CN110582564A - 从人类多能干细胞衍生肝类器官 - Google Patents

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Abstract

本公开提供多能内胚层球状体祖细胞、肝类器官、肠类器官和胰腺球状体，以及从干细胞和祖细胞产生它们的方法。

Description

从人类多能干细胞衍生肝类器官
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月15日提交的新加坡申请号SG10201507675Y的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
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背景技术
肝脏器官
肝脏是负责调节多种复杂代谢过程的主要器官。肝脏缺陷现在造成了很大的负担，但由于两个主要因素即肝脏供体短缺(Vilarinho and Lifton,2012)以及对肝脏病理潜在机制的不完全理解，肝脏疾病的管理仍然不充分。肝脏疾病的研究由于缺乏肝脏起源代谢疾病的可靠模型而受到阻碍。仍然严重依赖于小鼠模型，其不能充分描述人类疾病发病机理和对药物的反应(Grompe and Strom,2013；Seok et al.,2013；van der Worp etal.,2010)。另一方面，人肝细胞培养中的疾病模型化不能概括涉及器官内多种细胞类型之间相互作用的复杂疾病。此外，原代人类肝细胞对培养中的长期扩增是有挑战的(Mitaka,1998；Shan et al.,2013)，而从多能干细胞(PSC)分化的肝细胞样细胞(Gieseck et al.,2014；Si-Tayeb et al.,2010b)受限于低分化效率和缺乏在肝脏中发现的成熟功能能力。对于类似于从基础研究到工业和医疗应用的体内肝脏组织的高质量肝脏模型存在相当大的需求。
类器官
使用3维体外培养系统可以克服这些问题以产生组织样类器官。类器官被称为由三个特定标准定义的“微器官”：1)具有至少2个器官特异性细胞类型；2)细胞3D自组织以形成与器官中的组织类似的结构；和3)能够体现器官特异性功能(Lancaster and Knoblich,2014)。它们可以由人类来源的细胞产生，以避免在疾病发病机理和药物反应中隐藏的物种特异性差异，同时模拟体内疾病表现，包括涉及3D空间的各种细胞类型之间的相互作用(Matano et al.,2015；van de Wetering et al.,2015)；这些特性使其成为体外肝功能和疾病研究的理想选择。尽管没有描述具有上述标准的肝类器官，但是已经从人诱导多能干细胞(iPSC)(Takebe等，2013)和成体肝干细胞(Huch等，2015)衍生出复杂的3D肝脏培养物。这些技术尚未显示出两种主要肝细胞类型肝细胞和胆管细胞之间的功能性相互作用，并且在体外没有表现出任何肝特异性功能。另外，在这些3D肝脏体外培养物中没有观察到肝脏组织结构。当前的类器官生成方案也受到用于大规模扩增的极高成本的限制(Spence etal 2011,Lancaster et al 2013,Takasato et al 2016)，大规模扩增对于需要大量细胞的下游应用如植入(Fisher和Strom，2006)和高通量筛选是必要的。可扩展性取决于通过自身或其前体的增殖而扩增培养物至大量的能力。因此，自我更新的PSC被认为是终末分化细胞的有希望的来源。
自我更新的内胚层祖细胞
然而，类器官的PSC生成是复杂的，需要跨多个中间状态分化以产生特定的体细胞类型。对于内胚层组织如肝脏，通过将PSC连续暴露于细胞因子模拟人胚胎形态发生能够使它们在体外衍生(Basma et al.,2009；D'Amour et al.,2006；Spence et al.,2011)。然而，这些方法(1)利用复杂和长期的分化方案，通常只有低到中等的效率(Murry和Keller，2008)，(2)倾向于产生具有不成熟性质和不完整功能的细胞，以及(3)有畸胎瘤形成的风险(Hentze等，2009)。方案中所需的中间状态(步骤)的数量是总体分化效率的重要因素。对于每个步骤的80％分化效率，2步分化方案将具有64％的总体效力，3步方案为51.2％。50％分化效率的低效率也意味着2个细胞中的1个不是期望的，并且这些污染细胞在下游应用中导致许多并发症。为了克服这个问题，一些小组创建了自我更新的内胚层祖细胞，其可以用作替代细胞来源(Cheng et al.,2012；Hannan et al.,2013)，但是这些早期的内胚层祖细胞保持相对原始的分化格局并且仍然需要很多分化步骤来产生期望的内胚层细胞类型。需要产生晚期内胚层祖细胞，其可以在更短的时间和更少的步骤中产生感兴趣的器官细胞类型。除了晚期内胚层祖细胞之外，已经致力于形成特定器官谱系的成体干细胞是理想的细胞来源。此外，与PSC起源的细胞相比，这些成体干细胞会产生具有成体表型的细胞类型。
发明内容
本文描述了多能内胚层球状体祖细胞(MESP)，其是可用作人肝细胞来源的人多能干细胞(hPSC)衍生的自我更新祖细胞群，以及来自前肠后部如肠和胰腺的其他谱系。通过概述在发育过程中肝脏分化的逐步过程，本文描述的方法能够实现包含主要实质肝脏肝细胞类型——肝细胞和胆管细胞——的MESP衍生肝类器官的可扩展生产。这两种细胞类型自组织成类似于人类肝脏单位的结构并具有许多肝脏特异性功能。利用基因组编辑CRISPR/Cas技术，发明人开发了具有熟悉的高胆固醇血症的肝类器官模型，并证明了患病的肝类器官对他汀类药物的反应。另外，发明人以高通量方式产生了可适用于大规模筛选的类器官，证明了该技术对于研究和工业应用两者的适用性。此外，采用类似的技术，从成体干细胞产生肝类器官，这些类器官表现出与由MESP细胞产生的类器官类似的结构和肝特异性功能。
发明人已经令人惊讶地发现可以使用单一培养基产生肝细胞和胆管细胞两者。这与本领域已知的相反。例如，TGFβ信号传导促进胆管细胞形成，但抑制肝细胞形成。通常将TGFβ信号传导分子添加到胆管细胞培养物中，但从用于产生肝细胞的培养基中排除，并且在许多方法中，将TGFβ途径的抑制剂添加到用于产生肝细胞的培养基中。
一方面，提供肝类器官，所述肝类器官包含至少两种选自肝细胞、胆管细胞、肝特异性内皮细胞(LSEC)、星状细胞、肝成肌纤维细胞和成肝细胞的细胞类型。在一些实施方式中，肝细胞
a)表达白蛋白(ALB)；
b)表达选自以下的至少一种肝细胞标志物：HNF4a(NCBI:3172)、FAH(NCBI:2184)、TAT(NCBI:6898)、GCK(NCBI:2645)、TTR(NCBI:7276)、MET(NCBI:4233)、GLUl/MGAM(NCBI:8972)、FAHD2A(NCBI:51011)、HNF1B(NCBI:6928)、HNF1A(NCBI:6927)、CYP3A4(NCBI:1576)、CYP2C9(NCBI:1559)、CYP2C19(NCBI:1557)、CYP1A2(NCBI:1544)、CYP2E1(NCBI:1571)、CYP2D6(NCBI:1565)、CYP3A7(NCBI:1551)、CYP1A1(NCBI:1543)、CYP3A5(NCBI:1577)、CYP27A1(NCBI:1593)、MRP2(NCBI:1244)、NTCP(NCBI:6554)、OATP1B3(NCBI:28234)、UGT2B7(NCBI:7364)、UGT2B15(NCBI:7366)、UGT1A1(NCBI:54658)、CEBP(NCBI:1050)、KRT8(NCBI:3856)、NOTCH2(NCBI:4853)和CYP2B6(NCBI:1555)；和
c)不表达胆管细胞标志物细胞角蛋白7(CK7)。
在一些实施方式中，肝细胞标志物包含或由以下组成：HNF4a(NCBI:3172)、FAH(NCBI:2184)、TAT(NCBI:6898)、GCK(NCBI:2645)、TTR(NCBI:7276)、MET(NCBI:4233)、GLUl/MGAM(NCBI:8972)、FAHD2A(NCBI:51011)、HNF1B(NCBI:6928)、HNF1A(NCBI:6927)、CYP3A4(NCBI:1576)、CYP2C9(NCBI:1559)、CYP2C19(NCBI:1557)、CYP1A2(NCBI:1544)、CYP2E1(NCBI:1571)、CYP2D6(NCBI:1565)、CYP3A7(NCBI:1551)、CYP1A1(NCBI:1543)、CYP3A5(NCBI:1577)、CYP27A1(NCBI:1593)、MRP2(NCBI:1244)、NTCP(NCBI:6554)、OATP1B3(NCBI:28234)、UGT2B7(NCBI:7364)、UGT2B15(NCBI:7366)、UGT1A1(NCBI:54658)、CEBP(NCBI:1050)、KRT8(NCBI:3856)、NOTCH2(NCBI:4853)和CYP2B6(NCBI:1555)。
在一些实施方式中，胆管细胞表达CK7但不表达白蛋白(ALB)。在一些实施方式中，胆管细胞还表达选自CFTR(NCBI：1080)、CK19(NCBI：3880)、HNF1B(NCBI：6928)或SOX9(NCBI：6662)的标志物。
在一些实施方式中，成肝细胞表达选自以下的至少一种标志物：SOX9(NCBI:6662)、CK19(NCBI:3880)、CK18(NCBI:3875)、HNF4a(NCBI:3172)、PROX1(NCBI:5629)、ONECUT1(NCBI:3175)、AFP(NCBI:174)和ALB(NCBI:213)。
在一些实施方式中，肝脏特异性内皮细胞(LSEC)表达选自CD45、CD80、CD86、CD11c、VAP1、STAB1和CD31的至少一种标志物，其中CD31表达主要在细胞质中而不在细胞表面上。
在一些实施方式中，星状细胞表达选自GFAP、VIM、LHX2、LRAT、PDGFRb、HAND2、ICAM-1、VCAM-1和N-CAM-1的至少一种标志物。
在一些实施方式中，肝成肌纤维细胞表达选自COL1A1和α-SMA的标志物。
在一些实施方式中，实质细胞类型源自相同的干细胞。
在一些实施方式中，将肝类器官细胞悬浮培养而不使用胞外基质。
在一些实施方式中，类器官能够执行肝功能并且显示在肝中观察到的空间组织结构。在一些实施方式中，肝功能选自：肝特异性代谢活性、白蛋白分泌、糖原贮存、低密度脂蛋白摄取、胆汁酸产生、药物代谢和细胞色素酶活性。在一些实施方式中，空间组织结构包含肝细胞的核心和由肝细胞的核心周围的胆管细胞形成的外周胆管样结构。在一些实施方式中，空间组织结构包括内源性细胞外基质粘附分子。在某些情况下，空间组织结构包括类器官内部和外部两者的肝实质细胞。在一些实施方式中，肝细胞通过胆小管网络与胆管细胞胆管样结构连接。
另一方面，提供了用于产生肝类器官的培养基，所述培养基包含：
a)STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
b)作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
c)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
e)类固醇；
f)至少一种用于诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
g)调节胆汁酸合成和/或激活FGF和MAPK途径的分子。
在一些实施方式中，所述培养基还包含WNT信号传导激活剂。
另一方面，提供了用于产生肝类器官的培养基，所述培养基包含：
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
属于白细胞介素6组细胞因子的多效性细胞因子；
γ-分泌酶抑制剂；和
类固醇。
另一方面，提供了衍生和维持肝(肝脏)类器官的方法，所述方法包括：
a)在第一细胞培养基中培养内胚层干细胞以获得早期肝祖细胞；
b)将在a)中获得的所述细胞转移并在第二细胞培养基中的悬浮培养系统中培养以获得晚期肝祖细胞；和
c)在第三细胞培养基中的悬浮培养系统中培养b)中获得的晚期肝祖细胞以获得肝(肝脏)类器官。
在一些实施方式中，内胚层干细胞是早期内胚层祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、MESP或成体肝干细胞。在一些实施方式中，内胚层干细胞是MESP或成体肝干细胞。
在一些实施方式中，第一培养基包含：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
WNT信号传导激活剂；
类固醇；
至少一种诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
激活FGF和MAPK途径的分子。
在一些实施方式中，a)中的培养与细胞载体或细胞外基质一起进行。在一些实施方式中，细胞外基质促进细胞分化并且由选自基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素、其他合成聚合物或聚合物支架和固体支持材料的材料组成。
在一些实施方式中，a)中的培养持续1至10天或1至8天或1至6天。在一些实施方式中，b)中的培养持续6至12天或4至10天或6至8天。在一些实施方式中，c)中的培养持续18至26天或20至24天或19至22天。
在一些实施方式中，第二细胞培养基包含：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
类固醇；
诱导SMAD1和SMAD5磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的分子。
在一些实施方式中，第二细胞培养基还包含促进晚期肝祖细胞存活的组分，其中所述组分选自下列组分中的一种或两种或三种或全部：
AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；
cAMP依赖性途径的激活剂或蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；
Notch受体激活剂；
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；和/或
诱导晚期肝祖细胞形成的成分。
在一些实施方式中，用于诱导晚期肝祖细胞形成的组分是WNT信号传导激活剂、γ-分泌酶抑制剂；和/或YAP抑制剂。
在一些实施方式中，第三细胞培养基包含：
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
属于白细胞介素6组细胞因子的多效性细胞因子；
γ-分泌酶抑制剂；和/或
类固醇。
在一些实施方式中，第三细胞培养基还包含：
诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的化合物；
充当促炎细胞因子和抗炎肌动蛋白两者的白细胞介素；
作为调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的激素的化合物；
cAMP依赖性途径的激活剂；
YAP抑制剂；
具有胆汁酸效力的化合物；
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
糖胺聚糖；和/或
AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂。
另一方面，提供了多能内胚层球状体祖细胞(MESP)。在一些实施方式中，MESP表达选自以下的1、2、3、4、5、6、7或更多或全部标志物：HNF4A(NCBI基因：3172)、PDX1(NCBI基因：3651)、CDX2(NCBI基因：1045)、SOX9(NCBI基因：6662)、KRT19(NCBI基因3880)、AFP(NCBI基因174)、ONECUT2(NCBI基因9480)、LGR5(NCBI基因8549)、EPHB2(NCBI基因：2048)、LGR4(NCBI基因：55366)、NR5A2(NCBI基因：2494)、CDH1(NCBI基因：999)、KRT7(NCBI基因：3855)、ZNF503(NCBI基因：84858)、MSX2(NCBI基因：4488)、TRPS1(NCBI基因7227)、ASCL2(NCBI基因430)、IRF8(NCBI基因3394)、HNF4G(NCBI基因3174)、ID2(NCBI基因3398)、CD44(NCBI基因960)、EPCAM(NCBI基因：4072)、MET(NCBI基因：4233)、IHH(NCBI基因：3549)和CLDN3(NCBI基因：1365)。在一些实施方式中，MESP不表达选自SOX2(NCBI基因：6657)、CER1(NCBI基因：9350)、GATA4(NCBI基因：2626)、SOX17(NCBI基因：64321)、FOXA2(NCBI基因：3170)和CXCR4(NCBI基因：7852)的标志物。在一些实施方式中，MESP的核型在培养中至少10代传代是正常的。在一些实施方式中，MESP细胞是极化的。
另一方面，提供了用于衍生和维持内胚层球状体祖细胞的培养基，所述培养基包含：
a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；和
b)WNT信号传导激活剂。
在一些实施方式中，培养基还包含类固醇。在一些实施方式中，WNT信号传导激活剂是GSK3抑制剂。在一些实施方式中，培养基还包含AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；cAMP依赖性途径和/或蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；激活Notch受体的化合物；作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；选自烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米的化合物；和组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
另一方面，提供了产生多能球状体祖细胞(MESP)的方法，所述方法包括：
i)在适于将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件下，在细胞载体上的第一培养基中培养内胚层祖细胞；
ii)在适于将所述定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件下，在第二培养基中培养所述定形内胚层细胞；和
iii)在适于将原肠细胞分化成MESP细胞的条件下，在细胞载体上的第三培养基中培养原肠细胞。
在一些实施方式中，适于将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件以及适于将定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件包括二维单层培养。在一些实施方式中，适于将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件以及适于将定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件包括三维单层培养。在一些实施方式中，适于将原肠细胞分化成MESP细胞的条件包括三维培养。
在一些实施方式中，第一培养基包含TGF-β信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，第二培养基包含BMP信号传导途径的激活剂和FGF信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，第三培养基包含TGF-β信号传导途径的抑制剂、WNT信号传导途径的激活剂和Notch信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，第三培养基还包含：
a)SMAD2/3抑制剂；
c)类固醇；
d)AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂；
e)STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
f)cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；
h)NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂；或
i)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
在一些实施方式中，细胞载体包含选自基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素和合成聚合物或聚合物支架的材料。
另一方面，提供了一种胰腺球状体。在一些实施方式中，胰腺球状体包含表达标志物PDX1(NCBI 3651)和NKX6.1(NCBI 4825)的细胞。在一些实施方式中，胰腺球状体包含胰腺外分泌和内分泌细胞。在一些实施方式中，胰腺球状体包含表达以下的细胞：
a)选自GCG(NCBI 2641)、INS(NCBI 3630)和SST(NCBI 6750)的内分泌标志物；和/或
b)选自PDX1(NCBI 3651)、NKX6.1(NCBI 4825)、NKX2.2(NCBI 4821)、NEUROD1(NCBI 4760)和MAFA(NCBI 389692)的标志物；和/或
c)选自PRSS1(NCBI 5644)、CPA1(NCBI 1357)、AMY1(NCBI 276)和CTRC(NCBI11330)的腺泡细胞标志物；和/或
d)导管标志物角蛋白19(NCBI 3880)。
在一些实施方式中，胰腺球状体细胞分泌选自INS(NCBI 3630)、GCG(NCBI 2641)、SST(NCBI 6750)或PRSS1(NCBI 5644)的一种或多种激素或酶。在一些实施方式中，胰腺球状体细胞不表达EPCAM和SOX9。
另一方面，描述了制造胰腺球状体的方法，其中所述方法包括：
a)在第一细胞培养基中培养内胚层祖细胞以获得早期胰腺内胚层祖细胞；
b)将a)中获得的所述细胞转移到第二细胞培养基中并在悬浮培养系统中培养细胞以获得晚期胰腺内胚层祖细胞；
c)在第三细胞培养基中在悬浮培养系统中培养b)中获得的细胞以获得胰腺类器官。
在一些实施方式中，a)中的细胞与细胞外基质一起培养。在一些实施方式中，a)中的培养持续1至10天或1至8天或1至6天或1至4天。在一些实施方式中，b)中的培养持续8至16天或6至14天或4至12天或5至10天。在一些实施方式中，c)中的培养持续18至26天或20至24天或19至22天或16至20天。
在一些实施方式中，早期胰腺内胚层祖细胞表达选自SOX9(NCBI：6662)、PDX1(NCBI：3651)、NKX6.1(NCBI：4825)和CK19(3880)的一种或多种标志物。在一些实施方式中，晚期胰腺内胚层祖细胞表达选自PDX1(NCBI：3651)、NKX6.1(NCBI：4825)、NEUROG3(NCBI：50674)、NKX2.2(NCBI：4821)、NEUROD1(NCBI：4760)和PAX6(NCBI：5080)的一种或多种标志物。
另一方面，提供了用于早期胰腺内胚层祖细胞形成的培养基，其中所述培养基包含：
a)AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂；
b)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
c)WNT信号传导激活剂；和/或
d)FGF和MAPK途径激活剂。
在一些实施方式中，培养基还包含作为NFκB活性的阻遏物和/或促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子。在一些实施方式中，所述培养基还包含：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
cAMP依赖性途径激活剂；
Notch受体激活剂；
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；和/或
类固醇。
另一方面，提供了用于晚期胰腺内胚层祖细胞形成的培养基，其中所述培养基包含：
视黄醇的代谢物；
(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂；
FGF和MAPK途径激活剂；
蛋白激酶C激活剂；和
Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂。
在一些实施方式中，所述培养基还包含γ-分泌酶抑制剂；AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；和/或选自烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米的化合物。
另一方面，用于衍生和维持胰腺球状体的培养基，其中所述培养基包含：
视黄醇的代谢物；
ACTR-IB、TGFβRI和ACTR-IC抑制剂；
(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂；
FGF和MAPK途径激活剂；
γ-分泌酶抑制剂；
Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂；
AMPK信号传导激活剂；和/或
糖胺聚糖。
在一些实施方式中，所述培养基还包含γ-分泌酶抑制剂；AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；和/或选自烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米的化合物。
另一方面，提供了一种肠类器官。在一些实施方式中，肠类器官包含表达肠标志物Villin和CDX2的细胞。在一些实施方式中，肠类器官包含具有内腔的盘绕结构。在一些实施方式中，肠类器官包含细胞是极化的并且包含Villin的不对称分布。
另一方面，提供了筛选化合物的生物学效应的方法。在一些实施方式中，方法包括使本文所述的肝或肠类器官与化合物(例如测试化合物)接触，并测定生物学效应。在一些实施方式中，化合物是小分子，例如分子量小于约50kDa、小于约10kDa、小于约1kDa、小于约900道尔顿或小于约500道尔顿的有机分子。在一些实施方式中，生物学效应是毒性。在一些实施方式中，标志物的表达或活性在使类器官与测试化合物接触后测定。
定义
术语“约”在修饰任何量时，是指本领域技术人员通常遇到的量的变化，即在干细胞和类器官衍生和分化领域中的变化。例如，术语“约”是指在批次或样品内和批次或样品之间的给定分析技术的测量中遇到的正常变化。因此，术语“约”可以包括测量量或值的1-10％的变化，诸如+/-1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的变化。本文公开的量包括这些量的等同方式，包括由术语“约”修饰或未修饰的量。
本文公开的所有数值范围包括该范围的下限点和上限点，以及在端点之间之间的所有数值，至有效数字。例如，1至10的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。0.1至5.0的范围包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2，...4.8、4.9和5.0。
当提及基因、蛋白质或细胞标志物的表达时，术语“基本上”是指完全或几乎完全的表达度或程度。例如，特定细胞标志物“基本上”为阴性的细胞群对于特定细胞标志物完全为阴性，或者至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％或至少99％、或至少99.9％的细胞群对于特定细胞标志物是阴性的。“基本上”不含特定试剂的细胞培养系统意味着细胞培养系统完全不含该试剂，或者至少95％、或者至少96％、或者至少97％、或者至少98％或至少99％、或至少99.9％不含该特定试剂。
术语“类器官”是指类似于脊椎动物、哺乳动物或人体器官的体外3维细胞群。类器官满足以下标准：1)包含器官的多种细胞类型，2)不同细胞类型在空间上组织成类似于器官组织的结构，3)类器官应在体外执行器官特异性功能。
