诱导或非诱导)；多能干细胞；寡能干细胞和单能干细胞。在一些实施例中，前体细胞可以来自胚胎、婴儿、儿童或成人。在一些实施例中，前体细胞可以是经受处理的体细胞，使得通过遗传操作或蛋白质/肽处理赋予多能性。前体细胞包含胚胎干细胞(ESC)、胚胎癌细胞(EC)和外胚层干细胞(EpiSC)。

在一些实施例中，一个步骤是获得多能干细胞或可以诱导成为多能干细胞。在一些实施例中，多能干细胞衍生自胚胎干细胞，所述胚胎干细胞又衍生自早期哺乳动物胚胎的全能细胞，并且能够在体外无限制的未分化增殖。胚胎干细胞是衍生自早期胚胎的胚泡内细胞团的多能干细胞。从胚细胞衍生胚胎干细胞的方法是本领域熟知的。人胚胎干细胞H9(H9-hESC)用于本申请中描述的示例性实施例中，但是本领域技术人员将理解，本文描述的方法和系统适用于任何干细胞。

可以用于根据本公开的实施例中的另外的干细胞包含但不限于由旧金山加利福尼亚大学(UCSF)的人类胚胎干细胞研究中心的国立干细胞库(NSCB)主办的数据库；Wi细胞研究所的WISC细胞库；威斯康星大学干细胞与再生医学中心(UW-SCRMC)；Novoceli公司(加利福尼亚州圣地亚哥)；Cellartis AB(瑞典哥德堡)；胚胎干细胞国际公司(新加坡)；以色列理工学院以色列理工学院(以色列海法)；以及由普林斯顿大学和宾夕法尼亚大学主办的干细胞数据库提供或描述的那些干细胞。可以用于根据本公开的实施例中的示例性胚胎干细胞包含但不限于SA01(SA001)；SA02(SA002)；ES01(HES-1)；ES02(HES-2)；ES03(HES-3)；ES04(HES-4)；ES05(HES-5)；ES06(HES-6)；BG01(BGN-01)；BG02(BGN-02)；BG03(BGN-03)；TE03(13)；TE04(14)；TE06(16)；UCO1(HSF1)；UC06(HSF6)；WA01(H1)；WA07(H7)；WA09(H9)；WA13(H13)；WA14(H14)。示例性人多能细胞系包含但不限于TkDA3-4、1231A3、317-D6、317-A4、CDH1、5-T-3、3-34-1、NAFLD27、NAFLD77、NAFLD150、WD90、WD91、WD92、L20012、C213、1383D6、FF或317-12细胞。

在发育生物学中，细胞分化是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。如本文所用，术语“定向分化”描述了一种过程，通过所述过程，较不特化的细胞变成特定的特化靶细胞类型。特化靶细胞类型的特殊性可以通过可以用于定义或改变初始细胞命运的任何适用方法来确定。示例性方法包含但不限于遗传操作、化学处理、蛋白质处理和核酸处理。

在一些实施例中，腺病毒可以用于运输必需的四种基因，从而产生与胚胎干细胞基本上相同的iPSC。由于腺病毒不将其任何自身基因与靶向宿主组合，因此消除了产生肿瘤的危险。在一些实施例中，使用基于非病毒的技术生成iPSC。在一些实施例中，重编程可以通过质粒完成，而根本没有任何病毒转染系统，尽管效率非常低。在其它实施例中，蛋白质的直接递送用于生成iPSC，因此消除了对病毒或遗传修饰的需要。在一些实施例中，使用类似的方法生成小鼠iPSC是可能的：用通过聚精氨酸锚导入细胞的某些蛋白来重复处理细胞足以诱导多能性。在一些实施例中，还可以通过在低氧条件下用FGF2处理体细胞来增加多能性诱导基因的表达。

如本文所用，术语“饲养细胞”具有根据说明书所理解的其简单和普通含义，并且是指支持多能干细胞生长的细胞，如通过将生长因子分泌到培养基中或展示在细胞表面上来支持多能干细胞生长的细胞。饲养细胞通常是贴壁细胞并且可能生长停滞。例如，饲养细胞因辐照(例如γ射线)、丝裂霉素-C处理、电脉冲或温和的化学固定(例如用甲醛或戊二醛)而生长停滞。然而，饲养细胞不一定必须生长停滞。饲养细胞可以用于如分泌生长因子、在细胞表面展示生长因子、使培养基解毒或合成胞外基质蛋白等目的。在一些实施例中，饲养细胞与所支持的靶干细胞是同种异体的或异种异体的，这可能对下游应用有影响。在一些实施例中，饲养细胞是小鼠细胞。在一些实施例中，饲养细胞是人细胞。在一些实施例中，饲养细胞是小鼠成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠STO细胞、小鼠3T3细胞、小鼠SNL76/7细胞、人成纤维细胞、人包皮成纤维细胞、人真皮成纤维细胞、人脂肪间充质细胞、人骨髓间充质细胞细胞、人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞、人脐带间充质细胞、人胎儿肌细胞、人胎儿成纤维细胞或人成体输卵管上皮细胞。在一些实施例中，使用由饲养细胞制备的条件培养基代替饲养细胞共培养物或与饲养细胞共培养物组合。在一些实施例中，在靶干细胞增殖期间不使用饲养细胞。

如本文所用，术语“胞外基质”具有其根据本说明书的普通且惯用的含义，并且是指增强细胞附着和/或生长的任何生物或合成化合物、物质或组合物。本领域已知的任何胞外基质以及其任何模拟物或衍生物均可以用于本文公开的方法。胞外基质或其模拟物或衍生物的一些实例包含但不限于基于细胞的饲养层、聚合物、蛋白质、多肽、核酸、糖类、脂质、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、胶原蛋白、明胶、纤维连接蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、生腱蛋白、硫酸乙酰肝素、内联蛋白、巢蛋白、骨桥蛋白、基底膜、基质胶、水凝胶、PEI、WGA或透明质酸，或其任何组合。

本文所描述的一些实施例涉及药物组合物，其包括有效量的本文所描述的细胞组合物和药学上可接受的载体、赋形剂或其组合，基本上由其组成或由其组成。本文所描述的药物组合物适用于人类和/或兽医应用。

如本文所用，“药学上可接受的”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且是指在所使用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒或者具有可接受的毒性水平的载体、赋形剂和/或稳定剂。如本文所用，“药学上可接受的”“稀释剂”、“赋形剂”和/或“载体”具有根据本说明书所理解的其普通且惯用的含义，并且旨在包含任何和所有与对人类、猫、狗或其它脊椎动物宿主的施用兼容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是由联邦、州政府的监管机构或其它监管机构批准的，或在美国药典或其它公认的用于动物包含人类以及非人类哺乳动物如猫和狗中的药典中列出的稀释剂、赋形剂和/或载体。术语稀释剂、赋形剂和/或“载剂”可以指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。此类药物稀释剂、赋形剂和/或载体可以是无菌液体，如水和油，包含石油、动物油、植物油或合成来源的那些油。水、盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液可以用作液体稀释剂、赋形剂和/或载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。生理上可接受的载剂的非限制性实例是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体还可以包括以下中的一种或多种：抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白；明胶；免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；以及非离子表面活性剂，如

聚乙二醇(PEG)和

如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂、膨胀剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释调配物等形式。所述调配物应该适合于施用方式。

冷冻保护剂是细胞组合物添加剂，其通过防止形成大冰晶来提高低温冷冻保存的效率和产量。冷冻保护剂包含但不限于DMSO、乙二醇、甘油、丙二醇、海藻糖、甲酰胺、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺、3-磷酸甘油酯、脯氨酸、山梨糖醇、二甘醇、蔗糖、三甘醇、聚乙烯醇、聚乙二醇或羟乙基淀粉。冷冻保护剂可以用作冷冻保存培养基的一部分，所述冷冻保存培养基包含其它组分，如营养物(例如白蛋白、血清、牛血清、胎牛血清[ECS])，以提高细胞的解冻后可存活性。在这些冷冻保存培养基中，可以以以下浓度发现至少一种冷冻保护剂，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或在由上述数字中的任何两个数字限定的范围内的任何百分比。

具有期望性质的其它赋形剂包含但不限于防腐剂、佐剂、稳定剂、溶剂、缓冲剂、稀释剂、增溶剂、去污剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、盐、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸镁、糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨糖醇、纤维素、血清、氨基酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、硬脂酸镁、辛基苯酚乙氧基化物、苄索氯铵、硫柳汞、明胶、酯、醚、2-苯氧乙醇、尿素或维生素，或其任何组合。一些赋形剂可能是制造过程中的残留量或污染物，包含但不限于血清、白蛋白、卵清蛋白、抗生素、灭活剂、甲醛、戊二醛、β-丙内酯、明胶、细胞碎片、核酸、肽、氨基酸、或生长培养基成分或其任何组合。赋形剂的量可以以如下百分比存在于组合物中，即为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％w/w或在由上述数字中的任何两个数字限定的范围内的任何重量百分比。

术语“药学上可接受的盐”具有根据本说明书理解的普通且惯用的含义，并且包含组合物或赋形剂的相对无毒的无机和有机酸或碱加成盐，包含但不限于镇痛剂、治疗剂、其它材料等。药学上可接受的盐的实例包含衍生自矿物酸如盐酸和硫酸的那些，以及衍生自有机酸如乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸的那些，等等。用于形成盐的合适无机碱的实例包含氨、钠、锂、钾、钙、镁、铝、锌等的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐。盐也可以与合适的有机碱形成，包含无毒且强度足以形成此类盐的那些。例如，所述类别的此类有机碱可以包含但不限于单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，包含甲基胺、二甲胺和三乙胺；单羟基烷基胺、二羟基烷基胺或三羟基烷基胺，包含单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺；氨基酸，包含甘氨酸、精氨酸和赖氨酸；胍；N-甲基葡糖胺；N-甲基葡糖胺；L-谷氨酰胺；N-甲基哌嗪；吗啉；乙二胺；N-苄基苯乙胺；三羟甲基氨基乙烷。

适当的调配物取决于所选择的施用途径。本领域技术人员已知用于调配和施用本文所描述的化合物的技术。本领域存在多种施用化合物的技术，包含但不限于肠内、口服、直肠、局部、舌下、口腔、耳内、硬膜外、皮外、气雾剂、肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、动脉内、静脉内、门静脉内、关节内、皮内、腹膜内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。药物组合物将通常根据特定意图的施用途径进行调整。

如本文所用，“载体”具有其根据说明书理解的简单而普通含义，并且是指促进化合物通过、递送和/或掺入至细胞、组织和/或身体器官的化合物、颗粒、固体、半固体、液体或稀释剂。

如本文所用，“稀释剂”具有其根据说明书所理解的简单而普通的含义，并且是指药物组合物中缺乏药理活性但可能是药学上必需或期望的成分。例如，稀释剂可以用于增加质量太小而无法制造和/或施用的强效药物的体积。稀释剂也可以是用于溶解药物以通过注射、摄入或吸入来施用的液体。本领域中稀释剂的常见形式是缓冲水溶液，例如但不限于模拟人血组成的磷酸盐缓冲盐水。

本文的公开内容通常使用肯定性语言描述多个实施例。本公开还包含其中全部或部分地将主题排除在外的实施例，所述主题如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序。

PSC的分化

在一些实施例中，PSC如ESC和iPSC，首先以逐步的方式定向分化为定形内胚层(DE)，然后进入前肠或后肠谱系，并进入胃肠组织。在一些非限制性实施例中，PSC可以包括H1hESCs、iPSC72_3、iPSC75_1或iPSC285_1，或其任何组合。在一些实施例中，PSC以非逐步方式进行定向分化，其中同时添加用于促进DE形成的分子(例如，生长因子、配体)和用于随后组织形成的分子。在一些实施例中，定向分化是通过选择性地激活iPSC和/或DE细胞中的某些信号传导通路来实现的。在一些实施例中，信号传导通路包含但不限于Wnt信号传导通路；Wnt/APC信号传导通路；FGF信号传导通路；TGF-β信号传导通路；BMP信号传导通路；Notch信号传导通路；刺猬信号传导通路；LKB信号传导通路；以及Par极性信号传导通路。列出的信号传导通路中的每一个都具有本领域常规已知的信号传导通路激活剂和信号传导通路抑制剂。

定形内胚层产生肠管。前部DE形成前肠及其相关器官，包含食道、肺、胃、肝脏和胰腺，后部DE形成中肠和后肠，其形成小肠和大肠以及泌尿生殖系统的部分。使用小鼠、鸡和青蛙胚胎的研究表明，在原肠胚阶段建立DE的前后模式是随后前肠和后肠发育的先决条件。Wnt和FGF信号传导通路对于促进后内胚层/后肠或前内胚层/前肠命运至关重要。在后肠中，简单的真骨上皮首先发育为假复层柱状上皮，然后发育为含有极化柱状上皮的绒毛和绒毛基底的增殖区，与推定的祖细胞域相对应。

从多能细胞(例如，iPSC或ESC)产生定形内胚层的任何方法都适用于本文所描述的方法。在一些实施例中，多能细胞衍生自桑椹胚。在一些实施例中，多能干细胞是干细胞。在这些方法中使用的干细胞可以包含但不限于胚胎干细胞。胚胎干细胞可以衍生自胚胎内细胞团或衍生自胚胎性腺脊。胚胎干细胞或生殖细胞可以源自多种动物物种，包含但不限于包含人的各种哺乳动物物种。在一些实施例中，人胚胎干细胞用于产生定形内胚层。在一些实施例中，人胚胎生殖细胞用于产生定形内胚层。在一些实施例中，iPSC用于产生定形内胚层。在一些实施例中，人iPSC(hiPSC)用于产生定形内胚层。在一些实施例中，PSC在分化为定形内胚层之前首先被修饰。在一些实施例中，PSC在分化成定形内胚层之前被基因修饰，如以表达外源核酸或蛋白质。

在一些实施例中，胚胎干细胞或生殖细胞或iPSC用一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子处理一段时间，所述一段时间为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、120小时、150小时、180小时、240小时、300小时或在由上述时间中的任何两个时间限定的范围例如6小时到300小时、24小时到120小时、48小时到96小时、6小时到72小时或24小时到300小时内的任何时间。在一些实施例中，添加多于一种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，可以同时或分别添加多于一种的小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施例中，胚胎干细胞或生殖细胞或iPSC用一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子以如下浓度下处理：所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约10ng/mL、20ng/mL、50ng/rnL、75ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1200ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、7000ng/mL、10000ng/mL或15000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10ng/mL到15000ng/mL、100ng/mL到5000ng/mL、500ng/mL到2000ng/mL、10ng/mL到2000ng/mL或1000ng/mL到15000ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子的浓度在整个治疗期间保持在恒定水平。在一些实施例中，一种或多种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子的浓度在治疗过程中变化。在一些实施例中，添加多于一种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子。在这些情况下，多于一种小分子化合物、激活剂、抑制剂或生长因子的浓度可以不同。

在一些实施例中，ESC、生殖细胞或iPSC在支持干细胞生长的生长培养基中培养。在一些实施例中，ESC、生殖细胞或iPSC在干细胞生长培养基中培养。在一些实施例中，干细胞生长培养基是RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12、mTeSR 1、mTeSR Plus、DE分化、后肠内胚层分化、肠基(Gut Base)或完全佐藤培养基(Complete Sato media)。在一些实施例中，干细胞生长培养基包括胎牛血清(FBS)。在一些实施例中，干细胞生长培养基包括浓度为、为约、至少、至少约、不大于或不大于约0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如0％到20％、0.2％到10％、2％到5％、0％到5％或2％到20％的FBS内的任何百分比。在一些实施例中，干细胞生长培养基不含有异种异体组分。在一些实施例中，生长培养基包括一种或多种小分子化合物、活化剂、抑制剂或生长因子。

在一些实施例中，使用富集定形内胚层细胞的细胞群体。在一些实施例中，分离或基本上纯化定形内胚层细胞。在一些实施例中，分离的或基本上纯化的定形内胚层细胞将SOX17、FOXA2或CXRC4标志物中的一者或多者(例如，至少1个、3个)表达至比OCT4、AFP、TM、SPARC或SOX7标志物中的一个或多个(例如至少1个、3个、5个)更大的程度。

在一些实施例中，定形内胚层细胞和hESC用一种或多种生长因子处理。此类生长因子可以包含来自TGF-β超家族的生长因子。在一些实施例中，所述一种或多种生长因子包括TGF-β生长因子超家族的Nodal/活化素和/或BMP亚组。在一些实施例中，所述一种或多种生长因子选自由以下组成的组：Nodal、激活素A、激活素B、BMP4、Wnt蛋白或任何这些生长因子的组合。例如，在人类中，Wnt蛋白包含但不限于Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。

在一些实施例中，激活素诱导的定形内胚层(DE)可以进一步经历FGF和/或Wnt诱导的前内胚层或后内胚层形成、前肠或后肠特化和形态发生，以及最终胃肠道生长、形态发生和细胞分化成功能性胃肠细胞类型。在一些实施例中，PSC在体外有效地定向分化为包含分泌细胞类型、内分泌细胞类型和吸收细胞类型的胃肠上皮或间充质。应当理解，可以将如生长因子等分子添加到发育的任何阶段以促进特定类型的胃肠组织形成。

体外人胃肠发育发生在近似胎儿肠发育；内胚层形成、前内胚层或后内胚层图案化、前肠或后肠形态发生、胎儿肠发育、上皮形态发生、推定祖细胞结构域的形成以及分化为功能细胞类型的阶段。

本领域技术人员将理解，改变一种或多种Wnt信号传导蛋白的浓度、表达或功能与改变一种或多种FGF蛋白的浓度、表达或功能相结合可以产生根据本公开的定向分化。在一些实施例中，与Wnt和/或FGF信号传导通路相关的细胞成分，例如，所述通路的天然抑制剂、拮抗剂、激活剂或激动剂可以用于导致Wnt和/或FGF信号传导通路的抑制或激活。在一些实施例中，靶向与Wnt和/或FGF信号传导通路相关的细胞成分的siRNA和/或shRNA用于抑制或激活这些通路。

成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合和胚胎发育的生长因子家族。FGF是肝素结合蛋白，并且已经示出与细胞表面相关联的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的相互作用对于FGF信号转导是必需的。FGF是多种细胞和组织增殖和分化过程中的关键参与者。在人类中，已鉴定出FGF家族的22个成员，所有这些成员都是结构相关的信号传导分子。成员FGF1到FGF10都结合成纤维细胞生长因子受体(FGFR)。FGF1又被称为酸性成纤维细胞生长因子，并且FGF2又被称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。成员FGF11、FGF12、FGF13和FGF14，也被称为FGF同源因子1-4(FHF1-FHF4)，已示出了与FGF相比具有明显的功能差异。尽管这些因子具有非常相似的序列同源性，但是它们不与FGFR结合并且参与与FGF无关的细胞内过程。此组也被称为“iFGF”。成员FGF15至FGF23是较新的并且不那么好地被表征。FGF15是人FGF19的小鼠直系同源物(因此没有人FGF15)。基于其与非洲爪蟾蜍FGF-20(XFGF-20)的同源性鉴定了人FGF20。与其它FGF的局部活性相比之下，FGF15/FGF19、FGF21和FGF23具有更多的全身作用。

在一些实施例中，本领域技术人员将理解，任何FGF均可以与来自Wnt信号传导通路的蛋白质结合使用。在一些实施例中，所用的FGF是以下中的一种或多种：FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15(FGF19、FGF15/FGF19)、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21、FGF22或FGF23。

PSC分化为DE培养物，并且随后分化为各种中间成熟胃肠细胞类型，可以通过阶段特异性细胞标志物的存在来确定。在一些实施例中，代表性细胞成分的表达用于确定DE形成。代表性细胞成分包含但不限于CMKOR1、CXCR4、GPR37、RTN4RL1、SLC5A9、SLC40A1、TRPA1、AGPAT3、APOA2、C20orf56、C21orf129、CALCR、CCL2、CER1、CMKOR1、CRIP1、CXCR4、CXorf1、DIO3、DIO30S、EB-1、EHHADH、ELOVL2、EPSTI1、FGF17、FLJ10970、FLJ21195、FLJ22471、FLJ23514、FOXA2、FOXQ1、GATA4、GPR37、GSC、LOC283537、MYL7、NPPB、NTN4、PRSS2、RTN4RL1、SEMA3E、SIAT8D、SLC5A9、SLC40A1、SOX17、SPOCK3、TMOD1、TRPA1、TTN、AW166727、AI821586、BF941609、AI916532、BC034407、N63706或AW772192或其任何组合。在一些实施例中，细胞成分如前肠标志物Pdx1和白蛋白的不存在可以用于揭示定向的后肠形成。在一些实施例中，一个或多个(例如至少1个、3个)肠转录因子CDX2、KLF5或SOX9可以用于表示肠发育。在一些实施例中，GATA4或GATA6蛋白表达的一种或多种可以用于代表肠发育。

在一些实施例中，形态变化可以用于表示定向分化的进展。在一些实施例中，肠内胚层单层(例如，中后肠、后肠、前肠、前前肠或后前肠内胚层单层)或其细胞经受用于成熟的3维培养条件。在一些实施例中，肠内胚层单层在一定天数内成熟为胃肠类器官，所述天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天，或在由上述天数中的任何两个天数限定的范围例如1到40天、20到30天、30到40天或1到20天内的任何天数。在一些实施例中，可以观察到被间充质细胞包围的高度卷绕的上皮。在一些实施例中，胃肠类器官、上皮、极化柱状上皮、间充质、神经元细胞或平滑肌细胞可以在一定天数内观察到，所述天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天，或在由上述天数中的任何两个天数限定的范围例如1到40天、20到30天、30到40天或1到20天内的任何天数。

在一些实施例中，多能干细胞通过“一步”法转化为胃肠细胞类型。例如，一种或多种可将多能干细胞分化为DE培养物的分子(例如，激活素A)与可以促进DE培养物定向分化的另外的分子(例如CHIR99021和FGF4)组合以直接处理多能干细胞。

在一些实施例中，多能干细胞由体细胞制备。在一些实施例中，多能干细胞是从活检获得的生物组织制备的。在一些实施例中，多能干细胞从PBMC制备。在一些实施例中，人PSC由人PBMC制备。在一些实施例中，多能干细胞由冷冻保存的PBMC制备。在一些实施例中，PBMC在饲养细胞基底上生长。在一些实施例中，PBMC在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞基底上生长。在一些实施例中，PBMC在经辐照的MEF饲养细胞基底上生长。在一些实施例中，PBMC在0.1％明胶上生长。