术语“球状体”是指形成球状结构的体外三维细胞群。与类器官不同，球状体不具有多种器官细胞类型，主要由干细胞组成，并且不形成类似于器官的结构。
术语“实质”是指与结缔组织和血管支持组织相比组成器官的功能细胞类型。
术语“祖细胞”是指具有产生具有不同细胞状态的一个或多个子细胞的能力的细胞状态。
术语“早期内胚层祖细胞”是指能够在人类肠系统的器官中产生内胚层细胞类型的细胞。早期内胚层祖细胞通常表达早期内胚层标志物SOX17和CXCR4。
术语“晚期内胚层祖细胞”是指能够在人类肠系统的器官中产生内胚层细胞类型的细胞。晚期内胚层祖细胞通常表达SOX9但不表达早期内胚层标志物SOX17和CXCR4。
术语“内胚层祖细胞”是指具有产生分化或成体肝组织中发现的所有细胞类型的潜力的细胞。
术语“内胚层球状体祖细胞”是指在球状体培养系统中维持并具有产生分化或成体肝脏、肠和胰腺组织中发现的所有细胞类型的潜力的细胞。
术语“早期肝祖细胞”是指具有产生分化或成体肝组织中发现的细胞类型的潜力并表达早期肝祖细胞标志物如AFP的细胞。
术语“晚期肝祖细胞”是指具有产生分化或成体肝组织中发现的细胞类型的潜力并表达晚期肝祖细胞标志物如ALB的细胞。
术语“成体肝干细胞”是指从成体肝脏中分离并且具有产生不同肝细胞类型的能力的细胞。在一些实施方式中，成体肝干细胞是从哺乳动物例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、牛、猪或人分离的。
术语“干细胞”是指可稳定增殖并维持其细胞状态的细胞状态。干细胞可以进行产生具有相似细胞状态的2个子细胞的对称细胞分裂，或产生具有相似细胞状态的1个子细胞和具有不同细胞状态的1个子细胞的不对称分裂。该术语包括未分化或未特化的细胞，其能够通过细胞分裂使其自身永久存在并且具有产生具有特定功能的分化细胞(例如肝细胞、胰腺细胞和肠细胞)的潜力。
术语“胆管样”是指类似于肝脏中的胆管的结构。胆管由胆管细胞形成，胆管细胞被组织成包围内腔。
术语“功能连接”是指两种分开的细胞类型之间的结构连接，其例如促进两种分开的细胞类型之间的分子运输，或者提供促进本文描述的一种或多种细胞类型的成熟和分化的条件。在一些实施方式中，功能连接是指通过扩散、通过主动转运或通过物理细胞结构(例如胆管样结构或胆小管)在细胞之间转运分子。
术语“不表达”或“不可检测”是指标志物表达不超过背景表达或阴性对照表达的1.5倍以上。例如，如果测定是免疫荧光(IF)染色测定，那么如果当忽略初级检测抗体时荧光信号不大于背景信号的1.5倍，或者不大于不表达标志物(即，对于标志物是阴性的)的对照细胞的荧光信号的1.5倍，则认为蛋白质“不表达”。在微阵列测定和定量RT-PCR测定中，当RNA表达或相对强度比不表达转录物的对照细胞高不到1.5倍时，则转录物不表达。
术语“表达”或“富集”是指与背景表达或阴性对照表达相比，存在超过1.5倍的可检测标志物表达。例如，如果测定是定量PCR测定，则如果表达水平大于阴性对照样品的表达的1.5倍，则认为标志物“表达”或“富集”。如果测定是免疫荧光(IF)染色测定，则如果荧光信号在省略初级检测抗体时大于背景信号的1.5倍，或者大于不表达标志物(即，对于标志物是阴性的)的对照细胞的荧光信号的1.5倍，则认为标志物蛋白“表达”或“富集”。
术语“悬浮培养”或“悬浮培养系统”是指任何这样的培养条件或系统，其中细胞未被包埋在固体或半固体基质中并且自由漂浮在培养装置中而不停留在装置的底部，或者不附着于细胞饲养层或细胞载体层。
术语“固体载体材料”是指用于支持细胞生长的固体或半固体材料，其中细胞不处于悬浮培养。术语“细胞载体”是指为培养中的细胞提供结构和营养支持的材料。细胞载体可以提供结构支持和细胞因子，其在维持未分化状态的肝干细胞方面发挥作用。细胞载体可以包括选自以下的材料：基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素和合成聚合物或聚合物支架。在一些实施方式中，细胞载体将干细胞维持在诸如球状体或类器官的3D结构中。在一些实施方式中，细胞载体包含如本文进一步描述的细胞外基质。
术语“内源性”是指由本文所述的细胞或类器官产生或合成的生物系统的组分或分子。术语“外源性”是指生物系统的组分或分子，所述组分或分子源自生物系统外的试剂或由生物系统外的试剂产生或合成，例如，不由本文描述的细胞或类器官产生或合成的分子。
术语“基因修饰的”是指包含不存在于未修饰的细胞中，或不具有与内源核酸或基因相同的结构的外源核酸的细胞。
附图说明
图1.MESP从多能干细胞衍生的示意图。PSC沿着内胚层谱系逐步分化。PSC在3D中培养以形成MESP之前在2D中分化为定形内胚层细胞和随后的原肠细胞。
图2.在PSC分化成MESP期间诱导定形内胚层(DE)和原始GUT标志物。多能性标志物如OCT4和NANOG在该过程中下调。诸如SOX17、HHEX1、CER1和CXCR4等标志物在DE细胞中上调，随后随着细胞进一步进化形成原GUT细胞而下调。诸如HNF4A、HNF1B和FOXA2等标志物逐渐上调。结果表明细胞沿着内胚层谱系的进行性承诺(commitment)并且细胞不再类似于定形内胚层祖细胞。
图3A.MESP的长期培养。MESP可以在约260天内稳定传代19次。
图3B.MESP的长期培养。MESP可以从每次传代中接种的单细胞形成。这反映了细胞的克隆扩展潜力，球状体内的每个干细胞都能够形成MESP。
图4.MESP表达后部前肠的标志物。在发育期间，肠管的各个部分产生从气管到大肠的主要器官。具体而言，前部前肠产生气管、食道和肺，后部前肠产生十二指肠、肝脏和胰腺，中肠和后肠分别形成小肠和大肠。肠管的每个区域表达特定的标志物。MESP特异性表达在后部前肠富集的基因的转录物。通过将基因表达水平归一化至hESC获得相对倍数变化。数据支持这些祖细胞能够形成这3种器官的组织。
图5A.干细胞标志物在MESP中的均匀表达。蛋白质标志物如HNF4A、CDX2和PDX1在所有细胞中均匀表达。细胞还表达成体干细胞标志物如CK19和SOX9。
图5B.干细胞标志物在MESP中的均匀表达。针对3种标志物PDX1、CDX2和HNF4A染色的MESP细胞的FACS分析。结果显示与对照DE细胞和不表达这些标志物的hESC相比，细胞对所有3种标志物均匀染色。
图6.MESP培养系统的可扩展性。MESP可以在从8孔室玻片(每孔0.8cm2的表面积)至12孔培养皿(每孔3.7cm2的表面积)的大培养容器中培养。不同培养容器中培养的MESP高度相似。细胞的数量与培养容器的大小成比例地增加。结果强调培养系统的可扩展性，以为下游应用产生大量细胞。
图7A.稳定的长期MESP培养。每个孔(8孔室玻片)产生的细胞数量在长期培养中保持一致。在孔中传代21次后的细胞总数相当于6代。这些数据支持MESP的长期自我更新能力，并且细胞在长达280天的长期培养中不衰老。
图7B.稳定的长期MESP培养。测定MESP中的细胞的核型异常。长期培养10代(约140天)后，细胞保持正常的核型。
图8.MESP的转录组不同于hESC、DE和GUT。使用全基因组微阵列分析hESC、DE细胞、GUT细胞和MESP的全局基因表达谱。MESP簇的转录组谱与其他3种细胞状态明显不同。表达谱表明，与DE和GUT内胚层细胞相比，MESP是独特的干细胞状态。
图9：MESP不表达DE祖细胞特异性基因。内胚层标志物的表达对于DE祖细胞(Cheng等人和Hannan等人)和MESP是独特的。先前研究中鉴定的DE祖细胞标志物如GATA3、GATA4、SOX17、FOXA2、CXCR4在分析的DE细胞中表达，而不在MESP中表达。相应地，MESP特异性标志物如PDX1、CDX2、HNF4A、SOX9和KRT19不在DE细胞中表达。
图10：MESP表达许多在胎儿和成体干细胞中发现的基因。在来自各种器官(包括肠、肝、胰腺、结肠和前列腺)的胎儿和成体干细胞中表达的干细胞标志物列表的表达。与DE和hESC相比，许多这些基因在MESP中表达。结果强调了MESP的晚期内胚层细胞状态。
图11：MESP产生的肠类器官。使用Spence等人描述的类似方法将MESP分化成肠类器官。在分化的3周内，可以观察到类似于小肠的肠样盘绕结构。肠样结构包裹在一层成纤维细胞样细胞中。
图12.肠类器官表达关键肠道组织标志物CDX2和Villin。肠类器官中的所有细胞对肠标志物CDX2和Villin呈阳性染色。细胞在培养中自组织以形成类似于肠道的内腔。Villin的不对称分布表明细胞是极化的，类似于衬在小肠中的细胞。
图13：MESP可以由诱导性多能干细胞(iPSC)产生。尽管iPSC与hESC非常相似，但这些细胞表现出分子差异，并且可能不完全概括hESC特征。结果显示，我们可以类似地使用该方案以从iPSC生成MESP。由iPSC产生的MESP也表达关键干细胞标志物HNF4A、CDX2、PDX1、CK19和SOX9。
图14：用MESP产生多种器官的疾病模型。产生肝脏、胰腺和肠道疾病的体外模型的策略。这些器官的遗传疾病可以用可由基因组编辑工具例如CRISPR/Cas系统处理的干细胞建模。大量的研究表明，携带特定疾病的基因突变的体细胞可以重编程为iPSC。这种策略使得可以随后产生具有疾病遗传背景的MESP。如此，本文所述的MESP培养系统可用于建模MESP能够产生的器官的疾病。图16.从多能干细胞向个体器官的内胚层发育。在发育过程中，多能干细胞首先产生定形内胚层(DE)细胞，因为该细胞致力于内胚层谱系。DE细胞产生原始的肠道，其中前部至后部区域产生不同的器官。在内胚层发育晚期，肠的不同部分开始表达特定的调节因子(主要转录因子)，并致力于形成从前部区域中的气管到后肠中的大肠的各个器官。MESP代表致力于形成肝脏、胰脏和十二指肠的晚期内胚层祖细胞。晚期内胚层祖细胞的关键优势是当祖细胞分化成特定组织类型时细胞污染减少。早期内胚层祖细胞需要更多的分化步骤来产生目标组织。由于这些细胞的致力性较差(less committed)，它们在分化过程中产生其他器官的组织，产生污染性细胞类型。
图17.从MESP开始的肝类器官分化的示意图。MESP在悬浮H1培养基中接种为单细胞。细胞聚集形成球状体并表达早期肝祖细胞标志物如AFP。随后用H2诱导培养基处理球状体以诱导表达ALB的晚期肝祖细胞形成。最后，使用H3培养基将晚期肝祖细胞球状体分化成肝类器官。
图18.在HI和H2处理后，在祖细胞中表达关键肝脏标志物。H1培养基处理后，分化的MESP(早期肝祖细胞)开始表达AFP。这标志着该细胞致力于成为肝脏谱系。在H2培养基处理后，细胞表达ALB，表明细胞是晚期肝祖细胞。每次培养基处理后肝脏标志物的逐步诱导表明该系统是高度受控的并且可以用于模拟体外肝脏发育。
图19.从MESP分化的肝类器官的明场图像。类器官含有由不透明中心反映的肝细胞的密集核心。对于外周，细胞较不密集，可观察到胆管样囊肿结构。
图20.肝细胞和胆管细胞在类器官中分别被ALB和CK7差异化标志。在类器官中，ALB阳性细胞主要是肝细胞，而胆管细胞表达CK7。CK7细胞在具有密集肝细胞核的类器官外周形成囊肿样结构。细胞在空间上组织并且非随机分布在类器官中。
图21A和21B.与肝小叶相比，类器官中肝细胞和胆管细胞的类似排列。类器官类似于肝小叶的基本结构单元(A)，其中肝细胞位于门静脉周围的肝小叶的核心中，并且胆管细胞在肝细胞核的外周类似地形成胆管样囊肿结构(B)。
图22.肝组织基因在肝类器官中的表达。与未分化MESP相比，肝细胞特异性基因和胆管细胞特异性基因均在肝类器官中表达。结果支持类器官中存在两种细胞类型。
图23.肝脏特异性酶和转运蛋白在肝类器官中的表达。肝类器官表达所有主要的细胞色素P450酶和UDP-葡萄糖醛酸转移酶。这些酶对于肝脏的所有代谢和解毒功能是重要的。结果支持类器官可以执行肝脏器官的代谢活动。类器官还表达胆汁酸转运蛋白NTCP和OATP1B3。这些代谢酶和转运蛋白的表达表明类器官具有类似于肝脏器官的解毒和胆汁分泌功能。
图24.多药耐药相关蛋白2(MRP2)在肝类器官中的表达。使用特异于转运蛋白MRP2的抗体染色肝类器官。类器官中的肝细胞表达MRP2，并且染色显示肝类器官中的网络与肝组织中的胆小管相似。MRP2定位于肝细胞的顶端区域，并负责将肝细胞胆汁分泌到胆小管中。这种蛋白质在类器官中的表达表明器官中存在胆小管网络。
图25.囊性纤维化跨膜电位调节因子(CFTR)在肝类器官的胆管细胞中的表达。用特异于转运蛋白CFTR的抗体染色肝类器官。类似于之前的报道，CFTR仅在胆管样结构中的胆管细胞中表达。CFTR是一种重要的膜转运蛋白，该基因的突变导致囊性纤维化，这是一种常见的遗传疾病。
图26.肝特异性标志物α-1抗胰蛋白酶(AIAT)的表达。用A1AT特异性抗体染色肝类器官。A1AT是一种由肝脏产生和分泌的蛋白酶抑制剂，对抑制嗜中性粒细胞分泌的酶如弹性蛋白酶很重要。A1AT缺乏是一种常见的遗传性疾病，导致肺部疾病如肺气肿和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
图27A.肝类器官中肝细胞的糖原贮存和脂质摄取。PAS染色显示肝类器官的肝细胞中糖原的积累。结果支持类器官具有类似于肝脏的葡萄糖调节功能。
图27B.肝类器官中肝细胞的糖原贮存和脂质摄取。用荧光标记的低密度脂蛋白(LDL)处理类器官。LDL的积累可以在类器官的细胞中观察到，这表明肝类器官可以摄取脂质，类似于肝脏器官。
图28.肝类器官分泌白蛋白。在更换培养基后24小时收集类器官的培养基。培养基中白蛋白的量通过ELISA定量，以重组白蛋白作为标准。结果证实肝类器官可以分泌白蛋白。
图29.肝类器官的肝特异性代谢活动。使用基于萤光素酶的测定法分析个体细胞色素450酶的活性。将相对荧光素酶单位归一化至肝类器官中的细胞总数。所示为一百万个细胞的相对荧光素酶单位。将肝类器官的CYP代谢活性水平与工业中常用的hepG2细胞系进行比较。与HepG2相比，肝类器官具有更高水平的CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4活性。这3种主要的细胞色素酶占肝脏中CYP活性的80％。因此，本文所述的肝类器官具有与完整肝脏相似的代谢功能。
图30.功能性胆汁分泌系统由肝细胞和胆管细胞在肝脏中形成。图示由肝细胞和胆管细胞执行的器官水平功能。由肝脏产生的分子被主动转运到胆小管中，胆小管是肝细胞之间形成的细胞间通道。这些分子沿胆小管向胆管细胞形成的胆管输送，并输送出肝脏至小肠。
图31.使用CDFDA对功能胆汁分泌系统成像。说明功能性胆汁分泌系统如何在肝类器官中成像的示意图。CDFDA是一种不带电的非荧光分子。这种分子被动地扩散到细胞中。表达脱酯化酶的肝细胞能够通过除去分子上的酯基将CDFDA转化成CDF。与CDFDA不同，CDF是一种带电荷的荧光团。CDF被积极地通过MRP2/3转运蛋白泵出肝细胞进入胆小管。CDF沿着胆小管向由胆管细胞形成的胆管输送。按照时间顺序，CDF首先积聚在肝细胞中(荧光在肝细胞中)，CDF将被积极地泵入胆小管中并运送到胆管样结构。与肝细胞不同，胆管细胞不将CDFDA转化为CDF。积聚在胆管样结构中的CDF不是由胆管细胞产生的。
图32A.CDFDA由类器官中的肝细胞转化为CDF。用CDFDA处理30分钟的未分化MESP的活共焦图像。MESP细胞不具有将CDFDA转化为CDF的酶。处理30分钟后未检测到CDF。
图32B.CDFDA由类器官中的肝细胞转化为CDF。用CDFDA处理30分钟的肝类器官的活共焦图像。CDF在肝细胞中产生，并在30分钟内开始在器官中累积。
图33.将CDF导入类器官中的胆小管网络。已经用CDFDA处理3小时的2种类器官的活共焦图像。CDF不再在细胞中累积，而是输运到胆小管中。CDF照射胆小管网络。这两种类器官都显示出在类器官内形成的清楚的胆小管网络。
图34.类器官内胆小管络网络的3D重建图像。胆小管网络包围着标定细胞的每个圆形细胞核。图像显示在类器官内形成的胆小管通道的复杂网络。
图35.胆小管标志物二肽基肽酶IV(DPPIV)在类器官中的表达。CK7表达标志着类器官中的胆管细胞。DPPIV在形成胆小管的肝细胞表面表达。DPPIV在肝细胞中的独特染色(不与胆管细胞重叠)支持肝细胞的核心中存在胆小管网络。
图36A.CDF从肝细胞运输到胆管细胞在类器官中形成的胆管样囊肿结构。明场图像(最右边)显示胆管细胞在类器官周围形成大的囊肿结构。用CDFDA处理器官30分钟。CDF的成像显示CDF仅在肝细胞核中产生。形成胆管样囊肿结构的胆管细胞不产生CDF(箭头)。
图36B.CDF从肝细胞运输到胆管细胞在类器官中形成的胆管样囊肿结构。用CDFDA处理类器官1小时。胆小管网络形成于肝细胞的核心中。CDF在胆小管中转运至胆管样结构，其可从CDF充填囊肿清楚地看到。结果显示胆小管网络在器官中有功能。形成囊肿的胆管细胞不产生CDF。CDF填充胆小管网络，因为1小时处理后产生更多。CDF随后被运输并填充胆管样囊肿结构。
图36C.CDF从肝细胞运输到胆管细胞在类器官中形成的胆管样囊肿结构。胆小管网络与胆管样结构连接的放大图像。在肝细胞核中形成的胆小管网络连接到外周的胆管样囊肿结构。
图37.LDLR KO类器官响应胆固醇药物。LDLR缺陷型类器官由LDLR KO MESP产生。与正常肝类器官相比，LDLR缺陷型类器官分泌更高水平的胆固醇。值得注意的是，这种胆固醇的分泌增加可通过增加他汀类药物处理水平而降低(10nM普伐他汀处理降低胆固醇分泌水平至野生型LDLR+类器官的相似水平)。
图38.肝类器官的高通量生成。肝类器官可以96孔形式产生。每个孔含有具有具有相似尺寸和结构的单个类器官(比例尺＝500μm)。这允许肝类器官用于药物筛选和毒理学测试的筛选平台。
图39A.高通量系统中的个体类器官具有类似的代谢活性。测试不同孔中的9个类器官的CYP3A4活性。所有类器官显示出相似水平的CYP3A4活性。该结果表明高通量系统产生具有相似代谢功能能力的类器官。
图39B.高通量系统中的个体类器官具有类似的代谢活性。测试不同孔中的9个类器官的CYP2B6活性。所有类器官显示出相似水平的CYP2B6活性。该结果表明高通量系统产生具有相似代谢功能能力的类器官。
图40.从成体肝干细胞开始的肝类器官分化的示意图。将人类肝脏成体干细胞作为单细胞接种在H2悬浮培养基中。细胞聚集形成球状体并表达肝祖细胞标志物如ALB。随后用H3诱导培养基处理球状体以诱导类器官形成。
图41.从成体肝干细胞开始的晚期肝祖细胞形成。将人类肝脏成体干细胞解离成单细胞并在H2培养基中悬浮接种。肝脏成体干细胞聚集形成球状体结构并且细胞致力于形成表达CK19和ALB的晚期肝干细胞。结果支持H2培养基可用于肝干细胞以及诱导晚期肝祖细胞形成。
图42.使用成体肝脏干细胞产生的肝类器官。H2处理后，用H3培养基处理肝祖细胞球状体14天以诱导肝类器官形成。肝球状体形成肝类器官，其类似于MESP衍生的类器官，由肝细胞(ALB+ve)核心和胆管细胞(CK7+ve)在外周形成的导管样结构组成。
图43.具有导管结构的从成体肝脏干细胞衍生的肝类器官的3D成像。用光片显微镜检查3D成像衍生自成体肝干细胞的肝类器官显示类器官周边的胆管细胞形成中央具有内腔的导管样结构(左图)。可以在类器官表面观察到由胆管细胞形成的多个这种导管样结构(右图)。
图44.由成体肝干细胞产生的类器官表达肝脏特异性标志物。与未分化的成体干细胞相比，肝细胞特异性基因和胆管细胞特异性基因两者在肝类器官中表达。结果支持类器官中存在两种细胞类型。与源自MESP的肝类器官类似，成体肝类器官也表达所有主要的细胞色素P450酶，并且还表达UDP-葡萄糖醛酸转移酶和胆汁酸转运蛋白NTCP。
图45.由成体肝干细胞产生的类器官表现出肝特异性代谢活性。使用萤光素酶测定试剂盒(Promega)测定来自成体肝干细胞的类器官的CYP活性。与HepG2相比，成体类器官表现出强的CYP3A4和CYP2C9活性。结果显示成体类器官表现出肝脏代谢活性，并且在成体肝类器官中也检测到对成体肝细胞有特异性的CYP2C9活性。
图46.肝脏器官中的胆小管。成体干细胞衍生的肝类器官中胆小管网络的CDF成像。与MESP衍生的类器官类似，成体干细胞衍生的肝类器官含有胆小管网络，其功能性地转运由肝细胞分泌的CDF。类似地，CDF积累在类器官中的导管样结构中。
图47.从MESP产生胰腺球状体的示意图。用培养基P1处理MESP以诱导通过MESP进行胰腺谱系承诺。P1培养基处理后，从基质胶中取出早期胰腺祖细胞，并在具有P2培养基和随后的P3培养基的悬浮培养物中接种以获得胰腺球状体。
图48.由MESP产生的胰腺球状体。使用MESP产生胰腺球状体并用胰腺标志物PDX1和NKX6.1染色。胰腺球状体含有内腔，并且细胞对PDX1和NKX6.1两者呈阳性染色。这两种标志物存在于发育过程中最早的胰腺祖细胞中，并且也在终末特化的胰腺细胞如β-胰岛细胞中表达。
图49.极化E-钙粘蛋白在MESP中的表达。SOX9和E-钙粘蛋白在MESP中的染色。E-钙粘蛋白是定位于上皮细胞类型的顶端和侧膜的关键跨膜粘附分子。这在MESP中观察到，表明MESP中的极性。
具体实施方式
1.多能内胚层球状体祖细胞(MESP)
本文描述了从多能干细胞(PSC)衍生内胚层谱系的球状体祖细胞的方法。祖细胞可以在培养中稳定增殖和扩增。这些球状体祖细胞表现出产生内胚层谱系的多种器官细胞类型的潜力，包括肠、肝和胰腺。因此，这种球状体祖细胞在此被描述为多能内胚层球状体祖细胞(MESP)。MESP可以稳定繁殖，不出现衰老迹象，并保持干细胞标志物的同质表达。即使在长期培养后，细胞也保持23对染色体的正常核型，而没有主要染色体突变。这种稳定的祖细胞培养系统是可扩展的，可以用更大的培养容器产生更多的细胞，使得这些细胞适合于大规模产生用于各种应用的下游器官细胞类型，包括再生疗法和工业应用。
MESP代表由Cheng等人(Cell Stem Cell，2012)和Hannan等人(Stem CellReports，2013)报道的不同于内胚层祖细胞的不同内胚层祖细胞干细胞状态。Cheng等人(Cell Stem Cell，2012)报道了类似于早期定形内胚层干细胞的祖细胞干细胞，其是内胚层谱系发育的最早干细胞阶段。Hannan等人(Stem Cell Reports，2013)描述了在内胚层发育期间类似于前肠祖细胞的祖细胞干细胞。这两份报告的培养条件和干细胞标志物非常相似。另一方面，MESP的培养条件、培养基和干细胞标志物与上述参考文献中描述的不同(参见表1)。在晚期内胚层谱系发育期间，MESP细胞表达与后部前肠细胞表达的标志物相似的标志物(图16)。
在某些实施方式中，多能干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。可以使用iPSC重编程技术从任何人类成体组织产生iPSC，成为具有多能性能力的细胞。然后可以从这些多能干细胞产生MESP。
在某些方面，MESP也可以从反映早期内胚层谱系发育的早期内胚层祖细胞产生。目前的方法通过沿着内胚层谱系逐步分化产生MESP，其中PSC首先成为定形内胚层细胞并随后分化成原肠内胚层细胞。
在某些实施方式中，多能干细胞可以通过基因组编辑工具进行遗传修饰，例如规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/Cas系统。这些多能干细胞保持其多潜能能力，并且可以从这些遗传修饰的PSC产生MESP。
在某些实施方式中，多能干细胞可以是来自具有特定遗传疾病的人组织的诱导性多能干细胞(iPSC)。疾病特异性人类iPSC保持其多潜能能力以产生内胚层谱系组织。MESP可以由这些疾病特异性iPSC产生。
MESP培养系统
本文所述的多内胚层球状体祖细胞(MESP)培养系统包含干细胞培养基中的多种可溶性试剂和能够提供结构和营养支持的细胞载体。细胞载体将祖细胞维持在3D结构如球状体或类器官中。细胞载体提供了结构支持和细胞因子，它们在维持未分化状态的肝干细胞方面发挥作用。在一些实施方式中，所述多种可溶性试剂包含一种或多种生长因子、(经典)WNT途径的增强剂和干细胞分化抑制剂。
在一些实施方式中，提供了产生多能球状体祖细胞(MESP)的方法，所述方法包括：
i)在适于将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件下，在细胞载体上的第一培养基中培养内胚层祖细胞；
ii)在适于将所述定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件下，在第二培养基中培养所述定形内胚层细胞；和
iii)在适于将所述细胞分化成MESP细胞的条件下，在细胞载体上的第三培养基中培养所述原肠细胞。
在一些实施方式中，适合将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件和/或适合将定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件包括二维或单层培养。在一些实施方式中，适合将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件和/或适合将定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件包括三维培养。在一些实施方式中，适合将原肠(GUT)细胞分化成MESP细胞的条件包括三维培养。在一些实施方式中，可以在第一培养基或第二培养基中培养内胚层祖细胞以将内胚层祖细胞分化成DE细胞和原肠细胞，其随后可以在第三培养基中培养以产生MESP细胞。
在一些实施方式中，细胞载体包含选自以下的材料：基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素和合成聚合物或聚合物支架。
培养基：
在一些实施方式中，第一培养基包含TGF-β信号传导途径的激活剂，例如激活素(例如激活素A、B或AB)或TGF-β。在一些实施方式中，第一培养基还包含BMP信号传导途径的激活剂和FGF信号传导途径的激活剂。
在一些实施方式中，第二培养基包含BMP信号传导途径的激活剂和FGF信号传导途径的激活剂。
在一些实施方式中，第三培养基包含TGF-β信号传导途径的抑制剂、WNT信号传导途径的激活剂和Notch信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，第三培养基还包含类固醇，cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂、AKT/PI3K信号传导途径的激活剂和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，如本文所述。
在一些实施方式中，用于衍生和维持内胚层球状体祖细胞的培养基包含或由以下组成：以下的至少1、2、3、4、5、6、7、8或全部：
a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
b)WNT信号传导激活剂和/或糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂；
c)类固醇；
d)AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂；
e)STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
f)cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；
g)Notch受体激活剂；
h)NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂，或
i)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
在一些实施方式中，干细胞分化抑制剂是TGF-β信号传导抑制剂，其中TGF-β抑制剂的特征在于以下任一种：
a)抑制TGF-βI型受体ALK5激酶；
b)抑制I型激活素/节结受体ALK4；
c)抑制I型节结受体ALK7；
d)抑制SMAD2/3磷酸化；和/或
e)抑制激活素/TGFβ/SMAD信号传导途径。
TGF-β抑制剂可以阻断TGF-β途径的激活，其诱导干细胞分化，而TGF-β途径的失活可以维持内胚层干细胞的增殖。在一些实施方式中，TGF-β抑制剂选自：
i.A83-01 3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺，
ii.A 77-01 4-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉，
iii.SD-208 2-(5-氯-2-氟苯基)-N-吡啶-4-基喋啶-4-胺，LY2157299 4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-甲酰胺，