在一些实施例中，多能干细胞是通过病毒转导从PBMC制备的。在一些实施例中，PBMC用仙台病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒或其任何组合转导。在一些实施例中，PBMC用包括Oct3/4、Sox2、K1f4或L-Myc或其任何组合的表达载体的仙台病毒转导。在一些实施例中，PBMC用一种或多种病毒以MOI转导，所述MOI为、约为、至少为、至少约为、不超过或不超过约0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0MOI，或在由上述MOI中的任何两个限定的范围例如0到5.0、1.0到4.0、2.0到3.0、0到3.0或1.0到5.0内的任何MOI。在一些实施例中，转导之后，PBMC表达干细胞重编程因子。在一些实施例中，转导之后，PBMC被重编程为iPSC。在一些实施例中，iPSC在饲养细胞基底上生长。在一些实施例中，iPSC在MEF饲养细胞基底上生长。在一些实施例中，iPSC在经辐照的MEF饲养细胞基底上生长。在一些实施例中，iPSC在0.1％明胶上生长。在一些实施例中，iPSC在RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12、mTeSR1、mTeSR Plus、DE分化、后肠内胚层分化、肠基或完全佐藤培养基中生长。

在一些实施例中，根据本领域已知的方法培养PSC(例如ESC或iPSC)。在一些实施例中，PSC在胞外基质或其模拟物或衍生物中扩增。在一些实施例中，PSC在基质胶(Matrigel)中扩增。在一些实施例中，培养中的PSC被解离(例如使用分散酶)并铺板到基质胶包被的板上以用于扩增。在一些实施例中，iPSC在包括ROCK抑制剂(例如Y-27632)的细胞培养基中扩增。在一些实施例中，PSC被扩增直到至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％汇合。在一些实施例中，iPSC分化为定形内胚层细胞。在一些实施例中，iPSC通过使iPSC与激活素A接触而分化成定形内胚层细胞。在一些实施例中，PSC进一步与一种或多种BMP信号传导通路激活剂如BMP4接触。在一些实施例中，PSC与一定浓度的激活素A或一种或多种BMP信号传导通路激活剂中的每一种接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度所限定的范围例如1到200ng/mL、10到150ng/mL、1到100ng/mL或100到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，iPSC在RPMI 1640、DMEM、DMEM/F12、mTeSR1、mTeSR Plus、第1天DE分化、第2天DE分化、第3天DE分化、后肠内胚层分化、肠基或完整的佐藤介质分化为定形内胚层。在一些实施例中，DE分化培养基包括以下中的一种或多种(例如至少1、2、3、4种)：RPMI 1640、非必需氨基酸(NEAA)、透析胎牛血清(dFCS)或激活素A，或任何其组合。在一些实施例中，第1天DE分化培养基包括0％或约0％dFCS，第2天DE分化培养基包括0.2％或约0.2％dFCS，第3天DE分化培养基包括2％或约2％dFCS。

定形内胚层的分化

定形内胚层表示许多主要器官的胚胎祖细胞，包含胃肠道(例如食道、肺、甲状腺、肝脏、胰腺、小肠、大肠)。由多能干细胞(PSC)产生定形内胚层细胞的方法包含本领域常规已知的那些。在一些实施例中，定形内胚层是或已经从PSC分化而来。在一些实施例中，定形内胚层是或已经从胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)分化而来。在一些实施例中，定形内胚层或PSC源自人。在一些实施例中，所述定形内胚层是人定形内胚层。

在一些实施例中，本文所描述的用于产生一个或多个聚集的类器官的方法包括将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体的步骤。在一些实施例中，肠内胚层单层粘附于例如组织培养板或本文所公开的形成板的实施例，并且肠球状体分离并悬浮在用于培养定形内胚层、肠内胚层单层和肠球状体的生长培养基中。如本文所用，肠内胚层是指源自已经历胃肠谱系图案化的定形内胚层的细胞。在一些实施例中，肠内胚层可以包括前肠内胚层、中肠内胚层、后肠内胚层或其任何组合。在一些实施例中，如本文所用的后肠内胚层涵盖中肠和后肠内胚层两者，并且表示小肠和大肠器官谱系。在定形内胚层分化为肠内胚层期间，肠球状体自发形成并以悬浮的细胞团的形式从肠内胚层单层中分离。这些肠球状体表现出类器官的早期特性，特别是包括上皮细胞和间充质细胞谱系的组成细胞群体的异质性。

本文公开了将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体的方法。然而，也可以采用先前已知的方法来产生肠内胚层单层。方法可以见于例如美国专利9,719,068和10,174,289以及PCT公开WO 2016/061464、WO 2017/192997、WO 2018/106628、WO 2018/200481、WO 2018/085615、WO 2018/085622、WO 2018/085623、WO 2018/226267、WO 2020/023245，所述文献中的每个文献特此通过引用整体明确并入本文。先前所描述的用于将定形内胚层分化为肠球状体的方法可以被认为与将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体两者同义，因为肠球状体的产生通常使肠内胚层单层同时产生。

在一些实施例中，通过使定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合(例如，至少1、2或3种)接触，定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括一种或多种本文所公开的或本领域已知的FGF蛋白。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括一种或多种本文所公开的或本领域已知的Wnt蛋白。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括一种或多种GSK3抑制剂。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括本文所公开的或本领域已知的任何BMP信号传导通路抑制剂。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。在一些实施例中，定形内胚层进一步与视黄酸接触。在一些实施例中，定形内胚层进一步与EGF接触。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路抑制剂、视黄酸或EGF(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路抑制剂、视黄酸或EGF(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，通过将定形内胚层培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天，将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体。

在一些实施例中，定形内胚层分化为前肠内胚层单层和前肠球状体。在一些实施例中，肠内胚层单层是前肠内胚层单层并且肠球状体是前肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述前肠内胚层单层和所述前肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合(例如至少1、2或3种)接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或者所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白，或其任何组合(例如至少1、2或3种)。

在一些实施例中，定形内胚层分化为后肠内胚层单层和后肠球状体。在一些实施例中，肠内胚层单层是后肠内胚层单层并且肠球状体是后肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述后肠内胚层单层和所述后肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，或所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或两者。在一些实施例中，分化所述定形内胚层进一步包括使所述定形内胚层与一种或多种BMP信号传导通路激活剂例如本文所描述的或本领域已知的一种或多种BMP蛋白接触。在一些实施例中，定形内胚层在后肠内胚层分化培养基中分化为肠内胚层单层和肠球状体。在一些实施例中，后肠内胚层分化培养基包括RPM11640、NEAA、dFCS、FGF4或CHIR99021或其任何组合中的一种或多种(例如至少1、2、3、4、5种)。在一些实施例中，后肠内胚层分化培养基包括2％或约2％dFCS、500ng/mL或约500ng/mL FGF4、或3μM或约3μM CHIR99021或其任何组合。

在一些实施例中，通过中胚层和/或间充质谱系的相对丰度，通过本文所公开的方法中的任何方法产生的肠内胚层单层与根据先前方法产生的肠球状体区分开来。在一些实施例中，培养肠内胚层单层使中胚层和/或间充质增加。在一些实施例中，肠内胚层单层包括相对于细胞总数量的一定百分比的中胚层和/或间充质，所述百分比为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约细胞总数量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，或在由上述百分比中的任何两个百分比限定的范围例如1％到20％、1％到10％、10％到20％或5％到15％内的任何百分比。在一些实施例中，肠内胚层单层相对于相同培养阶段下的肠球状体包括更多的中胚层和/或间充质。在一些实施例中，肠内胚层单层包括一定数量的中胚层和/或间充质，所述数量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约在肠球状体中发现的中胚层和/或间充质数量的约1、2、3、4或5倍，或在由上述倍数中的任何两个所限定的范围内的任何倍数。

肠内胚层分离和解离

在定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体之后，本文所公开的方法中的任一种方法包括将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离，所述肠内胚层单层和所述肠球状体两者都在生长培养基中。可以采用本领域已知的任何分离粘附细胞(例如肠内胚层单层)和悬浮细胞(例如肠球状体)的方法。例如，作为非限制性实施例，生长培养基和悬浮的肠球状体被抽吸以离开肠内胚层单层。在一些实施例中，可以执行一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)洗涤步骤以确保所有或大部分肠球状体已被去除。在一些实施例中，可以轻轻地搅动生长培养基以重新悬浮任何沉淀的肠球状体。在另一个非限制性实施例中，肠内胚层单层和肠球状体经受新鲜生长培养基或洗涤溶液的连续流动条件(例如在流动室或细胞内)以连续去除任何分离和悬浮的肠球状体同时保留粘附肠内胚层单层。

在本文所公开的方法中的任一种方法中将肠内胚层单层与肠球状体分离后，所述方法进一步包括将肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液。在一些实施例中，肠内胚层细胞包括前肠内胚层细胞，或后肠内胚层细胞，或两者。在一些非限制性实施例中，使肠内胚层单层解离包括使肠内胚层单层机械解离或酶促解离，或两者。在一些实施例中，肠内胚层单层与蛋白水解和/或胶原分解酶解离。在一些实施例中，肠内胚层单层是用Accutase(干细胞技术有限公司)、Accumax(干细胞技术有限公司)、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher))、TrypLESelect(赛默飞世尔科技公司)或其任何组合酶促解离的。在一些实施例中，肠内胚层单层通过研磨例如用移液管机械解离。在一些实施例中，过滤肠内胚层细胞的单细胞悬浮液以去除任何未经解离的细胞团。

肠内胚层聚集

在本文所公开的方法中的任一种方法中将肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液之后，所述方法进一步包括将肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体是一个或多个前肠内胚层聚集体、包括其、基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，肠内胚层聚集体是后肠内胚层聚集体、包括其、基本上由其组成或由其组成。在一些非限制性实施例中，将所述肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成所述一个或多个肠内胚层聚集体包括以下中的一项或多项(例如至少1、2或3项)：将所述单细胞悬浮液聚集在悬滴中、使微孔培养板中的所述单细胞悬浮液离心，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。在一些实施例中，使单细胞悬浮液离心可以用允许单细胞悬浮液通过重力沉淀成聚集体取代。在一些实施例中，形成板是本文所公开的形成板之一。在一些实施例中，一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括一定数量的细胞，所述数量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000个肠内胚层细胞，或由在上述数字中的任何两个数字所限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞，例如50到10000个细胞、50到4000个细胞、1000到10000个细胞或1000到5000个肠内胚层细胞。在一些实施例中，在聚集之后，将一个或多个肠内胚层聚集体在RPMT 1640、DMEM、DMEM/F12、mTeSR 1、mTeSR Plus、DE分化、后肠内胚层分化、肠基或完全佐藤培养基中培养。在一些实施例中，肠基培养基包括以下中的一种或多种(例如至少1、2、3、4、5、6种)：高级DMEM/F12、B27补充剂、胰岛素、N2补充剂、HEPES缓冲液、青霉素/链霉素或L-谷氨酰胺或其任何组合。在一些实施例中，完全佐藤培养基包括以下中的一种或多种(例如至少1、2、3、4种)：肠基培养基、EGF、头蛋白或R-脊椎蛋白或其任何组合。在一些实施例中，完全佐藤培养基包括500ng/mL或约500ng/mL重组人EGF、100ng/mL或约100ng/mL重组人头蛋白、或500ng/mL或约500ng/mL重组人R-脊椎蛋白或其任何组合。在一些实施例中，本文公开的任何培养基(例如完全佐藤培养基)可以补充有ROCK抑制剂。在一些实施例中，ROCK抑制剂是Y-27632。在一些实施例中，ROCK抑制剂以10μM或约10μM补充。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，使用定轨振荡器聚集肠内胚层细胞。在一些实施例中，将肠内胚层细胞悬浮液置于37℃温育箱中的定轨振荡器上。振荡器赋予悬浮液的运动导致细胞相互接触并形成聚集体。在一些实施例中，肠内胚层细胞的聚集体在振荡1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48小时或在由上述时间中的任何两个时间所限定的范围例如1到24小时、24到48小时或12到36小时内的任何时间内形成。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，通过允许细胞通过重力从悬浮液中沉淀出来来聚集肠内胚层细胞。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，通过悬滴法聚集肠内胚层细胞。在一些实施例中，这种悬滴法包括将一滴悬浮在生长培养基中的肠内胚层细胞倒置在(例如细胞培养板的)表面上，并允许细胞沉到液滴底部以聚集。

形成板

图2A-C描绘了用于单细胞解离和聚集的示例性肠内胚层单层的制剂的实施例。在一些实施例中，聚集在形成板、微孔培养板、“v”底微孔培养板、“u”底微孔培养板中或使用定轨振荡器，或其任何组合进行。在一些实施例中，形成板是Aggrewell板(干细胞技术有限公司)，或通常用于根据本文所描述的方法使细胞聚集的任何其它板。

首先，关于图2A和2B，在一些实施例中，在本文所描述或本领域已知的条件下在生物相容性容器(16)内培养多个诱导多能干细胞(14)以形成定形内胚层(18)。在一些实施例中，定形内胚层(18)在本文所描述或本领域已知的条件下继续培养以在生物相容性容器(16)内分化成肠内胚层单层和肠球状体。在一些实施例中，肠内胚层单层是前肠内胚层单层或后肠内胚层单层，并且肠球状体是前肠球状体或后肠球状体，但考虑肠内胚层单层和/或肠球状体的任何变型。在一些实施例中，肠内胚层单层粘附于生物相容性容器(16)，而肠球状体被分离并悬浮在包含在生物相容性容器(16)内的生长培养基中。在一些实施例中，通过从生物相容性容器(16)中抽吸生长培养基和悬浮的肠球状体，将肠内胚层单层与肠球状体分离。在一些实施例中，分离的肠内胚层单层然后被解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液(10)，如本文所描述和图2C所描绘的。在一些实施例中，收集单细胞悬浮液(10)并根据本文公开的或本领域已知的任何方法进行聚集以形成一个或多个肠内胚层聚集体(20)。在一些实施例中，将一个或多个肠内胚层聚集体(20)置于相同或不同的生物相容性容器(16)中以将一个或多个肠内胚层聚集体培养成一个或多个聚集的类器官。

图3A-6描绘了形成板(12)的实施例。在一些实施例中，形成板(12)具有基部(22)和多个孔(24)。尽管图4中描绘的示例性板具有六个孔，但应当理解，可以类似地使用任何数量的孔(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、100、500、1000、2000、5000或更多个)。在一些实施例中，形成板(12)的每个孔(24)包括沿其底部(28)的多个微孔(26)，所述多个微孔被配置成接收肠内胚层细胞的单细胞悬浮液(10)并将其聚集成多个肠内胚层聚集体(20)。关于图6，在一些实施例中，每个微孔(26)包括长度(30)、宽度(32)和深度(34)。在一些实施例中，长度(30)在纵向方向上延伸，所述长度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μm，或在由上述长度中的任何两个长度所限定的范围例如100到1000μm、100到500μm、500到1000μm或300到600μm内的任何长度。在一些实施例中，所述长度被限定在微孔(26)的相对纵向侧壁(36)之间。在一些实施例中，所述宽度(32)在侧向方向上延伸，所述宽度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μm，或在由上述宽度中的任何两个宽度所限定的范围例如100到1000μm、100到500μm、500到1000μm或300到600μm内的任何宽度。在一些实施例中，所述宽度被限定在微孔(26)的相对侧向侧壁(38)之间。在一些实施例中，所述深度在(34)在横向方向上垂直于纵向方向和侧向方向延伸，所述深度为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μm，或在由上述宽度中的任何两个宽度所限定的范围例如50到500μm、50到300μm、300到500μm或100到400μm内的任何宽度。在一些实施例中，所述深度(34)被限定在底部部分(28)的上表面(42)中的开口(40)与底部部分(28)的底表面(44)之间。在一些实施例中，每个微孔(26)被限定在相应的纵向侧壁(36)、侧向侧壁(38)、开口(40)与底表面(44)之间。在一些实施例中，盖子可以包含在板(12)内并且被配置成覆盖孔(24)以便被封装而不是打开。在一些实施例中，形成板(12)不旨在被不必要地限制于在本文所提供的任何实例中示出和描述的孔(24)和微孔(26)的特定数量、布置或大小。在一些实施例中，形成板是Aggrewell板(干细胞技术有限公司)。在一些实施例中，Aggrewell板是Aggrewell 400或Aggrewell 800板。

在一些实施例中，为了聚集单细胞悬浮液(10)，微孔(26)从相对较宽的开口(40)朝向相对较窄的底表面(44)一起逐渐变细。在一些实施例中，如图6所描绘的，相对的纵向侧壁(36)从开口(40)到底表面(44)朝向彼此逐渐变细，而相对的侧向侧壁(38)类似地从开口(40)到底表面(44)朝向彼此逐渐变细。在一些实施例中，重力迫使悬浮液中的单细胞沿横向方向向下，而由纵向和侧向侧壁(36，38)施加到细胞的反作用力引导细胞向内朝向彼此，以有效地将单细胞集合并聚集在一起。在一些实施例中，此类逐渐变细允许细胞聚集为3维聚集体，这可以用离心机进一步促进。在一些实施例中，每个微孔(26)接收一定数量的单细胞，所述一定数量的单细胞为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50、100、200、400、600、800、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10000个单细胞，或在由上述数量中的任何两个数量所限定的范围例如50到10000个细胞、50到4000个细胞、1000到10000个细胞或1000到5000个细胞内的任何数量的细胞。

在一些实施例中，纵向侧壁和侧向侧壁(36，38)具有相同的尺寸并且限定在具有倒金字塔形状的微孔(26)内的空隙。在一些实施例中，纵向侧壁(36)和侧向侧壁(38)是平坦的并且一起朝向底表面(44)逐渐变细，所述底表面基本上是金字塔形状的倒置尖端。在一些实施例中，纵向侧壁(36)、侧向侧壁(38)和底表面(44)中的一个或多个是连续表面而不是在各个边缘相交。在一些实施例中，微孔(26)的各侧侧壁(36，38)和底表面(44)并非旨在不必要地限于本文中的一些实例中所示的非连续的、相交表面。在一些实施例中，微孔(26)内的空隙被成形为允许包含细胞的收集和/或聚结的其它几何形状。应当理解，本领域技术人员将能够确定微孔(26)的可接受的形状，例如，所述形状可以包含但不限于圆锥形、圆顶形、凹形、椭圆形、抛物线形和/或双曲线形状。在一些实施例中，微孔的形状和大小是变化的，以便被特别配置成更有效地生长特定的单细胞群体，如与其它组织相关联的内胚层或前体细胞。在一些实施例中，本发明因此并不旨在被不必要地限制于图中所示的形成板(12)和/或微孔(26)的特定形状和尺寸或与本文讨论的特定细胞一起使用。

在一些实施例中，本文所描述的形成板中的任一个形成板的每个微孔(26)接收一定数量的单细胞，所述一定数量的单细胞为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50、100、200、400、600、800、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10000个单细胞，或在由上述数量中的任何两个数量所限定的范围例如50到10000个细胞、50到4000个细胞、1000到10000个细胞或1000到5000个细胞内的任何数量的细胞。

在一些实施例中，形成板(12)具有由生物相容性材料制造的单一整体结构，其抑制细胞在微孔(26)内附着于形成板(12)，同时允许单细胞(10)发育成图3A-6的非限制性实例中所示的聚集体(20)。在一些实施例中，形成板(12)由多个组件形成，其中至少微孔(26)的表面由生物相容性材料制造。在一些实施例中，生物相容性材料包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：不锈钢、钛、聚合有机硅化合物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、玻璃、塑料、PVC、PE、PP、PMMA、PS、PTFE、尼龙、聚氨酯、PET、PES、透明质酸、壳聚糖、糖、陶瓷、氧化铝、氧化锆、生物玻璃、羟基磷灰石或其任何组合，或本领域已知的任何其它生物相容性材料。在一些实施例中，形成板(12)是无菌的、抗组织和/或细胞粘附的，包括疏水表面，包括改善所公开组织的形成以及随后的移除和/或使用的特征，或其任何组合。在一些实施例中，形成板(12)包括促进生长和/或分化的一种或多种(例如至少1、3、5、10种)小分子化合物、激活剂、抑制剂、生长因子、核酸、DNA、RNA、肽、多肽或蛋白质，或其任何组合。

聚集的类器官

在一些实施例中，本文所公开的方法进一步包括培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，本文所描述的一个或多个聚集的类器官是或包括食管类器官、胃类器官、胃底类器官、胃窦类器官、肝类器官、肠类器官或结肠类器官，或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括人食管类器官(HEO)、人胃类器官(HGO)、人胃底类器官(HFGO)、人胃窦类器官(HAGO)、人肝类器官(HHO)、人肠类器官(HIO)或人结肠类器官(HCO)或其任何组合。在一些实施例中，在将肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体之后，将所述一个或多个肠内胚层聚集体培养一定短时间段以进行收集、恢复和/或合并，所述时间段为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约例如1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50小时，或在由上述时间中的任何两个时间所限定的范围例如1到50小时、10到40小时、20到30小时、1到30小时或24到50小时内的任何时间段。在一些实施例中，将一个或多个肠内胚层聚集体从聚集培养基中移出或重新悬浮。例如，在一些实施例中，在一个或多个肠内胚层聚集体聚集在微孔培养板、“v”或“u”底微孔培养板或形成板中的情况下，一个或多个肠内胚层聚集体从培养板或形成板的微孔中被移出(例如，使用移液管将生长培养基轻轻地流过一个或多个肠内胚层聚集体，并且将聚集体抽吸到移液管尖端中)。在一些实施例中，用新鲜的生长培养基洗涤聚集培养基，例如用完全佐藤培养基或其它生物相容性水溶液，以确保收集所有聚集体。在一些实施例中，将一个或多个肠内胚层聚集体收集在容器(例如无菌管)中并允许通过重力沉淀。在一些实施例中，不应使用离心来收集一个或多个肠内胚层聚集体，因为这可能导致聚集体融合在一起。在一些实施例中，在沉淀之后，在将一个或多个肠内胚层聚集体分化为一个或多个聚集的类器官的条件下培养一个或多个肠内胚层聚集体。例如，在一些实施例中，在沉淀之后，去除任何剩余的生长培养基。在一些实施例中，一个或多个肠内胚层聚集体与基底膜或胞外基质或其模拟物或衍生物接触。在一些实施例中，基底膜或胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶。在一些实施例中，去除剩余的生长培养基以降低基底膜或胞外基质或其模拟物或衍生物的聚合效率。在一些实施例中，一个或多个肠内胚层聚集体与一个或多个生长因子、营养素、维生素、糖、蛋白质、小分子、激动剂、拮抗剂、细胞因子、信号传导通路激活剂或信号传导通路抑制剂接触以诱导一个或多个肠内胚层聚集体生长和成熟为一个或多个聚集的类器官。尽管本文提供了用于将一个或多个肠内胚层聚集体分化为各种不同的聚集的类器官的条件，但先前已知的用于将肠球状体(例如前肠球状体和/或后肠球状体)分化成相应的类器官的其它方法也可以用于以相同或类似的方式分化一个或多个肠内胚层聚集体。用于类器官分化的方法可以见于例如美国专利9,719,068和10,174,289以及PCT公开WO 2016/061464、WO2017/192997、WO 2018/106628、WO 2018/200481、WO 2018/085615、WO 2018/085622、WO2018/085623、WO 2018/226267、WO 2020/023245，所述文献中的每个文献特此通过引用整体明确并入本文。