iv.SB 431542 4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺，GW788388N-(环氧乙烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺，
v.SB505124 2-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-叔丁基-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶，
vi.SB525334 6-[2-叔丁基-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉，IN1130 2-[3-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-4-甲基-1,3-噻唑-3-鎓-5-基]乙醇，
vii.ITD 1(6,6-二甲基-5,7-二氢咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-4-鎓-3-基)甲基N,N'-二环己基硫代氨基甲酰亚胺酸酯，
viii.LY2109761 4-[2-[4-(2-吡啶-2-基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-7-基]氧乙基]吗啉，
ix.K02288 3-[6-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基]苯酚，
x.TGF-βRI激酶抑制剂[3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑]，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，TGF-β抑制剂的浓度为约0.5nM至20μM，或100nM至10μM，或250nM至5μM，或400nM至2.5μM，或0.5nM至1μM，或0.5nM至0.5μM，或者约1.5nM至0.4μM，或者约10nM至0.3μM，或者约30nM至0.2μM，或者约40nM至0.1μM，或者约50nM至85nM，或者约1、5、15、25、30、35、45、50、65、75、130、150、170、250、350或450nM，或约0.5、0.7、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、9、10、12、14、16、18或20μM。在一些实施方式中，选自以上(i)-(x)的TGF-β抑制剂以约0.5nM至20μM，或100nM至10μM，或250nM至5μM，或400nM至2.5μM，或0.5nM至1μM，或0.5nM至0.5μM，或约1.5nM至0.4μM，或约10nM至0.3μM，或约30nM至0.2μM或约40nM至0.1μM，或约50nM至85nM，或约1、5、15、25、30、35、45、50、65、75、130、150、170、250、350或450nM；或约0.5、0.7、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、9、10、12、14、16、18或20μM的浓度使用。
在一些实施方式中，类固醇能够抑制NF-κB途径，激活PI3K/AKT/mTOR途径，抑制TGF-β信号传导途径和/或抑制IGF信号传导途径。在一些实施方式中，类固醇是改善内胚层干细胞维持的皮质类固醇，例如糖皮质激素或抗炎糖皮质激素。
在一些实施方式中，糖皮质激素选自：
地塞米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮，
皮质醇(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，
可的松(8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-十氢环戊二烯并[a]菲-3,11-二酮，
泼尼松17,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮，
泼尼松龙(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
甲基泼尼松龙(1S,2R,8S,10S,11S,14R,15S,17S)-14,17-二羟基-14-(2-羟基乙酰基)-2,8,15-三甲基四环[8.7.0.02,7.011,15]十七碳-3,6-二烯-5-酮，
倍他米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-3-酮，
曲安西龙(11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
倍氯米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氯-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-氧代-17-[2-(丙酰基氧)乙酰基]-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-17-基丙酸酯，
醋酸氟氢可的松9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢环戊二烯并[a]菲-3酮，
醛固酮11β,21-二羟基-3,20-二氧代孕甾-4-烯-18-醛，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，类固醇、皮质类固醇或糖皮质激素(例如，地塞米松)以约0.5μM至200μM，或约1.5μM至150μM，或约5μM至100μM，或约10μM至90μM，或约20μM至80μM，或约30μM至70μM，或约40μM至60μM，或约2、8、15、25、30、35、45、65、75、110、130、140、160、170或190μM的浓度使用。
在一些实施方式中，WNT信号传导激活剂是糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂。
在一些实施方式中，GSK3抑制剂选自：
CHIR-99021 6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基]乙氨基]吡啶-3-甲腈，BIO 6-溴靛玉红-3'-肟，
SB 216763 3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
CHIR-98014 6-N-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-咪唑-1-基嘧啶-2-基]氨基]乙基]-3-硝基吡啶-2,6-二胺，
TWS119 3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚，
IM-12 3-[2-(4-氟苯基)乙氨基]-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
1-氮杂坎帕罗酮9-溴-7,12-二氢吡啶并[3',2':2,3]吖庚因并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮，
AR-A014418 1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲，
SB415286 3-(3-氯-4-羟基苯胺基)-4-(2-硝基苯基)吡咯-2,5-二酮，
AZD1080(3E)-3-[5-(吗啉-4-基甲基)-1H-吡啶-2-亚基]-2-氧代-1H-吲哚-5-甲腈，
AZD2858 3-氨基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基苯基]-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺，
靛玉红(3E)-3-(3-氧代-1H-吲哚-2-亚基)-1H-吲哚-2-酮，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，WNT信号传导激活剂以约0.1μM至10μM，或约0.5μM至8μM，或约1μM至7μM，或约2μM至6μM，或约3μM至5μM，或约0.2、0.3、0.4、3、4、4.5、5、6、7.5、8.5、9、9.5或10μM的浓度使用。
在一些实施方式中，GSK3抑制剂(例如CHIR-09921)以约0.1μM至10μM，或约0.5μM至8μM，或约1μM至7μM，或约2μM至6μM，或约3μM至5μM，或约0.2、0.3、0.4、3、4、4.5、5、6、7.5、8.5、9、9.5或10μM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂；例如但不限于选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)，双调蛋白(AR)，epigen(EPG)，转化生长因子α(TGFα)，乙胞素(BTC)，上皮调节蛋白(EPR)，肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)。在一些实施方式中，AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂以约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml的浓度使用。在一些实施方式中，表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、表皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和/或神经调节蛋白(NRG)以约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至约3ng/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含STAT3的激活剂、GAB1介导的细胞粘附的激活剂和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，STAT3的激活剂、GAB1介导的细胞粘附的激活剂和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/m，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，AKT/PI3K信号传导途径的激活剂是肝细胞生长因子(HGF)。在一些实施方式中，HGF以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或者约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂，其诱导上皮细胞类型的增殖。在一些实施方式中，cAMP依赖性途径的激活剂是选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素。在一些实施方式中，cAMP依赖性途径的激活剂以约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素，以约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些情况下，培养基还包含Notch受体激活剂。在一些实施方式中，Notch受体激活剂以约10nM至100μM，或约50nM至80μM，或约100nM至60μM，或约500nM至40μM，或约800nM至20μM，或约900nM至10μM，或约20、40、60或80nM，或约1、1.5、15、30、50、60、90或100μM的浓度使用。在一些实施方式中，Notch受体激活剂是选自以下的化合物：Jagged1蛋白(智人，也称为AGS；AHD；AWS；HJ1；CD339；JAGL1；JAG1)、Jagged2(NCBI 3714)、δ样1(NCBI 28514)、δ样3(NCBI 10683)和δ样4(NCBI 54567)。在一些实施方式中，Jagged1蛋白(智人，也称为AGS；AHD；AWS；HJ1；CD339；JAGL1；JAG1)、Jagged2(NCBI 3714)、δ样1(NCBI 28514)、δ样3(NCBI10683)和/或δ样4(NCBI 54567)以约10nM至100μM，或约50nM至80μM，或约100nM至60μM，或约500nM至40μM，或约800nM至20μM，或约900nM至10μM，或约20、40、60或80nM，或约1、1.5、15、30、50、60、90或100μM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含作为NFκB活性的阻遏物和/或促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子。在一些实施方式中，作为NFκB活性的阻遏物和/或促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子以约0.1mM至1M，或约2mM至约0.8M，或约4mM至0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM的浓度使用。在一些实施方式中，培养基还包含选自以下的化合物：烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米。在一些实施方式中，烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和/或尼可刹米以约0.1mM至1M，或约2mM至0.8M，或约4mM至约0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。在一些实施方式中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂是选自以下的化合物：丙戊酸(VPA)(2-丙基戊酸)，丁酸钠(钠；4-羟基丁酸盐)，vorinotstat(N'-羟基-N-苯基辛二酰胺)，帕比司他((E)-N-羟基-3-[4-[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)，曲古抑菌素A((2E,4E,6R)-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧代庚-2,4-二烯酰胺)，mocetinostat(N-(2-氨基苯基)-4-[[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]甲基]苯甲酰胺，BG45(N-(2-氨基苯基)-2-吡嗪甲酰胺)，4SC-202((E)-N-(2-氨基苯基)-3-(1-((4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基)磺酰基)-1H-吡咯-3-基)丙烯酰胺)，贝里司他，Scriptaid(6-(1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)-N-羟基己酰胺)，M344(4-(二甲基氨基)-N-[7-(羟基氨基)-7-氧代庚基]苯甲酰胺)，达西司特((E)-N-羟基-3-[4-[[2-羟乙基-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)，abexinostat，CUDC-101(7-(4-(3-乙炔基苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)-N-羟基庚酰胺，CUDC-907(N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺)和AR-42((S)-N-羟基-4-(3-甲基-2-苯基丁酰胺)苯甲酰胺)。在一些实施方式中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括但不限于上面列出的化合物)以约0.1μM至5mM，或约0.3μM至4mM，或约0.6μM至3mM，或约0.8μM至2mM，或约1mM至1.5mM，或约0.2、0.4、0.7、0.9、5、10、20、50、70或90μM或约1.5、2.5、3.5mM的浓度使用。
细胞外基质：
在一些实施方式中，干细胞在微环境中培养，所述微环境至少部分模拟所述干细胞天然存在的细胞生态位。通过代表控制干细胞命运的关键调控信号的在生物材料如基质、支架和培养基底的存在下培养所述干细胞，可以模拟这种细胞生态位。这样的生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或它们的混合物。支架提供二维或三维网络。用于这种支架的合适的合成材料包括选自以下的聚合物：多孔固体、纳米纤维和水凝胶，例如包括自组装肽的肽、由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇富马酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙酸纤维素和/或它们的共聚物组成的水凝胶(参见例如Saha等人，2007.CurrOpin Chem.Biol.11(4)：381-387；Saha等人，2008.Biophysical Journal 95：4426-4438；Little等人，2008.Chem.Rev 108,1787-1796)。如本领域技术人员所知，机械特性例如支架的弹性影响干细胞的增殖、分化和迁移。在一些实施方式中，支架包含生物可降解(共)聚合物，其在个体中移植后被天然存在的组分替代，例如以促进组织再生和/或伤口愈合。在一些实施方式中，所述支架在个体中移植后基本上不诱导免疫原性应答。所述支架补充有天然的、半合成的或合成的配体，其提供干细胞增殖和/或分化和/或迁移所需的信号。在一个实施方式中，所述配体包含确定的氨基酸片段。所述合成聚合物的实例包括F127嵌段共聚物表面活性剂(BASF)和Ethisorb(Johnson和Johnson)。
细胞生态位部分由干细胞和周围细胞以及由所述生态位中的细胞产生的细胞外基质(ECM)决定。在一些实施方式中，MESP附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成，其中糖蛋白包括胶原、巢蛋白(巢蛋白)、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。已知不同类型的ECM，包括不同组成，其包括不同类型的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。所述ECM可以通过在去除这些细胞并添加分离的肝碎片或分离的胆管或分离的上皮干细胞之前，在容器中培养产生ECM的细胞例如成纤维细胞来提供。产生细胞外基质的细胞的实例是主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质原胶原和纤连蛋白的成纤维细胞，和主要产生胶原蛋白(I、III和V型)，软骨素硫酸蛋白多糖，透明质酸，纤连蛋白和腱生蛋白-C的结肠成肌纤维细胞。或者，所述ECM是商业提供的。市售细胞外基质的实例是细胞外基质蛋白(Invitrogen)和来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基膜制备物(例如MatrigelTM(BD Biosciences))。可以使用合成的细胞外基质材料，例如ProNectin(Sigma Z378666)。如果需要，可以使用细胞外基质材料的混合物。用于培养干细胞的ECM的使用增强了干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。在没有ECM的情况下，干细胞培养物不可以长期培养，并且未观察到未分化干细胞的持续存在。另外，ECM的存在允许培养三维组织类器官，其在不存在ECM时不可以培养。通常将细胞外基质材料涂布到细胞培养容器上，但可以(另外地或替代地)以溶液供应。约1mg/ml的纤连蛋白溶液可以用于涂布细胞培养容器，或者以约1μg/cm2至约250μg/cm2，或者以约1μg/cm2至约150μg/cm2。在一些实施方式中，细胞培养容器以8μg/cm2至125μg/cm2的纤连蛋白涂布。在一些实施方式中，ECM包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或胶原蛋白和层粘连蛋白。ECM可以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ECM。另一种ECM由MatrigelTM(BD Biosciences)提供，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原蛋白。
MESP的表征：
本文描述的内胚层球状体祖细胞的特征在于表达以下标志物的任何一种或多种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或1或2或3或4或5或6或7种或全部：HNF4A(NCBI基因:3172)、PDX1(NCBI基因:3651)、CDX2(NCBI基因:1045)、SOX9(NCBI基因:6662)、KRT19(NCBI基因:3880)、AFP(NCBI基因:174)、ONECUT2(NCBI基因:9480)、LGR5(NCBI基因:8549)、EPHB2(NCBI基因:2048)、LGR4(NCBI基因:55366)、NR5A2(NCBI基因:2494)、CDH1(NCBI基因:999)、KRT7(NCBI基因:3855)、ZNF503(NCBI基因:84858)、MSX2(NCBI基因:4488)、TRPS1(NCBI基因:7227)、ASCL2(NCBI基因:430)、IRF8(NCBI基因:3394)、HNF4G(NCBI基因:3174)、ID2(NCBI基因:3398)、CD44(NCBI基因:960)、EPCAM(NCBI基因:4072)、MET(NCBI基因:4233)、IHH(NCBI基因:3549)和CLDN3(NCBI基因:1365)。
内胚层球状体祖细胞不表达或基本上不表达以下标志物的任何一种或两种或三种或四种或五种或全部：SOX2(NCBI基因：6657)、CER1(NCBI基因：9350)、GATA4(NCBI基因：2626)、SOX17(NCBI基因：64321)、FOXA2(NCBI基因：3170)和CXCR4(NCBI基因：7852)。
内胚层球状体祖细胞显示极性(在此，细胞的极性是指与不同环境接触的细胞的特定膜区域中的蛋白质的独特表达)。内胚层球状体祖细胞的极性从细胞上E-钙粘蛋白蛋白的不均匀分布是显而易见的。富集E-钙粘蛋白的区域标志着细胞的顶端和侧膜(图49)。
多能内胚层球状体祖细胞(MESP)
MESP是表达许多后部前肠标志物的独特干细胞，包括HNF4A、PDX1和CDX2(图4和13)。在发育上，后部前肠产生了人体成体的三个基本器官，即肝脏、胰腺和十二指肠。形成这3个器官的细胞表达各自的调节因子HNF4A(在肝脏中)、PDX1(在胰腺中)和CDX2(在小肠中)。MESP表达所有3种因子，同样具有产生肝(图17-20)、胰腺(图45)和肠(图11和12)的细胞的能力。
与报道的内胚层祖细胞干细胞不同，MESP在3D中培养并与2D单层细胞相比形成球状体结构(表1)。在球状体中培养的细胞被空间排列以产生内腔。因此细胞的两个表面暴露于2种不同的环境，增加了球状体中细胞状态调节的复杂性。粘附分子E-钙粘蛋白的不均匀分布进一步支持暴露于2种不同环境的细胞呈现极性。保持在MESP中的内胚层干细胞状态不同于所报道的其他内胚层干细胞。这种差异在MESP的信号传导要求中也很明显。TGFβ信号传导在维持早期内胚层干细胞状态中起作用(表1)，并且已经在许多PSC分化方案中被广泛用于诱导早期内胚层发育(图16)(Basma等，2009；D'Amour等，2006；Spence等，2011；Cheng等，2012；Gieseck等，2014；Hannan等，2013；Si-Tayeb等，2010a；Schwartz等，2014)。相比之下，TGFβ信号传导途径在MESP的维持中被抑制(表1)并且Wnt信号传导途径被激活。与其晚期内胚层祖细胞状态相对应(图16)，MESP不表达许多早期内胚层祖细胞标志物，如SOX17、CXCR4、FOXA2、SOX2和CER1(图9)。相反，MESP表达许多来源于胰腺、肝脏、小肠的在成体和胎儿干细胞中发现的特定干细胞标志物如NR5A2、ASCL2、HNF4A、KRT7、SOX9、KRT19、PDX1、LGR4、LGR5和ONECUT2(图10)(Si-Tayeb等，2010b；Dan等，2006；Schmelzer等，2007)。根据其后部前肠的身份，MESP不表达在结肠干细胞和前列腺祖细胞中发现的干细胞标志物(图10)。
作为干细胞，MESP可以繁殖19代(图3A)和更多，并显示从单细胞形成整个球状体的能力(图3B)。整个球状体中的细胞对干细胞标志物HNF4A、PDX1、CDX2、CK19和SOX9均匀地染色(图5A和5B)。干细胞培养物是一种强大的资源，使得能够进行细胞大规模扩增，用于再生疗法、大规模基因组学和蛋白质组学研究等应用。MESP培养物可以在较大的培养容器中线性放大以获得大量细胞(图6)。由于细胞在3D中培养，当使用具有与2D中的细胞培养相比相似的尺寸的培养容器时获得更多细胞。MESP在长期传代中也显示相似的增殖能力(图7A)。重要的是，细胞能够在培养中保持正常核型超过140天(图7B)。
因为MESP可以通过包括iPSC的多能干细胞有效衍生(图13)，所以MESP潜在地是用于模拟疾病的无价细胞资源(图14)。这可以通过iPSC的基因组编辑或者将来自具有特定遗传疾病的患者的体细胞重编程回多能干细胞状态来实现。这些PSC可以进一步用于产生具有疾病遗传背景的MESP。这些疾病特异性MESP随后可用于产生肝脏、胰腺和肠疾病模型(图14、15和37)。因此，MESP是生成用于研究的患病肝脏、胰腺和肠的模型的强力工具。
MESP的衍生和维持：
在实施例中描述了用于从内胚层细胞衍生和维持MESP的示例性方法。步骤如图1所示。
2.肝类器官
本文描述了从祖细胞和干细胞产生肝类器官的方法。肝类器官符合微器官的关键标准，其含有器官的多种细胞类型，在空间上组织成类似器官组织和执行器官特定功能的结构。本文所述的肝类器官至少含有肝脏的两种主要细胞类型，即肝细胞和胆管细胞。类器官的核心由肝细胞形成，胆管细胞在肝细胞的核心周围形成胆管样结构。肝细胞形成胆小管网络，其连接胆管周边的胆管细胞胆管样结构，类似于肝小叶中的肝细胞排列，其类似地通过胆小管网连接到胆管(图22)。肝类器官表现出多种肝脏特异性功能，包括肝脏特异性代谢活动、糖原贮存、脂质摄取和白蛋白分泌。重要的是，类器官还表现出类似的胆汁分泌功能，其中肝细胞分泌物通过胆小管网络转运到由胆管细胞形成的胆管结构。这是第一次体外证明，其中肝细胞和胆管细胞通过胆小管网络功能性连接。肝细胞出口经过小管输送至胆管细胞形成的囊肿结构，模拟肝脏中的体内胆汁分泌事件。本文所述的肝类器官因此满足模拟体内器官的类器官的标准。通过使用MESP和成体肝脏干细胞生成肝类器官，证明了该方法的多功能性。2种不同的干细胞类型产生具有相似组成和结构的类器官，支持当前方法可应用于具有形成肝细胞类型的能力的不同晚期内胚层干细胞。
从干细胞产生肝类器官的一个优点是可扩展性和用于建模疾病的可修正系统。干细胞可以大规模扩增以产生大量类器官。干细胞的自我更新能力允许从干细胞群不断产生肝类器官。使用诸如CRISPR/Cas系统或iPSC重编程之类的基因组编辑工具的遗传修饰促进产生展示各种疾病表型的疾病特异性干细胞和肝类器官。这些疾病特异性类器官对体外模拟疾病(图16)和疾病机制的鉴定非常有用。本文所述的方法还证实了在96孔培养皿中产生单一类器官的高通量方式的类器官生成方法的适应性。个体类器官表现出相似的形态和代谢功能。