在一些实施例中，其中肠内胚层细胞是前肠内胚层细胞，一个或多个肠内胚层聚集体是前肠内胚层聚集体，并且一个或多个肠内胚层聚集体分化为一个或多个聚集的前肠谱系类器官。

在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肝脏类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与以下中的一种或多种(例如至少1、2、3、4、5、6种)接触：一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M或其任何组合。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF2。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP4。在一些实施例中，一个或多个聚集的肝脏类器官包括肝上皮和肝间充质。

在所提供的实施例中的任何实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或1到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度，例如0.01到20μM、0.01到10μM、1到15μM或10到20μM。

在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的胃类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的胃类器官是或包括一个或多个聚集的胃底类器官或一个或多个聚集的胃窦类器官，或两者。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的胃窦类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与以下中的一种或多种(例如至少1、2或3种)接触：EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。在一些实施例中，一个或多个聚集的胃类器官包括胃上皮和胃间充质。在一些实施例中，一个或多个聚集的胃类器官的胃上皮是CDH1+、CLDNI8+或MUC5AC+，或其任何组合。

在所提供的实施例中的任何实施例中，以一定浓度接触EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂(如果提供)中的每一种，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。

在一些实施例中，在肠内胚层细胞是后肠内胚层细胞的情况下，一个或多个肠内胚层聚集体是或包括一个或多个后肠内胚层聚集体，并且所述一个或多个肠内胚层聚集体分化为一个或多个聚集的后肠谱系类器官。

在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肠类器官。在一些实施例中，培养一个或多个肠内胚层聚集体以形成一个或多个聚集的肠类器官包括使一个或多个肠内胚层聚集体与以下中的一种或多种(例如至少1、2或3种)接触：EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白、或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白或两者。在一些实施例中，一个或多个聚集的肠类器官包括肠上皮和肠间充质。在一些实施例中，一个或多个聚集的肠类器官的肠上皮是CDH1+、CDX2+、E-cad+或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个聚集的肠类器官的肠间充质是FOXF1+、CDX2+、界面蛋白+或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个聚集的肠类器官的肠上皮表现出近侧肠标志物。在一些实施例中，近侧肠标志物包括CDH17、或PDX1、或两者。在一些实施例中，将一个或多个聚集的肠类器官移植到接受者受试者中并经历成熟。在一些实施例中，成熟的一个或多个聚集的肠类器官包括肠细胞类型。在一些实施例中，肠细胞类型包括上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞或潘氏细胞(Paneth cell)或其任何组合。在一些实施例中，上皮细胞是SI+，杯状细胞是Muc2+，肠内分泌细胞是色谱A+，或潘氏细胞是溶菌酶+，或其任何组合。

在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的结肠类器官。在一些实施例中，培养一个或多个肠内胚层聚集体以形成一个或多个聚集的结肠类器官包括使一个或多个肠内胚层聚集体与以下中的一种或多种(例如至少1、2、3种)接触：EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂或其任何组合。在一些实施例中，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP2，或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个聚集的结肠类器官包括结肠上皮和结肠间充质。在一些实施例中，结肠上皮CDH1+或SATB2+或两者。

在所提供的实施例中的任何实施例中，EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度，例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL。在一些实施例中，EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，肠内胚层聚集体在完全佐藤培养基中培养。在一些实施例中，完全佐藤培养基补充有ROCK抑制剂。在一些实施例中，ROCK抑制剂是Y-27632。在一些实施例中，ROCK抑制剂以10μM或约10μM补充。

在一些实施例中，将一个或多个肠内胚层聚集体培养一定天数以形成一个或多个聚集的类器官，所述天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或50天，或在由上述天数中的任何两个天数限定的范围例如1到50天、10到30天、20到40天、1到30天或20到50天内的任何天数。

在一些实施例中，所得一个或多个聚集的类器官用于研究食道、胃、肝、肠或结肠功能，包含但不限于药物筛选、神经功能、微生物组相互作用或移植，或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官包括功能性管腔。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官具有在移植时进一步分化的能力。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官在体外生长到胎儿阶段，并在移植时进一步分化。

肠内胚层聚集体和聚集的类器官的均匀性和可扩展性

在一些实施例中，本文所公开的方法允许形成许多均质或几乎均质的肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官。在一些实施例中，聚集培养基(例如本文所公开的形成板中的任一种形成板)的方法和使用允许形成多个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，多个肠内胚层聚集体包括一定数量的肠内胚层聚集体，所述数量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、50000、100000、500000或1000000个肠内胚层聚集体，或在由上述肠内胚层聚集体数量中的任何两个所定义的数量例如1000到1000000个肠内胚层聚集体、5000到100000个肠内胚层聚集体、1000到10000个肠内胚层聚集体或10000到1000000个肠内胚层聚集体内的任何数量的肠内胚层聚集体。在一些实施例中，均质或几乎均质的肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的形成定义为多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官相对于肠内胚层球状体和/或由未聚集的球状体产生的类器官在至少一个空间维度上具有减小的变化。在一些实施例中，所述至少一个空间维度包括长度、宽度、深度、体积或表面积，或其任何组合。在一些实施例中，肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的几何形状为球形，并且所述至少一个空间维度包括半径、直径、周长、体积或表面积，或其任何组合。在一些实施例中，至少一个空间维度的减小的变化包括在距所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径。在一些实施例中，多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官中的每一个包括在距所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径。在一些实施例中，至少一个空间维度的减小的变化包括在距所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的体积，或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积。在一些实施例中，多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官中的每一个包括在距所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的体积，或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积。在一些实施例中，多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官中的每一个包括在距所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径以及在距所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的体积，或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积两者。对于一些实施例，在图9B、9C和9E中可以看到与自发形成的球状体相比肠内胚层聚集体的变化减小(即均匀)。

在多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的实施例中的任何实施例中，所述多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官源自同一受试者。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，受试者患有疾病、先前曾患有疾病、或处于患病风险中，或其任何组合。在一些实施例中，所述疾病是胃肠疾病。在一些实施例中，源自受试者的多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官可以用于基因测试或药物筛选目的。在一些实施例中，源自受试者的多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官可以用于大规模药物筛选以鉴定用于减少、改善或治疗受试者疾病的有效疗法。在一些实施例中，大规模药物筛选包括测试多种化合物，每种化合物具有多个肠内胚层聚集体和/或所得聚集的类器官的亚群。

本文还公开了包括多个微孔和多个肠内胚层聚集体的聚集培养基的实施例。在一些实施例中，聚集培养基是本文所公开的微孔培养板、“v”或“u”底微孔培养板或形成板中的任一种。在一些实施例中，多个肠内胚层聚集体是本文所公开的多种肠内胚层聚集体中的任一种，或本文所公开的一个或多个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，多个肠内胚层聚集体是通过本文所公开的方法中的任一种方法产生的多种肠内胚层聚集体中的任一种，或通过本文所公开的方法中的任一种方法产生的一个或多个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，多个微孔中的每一个包括多个肠内胚层聚集体中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个肠内胚层聚集体。在一些实施例中，多个微孔中的每一个包括多个肠内胚层聚集体中的单个肠内胚层聚集体。

移植和治疗方法

在一些实施例中，本文所公开的方法包括将本文所公开的聚集的类器官中的任何一个或多个聚集的类器官移植到接受者受试者中的另外的步骤。在一些实施例中，所述接受者受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述接受者受试者是人。在一些实施例中，接受者受试者是定形内胚层或前体多能干细胞源自的受试者。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官源自从接受者受试者分离的定形内胚层或PSC。在一些实施例中，当移植到接受者受试者中时，与本领域已知的非聚集的类器官相比，一个或多个聚集的类器官表现出更大的移植、成熟、生长或其任何组合。

在一些实施例中，将如本文所描述的一个或多个聚集的类器官移植到接受者受试者中，例如作为治疗或实验模型，如本文所描述。在一些实施例中，在将类器官培养以下天数后进行移植，所述天数是、大约是、至少是、至少大约是、不超过或不超过大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50天，或在由上述天数中的任何两个限定的范围例如1到50天、10到40天、20到30天、1到30天或20到50天内的任何培养天数。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官在通过本领域已知的其它方法制备的类器官处于相同或类似的成熟状态之前的一定天数足够成熟以进行移植和/或研究，其中所述天数为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，或在由上述天数中的任何两个天数限定的范围例如1到20天、5到15天、10到15天、1到15天或10到20天内的任何天数。在一些实施例中，所述接受者受试者是哺乳动物。在一些实施例中，接受者受试者是免疫缺陷哺乳动物。在一些实施例中，接受者受试者是免疫缺陷小鼠。在一些实施例中，接受者受试者是猴子、狗、仓鼠或老鼠。在一些实施例中，接受者受试者是免疫功能低下的猴子、狗、仓鼠或老鼠。在一些实施例中，所述接受者受试者是人。在一些实施例中，接受者受试者是免疫功能低下的人。在一些实施例中，接受者受试者是具有免疫活性的人。在一些实施例中，接受者受试者是用免疫抑制剂治疗的具有免疫活性的人。在一些实施例中，接受者受试者是具有免疫活性的人，并且聚集的类器官对于宿主生物是自体的。在一些实施例中，接受者受试者是具有免疫活性的人，并且聚集的类器官对于宿主生物是同种异体的。在一些实施例中，接受者受试者是需要器官移植的哺乳动物。在一些实施例中，接受者受试者是需要器官移植的人。

在一些实施例中，将一个或多个聚集的类器官植入到接受者受试者的适当区域。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官在接受者受试者内生长一定天数，所述天数位、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官比同时制备的体外聚集的类器官生长得更大或成熟得更快。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官表现出与接受者受试者组织的整合。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官包括胃肠细胞谱系。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官自发地形成胃肠细胞谱系。

本文描述了治疗具有受损器官功能的受试者或改善或抑制有需要的受试者的有害器官病症的方法。在一些实施例中，所述方法包括将一个或多个聚集的类器官移植(transplanting)或移植(engrafting)到受试者中。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是本文所描述的方法中的任一种方法的一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的食管类器官、一个或多个聚集的胃类器官、一个或多个聚集的胃底类器官、一个或多个聚集的胃窦类器官、一个或多个聚集的肝类器官、一个或多个聚集的小肠(肠)类器官或一个或多个聚集的大肠(结肠)类器官，或其任何组合。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官对于受试者是自体的或同种异体的。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官由从受试者获得或源自所述受试者的诱导多能细胞制备。在一些实施例中，受试者需要器官移植。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官被移植或移植为一个或多个完整的聚集的类器官。在一些实施例中，移植部位是器官组织。

本文还描述了通过本文所公开的方法中的任一种方法产生的聚集的类器官中的任何一个或多个聚集的类器官。此外，在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官用于恢复有需要的受试者的类器官功能。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是本文所描述的一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是通过本文所描述方法中的任何一种方法产生的一个或多个聚集的类器官。

产生聚集的类器官的非限制性方法

本文公开了产生一个或多个聚集的类器官的方法。在一些实施例中，所述方法包括：将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体；将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；将所述肠内胚层细胞的所述单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，肠内胚层单层是粘附的。在一些实施例中，所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。在一些实施例中，所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是用Accutase、Accumax、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express或TrypLE Select或其任何组合酶促解离的。在一些实施例中，所述聚集步骤包括在悬滴中聚集所述单细胞悬浮液，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。在一些实施例中，使单细胞悬浮液离心可以用允许单细胞悬浮液通过重力沉淀取代。在一些实施例中，所述形成板是Aggrewell板。在一些实施例中，一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括一定数量的细胞，所述数量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000个肠内胚层细胞，或在由上述数字中的任何两个数字所限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞，例如50到10000个细胞、50到4000个细胞、1000到10000个细胞或1000到5000个肠内胚层细胞。在一些实施例中，所述培养步骤包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与胞外基质或其模拟物或衍生物接触。在一些实施例中，所述胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶。在一些实施例中，肠内胚层单层是前肠内胚层单层并且肠球状体是前肠球状体。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的胃类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的胃类器官是或包括一个或多个聚集的胃窦类器官。在一些实施例中，肠内胚层单层是后肠内胚层单层并且肠球状体是后肠球状体。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肠类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的结肠类器官。

本文公开了产生一个或多个聚集的类器官的方法。在一些实施例中，所述方法包括：将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体；将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；将所述肠内胚层细胞的所述单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，肠内胚层单层是粘附的。在一些实施例中，所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。在一些实施例中，所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。在一些实施例中，肠内胚层单层与Accutase酶促解离。在一些实施例中，聚集步骤包括使形成板中的单细胞悬浮液或其任何组合离心。在一些实施例中，使单细胞悬浮液离心可以用允许单细胞悬浮液通过重力沉淀取代。在一些实施例中，所述形成板是Aggrewell板。在一些实施例中，一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括一定数量的细胞，所述数量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000个肠内胚层细胞，或在由上述数字中的任何两个数字所限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞，例如1000到5000个细胞、2000到4000个细胞、1000到3000个细胞或3000到5000个肠内胚层细胞。在一些实施例中，培养步骤包括使一个或多个肠内胚层聚集体与基质胶接触。在一些实施例中，肠内胚层单层是前肠内胚层单层并且肠球状体是前肠球状体。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的胃类器官。在一些实施例中，一个或多个胃类器官是或包括一个或多个聚集的胃窦类器官。在一些实施例中，肠内胚层单层是后肠内胚层单层并且肠球状体是后肠球状体。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肠类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的结肠类器官。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，所述肠内胚层单层是前肠内胚层单层并且所述肠球状体是前肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述前肠内胚层单层和所述前肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4。在一些实施例中，FGF4以500ng/mL或约500ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021。在一些实施例中，CHIR99021以3μM或约3μM的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。在一些实施例中，头蛋白以200ng/mL或约200ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，前肠内胚层单层被解离成前肠内胚层细胞的单细胞悬浮液。在一些实施例中，前肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个前肠内胚层聚集体。在一些实施例中，培养一个或多个前肠内胚层聚集体以产生一个或多个聚集的肝脏类器官，或一个或多个聚集的胃类器官，或两者。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，培养一个或多个前肠内胚层聚集体以产生一个或多个聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肝脏类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M或其任何组合接触。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或1到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M(如果提供)中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约0.01、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围内的任何浓度，例如0.01到20μM、0.01到10μM、1到15μM或10到20μM。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的胃类器官。在一些实施例中，培养一个或多个前肠内胚层聚集体以产生一个或多个聚集的胃类器官。在一些实施例中，一个或多个聚集的胃类器官是或包括一个或多个聚集的胃窦类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的胃窦类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，EGF以100ng/mL或约100ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，视黄酸以2μM或约2μM的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。在一些实施例中，头蛋白以200ng/mL或约200ng/mL的浓度提供。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，肠内胚层单层是后肠内胚层单层并且肠球状体是后肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述后肠内胚层单层和所述后肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者接触。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4。在一些实施例中，FGF4以500ng/mL或约500ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021。在一些实施例中，后肠内胚层单层被解离成后肠内胚层细胞的单细胞悬浮液。在一些实施例中，后肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个后肠内胚层聚集体。在一些实施例中，培养一个或多个后肠内胚层聚集体以产生一个或多个聚集的肠类器官，或一个或多个聚集的结肠类器官，或两者。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的肠类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，以一定浓度接触EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂中的每一种，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，EGF以500ng/mL或约500ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白。在一些实施例中，R-脊椎蛋白以500ng/mL或约500ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。在一些实施例中，头蛋白以100ng/mL或约100ng/mL的浓度提供。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，一个或多个聚集的类器官是或包括一个或多个聚集的结肠类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的结肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂或其任何组合接触。

在一些实施例中，EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂中的每一种以一定浓度接触，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如10到1000ng/mL、50到500ng/mL、500到1000ng/mL或10到200ng/mL内的任何浓度。在一些实施例中，以一定浓度接触EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂中的每一种，所述浓度为、为约、为至少、为至少约、不大于或不大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20μM，或在由上述浓度中的任何两个浓度限定的范围例如1到20μM、1到10μM、5到15μM或10到20μM内的任何浓度。在一些实施例中，EGF以500ng/mL或约500ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白。在一些实施例中，R-脊椎蛋白以500ng/mL或约500ng/mL的浓度提供。在一些实施例中，一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP2。在一些实施例中，BMP2以100ng/mL或约100ng/mL的浓度提供。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，肠球状体被分离并悬浮在生长培养基中。在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，所述定形内胚层已经从多能干细胞分化而来。在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，所述定形内胚层已经从胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而来。在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，所述定形内胚层是人定形内胚层。

在本文所公开的方法中的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述一个或多个聚集的类器官移植到接受者受试者。在一些实施例中，所述接受者受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述接受者受试者是人。

本文还描述了通过本文所公开的方法中的任一种方法产生的一个或多个聚集的类器官。

实例

在以下实例中进一步详细地公开了本文讨论的实施例的一些方面，所述实例不旨在以任何方式限制本公开的范围。本领域技术人员将理解，许多其它实施例也落入本公开的范围内，如本文和权利要求中所描述的。

实例1.人多能干细胞(hPSC)的培养

图1提供了用于形成聚集的类器官如聚集的人肠类器官(AggHIO)的示例性示意图。

在hPSC分化为定形内胚层之前两天(第2天)，培养了hPSC。制备了基质胶包被的24孔培养皿。将5mL分散酶溶液(1mg/mL；干细胞技术有限公司)加热至37℃。如有必要，从未经分化的hPSC中去除任何分化区域。仔细抽吸含有hPSC的每个孔中的培养基。将1mL预热的分散酶溶液添加到含有hPSC的每个孔，并且将细胞在37℃下温育，直到集落边缘出现轻微折叠。在约4分钟的分散酶温育之后，确认hPSC集落的边缘已开始从孔中抬起。如果集落边缘没有抬起，将细胞再温育另外几分钟，其中定期检查，直到观察到抬起。在分散酶温育期间，通过抽吸基质胶溶液并向每个孔中添加0.5mL的新鲜mTeSR1培养基(干细胞技术有限公司)来制备基质胶包被的培养皿。在任何时候都不允许基质胶包被的培养皿变干。如有必要，将孔一次一排而不是一次全部抽吸并用mTeSR1重新填充。从温育箱中取出hPSC板。轻轻抽吸分散酶溶液，并且用2mL的预热的DMEM-F12培养基洗涤孔至少三次。重要的是不要让板干燥，并避免移液时移出菌落。将培养基轻轻分配到每个孔的边缘上。从每个孔中抽吸DMEM-F12洗涤液，并且向每个孔添加2mL的温热的mTeSR1培养基。使用无菌一次性细胞刮刀小心分离菌落。mTeSR1和细胞聚集体组合到单个孔中，注意不要过度破碎细胞聚集体。通过小心地上下移液一次来研磨细胞。如果在单次研磨之后大的聚集体可见，则重复移液，在每次研磨之后检查聚集体的大小。如有必要，使用更大口径的微量移液器(例如p1000)仅破碎大的聚集体。将hPSC聚集体轻轻分散，并且将0.5mL的细胞悬浮液分配到基质胶包被的24孔板的每个孔。将新铺板的细胞前后左右轻轻振荡以分散细胞，并且然后转移到温育箱。

实例2.定形内胚层(DE)分化

在培养的第0天，证实铺板的hPSC(例如，如实例1中所描述)以约60-70％汇合度均匀分布并且细胞在开始分化之前展现出标准的未分化形态。抽吸每个孔中的mTeSR1培养基，注意不允许细胞变干。每孔添加0.5mL的第1天的DE分化培养基(表1)。细胞在37℃和5％CO2下温育24小时。

在培养的第1天，丢弃第1天的DE分化培养基，并且每孔添加0.5mL的第2天的DE分化培养基(表1)。细胞在37℃和5％CO2下温育24小时。

在培养的第2天，丢弃第2天的DE分化培养基，并且每孔添加0.5mL的第3天的DE分化培养基(表1)。细胞在37℃和5％CO₂下温育24小时。

表1中提供的DE分化培养基配方用于制备1mL的培养基。可以根据需要按比例放大体积。每天的最终激活素A浓度为100ng/mL。这些培养基可以提前制备并且储存在4℃下，但优选的是在使用当天制备。

表1：DE分化培养基

实例3.后肠内胚层图案化

在培养的第3天，基于细胞处于平坦、同质的单层和/或定形内胚层标志物(例如Sox17、FoxA2和/或CXCR4)的表达来评估分化的定形内胚层的质量。从每个孔中抽吸DE分化培养基，注意不允许细胞变干。每孔添加0.5mL的后肠内胚层分化培养基(表2)。细胞在37℃和5％CO2下温育24小时。

在培养的第4天，丢弃先前的后肠内胚层分化培养基，并且每孔添加0.5mL的新鲜后肠内胚层分化培养基。细胞在37℃和5％CO₂下温育24小时。

在培养的第5天，丢弃先前的后肠内胚层分化培养基，并且每孔添加0.5mL的新鲜后肠内胚层分化培养基。细胞在37℃和5％CO₂下温育24小时。在此阶段，可以观察到形态发生的开始。孔中可能存在一些分离的球状体。注意不要通过使板倾斜来抽吸这些球状体，同时在孔中留下一定小体积的含有球状体的培养基。

在培养的第6天，丢弃先前的后肠内胚层分化培养基，并且每孔添加0.5mL的新鲜后肠内胚层分化培养基。细胞在37℃和5％CO₂下温育24小时。在此阶段，观察到清晰的形态发生。孔中可能存在一些分离的球状体。注意不要通过使板倾斜来抽吸这些球状体，同时在孔中留下一定小体积的含有球状体的培养基。

在培养的第7天(暴露于CHIR99021/FGF4的4天)，存在广泛的形态发生，并且可以看到许多分离的球状体。对细胞进行加工以用于如实例4中所描述的球状体分析或如实例5中所描述的聚集。

表2中提供的后肠内胚层分化培养基配方用于制备1mL的培养基。可以根据需要按比例放大体积。

表2：后肠内胚层分化培养基配方

实例4.现有的球状体方案导致可变性

图7A描述了针对RIO形成的现有球状体产生的示意图，并且在实例1-3中进行了总体描述。总之，人多能干细胞首先暴露于100ng/mL的激活素A持续3天以产生定形内胚层(DE)。然后将DE暴露于3μM CHIR99021和500ng/mL的FGF4的组合持续4天，在此期间发生后肠内胚层的图案化和形态发生和自发球状体产生。在第7天，从HGE单层中收集分离的球状体，包埋在基质胶中，并且在500ng/mL的EGF、100ng/mL的头蛋白和500ng/mL的R-脊椎蛋白中培养28天。在第35天，采集HIO并将其用于后续实验。