也已经报道了肝类器官样结构；然而，它们不由体肝细胞类型组成并且不执行肝脏特异性功能。肝上皮类器官已经衍生自成体肝脏(PCT/IB11/02167)。PCT/IB11/02167申请中描述的'类器官'主要由肝上皮干细胞组成。这些干细胞用于产生肝细胞或胆管细胞。这些上皮类器官干细胞不包含多种肝细胞类型，也不包含类似于人肝组织的结构，并且不表现肝功能。已经产生了由包括肝成肝细胞的多种细胞类型组成的肝芽(WO2013047639A1)。肝芽由聚集在凝胶上的间充质细胞、内皮细胞和肝成肝细胞组成。虽然三种细胞类型在培养皿上聚集形成团块，但这种肝芽不形成组织化结构并且不显示肝脏特异性功能。肝芽必须移植到宿主中以进一步成熟为功能性肝组织。相比之下，我们在此描述了第一种人肝类器官，其包含多种功能性肝细胞类型，其具有肝组织组织化并且执行器官水平功能例如胆汁分泌和运输(表2和表3)。
还已经使用3D打印技术在体外对肝组织进行工程化(US2014/0287960A1)。与3D打印技术相比，本发明的方法在分化过程中利用干细胞的自组织能力。3D打印的肝脏组织使用细胞外基质作为凝胶以将细胞分层粘附在精确的位置。得到的肝组织结构是预先确定的，并且细胞被印制成所需的构型。相比之下，本文所述的干细胞衍生类器官提供了细胞相互作用并自组织成类似于肝组织的结构的条件。类器官中的细胞相互作用并粘附而不需要添加细胞外基质。例如，与使用外源基质胶或其他细胞外基质将细胞粘附在结构中的先前方法相比，本文所述的类器官包含由类器官中的细胞产生的内源性细胞外基质粘附分子。表4总结了本文所述的肝类器官组织与3D打印的肝脏组织之间的重要差异。例如，在本文所述的肝类器官中，实质细胞和非实质细胞来源于原代干细胞，而先前的方法(例如3D打印和细胞聚集方法)使用来自不同干细胞来源或永生化细胞系的实质细胞和非原代细胞类型。此外，本文所述的肝类器官包含功能性胆小管，其不使用先前的方法产生。
在某些实施方式中，干细胞是MESP。
在某些实施方式中，干细胞是成体肝干细胞。
在某些实施方式中，干细胞可以是具有产生肝组织细胞类型的潜力的内胚层谱系祖细胞。
因此，在一些实施方式中，产生肝类器官的方法包括在第一细胞培养基中培养内胚层干细胞以获得早期肝祖细胞。在一些情况下，内胚层干细胞是早期内胚层祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、MESP或成体肝干细胞。
在某些实施方式中，类器官可以由肝细胞和胆管细胞与至少一种其他肝细胞类型组成，其他肝细胞类型包括星状细胞、库普弗细胞、肝祖细胞和肝窦内皮干细胞。
在一些实施方式中，类器官不包含基因工程化细胞，例如重组修饰细胞。在一些实施方式中，类器官不包含经遗传工程化以表达基因产物例如调节细胞增殖的RNA和/或蛋白质的细胞。
如表5所示，本文所述的肝类器官在某些方面与原发性肝组织不同。例如，原发性肝组织中的肝细胞尺寸较大，包含双核并且表现出多倍体染色体数量，而肝类器官中的肝细胞约为原代肝中肝细胞大小的一半，并且包含含有二倍体染色体数量的单核。此外，原代肝细胞在培养24小时后显示出CYP功能的快速下降，而类器官肝细胞中的CYP功能稳定并且在培养中维持数周。原代胆管细胞形成长支管状结构并在培养中增殖，而类器官胆管细胞在培养中形成大囊肿，并且不增殖。
从MESP中衍生肝类器官
本文所述的肝类器官培养物系统包含在三种不同的肝培养基中的多种可溶性试剂、细胞载体和悬浮培养系统。细胞载体提供适合MESP分化成早期肝祖细胞的培养条件，并且悬浮培养系统提供适合形成晚期肝祖细胞和随后形成类器官的培养条件。在一些实施方式中，所述多种可溶性试剂包含一种或多种生长因子、(经典)WNT途径的增强剂，TGF-β信号传导抑制剂和Notch信号传导抑制剂。
培养基H1、H2和H3
培养基组分：
H1培养基
在一些实施方式中，H1培养基包括：
a.STAT3、GAB1介导的细胞粘附和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
b.作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
c.TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
d.WNT信号传导激活剂；
e.类固醇；
f.至少一种诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
g.激活FGF和MAPK途径的分子。
在一些实施方式中，用于诱导肝脏特化的分子是TGF-β信号传导抑制剂，其中所述TGF-β抑制剂的特征在于以下任一种：
a)抑制TGF-βI型受体ALK5激酶；
b)抑制I型激活素/节结受体ALK4；
c)抑制I型节结受体ALK7；
d)抑制SMAD2/3磷酸化；和/或
e)抑制激活素/TGFβ/SMAD信号传导途径。
TGF-β抑制剂可以阻断TGF-β途径的激活，诱导肝脏谱系特化。在一些实施方式中，TGF-β抑制剂选自：
i.A83-01 3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺，
ii.A 77-01 4-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉，
iii.SD-208 2-(5-氯-2-氟苯基)-N-吡啶-4-基喋啶-4-胺，LY2157299 4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-甲酰胺，
iv.SB 431542 4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺，GW788388N-(环氧乙烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺，
v.SB505124 2-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-叔丁基-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶，
vi.SB525334 6-[2-叔丁基-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉，IN1130 2-[3-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-4-甲基-1,3-噻唑-3-鎓-5-基]乙醇，
vii.ITD 1(6,6-二甲基-5,7-二氢咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-4-鎓-3-基)甲基N,N'-二环己基硫代氨基甲酰亚胺酸酯，
viii.LY2109761 4-[2-[4-(2-吡啶-2-基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-7-基]氧乙基]吗啉，
ix.K02288 3-[6-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基]苯酚，
x.TGF-βRI激酶抑制剂[3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑]，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，TGF-β抑制剂以约0.5nM至20μM，或100nM至10μM，或250nM至5μM，或400nM至2.5μM，或0.5nM至1μM，或0.5nM至0.5μM，或者约1.5nM至0.4μM，或者约10nM至0.3μM，或者约30nM至0.2μM，或者约40nM至0.1μM，或者约50nM至85nM，或者约1、5、15、25、30、35、45、50、65、75、130、150、170、250、350或450nM，或约0.5、0.7、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、9、10、12、14、16、18或20μM的浓度使用。在一些实施方式中，选自以上(i)-(x)的TGF-β抑制剂以约0.5nM至20μM，或100nM至10μM，或250nM至5μM，或400nM至2.5μM，或0.5nM至1μM，或0.5nM至0.5μM，或约1.5nM至0.4μM，或约10nM至0.3μM，或约30nM至0.2μM或约40nM至0.1μM，或约50nM至85nM，或约1、5、15、25、30、35、45、50、65、75、130、150、170、250、350或450nM；或约0.5、0.7、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、9、10、12、14、16、18或20μM的浓度使用。
在一些实施方式中，类固醇能够抑制NF-κB途径、激活PI3K/AKT/mTOR途径、抑制TGF-β信号传导途径和/或抑制IGF信号传导途径。在一些实施方式中，类固醇是改善内胚层干细胞维持的皮质类固醇，例如糖皮质激素或抗炎糖皮质激素。
在一些实施方式中，糖皮质激素选自：
地塞米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮，
皮质醇(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，
可的松(8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-十氢环戊二烯并[a]菲-3,11-二酮，
泼尼松17,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮，
泼尼松龙(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
甲基泼尼松龙(1S,2R,8S,10S,11S,14R,15S,17S)-14,17-二羟基-14-(2-羟基乙酰基)-2,8,15-三甲基四环[8.7.0.02,7.011,15]十七碳-3,6-二烯-5-酮，
倍他米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-3-酮，
曲安西龙(11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
倍氯米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氯-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-氧代-17-[2-(丙酰基氧)乙酰基]-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-17-基丙酸酯，
醋酸氟氢可的松9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢环戊二烯并[a]菲-3酮，
醛固酮11β,21-二羟基-3,20-二氧代孕甾-4-烯-18-醛，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，类固醇、皮质类固醇或糖皮质激素(例如，地塞米松)以约0.5μM至200μM，或约1.5μM至150μM，或约5μM至100μM，或约10μM至90μM，或约20μM至80μM，或约30μM至70μM，或约40μM至60μM，或约2、8、15、25、30、35、45、65、75、110、130、140、160、170或190μM的浓度使用。
在一些实施方式中，WNT信号传导激活剂是糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂。在一些实施方式中，GSK3抑制剂选自：
CHIR-99021 6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基]乙氨基]吡啶-3-甲腈，
BIO 6-溴靛玉红-3'-肟，
SB 216763 3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
CHIR-98014 6-N-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-咪唑-1-基嘧啶-2-基]氨基]乙基]-3-硝基吡啶-2,6-二胺，
TWS119 3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚，
IM-12 3-[2-(4-氟苯基)乙氨基]-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
1-氮杂坎帕罗酮9-溴-7,12-二氢吡啶并[3',2':2,3]吖庚因并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮，
AR-A014418 1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲，
SB415286 3-(3-氯-4-羟基苯胺基)-4-(2-硝基苯基)吡咯-2,5-二酮，
AZD1080(3E)-3-[5-(吗啉-4-基甲基)-1H-吡啶-2-亚基]-2-氧代-1H-吲哚-5-甲腈，
AZD2858 3-氨基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基苯基]-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺，
靛玉红(3E)-3-(3-氧代-1H-吲哚-2-亚基)-1H-吲哚-2-酮，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，WNT信号传导激活剂以约0.1μM至10μM，或约0.5μM至8μM，或约1μM至7μM，或约2μM至6μM，或约3μM至5μM，或约0.2、0.3、0.4、3、4、4.5、5、6、7.5、8.5、9、9.5或10μM的浓度使用。
在一些实施方式中，GSK3抑制剂(例如CHIR-09921)以约0.1μM至10μM，或约0.5μM至8μM，或约1μM至7μM，或约2μM至6μM，或约3μM至5μM，或约0.2、0.3、0.4、3、4、4.5、5、6、7.5、8.5、9、9.5或10μM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂；例如但不限于选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、上皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)。在一些实施方式中，AKT/PI3K信号传导途径和/或MAPK信号传导途径的激活剂以约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml的浓度使用。在一些实施方式中，表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、表皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和/或神经调节蛋白(NRG)以约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至约3ng/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含STAT3的激活剂、GAB1介导的细胞粘附的激活剂和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，STAT3的激活剂、GAB1介导的细胞粘附的激活剂和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/m，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，AKT/PI3K信号传导途径的激活剂是肝细胞生长因子(HGF)。在一些实施方式中，HGF以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或者约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含作为NFκB活性的阻遏物和/或促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子。在一些实施方式中，作为NFκB活性的阻遏物和/或促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子以约0.1mM至1M，或约2mM至约0.8M，或约4mM至0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM的浓度使用。在一些实施方式中，培养基还包含选自以下的化合物：烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米。在一些实施方式中，烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和/或尼可刹米以约0.1mM至1M，或约2mM至0.8M，或约4mM至约0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含至少一种、至少两种或至少三种诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子。在一些实施方式中，诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，培养基还包含选自BMP4、BMP2、BMP3、BMP5、BMP6和BMP7的分子。在一些实施方式中，BMP家族分子以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含作为FGF和MAPK途径的激活剂的分子。在一些实施方式中，培养基还包含选自FGF7、FGF1、FGF3、FGF10和FGF22的分子。在一些实施方式中，FGF和MAPK途径的激活剂或FGF家族分子以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中存在其他组分：
在一些实施方式中，培养基还包含cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂，其诱导上皮细胞类型的增殖。在一些实施方式中，cAMP依赖性途径的激活剂是选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素。在一些实施方式中，cAMP依赖性途径的激活剂以约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素，以约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些情况下，培养基还包含Notch受体激活剂。在一些实施方式中，Notch受体激活剂以约10nM至100μM，或约50nM至80μM，或约100nM至60μM，或约500nM至40μM，或约800nM至20μM，或约900nM至10μM，或约20、40、60或80nM，或约1、1.5、15、30、50、60、90或100μM的浓度使用。在一些实施方式中，Notch受体激活剂是选自以下的化合物：Jagged1蛋白(智人，也称为AGS；AHD；AWS；HJ1；CD339；JAGL1；JAG1)、Jagged2(NCBI 3714)、δ样1(NCBI 28514)、δ样3(NCBI 10683)和δ样4(NCBI 54567)。在一些实施方式中，Jagged1蛋白(智人，也称为AGS；AHD；AWS；HJ1；CD339；JAGL1；JAG1)、Jagged2(NCBI 3714)、δ样1(NCBI 28514)、δ样3(NCBI10683)和/或δ样4(NCBI 54567)以约10nM至100μM，或约50nM至80μM，或约100nM至60μM，或约500nM至40μM，或约800nM至20μM，或约900nM至10μM，或约20、40、60或80nM，或约1、1.5、15、30、50、60、90或100μM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。在一些实施方式中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂是选自以下的化合物：丙戊酸(VPA)(2-丙基戊酸)、丁酸钠(钠；4-羟基丁酸盐)、vorinotstat(N'-羟基-N-苯基辛二酰胺)、帕比司他((E)-N-羟基-3-[4-[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)、曲古抑菌素A((2E,4E,6R)-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧代庚-2,4-二烯酰胺)、mocetinostat(N-(2-氨基苯基)-4-[[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]甲基]苯甲酰胺、BG45(N-(2-氨基苯基)-2-吡嗪甲酰胺)、4SC-202((E)-N-(2-氨基苯基)-3-(1-((4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基)磺酰基)-1H-吡咯-3-基)丙烯酰胺)、贝里司他、Scriptaid(6-(1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)-N-羟基己酰胺)、M344(4-(二甲基氨基)-N-[7-(羟基氨基)-7-氧代庚基]苯甲酰胺)、达西司特((E)-N-羟基-3-[4-[[2-羟乙基-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)、abexinostat、CUDC-101(7-(4-(3-乙炔基苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)-N-羟基庚酰胺、CUDC-907(N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺)和AR-42((S)-N-羟基-4-(3-甲基-2-苯基丁酰胺)苯甲酰胺)。在一些实施方式中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(包括但不限于上面列出的化合物)以约0.1μM至5mM，或约0.3μM至4mM，或约0.6μM至3mM，或约0.8μM至2mM，或约1mM至1.5mM，或约0.2、0.4、0.7、0.9、5、10、20、50、70或90μM或约1.5、2.5、3.5mM的浓度使用。
在一些实施方式中，使用第一培养基H1的培养持续1至10天或1至8天或1至6天。
在一些实施方式中，使用第二培养基H2的培养持续6至12天或4至10天或6至8天。
在一些实施方式中，使用第三培养基H3的培养持续18至26天或20至24天或19至22天。
H2培养基
在一些实施方式中，H2培养基包含：
a)STAT3、GAB1介导的细胞粘附和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
b)作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
c)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
d)类固醇；
e)诱导SMAD1和SMAD5磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
f)调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的分子。
在一些实施方式中，TGF-β信号传导抑制剂如上所述并以培养基H1中所述浓度使用。
在一些实施方式中，类固醇和浓度如上培养基H1所述。
在一些实施方式中，培养基还包含如上所述和以培养基H1中所述浓度使用的AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，培养基还包含选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、表皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和/或神经调节蛋白(NRG)。在一些实施方式中，化合物(例如EGF)以约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至约3ng/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含如上所述和以培养基H1中所述的浓度使用的STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂。在一些实施方式中，培养基还包含肝细胞生长因子(HGF)。在一些实施方式中，HGF以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含如上所述并以培养基H1中所述的浓度使用的作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子。在一些实施方式中，培养基还包含选自烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米的化合物。在一些实施方式中，化合物(例如烟酰胺)以约0.1mM至1M，或约2mM至0.8M，或约4mM至0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含如上所述并且以培养基H1中所述浓度使用的至少一种、至少两种或至少三种诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子。
在一些实施方式中，培养基还包含如上所述并以培养基H1中所述的浓度使用的调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的分子。在一些实施方式中，所述分子选自FGF19、FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20和FGF23。在一些实施方式中，FGF家族成员以5ng/ml至0.8μg/ml，或约10ng/ml至0.6μg/ml，或约50ng/ml至0.5μg/ml，或约150ng/ml至1μg/ml，或约5、20、50、100、200、250、300、400、500ng/ml，或约1、0.8、0.7或0.9μg/ml的浓度使用。
H2培养基可进一步包含用于诱导晚期肝祖细胞分化的组分，其中所述组分是以下组分中的任何一种或两种：
γ-分泌酶抑制剂；和
YAP抑制剂。
在一些实施方式中，γ-分泌酶抑制剂选自：化合物E(C-E)(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-3H-1,4-苯并二吖庚因-3-基]丙酰胺，二苯并吖庚因(DBZ)：(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(7S)-5-甲基-6-氧代-7H-苯并[d][1]苯并吖庚因-7-基]丙酰胺，DAPT：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-苯基乙酸叔丁酯，Begacestat：5-氯-N-[(2S)-4,4,4-三氟-1-羟基-3-(三氟甲基)丁烷-2-基]噻吩-2-磺酰胺，和Flurizan：(2R)-2-(3-氟-4-苯基苯基)丙酸。在一些实施方式中，γ-分泌酶抑制剂以约10nM至5μM，或约100nM至4μM，或约200nM至3.5μM，或约300nM至3μM，或约400nM至2.5μM，或约450nM至2μM，或约500nM至1.5μM，或约50、90、150、250、350、450、480、500、650或700nM的浓度使用。