使用H1人胚胎干细胞的多次HIQ产生实验(n＝96)中的球状体产生被评估为成功(>50个分离的球状体/孔)；中级(<50个分离的球状体/孔)；或失败(无球状体分离)。评分由单个个体进行。如图7B所示，在同一方案的单独复制中，球状体的形成存在显著可变性。

使用现有方案评估来自H1 hESC和3个人iPSC系(iPSC72_3、iPSC75_1和iPSC285_1)的球状体产生。每个细胞系铺板八个孔并同时进行分化。在第7天，计算每孔分离的球状体的数量，并且捕获每个孔的图像。如图7C所示，球状体产生在不同PSC细胞系之间不同，这对个性化医学的应用有影响。图7D示出了用不同PSC系进行的球状体产生的示例性图像。每个条件的左上角示出了每个孔中分离的球状体的数量。观察到分离的球状体数量的系到系可变性以及稳健的形态发生，但在一些孔中没有球状体分离。

实例5.后肠内胚层聚集

可以采取几种方法来聚集hPSC和细胞衍生物(例如前肠或后肠内胚层)。这些包含但不限于产生悬滴、离心到96孔或384孔“v”或“u”底微孔培养板中，以及使用定轨振荡器聚集细胞。此实例中描述了Aggrewell(干细胞技术有限公司)的使用。

制备Aggrewell 400板。24孔大小的Aggrewell 400板的每个孔可以产生至多1200个聚集体。以下是针对Aggrewell 400板的单孔。可以按比例增加量以制备足够数量的孔/聚集体。将500μL的抗粘附冲洗溶液(干细胞技术有限公司)添加到Aggrewell板的孔中。将板在带有板架附件的摆动桶转子中以1300xg离心5分钟。在显微镜下观察所述板以确保已从微孔中去除气泡。如果仍有气泡，重复离心步骤。丢弃抗粘附冲洗溶液。用2mL的预热的37℃肠基培养基冲洗孔(表3)。丢弃肠基培养基。将1mL补充有10μM的Y-27632的预热的37℃完全佐藤培养基(表4)添加到孔。Aggrewell被保存在37℃的温育箱中直到以后使用。

制备了HGE细胞的单细胞悬浮液。丢弃培养基和任何从HGE内胚层组织培养物中分离的球状体。将0.5mL的预热的37℃Accutase添加到每个孔，并且将板在37℃下温育约5-10分钟。用显微镜监测板以确保细胞已从板中分离。如有必要，细胞可以在37℃下温育另外的时间。Accutase可以用本领域已知的其它酶解离试剂取代，如胰蛋白酶、EDTA、TrypLEExpress(赛默飞世尔科技公司)或TrypLE Select(赛默飞世尔科技公司)，以制备单细胞。将0.5mL补充有10μM的Y-27632的完全佐藤培养基添加到每个孔。用移液管轻轻分散细胞，并且作为单细胞转移到15ml的离心管中。确定悬浮液中的细胞浓度，并且根据以下比率计算要使用的细胞数量：Aggrewell 400板的每孔需要1.2×10⁶个细胞以形成1,000个细胞的聚集体。将此期望数量的细胞转移到新的离心管并且以300xg离心5分钟。丢弃上清液，并且将细胞沉淀物重新悬浮在1mL补充有10μM Y-27632的预热的37℃完全佐藤培养基中。将先前制备的Aggrewell 400板从温育箱中取出。在不去除板中已有的培养基的情况下，将重新悬浮的细胞转移到Aggrewell孔。立即用移液管混合细胞，使细胞均匀分布在整个孔中。Aggrewell板以100xg离心3分钟以捕获微孔中的细胞。在显微镜下检查板以确保细胞均匀分布在微孔中。将Aggrewell板放回温育箱过夜。

表3和4中提供的肠基培养基和完全佐藤培养基配方用于制备50mL的培养基。可以根据需要按比例放大体积。肠基培养基可以在4℃下储存至多2周。对于完全佐藤培养基，在使用之前立即添加EGF、头蛋白和R-脊椎蛋白。

表3：肠基培养基配方

材料	50mL	最终浓度	供应商；目录#
				高级DMEM/F12	46.75mL	-	生命技术公司；12634028
B27+胰岛素(50x)	I mL	lx	生命技术公司；12587-10
				N2补充剂(100x)	500uL	lx	生命技术公司；17502-048
HEPES缓冲液(1M)	750uL	15mM	生命技术公司；15630106
				青霉素/链霉素(100x)	500uL	lx	生命技术公司；15140122
L-谷氨酰胺(100x)	500uL	lx	生命技术公司；25030081

表4：完全佐藤培养基配方

实例6.收集和包埋聚集体

在培养的第8天，对于每个含有聚集体的孔，通过移液将聚集体从微孔中轻轻移出并抽吸到移液管尖端中。将收集的聚集体转移到无菌的15ml离心管。为了取出孔中残留的聚集体，添加1mL的预热的37℃完全佐藤培养基(不含ROCK抑制剂)并重复收集过程。此体积与先前收集的聚集体进行组合。使所收集的聚集体(Aggrewell 400的每孔约1200个)在重力作用下沉淀到管底部。沉淀之后，从聚集体中去除尽可能多的上清液。此去除步骤很重要，因为任何残留的液体都会在重新悬浮时损害基质胶基质的完整性。将200μL的冰冷的基质胶添加到含有聚集体的管。缓慢上下用移液器吸取溶液以均匀地重新悬浮和混合聚集体，同时避免形成空气泡。将50μL的基质胶/聚集体混合物添加到24孔经组织培养处理的板的孔的中心。注意地将基质胶保持在不接触孔的侧面的单滴中，如果发生这种情况，基质胶可能会变平并且球状体可能会粘附于塑料。重复此铺板过程，直到所有的基质胶/聚集体体积都已铺板。将板快速但小心地倒置以防止球状体沉淀到组织培养板的表面。将板转移到37℃温育箱中持续20分钟以促进基质胶聚合。随后，将0.5mL的预热的37℃完全佐藤培养基添加到每个孔。每3-4天更换一次培养基。如果pH指示剂快速变化或如果类器官显得非常密集，则应传代发育中的类器官。

实例7.聚集的肠类器官类似于具有更高可重复性的体内组织

作为对照，对H1 hESC和4个人iPSC系(iPSC72_3、iPSC75_1、iPSC115_1和iPSC285_1)进行分化。在第7天，通过CDX2(HGE标志物)和DAPI(细胞核)的免疫荧光评估HGE的形成。示出了来自每个细胞系的4个随机选择的孔区域的平铺扫描。如图8所示，在所有测试的hPSC细胞系中观察到了CDX2的均匀表达，并且证明了稳健和高效的HGE产生。

图9A描述了用于产生肠内胚层聚集体和聚集的类器官的示意图，其总体上在实例5-6中描述。总之，人多能干细胞首先暴露于100ng/mL的激活素A持续3天以产生DE。然后将DE暴露于3μM CHIR99021和500ng/mL的FGF4的组合持续4天，在此期间发生后肠内胚层的图案化和自发球状体产生。在第7天，无论是否存在分离的自发球状体，都制备了HGE的单细胞悬浮液，并且使用Aggrewell板进行聚集24小时。然后从微孔中收集聚集体，包埋在基质胶中，并在500ng/mL EGF、100ng/mL头蛋白和500ng/mL R-脊椎蛋白中培养28天。在第35天，收集聚集的人肠类器官(aggHIO)并用于后续实验。

H1 hESC和4个人iPSC系(iPSC72_3、iPSC75_1、iPSC115_1和iPSC285_1)使用聚集方案进行分化。分化7天之后，使用Accutase将HGE解离为单细胞，并且在含有500ng/mLEGF、100ng/mL头蛋白和500ng/mL R-脊椎蛋白的培养基中聚集24小时。聚集之后，每个Aggrewell中的细胞的图像被捕获并且以50x(左列；比例尺＝500μm)和200x(右列；比例尺＝100μm)示出。如图9B所示，用Aggrewell形成板可实现肠内胚层细胞的均匀聚集。

使用现有的非聚集方案对H1 hESC进行分化。分化7天之后，使用Keyence BZ-X800系统采集自发产生的分离球状体、对其进行计数和成像。然后使用Accutase将剩余的HGE(即未分离的材料)解离成单细胞并且在含有500ng/mL EGF、100ng/mL头蛋白和500ng/mLR-脊椎蛋白的培养基中聚集24小时。然后还使用Keyence BZ-X800系统对聚集体进行计数和成像。代表性图像如图9C所示。观察到使用聚集方法从非分离单层中产生的球状体数量增加和球状体大小更均匀。

在形成板中的肠内胚层聚集体培养之后球状体的数量被定量并在图9D中示出。使用现有的非聚集方案对H1 hESC和4个人iPSC系(iPSC72_3、iPSC75_1、iPSC115_1和iPSC285_1)的每孔产生的分离球状体的数量进行评分。另外，确定了在每个实验中从非分离的HGE材料获得的解离细胞在每孔中形成的聚集体的平均数量。N＝4个实验。

自发分离(第7天)或聚集(第8天)的球状体被固定并经受免疫染色以鉴定肠上皮细胞(CDH1+/CDX2+)和肠间充质细胞(FoxF1/CDX2+)。图9E示出了由共聚焦显微镜捕获的代表性图像。从肠内胚层聚集体培养的球状体示出了具有更均匀形态的肠上皮和间充质细胞的稳健图案化。

H1 hESC和4个人iPSC系(iPSC72_3、iPSC75_1、iPSC115_1和iPSC285_1)被分化为HGE。在第7天，分离的自发球状体直接包埋在基质胶中，并且未分离的细胞在包埋在基质胶中之前聚集24小时。在含有500ng/mL EGF、100ng/mL头蛋白和500ng/mL R-脊椎蛋白的培养基中培养3天之后，评估包埋的球状体的总体形态。如图10A所示，两种条件都能够产生适当生长和成熟的类器官前体。

自发分离或聚集的球状体被包埋在基质胶中。培养3天之后，球状体被固定并经受整装免疫染色以鉴定肠上皮细胞(CDH1+/CDX2+)和肠间充质细胞(FoxF1/CDX2+)。如图10B所示，两种条件都产生了包括完整肠上皮和间充质的类器官。

H1 hESC分化为HGE。在第7天，分离的自发球状体包埋在基质胶中，未分离的HGE在包埋在基质胶中之前解离和聚集24小时。在第18、25和35天，类器官的形态学分析证明，由分离的球状体和聚集的HGE两者产生的HIO表现出类似的类器官生长，并包括离散的上皮和间充质层(图11A)。

在第35天，采集H1衍生的HIO和AggHIO，并对肠上皮(CDX2+/E-cad+)和间充质细胞(界面蛋白1)的存在进行共免疫荧光分析。如图11B所示，两种条件均产生形成良好的CDX2+/E-cad+上皮和界面蛋白1+间充质。

在第35天，采集了H1衍生的HIO和AggHIO，并对近侧肠标志物CDH17和PDX1的存在进行免疫荧光分析。所有CDX2+上皮细胞对CDH17和PDX1两者均呈阳性，表明近侧小肠图案化。如图11C所示，两种条件都导致对CDH17+/PDX1+近侧小肠组织的图案化。

第35天采集AggHIO并将其移植到免疫缺陷小鼠的肾囊中。6周之后，对小鼠进行安乐死，切除移植的AggHIO，并用苏木精/伊红(H&E)染色进行组织学分析。如图12A所示，聚集的肠类器官适合移植，并经历了稳健的生长和成熟。