在一些实施方式中，YAP抑制剂选自：
维替泊芬3-[(23S,24R)-14-乙烯基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-22,23-双(甲氧基羰基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮杂己环[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二烷-9-基]丙酸，
LPA[(2R)-2-羟基-3-膦酰氧基丙基](Z)-十八碳-9-烯酸酯，
S1P[(E,2S,3R)-2-氨基-3-羟基十八-4-烯基]二氢磷酸酯，
凝血酶(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-氨基-2-[[2-[[(2S)-6-氨基-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-氨基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-氨基-3-羟基丁酰基]氨基]-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基]氨基]-3-羟基丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-4-氧代丁酰基]氨基]-3-甲基丁酰基]氨基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]乙酰基]氨基]-5-氧代戊酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]-3-羟基丙酸，
肾上腺素4-[(1R)-1-羟基-2-(甲氨基)乙基]苯-1,2-二醇，
胰高血糖素(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-5-氨基-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-(1H-咪唑-5-基)丙酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-5-氧代戊酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基丁酰基]氨基]-3-苯基丙酸，
Dihydrexidine(6aR,12bS)-5,6,6a,7,8,12b-六氢苯并[α]菲啶-10,11-二醇，
多巴酚丁胺4-[2-[4-(4-羟基苯基)丁-2-基氨基]乙基]苯-1,2-二醇，
达沙替尼N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]-1,3-噻唑-5-甲酰胺，
拉春库林A(4R)-4-[(1R,4S,5Z,7E,11Z,15R,17R)-17-羟基-4,11-二甲基-13-氧代-14,18-二氧杂双环[13.3.1]十九碳烯-5,7,11-三烯-17-基]-1,3-噻唑烷-2-酮，
拉春库林B(4R)-4-[(1R,4S,5Z,9Z,13R,15R)-15-羟基-4,9-二甲基-11-氧代-12,16-二氧杂双环[11.3.1]十七-5,9-二烯-15-基]-1,3-噻唑烷-2-酮，
细胞松弛素D(3S,3aR,4S,6S,6aR,7E,10S,12R,13E,15R,15aR)-3-苄基-6,12-二羟基-4,10,12-三甲基-5-亚甲基-1,11-二氧代-2,3,3a,4,5,6,6a,9,10,11,12,15-十二氢-1H-环十一[d]异吲哚-15-基乙酸酯，
Blebbistatin3α-羟基-6-甲基-1-苯基-2,3-二氢吡咯并[2,3-b]喹啉-4-酮，
ML7 1-(5-碘萘-1-基)磺酰基-1,4-二氮杂环庚烷，
肉毒杆菌C3 4-N-(3-氯-7-甲氧基吖啶-1-基)-1-N,1-N-二乙基戊烷-1,4-二胺；二盐酸盐，
Y27632 4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-吡啶-4-基环己烷-1-甲酰胺，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，YAP抑制剂(例如维替泊芬)以约1nM至10μM，或约50nM至8μM，或约200nM至6μM，或约500nM至4μM，或约700nM至2μM，或约1μM至2μM，或约1、10、30、70、130、180、250、350、400、600、800或900nM，或约9、7、5、3、2.5、1.5或1μM的浓度使用。
H3培养基
在一些实施方式中，H3培养基包含：
·TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
·属于白细胞介素6组细胞因子的多效性细胞因子；
·γ分泌酶抑制剂；和
·类固醇。
属于白介素6组细胞因子的多效性细胞因子能够激活JAK-STAT、MAPK和AKT/PI3K信号传导。在一些实施方式中，多效性细胞因子是制瘤素M(OSM)或白血病抑制因子(LIF；NCBI：3976)或心脏营养素-1/CT-1(NCBI：1489)或睫状神经营养因子受体(CNTF；NCBI：1271)、IL-11或IL-31。在一些实施方式中，多效性细胞因子(例如OSM)以约0.1ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至约0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，γ-分泌酶抑制剂选自：化合物E(C-E)(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-3H-1,4-苯并二吖庚因-3-基]丙酰胺、二苯并吖庚因(DBZ)：(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(7S)-5-甲基-6-氧代-7H-苯并[d][1]苯并吖庚因-7-基]丙酰胺、DAPT：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-苯基乙酸叔丁酯、Begacestat：5-氯-N-[(2S)-4,4,4-三氟-1-羟基-3-(三氟甲基)丁烷-2-基]噻吩-2-磺酰胺、和Flurizan：(2R)-2-(3-氟-4-苯基苯基)丙酸。在一些实施方式中，γ-分泌酶抑制剂以约10nM至5μM，或约100nM至4μM，或约200nM至3.5μM，或约300nM至3μM，或约400nM至2.5μM，或约450nM至2μM，或约500nM至1.5μM，或约50、90、150、250、350、450、480、500、650或700nM的浓度使用。
在一些实施方式中，TGF-β信号传导抑制剂如上所述并且以上文培养基H1所述的浓度使用。
在一些实施方式中，类固醇如上所述并且以上文培养基H1所述的浓度使用。
H3培养基可进一步包含促进肝类器官成熟的至少一种或两种或三种或四种或五种或六种组分和/或促进肝类器官存活的至少一种或两种或三种组分。
促进肝类器官成熟的组分选自：
诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的化合物；
充当促炎细胞因子和抗炎肌动蛋白两者的白细胞介素；
调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的化合物；
cAMP依赖性途径的激活剂；
YAP抑制剂；和
具有胆汁酸效力的化合物。
在一些实施方式中，促进肝类器官成熟的上述组分如上所述并且以上文培养基H1和H2所述的浓度使用。
充当促炎细胞因子和抗炎肌动蛋白两者的白细胞介素激活JAK-STAT、MAPK和AKT/PI3K信号传导。在一些实施方式中，白细胞介素是IL-6。在一些实施方式中，白细胞介素以约0.1ng/ml至1μg/ml，或约5ng/ml至0.5μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，具有胆汁酸效力的化合物的特征在于具有以下能力中的任何一种或多种或全部：激活核法尼酯衍生物X受体，增加cAMP并由此激活PKC信号传导途径。在一些实施方式中，具有胆汁酸效力的化合物选自：
牛磺胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙磺酸，
胆酸(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
鹅去氧胆酸(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
甘胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙酸，
脱氧胆酸(4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
甘氨鹅去氧胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙酸，
牛磺鹅去氧胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙磺酸，
石胆酸(4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，具有胆汁酸效力的化合物以约1μM至1mM，或约10μM至0.8mM，或约50μM至0.6mM，或约100μM至0.4mM，或约150μM至0.2mM，或约5、15、20、40、60、80、90、100、150、250、350、450、550、650、750或850μM的浓度使用。
在一些实施方式中，促进肝类器官存活的组分选自：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
糖胺聚糖；和
AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂。
在一些实施方式中，STAT3、GAB1介导的细胞粘附和/或AKT/PI3K信号传导途径的激活剂，以及AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂如上所述并且以培养基H1和H2所述的浓度使用。
在一些实施方式中，糖胺聚糖以约100ng/ml至1mg/ml，或约100ng/ml至1mg/ml，或约500ng/ml至0.5mg ml，或约1μg/ml至0.1mg/ml，或约5μg/ml至500μg/ml，或约300、500、700或800ng/ml，或约1、2、3、10、20、40、50、60、100、500、700μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，糖胺聚糖是肝素，并且以约100ng/ml至1mg/ml，或约100ng/ml至1mg/ml，或约500ng/ml至0.5mg/ml，或约1μg/ml至0.1mg/ml，或约5μg/ml至500μg/ml，或约300、500、700或800ng/ml，或约1、2、3、10、20、40、50、60、100、500、700μg/ml的浓度使用。
细胞外基质和悬浮培养
细胞外基质：
在一些实施方式中，干细胞在微环境中培养，所述微环境至少部分模拟所述干细胞天然存在的细胞生态位。通过在代表控制干细胞命运的关键调控信号的生物材料如基质、支架和培养基底的存在下培养所述干细胞，可以模拟这种细胞生态位。这样的生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或它们的混合物。支架提供二维或三维网络。用于这种支架的合适的合成材料包括选自以下的聚合物：多孔固体、纳米纤维和水凝胶、例如包括自组装肽的肽、由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇富马酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙酸纤维素和/或它们的共聚物组成的水凝胶(参见例如Saha等人，2007.CurrOpin Chem.Biol.11(4)：381-387；Saha等人，2008.Biophysical Journal 95：4426-4438；Little等人，2008.Chem.Rev 108,1787-1796)。如本领域技术人员所知，机械特性例如支架的弹性影响干细胞的增殖、分化和迁移。在一些实施方式中，支架包含生物可降解(共)聚合物，其在个体中移植后被天然存在的组分替代，例如以促进组织再生和/或伤口愈合。在一些实施方式中，所述支架在个体中移植后基本上不诱导免疫原性应答。所述支架补充有天然的、半合成的或合成的配体，其提供干细胞增殖和/或分化和/或迁移所需的信号。在一个实施方式中，所述配体包含确定的氨基酸片段。所述合成聚合物的实例包括F127嵌段共聚物表面活性剂(BASF)和Ethisorb(Johnson和Johnson)。细胞生态位部分由干细胞和周围细胞以及由所述生态位中的细胞产生的细胞外基质(ECM)决定。在一些实施方式中，MESP附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成，其中糖蛋白包括胶原、巢蛋白(巢蛋白)、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。已知不同类型的ECM，包含不同组成，其包括不同类型的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。所述ECM可以通过在去除这些细胞并添加分离的肝碎片或分离的胆管或分离的上皮干细胞之前，在容器中培养产生ECM的细胞例如成纤维细胞来提供。产生细胞外基质的细胞的实例是主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质原胶原和纤连蛋白的成纤维细胞，和主要产生胶原蛋白(I、III和V型)，软骨素硫酸蛋白多糖，透明质酸，纤连蛋白和腱生蛋白-C的结肠成肌纤维细胞。或者，所述ECM是商业提供的。市售细胞外基质的实例是细胞外基质蛋白(Invitrogen)和来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基膜制备物(例如MatrigelTM(BD Biosciences))。可以使用合成的细胞外基质材料，例如ProNectin(Sigma Z378666)。如果需要，可以使用细胞外基质材料的混合物。用于培养干细胞的ECM的使用增强了干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。在没有ECM的情况下，干细胞培养物不可以长期培养，并且未观察到未分化干细胞的持续存在。另外，ECM的存在允许培养三维组织类器官，其在不存在ECM时不可以培养。通常将细胞外基质材料涂布到细胞培养容器上，但可以(另外地或替代地)以溶液供应。约1mg/ml的纤连蛋白溶液可以用于涂布细胞培养容器，或者以约1μg/cm2至约250μg/cm2，或者以约1μg/cm2至约150μg/cm2。在一些实施方式中，细胞培养容器以8μg/cm2至125μg/cm2的纤连蛋白涂布。在一些实施方式中，ECM包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或胶原蛋白和层粘连蛋白。ECM可以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ECM。另一种ECM由MatrigelTM(BDBiosciences)提供，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和IV型胶原蛋白。
悬浮培养系统是指任何培养系统，其中细胞不被嵌入培养物中的固体或半固体基质中，并且自由漂浮在培养装置中而不停留在装置的底部。
早期肝祖细胞、晚期肝祖细胞和肝类器官的表征：
在一些实施方式中，早期肝祖细胞的特征在于以下标志物的任何一种或多种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或1或2或3至4或5或6或7或全部，或全部下列标志物：SOX9(NCBI：6662)、CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、PROX1(NCBI：5629)、ONECUT1(NCBI：3175)、AFP(NCBI：174)、TBX3(NCBI：6926)。
在一些实施方式中，晚期肝祖细胞的特征在于任何一种或多种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或1或2或3至4或5或6或7或全部，或全部下列标志物：CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、PROX1(NCBI：5629)、ONECUT1(NCBI：3175)、AFP(NCBI：174)、TBX3(NCBI：6926)、ALB(NCBI：213)。
在一些实施方式中，肝(肝脏)类器官包含选自肝细胞、胆管细胞、肝特异性内皮细胞(LSEC)、星状细胞、肝成肌纤维细胞和成肝细胞的多于一种肝特异性细胞类型。
在一些实施方式中，肝细胞的特征在于其表达白蛋白(ALB)但不表达胆管细胞标志物，例如细胞角蛋白7(CK7)。在一些实施方式中，肝细胞表达任何一种或多种，或至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或全部以下肝细胞标志物：HNF4a(NCBI：3172)、FAH(NCBI：2184)、TAT(NCBI：6898)、GCK(NCBI：2645)、TTR(NCBI：7276)、MET(NCBI：4233)、GLU1/MGAM(NCBI：8972)、FAHD2A(NCBI：51011)、HNF1B(NCBI：6928)、HNF1A(NCBI：6927)、CYP3A4(NCBI：1576)、CYP2C9(NCBI：1559)、CYP2C19(NCBI：1557)、CYP1A2(NCBI：1544)、CYP2E1(NCBI：1571)、CYP2D6(NCBI：1565)、CYP3A7(NCBI：1551)、CYP1A1(NCBI：1543)、CYP3A5(NCBI：1577)、CYP27A1(NCBI：1593)和CYP2B6(NCBI：1555)。
在一些实施方式中，胆管细胞的特征在于其表达CK7但不表达白蛋白(ALB)，并且任选特征在于其表达其他胆管细胞标志物如CK19(NCBI：3880)、HNF1B(NCBI：6928)和SOX9(NCBI：6662)。
在一些实施方式中，成肝细胞的特征在于其表达选自SOX9(NCBI：6662)、CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、PROX1(NCBI：5629)、ONECUT1(NCBI：3175)、AFP(NCBI：174)和ALB(NCBI：213)的任何一种或多种标志物。
在一些实施方式中，肝特异性内皮细胞(LSEC)的特征在于其表达选自CD45、CD80、CD86、CD11c、VAP1、STAB1和CD31的任何一种或多种标志物，其主要表达在细胞质中而不是细胞表面上。
在一些实施方式中，星状细胞的特征在于其表达选自GFAP、VIM、LHX2、LRAT、PDGFRb、HAND2、ICAM-1、VCAM-1和N-CAM的任何一种或多种标志物。
在一些实施方式中，肝成肌纤维细胞的特征在于其表达选自COL1A1和α-SMA中的任何一种或多种标志物。
本文所述的肝(肝脏)类器官能够执行肝功能并且显示在肝脏中观察到的结构组成。
在一些实施方式中，肝功能选自：白蛋白分泌、细胞色素酶活性、糖原贮存、低密度脂蛋白摄取、胆汁酸产生和药物代谢。
在本文所述的肝(肝脏)类器官中发现的肝脏中观察到的结构组成的特征在于组成肝脏的不同肝脏细胞类型的非随机分布。
肝类器官
可以通过逐步诱导方法从MESP产生肝类器官，其中干细胞首先致力于表达AFP但不表达ALB的早期肝祖细胞(图17和18)。随后诱导细胞形成表达AFP和ALB两者的晚期肝祖细胞(图18)。作为肝祖细胞，由于球状体被诱导形成含仅表达ALB但不表达CK7的终末分化肝细胞和仅表达CK7而不表达ALB的终末分化胆管细胞(图20)的类器官，因此细胞产生多种肝细胞类型。胆管细胞形成位于类器官周围的胆管样囊肿结构，周围是密集的肝细胞簇(图19和图20)。肝细胞的核心周围的胆管细胞囊肿结构的这种排列与肝组织中的肝细胞和胆管的排列非常相似，这支持了类器官由多种细胞类型组成，这些细胞类型在空间上排列成与肝器官中发现结构类似的结构(图21)。基因表达分析还显示，类器官表达肝细胞标志物，如ALB、CEBP、FOXA2、HNF1B、HNF4A、HNF6、KRT18、KRT8和NOTCH，以及胆管细胞标志物如CFTR、KRT7、KRT19和SOX9(图22)。通过对肝细胞中的ALB(图21)和胆管细胞中的CK7和CFTR(图21和25)等标志物的特异性染色验证了个体细胞类型的标志物的特异性表达。
由MESP产生的肝类器官也表达许多在肝脏中发现的功能性代谢酶(图23)。这包括主要细胞色素P450酶和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶。类器官还表达主要胆汁分泌转运蛋白，如NTCP和OATP1B3。这些酶和转运蛋白的表达强烈表明，肝类器官执行肝脏的主要功能。实际上，显示肝类器官执行许多肝脏特异性功能，例如由肝类器官中肝细胞的糖原贮存能力证实的葡萄糖代谢(图27A)以及如肝细胞中脂质摄取所示的脂质代谢(图27B)。还显示类器官能够分泌白蛋白(图28)。α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是肝脏产生和分泌的重要酶。人类A1AT缺陷导致肺部疾病，如COPD。肝类器官也能够产生这种重要的酶(图26)。CYP450酶活性对于肝脏的解毒作用很重要。与HepG2细胞系相比，肝类器官表现出更强的CYP3A4、CYP2D6、CYP2B6和CYP1A2活性(图29)。这些主要CYP负责由肝脏代谢的药物的接近70％(Zanger和Schwab，2013)。
在肝类器官组织中观察到的多种细胞类型形成的肝组织结构允许我们建模使用纯二维和三维肝细胞培养不可能的肝脏器官功能。在此，显示肝脏器官表现出肝脏特异性器官水平功能，例如胆汁分泌和运输至胆管。胆汁分泌是肝脏的重要独特功能(Boyer等，2013)。肝细胞分泌的胆汁含有许多重要成分，如胆盐、胆固醇和代谢的外源性药物、异生素和毒素。胆汁具有重要的生理功能，如去除有害的亲脂物质、消化和吸收小肠脂肪、消除胆固醇和调节有助于肠道发育的许多激素和信息素。由于没有连接胆管的胆小管功能网络，肝脏中的胆汁分泌和运输不可以用2D和3D以及肝细胞建模。相比之下，本文所述的肝类器官含有在连接至胆管样囊肿的肝细胞的核心中的广泛的胆小管网络(图30-36)。CDFDA处理的活体成像和胆小管标志物DPP IV的染色显示肝细胞形成从类器官中心延伸到周边的网状胆小管。由于显示肝细胞分泌分子(CDF)从胆小管运输到由胆管细胞形成的胆管样囊肿结构(图36)，因此胆小管也是功能性的。因此，本文所述的肝类器官显示器官水平功能，其只可以通过多种细胞类型的功能性相互作用以形成组织结构而实现。这样的器官水平功能将本文所述的肝类器官与1)主要包含干细胞的肝脏上皮类器官(Huch等，2015)和2)通过多种细胞类型的聚集形成的肝芽区分开，所述肝芽在体外无功能且仅当移植到动物中时成熟以形成肝组织(Takaebe等，2013)。本申请中产生的肝类器官现在允许我们研究培养皿中的器官水平功能，其更加反映人类特异性肝脏疾病。
从MESP成功产生肝类器官使得能够建模肝脏的遗传疾病。LDLR-/-MESP可以分化以形成肝类器官。这些肝类器官产生升高的水平的胆固醇，其反映家族性高胆固醇血症的病理状况(图37)。家族性高胆固醇血症是一种遗传性疾病，其中患者在低密度脂蛋白受体(LDLR)基因中存在突变，导致肝脏中LDLR蛋白的缺乏。这种缺乏导致肝脏分泌和进入血流的胆固醇的较高水平。升高的血液胆固醇水平最终导致心血管疾病的早期发作，并且患者通常接受他汀类药物方案以降低血液胆固醇水平。值得注意的是，用他汀类药物类似剂量依赖性地治疗LDLR-/-肝类器官导致胆固醇分泌水平降低，类似于表达LDLR的类器官(图37)。这些结果显示，基因修饰的MESP及其衍生的肝类器官概括了遗传疾病的病理生理状况和对已知药物治疗的反应。因此，这个系统(图14)是一个强大的工具，使得能够对肝脏、胰腺和肠疾病进行可能的建模。
虽然已经产生了模拟不同人体器官的类器官，但是关键的障碍是以高通量的方式产生均质类器官以允许大规模药物筛选(Spence et al 2011,Lancaster et al 2013,Takasato et al 2016)。用于类器官产生的复杂培养条件和对干细胞的自组织能力的依赖使其难以生成一盘具有类似大小、结构和功能的类器官。这是朝向在工业应用中使用类器官的有待克服的挑战性障碍。如本文所述，对类器官进行优化以用于以高通量方式产生，其中每个单一96孔含有具有相似大小和结构的单一类器官(图38)。除形态学外，使用这种高通量方式产生的类器官对于细胞色素酶CYP3A4和CYPB6表现出类似的代谢活性。这种以高通量方式生成近乎均匀的肝类器官，使其适用于大规模实验室或工业环境中使用的当前方法。
从MESP衍生肝类器官
在实施例中描述了从MESP产生肝类器官的示例性方法，并在图17中示意性地示出。
成体肝类器官
来自后部前肠样MESP的肝类器官的成功逐步生成表明，该方法也可用于从在发育上与肝脏器官发育一致的内胚层谱系的干细胞产生肝类器官。这包括来自MESP的早期肝祖细胞干细胞或存在于成体肝干细胞中的干细胞。使用源自人类成体肝脏的干细胞(如PCT/SG2016/050270中所述)，本文所述的类器官生成方法同样可用于从成体肝干细胞(ALSC)产生肝类器官(图41-44)。从ALSC发育的类器官在本文中被称为成体肝类器官。与MESP相比，ALSC在发育上致力于形成肝脏谱系的组织。因此，在一些实施方式中，不需要用于肝谱系特化的H1培养基的初始处理。在一些实施方式中，可以通过在培养基H2和H3中培养ALSC产生肝类器官(图40)。用H2培养基处理的成体肝干细胞分化成表达ALB和CK19的晚期肝祖细胞(图41)。晚期祖细胞随后在H3培养基中分化形成肝类器官(图42和43)。胆管细胞位于类器官的外周，肝细胞形成类器官的核心。胆管细胞自身组织成管样结构，具有在中心的内腔(图43)。与MESP衍生的类器官类似，ALSC衍生的类器官表达肝细胞和胆管细胞两者的标志物，以及肝脏富集和特异性的代谢酶和转运蛋白(图44)。重要的是，成体肝类器官也表现出肝脏特异性代谢活性(图45)。CYP2C9酶仅在成体肝细胞中具有高度活性。成体肝类器官表现出的高水平CYP2C9活性强调成体类器官显示与成体肝脏类似的代谢活性。除肝功能外，成体肝类器官也具有与MESP衍生的类器官相似的胆小管结构(图46)。
MESP和ALSC两者产生类似的类器官，其由肝细胞核心和在类器官外周形成导管样结构的胆管细胞组成。在两种类器官中由胆管细胞形成的导管结构中可观察到结构差异。MESP衍生的类器官的胆管细胞形成球状体囊肿结构，而ALSC衍生的类器官的胆管细胞排列成中心具有内腔的环。由于干细胞具有不同的发育潜力，可以预期这种差异。另一方面，衍生自ALSC的肝类器官反映成体肝脏组织。鉴于两种类器官的发育阶段的差异，类器官的整体结构和细胞组织化是类似的；肝细胞在类器官的核心中发现，胆管细胞在类器官的外周发现。更为显著的是，根据初始内胚层干细胞状态，本文所述的多步法可以有区别地使用以产生肝类器官。因此，显然任何早期内胚层祖细胞例如定形内胚层或前肠可使用本文描述的方法首先分化为MESP并随后产生类器官。类似地，本领域技术人员可以采用关于在后部前肠到成体肝脏的发育期间产生的干细胞或祖细胞的方案。
从成体肝干细胞衍生肝类器官
本文所述的肝类器官培养系统包含在两种不同的肝培养基中的多种可溶性试剂和悬浮培养系统。悬浮培养系统提供了形成晚期肝祖细胞和随后形成类器官的条件。在一些实施方式中，所述多种可溶性试剂包含一种或多种生长因子、(经典)WNT途径的增强剂、TGF-β诱导剂和Notch信号传导抑制剂。
成体晚期肝祖细胞和成体肝类器官的表征
在一些实施方式中，晚期肝祖细胞的特征在于任何一种或多种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或1或2或3或4或5或6种或全部，或全部下列标志物：CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、ALB(NCBI：213)、HNF1B(NCBI：6928)和SOX9(NCBI)。
在一些实施方式中，肝(肝脏)类器官包括选自肝细胞、胆管细胞、肝特异性内皮细胞(LSEC)、星状细胞、肝成肌纤维细胞和成肝细胞的多于一种肝特异性细胞类型。
在一些实施方式中，肝细胞的特征在于：
a.其表达白蛋白(ALB)而不表达胆管细胞标志物，如细胞角蛋白7(CK7)；和
b.表达任何一种或至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种或全部下列干细胞标志物：HNF4a(NCBI:3172)、FAH(NCBI:2184)、TAT(NCBI:6898)、GCK(NCBI:2645)、TTR(NCBI:7276)、MET(NCBI:4233)、GLUl/MGAM(NCBI:8972)、FAHD2A(NCBI:51011)、HNF1B(NCBI:6928)、HNF1A(NCBI:6927)、CYP3A4(NCBI:1576)、CYP2C9(NCBI:1559)、CYP2C19(NCBI:1557)、CYP1A2(NCBI:1544)、CYP2E1(NCBI:1571)、CYP2D6(NCBI:1565)、CYP3A7(NCBI:1551)、CYP1A1(NCBI:1543)、CYP3A5(NCBI:1577)、CYP27A1(NCBI:1593)和CYP2B6(NCBI:1555)。
在一些实施方式中，胆管细胞的特征在于其表达CK7而不表达白蛋白(ALB)，并且任选其表达其他胆管细胞标志物，如CK19(NCBI：3880)、HNF1B(NCBI：6928)和SOX9(NCBI：6662)。
在一些实施方式中，肝特异性内皮细胞(LSEC)的特征在于表达选自CD45、CD80、CD86、CD11c、VAP1、STAB1和CD31的任何一种或多种标志物，其中CD31主要表达在细胞质中而不是细胞表面上。
在一些实施方式中，星状细胞的特征在于表达选自GFAP、VIM、LHX2、LRAT、PDGFRb、HAND2、ICAM-1、VCAM-1和N-CAM的任何一种或多种标志物。
在一些实施方式中，肝成肌纤维细胞的特征在于表达选自COL1A1和α-SMA中的任何一种或多种标志物。
在一些实施方式中，成肝细胞的特征在于表达选自SOX9(NCBI：6662)、CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、HNF1B(NCBI：6928)和ALB(NCBI：213)的任何一种或多种标志物。
衍生自ALSC的肝(肝脏)类器官能够执行肝脏功能并显示在肝脏中观察到的结构组成。
肝功能选自白蛋白分泌、细胞色素酶活性、糖原贮存、低密度脂蛋白摄取、胆汁酸产生和药物代谢。
在肝(肝脏)类器官中发现的在肝脏中观察到的结构组成的特征在于组成肝脏的不同肝细胞类型的非随机分布。
在实施例中描述了用于从成体肝干细胞产生肝类器官的示例性方法，并且在图41中示意性地示出。
3.来自MESP的肠类器官和胰腺球状体
本文提供了从MESP产生肠类器官和胰腺球状体的方法。MESP表达标志物PDX1、HNF4A和CDX2，它们是由后部前肠谱系产生的器官即肝、肠和胰腺的重要发育调节物。MESP产生的肠类器官类似于具有内腔的肠样盘绕结构。类器官中的细胞表达关键肠标志物，如CDX2和Villin，Villin的不对称分布表明细胞高度成熟。肠样结构包裹在一层间质组织中。这类似于体内的小肠，其是对于蠕动重要的肌肉组织的包膜。
本文描述了首次通过使用MESP从PSC衍生胰腺球状体。胰腺球状体表达胰腺祖细胞的标志物，例如PDX1和NKX6.1。本文所述的胰腺球状体祖细胞具有产生胰腺器官的所有细胞类型的潜力。胰腺球状体已经从成体胰腺产生(参见US 8,642,339 B2)。然而，这些成体胰腺球状体由上皮祖细胞组成并且不表达由几乎所有胰腺细胞类型表达的PDX1和NKX6.1。本文所述的胰腺球状体具有进一步产生含有多种胰腺细胞类型的胰腺类器官的潜力。
从MESP衍生胰腺球状体祖细胞
本文所述的胰腺球状体培养系统包含在三种不同胰腺培养基中的多种可溶性试剂、细胞载体和悬浮培养系统。细胞载体提供适合于将MESP分化成早期胰腺祖细胞的培养条件，并且悬浮培养系统提供适合于形成晚期胰腺祖细胞的培养条件。在一些实施方式中，所述多种可溶性试剂包含一种或多种生长因子、(经典)WNT途径的增强剂、TGF-β诱导剂和Notch信号传导抑制剂。
培养基P1、P2和P3
培养基P1
在一些实施方式中，提供了用于早期胰腺内胚层祖细胞形成的培养基，其中所述培养基包含：
a)AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；
b)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
c)WNT信号传导激活剂；和
d)FGF和MAPK途径激活剂。
e)作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子
在一些实施方式中，AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；WNT信号传导激活剂和GSK3抑制剂；FGF和MAPK途径激活剂；和作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子如上所述并且以上文所述的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含作为FGF和MAPK途径的激活剂的分子。在一些实施方式中，FGF和MAPK途径的激活剂以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至约4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。在一些实施方式中，FGF和MAPK途径的激活剂选自FGF7、FGF1、FGF3、FGF10和FGF22。在一些实施方式中，选自FGF7、FGF1、FGF3、FGF10和FGF22的FGF以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至约4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基P1包含促进胰腺内胚层的存活和增殖的1、2、3、4或全部以下另外的组分：
(i)如上所述的类固醇；
(ii)如上所述的cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；
(iii)如上所述的Notch受体激活剂；和/或
(iv)如上所述的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制剂。
培养基P1的另外的组分可以以本文先前描述的浓度使用。
培养基P2
在一些实施方式中，用于晚期胰腺内胚层祖细胞形成的培养基包含：
·视黄醇的代谢物；
·(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂；
·FGF和MAPK途径激活剂；
·蛋白激酶C激活剂；和/或
·Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂。
在一些实施方式中，视黄醇的代谢物选自视黄酸、9-顺式-视黄酸、异维甲酸、阿维A、贝沙罗汀和阿利维A酸。在一些实施方式中，视黄醇的代谢物以约0.2μM至5μM，或约0.4至4μM，或约0.6至3μM，或约0.8至2μM，或约1至约1.5μM，或约0.3、0.5、0.7、0.9、1、2、2.5、3.5、4.5μM的浓度使用。
在一些实施方式中，Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂选自N-[2-[(3'R,7'aR)-3',6',10,11b-四甲基-3-氧代螺[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-十氢苯并[a]芴-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-六氢呋喃并[3,2-b]吡啶]-4'-基]乙基]-6-(3-苯基丙酰氨基)己酰胺(KAAD-环巴胺)、(E)-N-(4-苄基哌嗪-1-基)-1-(3,5-二甲基-1-苯基吡唑-4-基)甲亚胺(SANT-1)和(3S,3'R,3'aS,6'S,6aS,6bS,7'aR,9R,11aS,11bR)-3',6',10,11b-四甲基螺[2,3,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-十氢-1H-苯并[a]芴-9,2'-3a,4,5,6,7,7a-六氢-3H-呋喃并[3,2-b]吡啶]-3-醇(环巴胺)。在一些实施方式中，Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂以约25nM至5μM，或约200nM至4μM，或约400nM至3μM，或约600nM至2μM，或约800nM至1μM，或约100、250、350、450、500、700、800nM，或约1.5、2、2.5、3.5及4.5μM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基包含如上所述并且以本文所述的浓度使用的作为FGF和MAPK途径激活剂的分子。
在一些实施方式中，蛋白激酶C激活剂选自：佛波酯，(1S,3S,5Z,7R,8E,11S,12S,13E,15S,17R,20R,23R,25S)-25-乙酰氧基-1,11,20-三羟基-17-[(1R)-1-羟乙基]-5,13-双(2-甲氧基-2-氧代亚乙基)-10,10,26,26-四甲基-19-氧代-18,27,28,29-四氧杂四环[21.3.1.13,7.111,15]二十九碳-8-烯-12-基(2E,4E)-2,4-辛二烯酸酯(苔藓抑素I)、(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(乙酰氧基)-4a,7b-二羟基-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]甘菊环-9-基肉豆蔻酸酯(TPA)和5-氯-N-庚基萘-1-磺酰胺(SC-10)、(2Z)-2-甲基-2-丁烯酸(1aR,2S,5R,5aS,6S,8aS,9R,10aR)-1a,2,5,5a,6,9,10,10a-八氢-5,5a-二羟基-4-(羟甲基)-1,1,7,9-四甲基-11-氧代-1H-2,8a-桥亚甲基环戊二烯并[a]环丙并[e]环癸烯-6-基酯(PEP005)。在一些实施方式中，蛋白激酶C激活剂以约100nM至10μM，或约200nM至约8μM，或约400nM至约6μM，或约400nM至4μM，或约400nM至2μM，或约450nM至约1μM，或约350、475、500、550、600、800或900nM，或约7、5、3、2.5、1.5或1μM的浓度使用。
在一些实施方式中，(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂选自头蛋白(NCBI 9241)、6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-a]嘧啶(Dorsomorphin)和4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹诺酮(LDN193189)。在一些实施方式中，(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂(例如Noggin)以约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含γ-分泌酶抑制剂。在一些实施方式中，γ-分泌酶抑制剂选自：DAPT：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-苯基乙酸叔丁酯、化合物E(C-E)(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-3H-1,4-苯并二吖庚因-3-基]丙酰胺、二苯并吖庚因(DBZ)：(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(7S)-5-甲基-6-氧代-7H-苯并[d][1]苯并吖庚因-7-基]丙酰胺、Begacestat：5-氯-N-[(2S)-4,4,4-三氟-1-羟基-3-(三氟甲基)丁烷-2-基]噻吩-2-磺酰胺和Flurizan：(2R)-2-(3-氟-4-苯基苯基)丙酸。在一些实施方式中，γ-分泌酶抑制剂(例如DAPT)以约0.1μM至20μM，或约0.5μM至15μM，或约0.8μM至10μM，或约1μM至5μM，或者约0.9μM至2.5μM，或者约0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、7、8、12、17或19μM的浓度使用。
在一些实施方式中，培养基还包含如上所述并且以本文所述的浓度使用的AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂，或作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子，或选自烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米的化合物。
培养基P3
在一些实施方式中，用于衍生和维持胰腺球状体的培养基包含：
·视黄醇的代谢物；
·ACTR-IB、TGFβRI和ACTR-IC抑制剂；
·(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂；
·FGF和MAPK途径激活剂；
·γ-分泌酶抑制剂；
·Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂；
·AMPK信号传导激活剂；和
·糖胺聚糖。
在一些实施方式中，ACTR-IB、TGFβRI和ACTR-IC抑制剂是ALK5抑制剂(例如，ALK5抑制剂II)。在一些实施方式中，ACTR-IB、TGFβRI、ACTR-IC和/或ALK5的抑制剂以约0.1μM至100μM，或约1μM至50μM，或约4μM至25μM，约6μM至15μM，或约8μM至10μM，或约2、3、5、7、9、9.5、10.5、11、12、12.5、35、60、75或80μM的浓度使用。
在一些实施方式中，视黄醇的代谢物、(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂、FGF和MAPK途径激活剂、γ-分泌酶抑制剂、Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂和糖胺聚糖如本文所述并以本文所述的浓度使用。
在一些实施方式中，AMPK信号传导激活剂选自：甲状腺激素3(T3)、5-氨基-1-[(2R,3S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]咪唑-4-甲酰胺(AICAR)和3-(二氨基亚甲基)-1,1-二甲基胍(二甲双胍)。在一些实施方式中，AMPK信号传导激活剂(例如T3)以约10nM至1M，或约200nM至0.8M，或约400nM至0.6M，或约600nM至约0.4M，或约800nM至0.2M，或约1μM至2μM，或约500、700、900、950nM，或约1、1.1、1.5、2、5、7、8、150、500、700或800μM的浓度使用。
在一些实施方式中，P3培养基还包含如本文所述并且以本文所述的浓度使用的作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；或选自烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹胺的化合物。
早期胰腺祖细胞、晚期胰腺祖细胞和胰腺球状体的表征
在一些实施方式中，早期胰腺内胚层祖细胞的特征在于表达选自以下的一种或多种标志物：SOX9(NCBI：6662)、PDX1(NCBI：3651)、NKX6.1(NCBI：4825)和CK19(3880)。
在一些实施方式中，晚期胰内胚层祖细胞的特征在于表达选自以下的一种或多种标志物：PDX1(NCBI：3651)、NKX6.1(NCBI：4825)、NEUROG3(NCBI：50674)、NKX2.2(NCBI：4821)、NEUROD1(NCBI：4760)和PAX6(NCBI：5080)。
在一些实施方式中，胰腺内胚层祖细胞的特征在于表达选自以下的一种或多种标志物：
a)一种或两种或全部以下内分泌标志物：GCG(NCBI 2641)、INS(NCBI 3630)、SST(NCBI 6750)；和/或
b)一种或两种或三种或四种或全部以下标志物：PDX1(NCBI 3651)、NKX6.1(NCBI4825)、NKX2.2(NCBI 4821)、NEUROD1(NCBI 4760)、MAFA(NCBI 389692)；和/或
c)一种或两种或三种或全部选自以下的腺泡标志物：PRSS1(NCBI 5644)、CPA1(NCBI 1357)、AMY1(NCBI 276)、CTRC(NCBI 11330)；和/或
d)至少一种导管标志物，例如角蛋白19(NCBI 3880)。
在一些实施方式中，细胞分泌一种或多种以下激素或酶：INS(NCBI 3630)、GCG(NCBI 2641)、SST(NCBI 6750)或PRSS1(NCBI 5644)。
胰腺球状体
MESP表达PDX1，其是胰腺谱系的关键标志物。这突出了MESP产生胰腺谱系组织的潜力。本文描述了从MESP衍生胰腺球状体的3步骤方案。胰腺球状体不仅表达PDX1，而且表达另一种重要的胰腺祖细胞标志物NKX6.1(Rezania等，2013；Burlison等，2008；Nostro等，2015)(图48)。这些表达PDX1和NKX6.1的祖细胞具有产生胰腺的外分泌和内分泌细胞两者的能力，包括产生胰岛素的β-胰岛细胞。球状体是随后分化产生类器官的祖细胞(Mustata等，2013；Dye等，2015)。因此，这些胰腺球状体应具有产生胰腺类器官的潜力。
相比之下，衍生自成体胰腺的胰腺上皮类器官(PCT/NL2010/000017)表达不同的干细胞标志物，例如EPCAM和SOX9(表6)。与成体胰腺上皮类器官相比，不同的培养条件也用于培养MESP衍生的胰腺球状体(表7)。
从MESP衍生胰腺祖细胞和球状体
在实施例中描述了用于从MESP产生胰腺祖细胞和球状体的示例性方法，并且在图47中示意性地示出。
实施例
材料和方法
用定量PCR(qPCR)进行基因表达分析
根据制造商的方案使用TRIzol试剂(thermos scientific)分离来自细胞的总RNA。简言之，1ml Trizol用于不超过150万个细胞。除去培养基后，将Trizol直接加入到细胞中。将样品温育15-30分钟以完全裂解细胞。加入200μl 100％氯仿并剧烈混合样品并在室温下放置5分钟。将样品在4℃以13,000RPM离心15分钟，并将顶部水层取回到新的1.5mlappendorf管中。将等体积的100％异丙醇加入到水溶液中以沉淀总DNA和RNA。将样品放置10分钟并在4℃以13,000RPM离心10分钟。将沉淀的总DNA和RNA用70％乙醇洗涤一次，并在室温下以5,000RPM离心5分钟。总DNA和RNA用DEPC水重构。通过DNASE I处理(ThermoScientific)除去DNA污染物。根据制造商的方案使用RNA纯化试剂盒(PureLink，Invitrogen)清洁总RNA。根据制造商的方案，将500ng总RNA输入使用SuperScript II逆转录酶试剂(Invitrogen)的反转录过程。使用SYBR FAST qPCR Master Mix(KAPA)试剂定量cDNA并用实时PCR系统(Applied Biosystem)读取。
使用免疫荧光进行细胞染色
对于3D悬浮培养物的免疫荧光，在室温下用4％PFA固定30分钟之前，用PBS将类器官洗涤三次。样品用0.5％Triton X-100透化并分别用0.5％Triton X-100+5％BSA封闭1小时。将样品与稀释于含有5％BSA的0.1％Tween-20中的一抗在4℃温育过夜。16-24小时后，每次洗涤期间样品用0.1％Tween-20洗涤15分钟三次。将类器官与在含有5％BSA的0.1％Tween-20中稀释的二抗在室温下温育3小时，随后用0.1％Tween-20洗涤三次。Hoechst33342在最后一次洗涤期间加入。对于3D基质胶培养物的免疫荧光，将含有细胞的基质胶机械解离，转移至eppendorff管并保持在冰上。使用分散酶和低温的组合液化基质胶。15分钟后，样品以1,000r.p.m离心5分钟，吸出上清液。将沉淀用冷PBS洗涤一次以除去剩余的基质胶污染物。随后如上所述将样品固定并染色。使用共焦显微镜(Olympus FV1000倒置)获得3D样品的所有免疫荧光图像。ImageJ 1.48k软件(Wayne Rasband,NIHR,USA,http://imagej.nih.gov/ij)用于图像处理。处理过程中亮度或对比度的变化同样适用于整个图像。
实施例2
MESP的长期稳定培养
将MESP接种在含有B27补充物(Invitrogen)的基质胶(BD Biosciences)上。MESP在含有N2补充物(Gibco)，B27补充物(Gibco)，青霉素/链霉素(Gibco)，A83-01(Stemgent)，地塞米松(Stemgent)，ChIR99021，丙戊酸(VPA)(Stemgent)，人HGF(R&D)，人EGF(R&D)，Jagged-1(Anaspec)，N6,2'-O-二丁酸腺苷3',5'-环状单磷酸钠(dbCAMP)(Sigma-Aldrich)，烟酰胺(Sigma-Aldrich)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Tocris)中培养。使用分散酶和TryLE每14-16天传代MESP。基质胶被机械分离，转移到eppendorff管并保持在冰上以允许分散酶和低温的组合液化基质胶。5分钟后，将样品以1,000r.p.m离心5分钟，并吸出上清液。然后将球状体在37℃下在TryLE中温育5分钟，然后解离成单细胞。细胞以1,000r.p.m离心5分钟。细胞用MESP培养基洗涤一次，然后重悬于MESP培养基中。细胞以12,000个细胞/cm2的密度接种。培养基每两天更换一次。
为了鉴定MESP沿内胚层谱系的发育特征，通过使用qPCR的基因表达分析选择和检测靶向GUT管的不同区域的标志物(图4)。MESP不表达在前部前肠、中肠和后肠中发现的关键标志物基因，但表达在后部前肠中发现的标志物基因如PDX1、CDX2和HNF4A。这些标志物也从使用特异于每种标志物的蛋白质的抗体的细胞染色结果在蛋白质水平上出现(图5)。MESP还表达通常在不同的胎儿和成体祖细胞和干细胞中表达的干细胞标志物CK19和SOX9(图5和10)。这种MESP干细胞特征反映在细胞的稳定增殖能力中(图7A)。
MESP的这种增殖能力对于再生疗法以及蛋白质组学和基因组学研究中所需的细胞的大规模生产是有价值的。为了扩大MESP的产量，将细胞接种在24孔和12孔培养皿的更大容器中。MESP以12,000个细胞/cm2的相似密度接种，并且使用的基质胶的体积与培养室的体积成比例地增加。培养基类似地每两天更新一次。通过增加室的大小，取得的MESP的数量也按比例增加(图6)。可以从3.7cm2的小表面积生成超过一百万个细胞，证实了系统的可扩展性，以为各种下游应用生成大量MESP。
为了进一步表征MESP的独特干细胞状态，使用全基因组微阵列分析转录组。简而言之，使用用于qPCR基因表达分析的类似方法，使用Trizol试剂从MESP、DE和GUT细胞提取总RNA，使用Purelink RNA试剂盒处理和纯化DNASE。对于微阵列，根据制造商的方案，使用Illumina Total Prep RNA扩增试剂盒(Ambion)将500ng脱氧核糖核酸酶处理的总RNA扩增成生物素标记的cRNA。随后，根据制造商的方案，将750ng cRNA杂交，洗涤并用Cy3-链霉抗生物素蛋白标记到阵列(Illumina HumanHT-12_v4_BeadChips)上。使用Illumina HiScan平台读取杂交芯片。数据使用Genome Studio(Illumina)进行处理。样品进行分位数标准化。标准化的数据被导出成GeneSpring格式和Microsoft Excel进行后续分析。简言之，过滤数据以除去没有任何信号的探针。使用GeneSpring(GeneSpring)进行主成分分析图的产生，生成基因的统计分析。使用Gene-E(Broard Institute)完成热图和聚类的生成。聚类分析显示MESP的转录组与DE和GUT细胞有很大不同。MESP表达独特的表达签名作为干细胞状态。许多早期内胚层特异性标志物如SOX2、CER1、GATA4、SOX17、CXCR4、FOXA2和CD34不在MESP中表达(图9)。MESP表达了从胚胎或成体肝脏、胰腺和小肠分离的晚期内胚层祖细胞和干细胞中表达的独特基因的列表(图10)。这些标志物的表达支持MESP是与已报道的其他早期内胚层干细胞(Cheng.,et al 2012；Hannan.,et al 2013)不同的晚期内胚层干细胞。
实施例3
从诱导性多能干细胞(iPSC)衍生MESP
多能干细胞包括诱导多能干细胞。iPSC是由Takahashi和Yamanaka的诺贝尔获奖方法产生(Takahashi和Yamanaka，2006)，其中终末分化的体细胞被转化回多能细胞状态。iPSC技术具有巨大的应用潜力，其中一项重大突破包括遗传疾病建模。疾病患者体细胞例如血液或皮肤成纤维细胞可以转化回多能细胞状态。这种疾病患者多能干细胞可用于产生含有疾病表型的感兴趣的细胞类型。因此，该技术潜在地允许在培养皿中对任何遗传疾病进行建模。因此，显示iPSC同样可用于产生用于建模疾病的MESP是非常重要的。
如先前所述产生和表征iPSC(Chia.,et al,nature 2010)。简言之，用含有基因OCT4、SOX2、KLF4、CMYC和PRDM14的过表达盒的逆转录病毒感染在补充有15％胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Gibco)补充物中的人MRC5成纤维细胞(ATCC)培养物。感染3-5天后，将成纤维细胞铺在丝裂霉素C灭活的CF-1饲养细胞上。感染24-48小时后，细胞在含有20％敲除血清替代物(Gibco)，1mM L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，0.1mM 2-巯基乙醇并补充有4-8ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)的DMEM/F12中培养。培养基每两天更新一次。人iPSC集落将出现并准备在接种后3周手动挑选。通过多能干细胞标志物的基因表达和在SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力验证了挑取的iPSC克隆的多能细胞状态(Chia.,et al,nature 2010)。
实施例5
从MESP产生肠类器官