将移植的AggHIO切片并进行成熟肠标志物蔗糖酶-异麦芽糖酶(SI；上皮细胞)、Muc2(杯状细胞)、嗜铬粒蛋白A(肠内分泌细胞)和溶菌酶(潘氏细胞)的免疫荧光分析。如图12B所示，移植的聚集肠类器官对所有测试的肠细胞标志物均呈阳性。

实例8.聚集的胃类器官的形成

图13A描绘了用于形成聚集的胃窦类器官的示意图。提供了现有方法和聚集方法之间的比较。图13A的顶部：依赖于窦类器官的自发形成的方法(例如，如以下中所见：McCracken等人《自然(Nature.)》(2014)516(7531):400-4)。图13A底部：改进的方案，包括用于使前肠内胚层聚集的步骤。

从自发分离的球状体和从自聚集的前肠内胚层产生的球状体产生了窦类器官。aHGO形态的代表性图像是在第35天拍摄的(图13B)。

第35天从自发球状体或聚集的前肠内胚层产生的aHGO被固定、切片，并进行胃上皮标志物CLDN18和MUC5AC的免疫染色。源自自发细胞和聚集的细胞的aHGO中的上皮细胞均呈Cdh1/CLDN18/MUC5AC阳性(图13C)。

实例9.聚集的结肠类器官的形成

图14A描绘了用于形成聚集的结肠类器官的示意图。提供了现有方法和聚集方法之间的比较。图14A的顶部：依赖于结肠类器官自发形成的方法。图14A的底部：改进的方案，在用BMP2进行后验之前并入用于使球状体聚集的步骤。

HCO是从自发的、分离的球状体和从自聚集的后肠内胚层产生的球状体中产生的。然后通过暴露于BMP2持续3天将球状体图案化为后命运。32天之后，捕获了HCO形态的代表性图像(图14B)。

第35天从自发球状体或聚集的后肠内胚层产生的HCO被固定、切片并进行结肠上皮标志物SATB2的免疫染色。从自发和聚集的后肠内胚层产生的HCO中的CDH1+上皮表现出类似数量的SATB2阳性细胞(图14C)。

实例10.聚集的肝脏类器官的形成

图15描绘了用于形成聚集的肝脏类器官的示意图。HLO是从自发的、分离的球状体和从自聚集的后肠内胚层产生的球状体中产生的。球状体然后通过暴露于FGF2(10-100ng/mL)、BMP4(10-100ng/mL)、视黄酸(2μM)、肝细胞生长因子(10-20ng/mL)、地塞米松(0.1μM)和制瘤素M(10-100ng/mL)图案化为肝脏类器官。

实例11.培养肠内胚层单层增加中胚层群体

由于用于肠内胚层分化的常规方案涉及具有最少生长因子的定形内胚层的体外培养，因此所得肠内胚层和下游球状体/类器官包括其它重要细胞类型的比率，如与体内组织相比不具有代表性(即更少)的中胚层和间充质。在正常发育中，中胚层和相关的间充质对于适当的细胞组织和组织成熟很重要。因此，需要增加类器官组合物中的中胚层/间充质群体。

根据实例1-5和8中探索的程序制备第3天前肠和后肠内胚层单层。通过中胚层标志物Brachyury(T)和定形内胚层标志物FOXA2的免疫荧光成像染色检查单层(图16A)。图像示出了单层主要由定形内胚层和少量中胚层构成。对这些肠内胚层单层的中胚层和定形内胚层群体进行定量(图16B)。在前肠内胚层单层和后肠内胚层单层两者中，平均分别仅有3％和1％的中胚层细胞，以及分别有94％和87％的定形内胚层细胞。

与第3天单层培养物一样，制备第7天前肠和后肠内胚层单层培养物。由于这些培养物在分化和肠模式(包含自发球状体的形成)方面进一步发展，因此检查了间充质细胞，而不是中胚层细胞。单层用间充质标志物FOXF1和内胚层标志物FOXA2染色，并且观察到间充质部分普遍增加(图16C)。对间充质和内胚层群体进行定量(图16D)。前肠内胚层单层含有3％间充质和91％内胚层，而后肠内胚层单层含有11％间充质和86％内胚层。所观察到的，在培养后肠内胚层单层之后，中胚层/间充质谱系显著增加。

在独立实验中重复对后肠内胚层单层的定量。如图16E中所见，再次，与亲本定形内胚层培养物相比，在第7天，后肠内胚层单层培养物中的中胚层/间充质谱系增加。通过用相对于增殖细胞标志物Ki67的中胚层标志物T和内胚层标志物FOXA2染色细胞来进行定量。

在至少一些前述实施例中，一个实施例中使用的一个或多个元件可以在另一个实施例中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将认识到，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对本文所描述的方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求定义的主题的范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以在适于上下文和/或应用的情况下将复数转换成单数和/或将单数转换成复数。为了清楚起见，本文中可以明确地阐述各种单数/复数排列。

本领域的技术人员应当理解，一般而言，本文所使用的术语，尤其是在所附权利要求中的术语(例如，所附权利要求的主体)通常旨在是“开放性的”术语(例如，术语“包含(including)”应当被解释为“包含但不限于”，术语“具有”应当被解释为“具有至少”，术语“包含(includes)”应当被解释为“包含但不限于”等等)。本领域内的人员将进一步理解，如果所引入的权利要求叙述的特定数字是有意图的，那么将在所述权利要求中明确地叙述此意图，并且在不存在此叙述的情况下，不存在此意图。例如，为了帮助理解，所附权利要求可能包含使用引入性短语“至少一个”和“一或多个”来引入权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示着权利要求陈述通过不定冠词“一个/一种(a或an)”进行的引入将含有这样引入的权利要求陈述物的任何特定权利要求限制为只含有一个这样的陈述物的实施例，即使当同一权利要求包含该引入性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词“一个”或“一种”时也是如此(例如，“一个”和/或“一种”应当被解译为意指“一个或多个”或“至少一个”)；这对于用于引入权利要求陈述物的定冠词的使用同样有效。另外，即使明确地陈述了特定数目的所引入的权利要求陈述，本领域的技术人员也应认识到，此类陈述应被解释为意指至少所陈述的数目(例如，没有其它修饰语的“两个陈述”的无修饰陈述意指至少两个陈述，或者两个或两个以上陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C中的至少一个等”的惯用语的那些情况下，一般而言，此类构造的意图在于本领域的技术人员将理解所述惯用语(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包含但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C和/或同时具有A、B和C的系统等)。在使用类似于“A、B或C中的至少一项等等”的惯例的情况中，通常，这种构造旨在本领域技术人员应当理解所述惯例的意义上(例如，“一个系统具有A、B或C中的至少一项”将包含但是不限于系统单独具有单独的A、单独的B、单独的C、A与B一起、A与C一起、B与C一起、和/或A、B和C三者一起，等等)。本领域的普通技术人员将进一步理解的是无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个替代性术语的几乎任何分隔性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包含这些术语中的一者、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应理解为包含“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在按照马库什(Markush)组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此按照马库什组中的任何单独成员或成员子组进行描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分描述了并且实现了相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含所叙述的数字并且是指可以被随后分解为如本文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。

尽管本文已经公开了各个方面和实施例，但是其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所公开的各个方面和实施例是出于说明的目的，而不是旨在进行限制，并且真实的范围和精神由所附权利要求书指示。

本文引用的所有参考文献，包含但不限于已公开和未公开的申请、专利和参考文献，均通过引用整体并入本文，并且特此成为本说明书的一部分。在通过引用的方式并入的公开和专利或专利申请与本说明书中所包含的公开内容相抵触的情况下，本说明书意欲替代和/或优先于任何这类矛盾材料。

Claims (41)

1.一种产生一个或多个聚集的类器官的方法，所述方法包括：

将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体，其中所述肠内胚层单层是粘附的，并且所述肠球状体被分离并悬浮在生长培养基中；

将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；

将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；

将所述肠内胚层细胞的所述单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及

培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述定形内胚层已经从多能干细胞分化而来。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层已经从胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而来。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层是人定形内胚层。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肠内胚层单层是用Accutase、Accumax、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express或TrypLE Select或其任何组合酶促解离的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚集步骤包括在悬滴中聚集所述单细胞悬浮液，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述形成板是Aggrewell板。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括约250个、约500个、约1000个、约1500个、约2000个、约2500个、约3000个、约3500个、约4000个、约4500个、约5000个、约5500个、约6000个、约6500个、约7000个、约7500个、约8000个、约8500个、约9000个、约9500个或约10000个肠内胚层细胞，或在由上述细胞数量中的任何两个限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养步骤包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与胞外基质或其模拟物或衍生物接触。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶(Matrigel)。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述肠内胚层单层是前肠内胚层单层，并且所述肠球状体是前肠球状体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中将所述定形内胚层分化为所述前肠内胚层单层和所述前肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或者所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白(Noggin)，或其任何组合。

16.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肝脏类器官。

17.根据权利要求16所述的方法，其中培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肝脏类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松(dexamethasone)或制瘤素M(Oncostatin M)或其任何组合接触。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF2，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP4，或两者。

19.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的胃类器官。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个聚集的胃类器官是聚集的胃窦类器官。

21.根据权利要求20所述的方法，其中培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的胃窦类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。

23.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述肠内胚层单层是后肠内胚层单层，并且所述肠球状体是后肠球状体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述定形内胚层分化为所述后肠内胚层单层和所述后肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者接触。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，或所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或两者。

26.根据权利要求23到25中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肠类器官。

27.根据权利要求26所述的方法，其中培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂、或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白，或两者。

29.根据权利要求23到25中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的结肠类器官。

30.根据权利要求29所述的方法，其中培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的结肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂、或一种或多种BMP信号传导通路激活剂或其任何组合接触。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R-脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP2，或其任何组合。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个肠内胚层聚集体包括至少1个、10个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个肠内胚层聚集体，或在由上述肠内胚层聚集体数量中的任何两个限定的数量内的任何数量的肠内胚层聚集体。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括：

在距所述一个或多个肠内胚层聚集体的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径，或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径；或者

在距所述一个或多个肠内胚层聚集体的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的体积，或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积；或两者。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括将所述一个或多个聚集的类器官移植到接受者受试者。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述接受者受试者是哺乳动物。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述接受者受试者是人。

37.一种或多种通过权利要求1到36中任一项产生的聚集的类器官。

38.多种肠内胚层聚集体，其包括至少1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个肠内胚层聚集体，或在由上述肠内胚层聚集体数量中的任何两个限定的数量内的任何数量的肠内胚层聚集体：其中所述多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括：

在距所述多个肠内胚层聚集体的平均直径±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的直径，或在由上述直径中的任何两个直径限定的范围内的任何直径；或者

在距所述多个肠内胚层聚集体的平均体积±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％内的体积，或在由上述体积中的任何两个体积限定的范围内的任何体积；或两者。

39.根据权利要求38所述的多个肠内胚层聚集体，其中所述多个肠内胚层聚集体源自同一受试者。

40.一种形成板，其包括多个微孔和根据权利要求38或39所述的多个肠内胚层聚集体，其中所述多个微孔中的每个微孔包括所述多个肠内胚层聚集体的单个肠内胚层聚集体。

41.根据权利要求38所述的多个肠内胚层聚集体或根据权利要求40所述的形成板，其中所述多个肠内胚层聚集体是根据权利要求1到36中任一项所述的方法产生的。

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