MESP基因表达谱表明该干细胞与后部前肠非常相似，后部前肠具有产生肝脏、胰腺和肠的发育潜力。我们测试了采用和改变其他人报道的由hESC产生类器官的分化策略(Spence.,et al 2011)，MESP是否能够产生肠类器官。MESP在由含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、A83-01(Stemgent)、SB202190(Tocris)、人EGF(R&D)、烟酰胺(Sigma-Aldrich)、Noggin(R&D)、Wnt3A(R&D)、R-spondin1(R&D)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和FGF4(R&D)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)组成的培养基中培养8天以诱导朝向肠谱系的特化。之后，使用分散酶将球状体从基质胶中除去并使用TryLE解离成单个细胞。简而言之，将基质胶机械分离，转移至eppendorff管并保持在冰上以允许分散酶和低温的组合液化基质胶。5分钟后，将样品以1,000r.p.m离心5分钟，并吸出上清液。然后将球状体在37℃下在TryLE中温育5分钟，然后解离成单细胞。细胞以1,000r.p.m离心5分钟。细胞用由含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、A83-01(Stemgent)、SB202190(Tocris)、人EGF(R&D)、烟酰胺(Sigma-Aldrich)、Noggin(R&D)、Wnt3A(R&D)、R-spondin1(R&D)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和FGF4(R&D)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)的I2培养基洗涤一次。细胞随后以5,000个细胞/孔(96孔)的密度接种并在I2中作为悬浮培养物在96孔超低附着板中培养30天以衍生肠类器官。
分化3周后，可在培养皿中观察到类似于小肠的盘绕螺旋结构(图11)。该肠样结构嵌入类似于间充质组织的成纤维细胞样组织的网状物中。这些类器官形成类似的结构，其形态类似于先前报道的肠类器官(Spence.,et al 2011)。事实上，这些MESP产生表达关键肠标志物Villin和CDX2的肠类器官。细胞自组织化并包围与小肠相似的内腔。如从Villin的不对称分布明显的，细胞是极化的。结果反映了MESP形成肝脏、胰腺和肠组织的发育潜力。
实施例6
从MESP产生肝类器官
后部前肠在人体内形成肝脏器官。因此，MESP球状体具有产生肝类器官的潜力。在此我们开发了从MESP产生人类肝类器官的逐步诱导方案(图17)。简而言之，将MESP在含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、A83-01(Stemgent)、ChIR99021(Tocris)、人HGF(R&D)、人EGF(R&D)、Jagged-1(Anaspec)、N6,2'-O-二丁酸腺苷3',5'-环状单磷酸钠(dbCAMP)(Sigma-Aldrich)、烟酰胺(Sigma-Aldrich)、BMP4、BMP7(R&D)和FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)中培养8天以首先诱导朝向肝谱系的特化。在此阶段，MESP开始表达在MESP中不表达(图5、13和15)的α-胎蛋白(AFP)(图18，上图)。这标志着球状体成为作为早期肝祖细胞的肝谱系的承诺。
随后使用分散酶从基质胶中去除早期肝祖细胞，并使用TryLE解离成单细胞。简而言之，将基质胶机械分离，转移至eppendorff管并保持在冰上以允许分散酶和低温的组合液化基质胶。5分钟后，将样品以1,000r.p.m离心5分钟，并吸出上清液。然后将早期肝祖细胞在TryE中在37℃下温育5分钟，然后解离成单细胞。细胞以1,000r.p.m离心5分钟。细胞用H2培养基洗涤一次，然后重悬于H2培养基中。细胞以5,000个细胞/孔(96孔)的密度接种，并在含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、A83-01(Stemgent)、ChIR99021(Tocris)、人HGF(R&D)、人EGF(R&D)、Jagged-1(Anaspec)、N6,2'-O-二丁酸腺苷3',5'-环状单磷酸钠(dbCAMP)(Sigma-Aldrich)、(Sigma-Aldrich)、BMP7(R&D)和FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)中作为悬浮培养物在96孔超低附着板中培养15天以衍生晚期肝祖细胞(图17)。除了AFP，晚期肝祖细胞开始表达白蛋白(ALB)，它是肝细胞的决定性标志物。
对于衍生的肝类器官，将肝祖细胞在含有A83-01，地塞米松，化合物-E(EMDMillipore)，HGF，BMP7，FGF19，制瘤素-M(R&D)的CloneticsTM HCMTM肝细胞培养基(Lonza)中培养至少3周(图17)。在分化过程中，球状体在尺寸上变得越来越紧凑，球状体的中心变得密集且更不透明。分化3周后，类器官将由细胞的密集核心和开始在外周形成的囊肿结构组成。形成后，类器官在培养中稳定2周以上。
实施例7
肝类器官中存在多种细胞类型
肝主要由肝细胞组成，肝细胞是器官的主要代谢细胞类型。除了肝细胞外，其他肝实质细胞类型是胆管细胞。胆管细胞形成肝脏中的胆管，胆汁分泌物从肝细胞排出肝脏并进入小肠。为了研究肝类器官是否包含肝脏的实质细胞类型，将类器官与对ALB(在肝细胞中特异性表达)和细胞角蛋白7(CK7)(在胆管细胞中特异性表达)特异的抗体共同染色。从染色结果(图20)，CK7阳性细胞仅在囊肿结构中，而不在肝类器官的核心中发现，并且ALB阳性细胞仅在类器官核心中而不在囊肿中发现。结果显示胆管细胞和肝细胞两者存在于衍生自MESP的类器官中。在肝类器官中两种薄壁细胞类型的存在也通过在肝细胞和胆管细胞两者中表达的标志物基因的基因表达分析验证。与MESP相比，肝类器官表达许多肝细胞富集标志物，例如ALB、CEBP、FOXA2、HNF1B、HNF4A、HNF6、KRT18、KRT8和NOTCH2。与MESP相比，胆管细胞富集标志物如CFTR、KRT7、KRT19和SOX9也在肝类器官中高得多地表达(图22)。用CFTR特异性抗体染色也显示囊肿结构由胆管细胞组成(图25)。
两种薄壁组织肝细胞不仅在肝类器官中发现，而且细胞还以模仿体内肝脏组织的特定方式排列(图21)。在肝小叶(构成整个肝脏的基本单位)中，肝细胞在中心静脉周围环状紧密堆积。胆管细胞形成位于小叶周边的胆管(图21A)。类似地，在MESP衍生的肝类器官中，肝细胞密集堆积在核心中，并且胆管细胞形成模拟胆管的囊肿结构(图21B)。结果支持肝类器官包含肝脏器官的两种主要实质细胞类型，并且细胞与在肝脏组织中发现的细胞类似地组织化。
实施例8
肝类器官表现出多种肝脏特异性功能
为了确定肝类器官是否有功能，通过qPCR检测各种代谢酶的表达和运输。与MESP相比，肝类器官表达大部分细胞色素P450酶(CYP)，包括CYP3A4，CYP3A7，CYP1A1，CYP2D6，CYP2B6，CYP2C19和CYP2E1。另外，与MESP相比，肝类器官还表达主要UDP-葡萄糖醛酸基转移酶UGT1A1，UGT2B15和UGT2B7。这些酶对于肝脏的解毒功能的不同阶段是重要的。CYP基本上代谢了人体中几乎75％的药物。在肝脏解毒的第一阶段，这些酶向底物引入反应性亚基团以增加分子水溶性用于除去。在第二阶段，UDP-葡萄糖醛酸基转移酶将来自CYP酶的这些反应性代谢物与电荷基团如葡糖醛酸偶联以增加该底物的质量并降低其反应性。在解毒的最后阶段，在类器官中表达的胆汁转运蛋白(如NTCP和OATP1B3)主动将去毒的产物转运出肝细胞进入胆小管并朝向用于去除的胆管。用另一种重要的肝脏转运蛋白MRP2进行细胞染色显示肝类器官表达对肝脏解毒功能必要的必要转运蛋白。表达分析表明，类器官表达肝脏中解毒过程的所有阶段需要的大多数解毒酶。
为了进一步验证在类器官中表达的CYP的酶活性，使用P450-GloTM CYP450测定法(Promega)来测定各种CYP的活性。根据制造商的方案使用针对每种CYP酶的特定测定试剂盒。对于特异于检测CYP3A4、CYP2D6、CYP2B6和CYP1A2的每种测定试剂盒使用独立的类器官。将从发光计获得的总萤光素酶读数归一化至类器官中的总细胞数。酶测定表明，与业内常用于肝脏研究的HepG2细胞系相比，类器官具有高度活跃的CYP酶活性。
还测定类器官的特异性肝功能，例如白蛋白分泌。24小时后收集个体类器官的培养基。使用具有人白蛋白特异性抗体和分光光度计的ELISA检测培养基中白蛋白的量。使用由不同浓度的重组白蛋白组成的标准对照确定白蛋白的确切量。来自各种浓度的重组白蛋白的读数产生标准曲线。标准曲线用于根据ELISA中的读数推断培养基中白蛋白的量。结果显示与培养基对照相比，肝类器官分泌30-60ng/ml/天的白蛋白。
肝脏的另一个主要功能是将过量葡萄糖作为糖原贮存在肝细胞中。糖原作为能量储存的重要形式，并且肝脏中该过程的失调导致诸如糖尿病的疾病。肝类器官用检测多糖如糖原的高碘酸-希夫(PAS)染色。PAS染色显示类器官中的肝细胞(染成紫色，箭头)能够储存糖原(图27A)。肝脏中的肝细胞不仅调节葡萄糖体内平衡，细胞还积极摄取脂质以调节人体内的脂质体内平衡。为了测定肝类器官的脂质摄取功能，用荧光标记的低密度脂蛋白处理类器官。这些LDL可以在器官中成像并可视化。结果显示肝类器官中的肝细胞能够摄取LDL(图27B)。
实施例9
肝类器官含有功能性胆小管网络
在肝小叶中，肝细胞和胆管细胞通过称为胆小管的通道连接(图30)。该管用于转运来自含有用于脂肪消化和吸收的重要胆汁盐的肝细胞的胆汁分泌物，胆固醇和除去的代谢的外源亲脂性物质。该通道是肝细胞和胆管细胞之间的重要功能连接通道。肝细胞主动将溶质泵入胆小管中，其随后转运至由胆管细胞形成的胆管(箭头表示肝细胞分泌和运输至胆小管的方向)(图30)。肝类器官的肝细胞表达关键的胆小管标志物DPP IV，其标志与胆小管接触的肝细胞表面(图35)。为了使胆小管成像，用分子5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(CDFDA)处理类器官(图31)。CDFDA是一种大的惰性分子，可被肝细胞和其他细胞被动摄取(Zamek-Gliszczynski等，2003)。CDFDA通过在肝细胞但不在胆管细胞中存在的酯酶在肝细胞中转化为5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素(CDF)。与CDFDA相比，CDF是可以通过成像技术检测的荧光团。肝细胞中产生的CDF通过MRP2转运蛋白被肝细胞积极地泵出到胆小管中。胆小管随后将CDF转运至由胆管细胞形成的胆管。
为了检测肝类器官中的功能性胆小管网络，用CDFDA处理活的类器官。简而言之，除去培养基，首先用含有钙和镁的PBS洗涤类器官三次。接下来，类器官与5μg/ml CDFDA(Molecular Probes)和1μg/ml Hoechst 33342在37℃下温育规定的时间。随后将类器官洗涤三次，并在共聚焦显微镜下进行成像(Olympus FV1000倒置)。ImageJ 1.48k软件(WayneRasband，NIHR，USA，http://imagej.nih.gov/ij)用于图像处理。处理过程中亮度或对比度的变化同样适用于整个图像。
在用CDFDA处理30分钟内，与对照未分化MESP(图32A)相比，类器官中的肝细胞积累了CDF(图32B)。结果显示肝细胞在培养基中从CDFDA积极产生CDF。在延长类器官处理至多3小时后，CDF水平在肝细胞中降低，并可在细胞轮廓中清楚地看到(图33)。CDF从肝细胞中转运出来并位于类器官中形成的胆小管网络中。来自类器官的肝成像的共聚焦切片的3D重建图像显示胆小管网高度连接并在肝细胞之间形成复杂的通道网。为了进一步显示来自肝细胞的分泌物被功能性地转运至胆管细胞，用CDFDA处理具有大胆管样囊肿结构的类器官(图36)。类似地，在CDFDA处理30分钟后，肝细胞开始在细胞质中积聚CDF，并且在形成囊肿结构的胆管细胞(箭头)中未检测到CDF(图36A)。CDFDA处理1小时后，再次地可在肝细胞的核心中观察到胆小管网络(图36B)。值得注意的是，囊肿结构(箭头)也填充了CDF(图36B)。由于胆管细胞不产生CDF，该CDF可能是从肝细胞产生和分泌并通过胆小管转运至囊肿。近距离观察类器官表明CDF填充的胆小管网络确实连接囊肿结构(图36C)。CDFDA处理和成像测定显示，类器官中的肝细胞和胆管细胞确实形成连接2种细胞类型的重要胆小管网络。这种肝类器官的重要功能结构对体外胆汁分泌过程的研究是非常有价值的。这些研究仅已在小鼠和大鼠肝脏中进行，因为没有报道体外胆小管结构。这大大减缓了识别破坏这种重要进程的因素的努力。胆汁分泌过程的破坏导致胆汁淤积，其导致许多起药物诱导肝损伤(DILI)(Kaplowitz，2004)。DILI占肝功能衰竭病例的几乎一半。由于缺乏允许实时监测事件的体外模型，其在动物模型中是非常具有挑战性的，难以测定诱导胆汁淤积的药物。因此，本文所述的肝类器官对于测定潜在地诱导胆汁淤积的药物是非常有价值的。
实施例10
用肝类器官建模疾病
遗传修饰的MESP(实施例4)的成功生成突出了可以从MESP产生的器官的建模疾病的潜力。在此，使用与野生型MESP类似的方法(实施例6)使用LDLR KO MESP产生肝类器官。在LDLR缺乏的患者中，肝脏在人体内分泌高水平的胆固醇，导致高胆固醇血症。血流中胆固醇水平升高导致心血管疾病，患者接受他汀类药物治疗以控制血液胆固醇水平。为了研究LDLR缺陷型肝类器官是否模拟LDLR缺陷的高胆固醇血症患者的肝脏器官，我们测定肝类器官分泌的胆固醇水平。24小时后收集与类器官一起温育的培养基，并根据制造商的方案使用红色胆固醇测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测定培养基中胆固醇的量。简而言之，将来自每个类器官的培养基与试剂盒中提供的试剂一起温育，并在37℃温育30分钟。使用荧光读板器检测和量化产生的荧光。将1ml培养基的总胆固醇量列表。为了测试LDLR缺陷型类器官对他汀类药物治疗的反应，将类器官与不同浓度的普伐他汀(Sigma)一起加入培养基中温育。与表达LDLR的肝类器官相比，LDLR缺陷型肝类器官分泌更高水平的胆固醇(图37)。重要的是，分泌的胆固醇的升高水平受到渐增浓度的他汀类药物治疗的抑制。结果支持遗传修饰的类器官可用于体外建模肝脏疾病。
实施例11
肝类器官的高通量生成
为了大量产生类器官，使方案适应于在96孔培养皿中产生具有类似尺寸和功能的类器官。简而言之，将MESP在含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、500nM A83-01(Stemgent)、2μM ChIR99021(Tocris)、20ng/ml人HGF(R&D)、50ng/ml人EGF(R&D)、1μM Jagged-1(Anaspec)、300ng/ml N6,2'-O-二丁酸腺苷3',5'-环状单磷酸钠(dbCAMP)(Sigma-Aldrich)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、20ng/ml BMP4、20ng/mlBMP7(R&D)和25ng/ml FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)中培养8天，以诱导朝向肝谱系的特化。之后，将球状体从基质胶中移出，使用TryPLE解离成单细胞并在96孔板中接种在含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、2.5mM A83-01(Stemgent)、2μM ChIR99021(Tocris)、20ng/ml人HGF(R&D)、50ng/ml人EGF(R&D)、300ng/ml N6,2'-O-二丁酸腺苷3',5'-环状单磷酸钠(dbCAMP)(Sigma-Aldrich)、10mM烟酰胺(Sigma-Aldrich)、20ng/ml BMP4、20ng/ml BMP7(R&D)和25ng/ml FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)中作为悬浮培养2周。随后将细胞在含有500nMA83-01、30μM地塞米松、500nM化合物-E(EMDMillipore)、25ng/ml HGF、25ng/ml BMP7、25ng/ml FGF19、20ng/ml制瘤素-M(R&D)的CloneticsTM HCMTM肝细胞培养基(Lonza)培养另外3-4周来衍生肝类器官。96孔格式板的每个孔产生一个类器官(图39)。个体类器官大小相似(400-500μM)。使用先前描述的P450-GloTM CYP450测定(Promega)(实施例8)测定个体类器官的功能性CYP3A4和CYP2B6活性。值得注意的是，每种类器官都表现出非常相似的CYP3A4和CYP2B6活性。因此，本文提供的方法非常适用于大规模工业应用。
实施例12
从成体肝干细胞中产生肝类器官
在从MESP衍生肝类器官的过程(实施例6)中，肝祖细胞的逐步产生表明该方法可以应用于肝谱系的其他干细胞。相应地，该方法成功地适用于从衍生自成体肝脏组织的肝脏干细胞(PCT/SG2016/050270)衍生肝类器官(图40)。简言之，用PBS洗涤成体肝脏干细胞一次并与TryLE一起温育。5分钟后，移除TryLE并用PBS洗涤细胞一次。如果成体干细胞在饲养细胞上生长，将所有饲养细胞与成体肝干细胞分开很重要。样品以1,000r.p.m离心5分钟，吸出上清液。用由含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、A83-01(Stemgent)、ChIR99021(Tocris)、人HGF(R&D)、人EGF(R&D)、N6,2'-O-二丁酸腺苷3',5'-环状单磷酸钠(dbCAMP)(Sigma-Aldrich)、BMP7(R&D)和FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)组成的H2培养基洗涤细胞一次。将细胞以20,000至40,000个细胞/孔的密度接种，并在96孔超低附着板中作为悬浮培养物培养2周以衍生晚期表达ALB和CK19的晚期肝祖细胞(图41)。由于成体干细胞已经不像MESP那样致力于肝谱系，所以细胞不必进行H1培养基处理。
将晚期肝祖细胞最后在含有A83-01、地塞米松、化合物-E(EMD Millipore)、HGF、BMP7、FGF19、制瘤素-M(R&D)的CloneticsTM HCMTM肝细胞培养基(Lonza)中培养另外3-4周来衍生肝类器官。类器官与特异于ALB和CK7的抗体一起共染色以检查类器官中是否存在两种实质肝细胞(肝细胞和胆管细胞)。衍生自成体肝干细胞的类器官类似地由表达ALB的肝细胞和表达CK7的胆管细胞组成(图42)。类似地，胆管细胞在肝细胞核心周围的类器官的外周发现。使用光片显微镜检查(Leica)对肝类器官进行成像以阐明外周中胆管细胞的结构组织化。通过光片显微镜检查捕获的整个类器官3D图像(图43)显示，类器官表面处的胆管细胞排列形成具有中央内腔的导管结构，其不同于MESP衍生的类器官中观察到的囊肿结构。在成体类器官中观察到的这种不同的导管结构可以反映肝类器官的发育阶段之间的细微差异；来自PSC的MESP产生类似于胎儿肝脏的肝类器官，而成体肝脏干细胞产生与成体人类肝脏类似的肝类器官。尽管如此，成体肝干细胞和MESP衍生的类器官两者具有与肝小叶(实施例6中描述)相似的结构组织化。使用qPCR对成体肝类器官进行的基因表达分析显示ALSC衍生的类器官还表达肝细胞和胆管细胞富集的基因，包括代谢酶和转运蛋白(图44)。使用P450-GloTM CYP450测定法(Promega)测定成体肝类器官的CYP3A4和CYP2C9活性。成体肝干细胞衍生的类器官不仅表现出强的CYP3A4活性，而且具有强的CYP2C9酶活性(图45)。CYP2C9是在成体肝组织中表达并高度活跃的CYP。该活性与从成体肝干细胞产生的肝类器官的成体性质相对应。使用CDFDA的实时成像(在实施例6中描述)，显示肝类器官类似地具有胆小管网络。该结果支持本文所述的方案适用于在后部前肠到肝脏干细胞的发育期间存在的多样内胚层干细胞或祖细胞。MESP和肝脏成体干细胞代表人类肝脏发育中不同的发育阶段。然而，使用本文所述的方法，两种干细胞均可用于产生相似的肝类器官。
实施例13
从MESP产生胰腺球状体
MESP中的PDX1表达表明与后部前肠相似的这些球状体干细胞具有产生胰腺组织的能力。在此，我们采用逐步方案将MESP分化为胰腺球状体(图47)。简而言之，将MESP在由含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、A83-01(Stemgent)、ChIR99021(Tocris)、人HGF(R&D)、烟酰胺(Sigma-Aldrich)，地塞米松(Stemgent)和FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)组成的P1培养基培养一周以诱导朝向胰腺谱系的特化。随后使用分散酶从基质胶中取回球状体并使用TryLE解离成单细胞。简而言之，将基质胶机械分离，转移至eppendorff管并保持在冰上以允许分散酶和低温的组合液化基质胶。5分钟后，将样品以1,000r.p.m离心5分钟，并吸出上清液。然后将球状体在37℃下在TryLE中温育5分钟，然后解离成单细胞。细胞以1,000r.p.m离心5分钟。用由含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、KAAD-环巴胺(Stemgent)、DAPT(Stemgent)、人Noggin(R&D)、人EGF(R&D)、FGF7/KGF(R&D)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)的P2培养基洗涤细胞一次并在P2培养基中温育。在P2培养基中以5,000个细胞/孔的密度接种细胞，在96孔超低附着板中作为悬浮培养2周。最后，胰腺祖细胞在由含有N2补充物(Gibco)、B27补充物(Gibco)、1×青霉素/链霉素(Gibco)、KAAD-环巴胺(Stemgent)、DAPT(Stemgent)、人Noggin(R&D)、人EGF(R&D)、FGF7/KGF(R&D)、ALKii(EMD Millipore)和T3(Sigma)的高级Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12(Gibco)的P3培养基培养3-4周以衍生胰腺球状体(图48)。将胰腺球状体用对在几乎所有胰腺细胞类型中表达的PDX1和NKX6.1特异的抗体染色。胰腺球状体中的所有细胞对于2种胰腺标志物都呈阳性染色，这支持了球状体确实具有胰腺细胞命运。胰腺球状体的成功生成支持MESP的多能性能力。
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表1：本文所述的内胚层祖细胞的特征。
表2.类器官比较图
表3.肝类器官培养基
表4.与3D打印的肝组织比较的类器官培养方法
表5.肝脏类器官与原代肝脏组织的比较。
表6.本文描述的胰腺球状体的特征
表7.胰腺球状体培养基。
缩略语表
PSC：多能干细胞；ESC：胚胎干细胞；MESP：多能内胚层球状体祖细胞；ECM；细胞外基质；CYP：细胞色素P450，例如CYP3A4：细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽4；LGR5：含亮氨酸富集重复的G蛋白偶联受体5；KRT：细胞角蛋白，例如KRT19：细胞角蛋白19；AFP：甲胎蛋白；HNF：肝细胞核因子，例如HNF4a：肝细胞核因子4α；IF：免疫荧光；E-CAD：E-钙粘蛋白；KI67：抗原KI-67；SOX：SRY(性别决定区Y)-盒，例如，SOX9：SRY(性别决定区Y)-盒9；PROM1：Prominin 1；FOXA：叉头盒蛋白质，例如FOXA2：叉头盒蛋白质A2；ALB：白蛋白；PROX1：Prospero Homeobox 1；qPCR：定量聚合酶链式反应；FACS：荧光激活细胞分选；2D：2维；3D：三维；PAS：高碘酸希夫；LDL：低密度脂蛋白；cAMP：环单磷酸腺苷；BMP：骨形态发生蛋白；HGF：肝细胞生长因子；FGF：成纤维细胞生长因子；EGF：表皮生长因子；TGF-β：转化生长因子β；MAPK；促分裂原活化蛋白激酶；细胞外信号调节激酶；JNK；c-Jun N端激酶；FGF；成纤维细胞生长因子；STAT3：信号转导和转录激活因子3；GAB1：GRB2相关结合蛋白1；AKT/PI3K/mTOR：蛋白激酶B/磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶/雷帕霉素的机制靶标；NF-κB：活化的B细胞的核因子κ-轻链增强剂；YAP：Yes相关蛋白；IGF；胰岛素样生长因子，IL：白细胞介素，例如IL-6：白细胞介素-6，OSM：制瘤素-M
保藏声明
本文所述的内胚层球状体祖细胞的生物纯培养物根据布达佩斯条约于2016年9月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110 USA)，并且分别给予专利保藏编号PTA-123501。微生物保藏是根据“国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约”的条款进行。在基于本申请的专利的授权后，对这些保藏微生物的公众可获得性的所有限制将被不可撤销地取消。为了本公开的目的，具有保藏细胞的鉴定特征的任何分离物，包括具有如本文所述的鉴定特征和活性的亚培养物和变体，被包括。
应该理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，并且鉴于其的各种修改或改变将建议给本领域技术人员和包括在本申请的精神和范围以及随附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。
非正式序列表
标志物的蛋白名称、登录号、基因名称和氨基酸序列
SEQ ID NO：1
肝细胞核因子4，α(HNF4A)，登录号：AAI37540；基因：HNF4A
MRLSKTLVDMDMADYSAALDPAYTTLEFENVQVLTMGNDTSPSEGTNLNAPNSLGVSALCAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSVRKNHMYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLKKCFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSSYEDSSLPSINALLQAEVLSRQITSPVSGINGDIRAKKIASIADVCESMKEQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGATKRSMVFKDVLLLGNDYIVPRHCPELAEMSRVSIRILDELVLPFQELQIDDNEYAYLKAIIFFDPDAKGLSDPGKIKRLRSQVQVSLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSITWQMIEQIQFIKLFGMAKIDNLLQEMLLGGPCQAQEGRGWSGDSPGDRPHTVSSPLSSLASPLCRFGQVA
SEQ ID NO：2
胰/十二指肠同源盒蛋白1(PDX1)，登录号：NP_000200；基因：PDX1
MNGEEQYYAATQLYKDPCAFQRGPAPEFSASPPACLYMGRQPPPPPPHPFPGALGALEQGSPPDISPYEVPPLADDPAVAHLHHHLPAQLALPHPPAGPFPEGAEPGVLEEPNRVQLPFPWMKSTKAHAWKGQWAGGAYAAEPEENKRTRTAYTRAQLLELEKEFLFNKYISRPRRVELAVMLNLTERHIKIWFQNRRMKWKKEEDKKRGGGTAVGGGGVAEPEQDCAVTSGEELLALPPPPPPGGAVPPAAPVAAREGRLPPGLSASPQPSSVAPRRPQEPR
SEQ ID NO：3
同源盒蛋白CDX-2，登录号：NP_001256；基因：CDX2
MYVSYLLDKDVSMYPSSVRHSGGLNLAPQNFVSPPQYPDYGGYHVAAAAAAAANLDSAQSPGPSWPAAYGAPLREDWNGYAPGGAAAAANAVAHGLNGGSPAAAMGYSSPADYHPHHHPHHHPHHPAAAPSCASGLLQTLNPGPPGPAATAAAEQLSPGGQRRNLCEWMRKPAQQSLGSQVKTRTKDKYRVVYTDHQRLELEKEFHYSRYITIRRKAELAATLGLSERQVKIWFQNRRAKERKINKKKLQQQQQQQPPQPPPPPPQPPQPQPGPLRSVPEPLSPVSSLQASVSGSVPGVLGPTGGVLNPTVTQ
SEQ ID NO：4
SOX9，登录号：CAA86598；基因：SOX9
MNLLDPFMKMTDEQEKGLSGAPSPTMSEDSAGSPCPSGSGSDTENTRPQENTFPKGEPDLKKESEEDKFPVCIREAVSQVLKGYDWTLVPMPVRVNGSSKNKPHVKRPMNAFMVWAQAARRKLADQYPHLHNAELSKTLGKLWRLLNESEKRPFVEEAERLRVQHKKDHPDYKYQPRRRKSVKNGQAEAEEATEQTHISPNAIFKALQADSPHSSSGMSEVHSPGEHSGQSQGPPTPPTTPKTDVQPGKADLKREGRPLPEGGRQPPIDFRDVDIGELSSDVISNIETFDVNEFDQYLPPNGHPGVPATHGQVTYTGSYGISSTAATPASAGHVWMSKQQAPPPPPQQPPQAPPAPQAPPQPQAAPPQQPAAPPQQPQAHTLTTLSSEPGQSQRTHIKTEQLSPSHYSEQQQHSPQQIAYSPFNLPHYSPSYPPITRSQYDYTDHQNSSSYYSHAAGQGTGLYSTFTYMNPAQRPMYTPIADTSGVPSIPQTHSPQHWEQPVYTQLTRP
SEQ ID NO：5
角蛋白，I型细胞骨架19(KRT19)，登录号：NP_002267；基因：KRT19
MTSYSYRQSSATSSFGGLGGGSVRFGPGVAFRAPSIHGGSGGRGVSVSSARFVSSSSSGAYGGGYGGVLTASDGLLAGNEKLTMQNLNDRLASYLDKVRALEAANGELEVKIRDWYQKQGPGPSRDYSHYYTTIQDLRDKILGATIENSRIVLQIDNARLAADDFRTKFETEQALRMSVEADINGLRRVLDELTLARTDLEMQIEGLKEELAYLKKNHEEEISTLRGQVGGQVSVEVDSAPGTDLAKILSDMRSQYEVMAEQNRKDAEAWFTSRTEELNREVAGHTEQLQMSRSEVTDLRRTLQGLEIELQSQLSMKAALEDTLAETEARFGAQLAHIQALISGIEAQLGDVRADSERQNQEYQRLMDIKSRLEQEIATYRSLLEGQEDHYNNLSASKVL
SEQ ID NO：6
甲胎蛋白(AFP)，登录号：AAH27881；基因：AFP
MKWVESIFLIFLLNFTESRTLHRNEYGIASILDSYQCTAEISLADLATIFFAQFVQEATYKEVSKMVKDALTAIEKPTGDEQSSGCLENQLPAFLEELCHEKEILEKYGHSDCCSQSEEGRHNCFLAHKKPTPASIPLFQVPEPVTSCEAYEEDRETFMNKFIYEIARRHPFLYAPTILLWAARYDKIIPSCCKAENAVECFQTKAATVTKELRESSLLNQHACAVMKNFGTRTFQAITVTKLSQKFTKVNFTEIQKLVLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAENDEKPEGLSPNLNRFLGDRDFNQFSSGEKNIF
LASFVHEYSRRHPQLAVSVILRVAKGYQELLEKCFQTENPLECQDKGEEELQKYIQESQALAKRSCGLFQKLGEYYLQNAFLVAYTKKAPQLTSSELMAITRKMAATAATCCQLSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGVGQCCTSSYANRRPCFSSLVVDETYVPPAFSDDKFIFHKDLCQAQGVALQTMKQEFLINLVKQKPQITEEQLEAVIADFSGLLEKCCQGQEQEVCFAEEGQKLISKTRAALGV
SEQ ID NO：7
ONECUT-2转录因子(OC-2)，登录号：CAB38253；基因：OC-2
MNPELTMESLGTLHGARGGGSGGGGGGGGGGGGGGPGHEQELLASPSPHHARRGPRGSLRGPPPPPTAHQELGTAAAAAAAASRSAMVTSMASILDGGDYRPELSIPLHHAMSMSCDSSPPGMGMSNTYTTLTPLQPLPPISTVSDKFHHPHPHHHPHHHHHHHHQRLSGNVSGSFTLMRDERGLPAMNNLYSPYKEMPGMSQSLSPLAATPLGNGLGGLHNAQQSLPNYGPPGHDKMLSPNFDAHHTAMLTRGEQHLSRGLGTPPAAMMSHLNGLHHPGHTQSHGPVLAPSRERPPSSSSGSQVATSGQLEEINTKEVAQRITAELKRYSIPQAIFAQRVLCRSQGTLSDLLRNPKPWSKLKSGRETFRRMWKWLQEPEFQRMSALRLAACKRKEQEPNKDRNNSQKKSRLVFTDLQRRTLFAIFKENKRPSKEMQITISQQLGLELTTVSNFFMNARRRSLEKWQDDLSTGGSSSTSSTCTKA
SEQ ID NO：8
G蛋白偶联受体LGR5，登录号：AAC77911；基因：LGR5
MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLHFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPDYAFGNLSSWVVLHLHNNRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVIAAVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCHVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSVKYSAKFETKAPFSSLKVIILLCALLALTMAAVPLLGGSKYGASPLCLPLPFGEPSTMGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNLDKGDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILNCPVAFLSFSSLINLTFISPEVIKFILLVVVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLRKQTYVWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPAYPVTESCHLSSVAFVPCL
SEQ ID NO：9
EPHB2，登录号：AAH67861；基因：EPHB2
MALRRLGAALLLLPLLAAVEETLMDSTTATAELGWMVHPPSGWEEVSGYDENMNTIRTYQVCNVFESSQNNWLRTKFIRRRGAHRIHVEMKFSVRDCSSIPSVPGSCKETFNLYYYEADFDSATKTFPNWMENPWVKVDTIAADESFSQVDLGGRVMKINTEVRSFGPVSRSGFYLAFQDYGGCMSLIAVRVFYRKCPRIIQNGAIFQETLSGAESTSLVAARGSCIANAEEVDVPIKLYCNGDGEWLVPIGRCMCKAGFEAVENGTVCRGCPSGTFKANQGDEACTHCPINSRTTSEGATNCVCRNGYYRADLDPLDMPCTTIPSAPQAVISSVNETSLMLEWTPPRDSGGREDLVYNIICKSCGSGRGACTRCGDNVQYAPRQLGLTEPRIYISDLLAHTQYTFEIQAVNGVTDQSPFSPQFASVNITTNQAAPSAVSIMHQVSRTVDSITLSWSQPDQPNGVILDYELQYYEKMKTQRS
SEQ ID NO：10
LGR4，登录号：AAH33039；基因：LGR4
MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPGGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALQLAGNDLSFIHPKALSGLKELKVLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLWLDDNSLTEVPVHHLSNLPTLQALTLALNKISSIPDFAFTNLSSLVVLHLHNNKIRSLSQHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTVHLESLTLTGTKISSIPNNLCQEQKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLGPITNLDVSFNELTSFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLLVILTTFASCTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFLAVFSSESAIFLLMLATVERSLSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGCFPIFHRGEYSASPLCLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKLYCNLEKEDLSENSQSSMIKHVAWLIFTNCIFFCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNPVLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMYSHLQGNLTVCDCCESFLLTKPVSCKHLIKSHSCPALAVASCQRPEGYWSDCGTQSAHSDYADEEDSFVSDSSDQVQACGRACFYQSRGFPLVRYAYNLPRVKD
SEQ ID NO：11
核受体亚家族5组A成员2同种型1(NR5A2)，登录号：NP_995582；基因：NR5A2
MSSNSDTGDLQESLKHGLTPIGAGLPDRHGSPIPARGRLVMLPKVETEALGLARSHGEQGQMPENMQVSQFKMVNYSYDEDLEELCPVCGDKVSGYHYGLLTCESCKGFFKRTVQNNKRYTCIENQNCQIDKTQRKRCPYCRFQKCLSVGMKLEAVRADRMRGGRNKFGPMYKRDRALKQQKKALIRANGLKLEAMSQVIQAMPSDLTISSAIQNIHSASKGLPLNHAALPPTDYDRSPFVTSPISMTMPPHGSLQGYQTYGHFPSRAIKSEYPDPYTSSPESIMGYSYMDSYQTSSPASIPHLILELLKCEPDEPQVQAKIMAYLQQEQANRSKHEKLSTFGLMCKMADQTLFSIVEWARSSIFFRELKVDDQMKLLQNCWSELLILDHIYRQVVHGKEGSIFLVTGQQVDYSIIASQAGATLNNLMSHAQELVAKLRSLQFDQREFVCLKFLVLFSLDVKNLENFQLVEGVQEQVNAALLDYTMCNYPQQTEKFGQLLLRLPEIRAISMQAEEYLYYKHLNGDVPYNNLLIEMLHAKRA
SEQ ID NO：12
CDH1，登录号：AAI46663；基因：CDH1
MGPWSRSLSALLLLLQVSSWLCQEPEPCHPGFDAESYTFTVPRRHLERGRVLGRVNFEDCTGRQRTAYFSLDTRFKVGTDGVITVKRPLRFHNPQIHFLVYAWDSTYRKFSTKVTLNTVGHHHRPPPHQASVSGIQAELLTFPNSSPGLRRQKRDWVIPPISCPENEKGPFPKNLVQIKSNKDKEGKVFYSITGQGADTPPVGVFIIERETGWLKVTEPLDRERIATYTLFSHAVSSNGNAVEDPMEILITVTDQNDNKPEFTQEVFKGSVMEGALPGTSVMEVTATDADDDVNTYNAAIAYTILSQDPELPDKNMFTINRNTGVISVVTTGLDRESFPAYTLVVQAADLQGEGLSTTATAVITVTDTNDNPPIFNPTTYKGQVPENEANVVITTLKVTDADAPNTPWEAVYTILNDDGGQFVVTTNPVNNDGILKTAKGLDFEAKQQYILHVAVTNVVPFEVSLTTSTATVTVDVLDVNEAPIFVPPEKRVEVSEDFGVGQEITSYTAQEPDTFMEQKITYRIWRDTANWLEINPDTGAISTRAELDREDFEHVKNSTYTALIIATDNGSPVATGTGTLLLILSDVNDNAPIPEPRTIFFCERNPKPQVINIIDADLPPILASQSIGITDMSHCTCPAPQLPAIF
SEQ ID NO：13
角蛋白，II型细胞骨架7(KRT7)，登录号：NP_005547；基因：KRT7
MSIHFSSPVFTSRSAAFSGRGAQVRLSSARPGGLGSSSLYGLGASRPRVAVRSAYGGPVGAGIREVTINQSLLAPLRLDADPSLQRVRQEESEQIKTLNNKFASFIDKVRFLEQQNKLLETKWTLLQEQKSAKSSRLPDIFEAQIAGLRGQLEALQVDGGRLEAELRSMQDVVEDFKNKYEDEINHRTAAENEFVVLKKDVDAAYMSKVELEAKVDALNDEINFLRTLNETELTELQSQISDTSVVLSMDNSRSLDLDGIIAEVKAQYEEMAKCSRAEAEAWYQTKFETLQAQAGKHGDDLRNTRNEISEMNRAIQRLQAEIDNIKNQRAKLEAAIAEAEERGELALKDARAKQEELEAALQRGKQDMARQLREYQELMSVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLAGDGVGAVNISVMNSTGGSSSGGGIGLTLGGTMGSNALSFSSSAGPGLLKAYSIRTASASRRSARD
SEQ ID NO：14
锌指蛋白503(ZNF503)，登录号：NP_116161；基因：ZNF503
MSTAPSLSALRSSKHSGGGGGGGGGGGADPAWTSALSGNSSGPGPGSSPAGSTKPFVHAVPPSDPLRQANRLPIKVLKMLTARTGHILHPEYLQPLPSTPVSPIELDAKKSPLALLAQTCSQIGKPDPSPSSKLSSVASNGGGAGGAGGGAAGDKDTKSGPLKLSDIGVEDKSSFKPYSKPGSDKKEPGGGGGGGGGGGGGGGGVSSEKSGFRVPSATCQPFTPRTGSPSSSASACSPGGMLSSAGGAPEGKDDKKDTDVGGGGKGTGGASAEGGPTGLAHGRISCGGGINVDVNQHPDGGPGGKALGSDCGGSSGSSSGSGPSAPTSSSVLGSGLVAPVSPYKPGQTVFPLPPAGMTYPGSLAGAYAGYPPQFLPHGVALDPTKPGSLVGAQLAAAAAGSLGCSKPAGSSPLAGASPPSVMTASLCRDPYCLSYHCASHLAGAAAASASCAHDPAAAAAALKSGYPLVYPTHPLHGVHSSLTAAAAAGATPPSLAGHPLYPYGFMLPNDPLPHICNWVSANGPCDKRFATSEELLSHLRTHTAFPGTDKLLSGYPSSSSLASAAAAAMACHMHIPTSGAPGSPGTLALRSPHHALGLSSRYHPYSKSPLPTPGAPVPVPAATGPYYSPYALYGQRLTTASALGYQ
SEQ ID NO：15
同源盒蛋白质MSX-2，登录号：NP_002440；基因：MSX2
MASPSKGNDLFSPDEEGPAVVAGPGPGPGGAEGAAEERRVKVSSLPFSVEALMSDKKPPKEASPLPAESASAGATLRPLLLSGHGAREAHSPGPLVKPFETASVKSENSEDGAAWMQEPGRYSPPPRHMSPTTCTLRKHKTNRKPRTPFTTSQLLALERKFRQKQYLSIAERAEFSSSLNLTETQVKIWFQNRRAKAKRLQEAELEKLKMAAKPMLPSSFSLPFPISSPLQAASIYGASYPFHRPVLPIPPVGLYATPVGYGMYHLS
SEQ ID NO：16
锌指转录因子Trps1，登录号：NP_054831；基因：TRPS1
MPYEVNAGYDFTNMVRKKNPPLRNVASEGEGQILEPIGTESKVSGKNKEFSADQMSENTDQSDAAELNHKEEHSLHVQDPSSSSKKDLKSAVLSEKAGFNYESPSKGGNFPSFPHDEVTDRNMLAFSSPAAGGVCEPLKSPQRAEADDPQDMACTPSGDSLETKEDQKMSPKATEETGQAQSGQANCQGLSPVSVASKNPQVPSDGGVRLNKSKTDLLVNDNPDPAPLSPELQDFKCNICGYGYYGNDPTDLIKHFRKYHLGLHNRTRQDAELDSKILALHNMVQFSHSKDFQKVNRSVFSGVLQDINSSRPVLLNGTYDVQVTSGGTFIGIGRKTPDCQGNTKYFRCKFCNFTYMGNSSTELEQHFLQTHPNKIKASLPSSEVAKPSEKNSNKSIPALQSSDSGDLGKWQDKITVKAGDDTPVGYSVPIKPLDSSRQNGTEATSYYWCKFCSFSCESSSSLKLLEHYGKQHGAVQSGGLNPELNDKLSRGSVINQNDLAKSSEGETMTKTDKSSSGAKKKDFSSKGAEDNMVTSYNCQFCDFRYSKSHGPDVIVVGPLLRHYQQLHNIHKCTIKHCPFCPRGLCSPEKHLGEITYPFACRKSNCSHCALLLLHLSPGAAGSSRVKHQCHQCSFTTPDVDVLLFHYESVHESQASDVKQEANHLQGSDGQQSVKESKEHSCTKCDFITQVEEEISRHYRRAHSCYKCRQCSFTAADTQSLLEHFNTVHCQEQDITTANGEEDGHAISTIKEEPKIDFRVYNLLTPDSKMGEPVSESVVKREKLEEKDGLKEKVWTESSSDDLRNVTWRGADILRGSPSYTQASLGLLTPVSGTQEQTKTLRDSPNVEAAHLARPIYGLAVETKGFLQGAPAGGEKSGALPQQYPASGENKSKDESQSLLRRRRGSGVFCANCLTTKTSLWRKNANGGYVCNACGLYQKLHSTPRPLNIIKQNNGEQIIRRRTRKRLNPEALQAEQLNKQQRGSNEEQVNGSPLERRSEDHLTESHQREIPLPSLSKYEAQGSLTKSHSAQQPVLVSQTLDIHKRMQPLHIQIKSPQESTGDPGNSSSVSEGKGSSERGSPIEKYMRPAKHPNYSPPGSPIEKYQYPLFGLPFVHNDFQSEADWLRFWSKYKLSVPGNPHYLSHVPGLPNPCQNYVPYPTFNLPPHFSAVGSDNDIPLDLAIKHSRPGPTANGASKEKTKAPPNVKNEGPLNVVKTEKVDRSTQDELSTKCVHCGIVFLDEVMYALHMSCHGDSGPFQCSICQHLCTDKYDFTTHIQRGLHRNNAQVEKNGKPKE
SEQ ID NO：17
achyte-scute同源体2(ASCL2)，登录号：NP_005161；基因：ASCL2
MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
SEQ ID NO：18
干扰素调节因子8(IRF8)，登录号：NP_002154；基因：IRF8
MCDRNGGRRLRQWLIEQIDSSMYPGLIWENEEKSMFRIPWKHAGKQDYNQEVDASIFKAWAVFKGKFKEGDKAEPATWKTRLRCALNKSPDFEEVTDRSQLDISEPYKVYRIVPEEEQKCKLGVATAGCVNEVTEMECGRSEIDELIKEPSVDDYMGMIKRSPSPPEACRSQLLPDWWAQQPSTGVPLVTGYTTYDAHHSAFSQMVISFYYGGKLVGQATTTCPEGCRLSLSQPGLPGTKLYGPEGLELVRFPPADAIPSERQRQVTRKLFGHLERGVLLHSSRQGVFVKRLCQGRVFCSGNAVVCKGRPNKLERDEVVQVFDTSQFFRELQQFYNSQGRLPDGRVVLCFGEEFPDMAPLRSKLILVQIEQLYVRQLAEEAGKSCGAGSVMQAPEEPPPDQVFRMFPDICASHQRSFFRENQQITV
SEQ ID NO：19
肝细胞核因子4-γ(HNF4G)，登录号：NP_004124；基因：HNF4G
MDMANYSEVLDPTYTTLEFETMQILYNSSDSSAPETSMNTTDNGVNCLCAICGDRATGKHYGASSCDGCKGFFRRSIRKSHVYSCRFSRQCVVDKDKRNQCRYCRLRKCFRAGMKKEAVQNERDRISTRRSTFDGSNIPSINTLAQAEVRSRQISVSSPGSSTDINVKKIASIGDVCESMKQQLLVLVEWAKYIPAFCELPLDDQVALLRAHAGEHLLLGATKRSMMYKDILLLGNNYVIHRNSCEVEISRVANRVLDELVRPFQEIQIDDNEYACLKAIVFFDPDAKGLSDPVKIKNMRFQVQIGLEDYINDRQYDSRGRFGELLLLLPTLQSITWQMIEQIQFVKLFGMVKIDNLLQEMLLGGASNDGSHLHHPMHPHLSQDPLTGQTILLGPMSTLVHADQISTPETPLPSPPQGSGQEQYKIAANQASVISHQHLSKQKQ
SEQ ID NO：20
DNA结合蛋白抑制剂ID-2，登录号：NP_002157；基因：ID-2
MKAFSPVRSVRKNSLSDHSLGISRSKTPVDDPMSLLYNMNDCYSKLKELVPSIPQNKKVSKMEILQHVIDYILDLQIALDSHPTIVSLHHQRPGQNQASRTPLTTLNTDISILSLQASEFPSELMSNDSKALCG
SEQ ID NO：21
CD44，登录号：ACI46596；基因：CD44
MDKFWWHAAWGLCLVPLSLAQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIYPSNPTDDDVSSGSSSERSSTSGGYIFYTFSTVHPIPDEDSPWITDSTDRIPATRHSHGSQEGGANTTSGPIRTPQIPEWLIILASLLALALILAVCIAVNSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGV
SEQ ID NO：22
上皮细胞粘附分子(EPCAM)，登录号：AAH14785；基因：EPCAM
MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSTCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA
SEQ ID NO：23
MET原癌基因蛋白(MET)，登录号：AAA59591；基因：MET
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKAMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVVLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
SEQ ID NO：24
印度刺猬蛋白前原蛋白(IHH)，登录号：NP_002172；基因：IHH
MSPARLRPRLHFCLVLLLLLVVPAAWGCGPGRVVGSRRRPPRKLVPLAYKQFSPNVPEKTLGASGRYEGKIARSSERFKELTPNYNPDIIFKDEENTGADRLMTQRCKDRLNSLAISVMNQWPGVKLRVTEGWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSDRDRNKYGLLARLAVEAGFDWVYYESKAHVHCSVKSEHSAAAKTGGCFPAGAQVRLESGARVALSAVRPGDRVLAMGEDGSPTFSDVLIFLDREPHRLRAFQVIETQDPPRRLALTPAHLLFTADNHTEPAARFRATFASHVQPGQYVLVAGVPGLQPARVAAVSTHVALGAYAPLTKHGTLVVEDVVASCFAAVADHHLAQLAFWPLRLFHSLAWGSWTPGEGVHWYPQLLYRLGRLLLEEGSFHPLGMSGAGS
SEQ ID NO：25
闭合蛋白-3(CLDN3)，登录号：NP_001297；基因：CLDN3
MSMGLEITGTALAVLGWLGTIVCCALPMWRVSAFIGSNIITSQNIWEGLWMNCVVQSTGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALIVVAILLAAFGLLVALVGAQCTNCVQDDTAKAKITIVAGVLFLLAALLTLVPVSWSANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGAGLYVGWAAAALQLLGGALLCCSCPPREKKYTATKVVYSAPRSTGPGASLGTGYDRKDYV
SEQ ID NO：26
SOX2，登录号：NP_003097；基因：SOX2
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSRGQRRKMAQENPKMHNSEISKRLGAEWKLLSETEKRPFIDEAKRLRALHMKEHPDYKYRPRRKTKTLMKKDKYTLPGGLLAPGGNSMASGVGVGAGLGAGVNQRMDSYAHMNGWSNGSYSMMQDQLGYPQHPGLNAHGAAQMQPMHRYDVSALQYNSMTSSQTYMNGSPTYSMSYSQQGTPGMALGSMGSVVKSEASSSPPVVTSSSHSRAPCQAGDLRDMISMYLPGAEVPEPAAPSRLHMSQHYQSGPVPGTAINGTLPLSHM
SEQ ID NO：27
Cerberus 1(CER1)，登录号：AAH69491；基因：CER1
MHLLLFQLLVLLPLGKTTRHQDGRQNQSSLSPVLLPRNQRELPTGNHEEAEEKPDLFVAVPHLVGTSPAGEGQRQREKMLSRFGRFWKKPEREMHPSRDSDSEPFPPGTQSLIQPIDGMKMEKSPLREEAKKFWHHFMFRKTPASQGVILPIKSHEVHWETCRTVPFSQTITHEGCEKVVVQNNLCFGKCGSVHFPGAAQHSHTSCSHCLPAKFTTMHLPLNCTELSSVIKVVMLVEECQCKVKTEHEDGHILHAGSQDSFIPGVSA
SEQ ID NO：28
GATA-4，登录号：NP_001295022；基因：GATA4
MYQSLAMAANHGPPPGAYEAGGPGAFMHGAGAASSPVYVPTPRVPSSVLGLSYLQGGGAGSASGGASGGSSGGAASGAGPGTQQGSPGWSQAGADGAAYTPPPVSPRFSFPGTTGSLAAAAAAAAAREAAAYSSGGGAAGAGLAGREQYGRAGFAGSYSSPYPAYMADVGASWAAAAAASAGPFDSPVLHSLPGRANPAARHPNLVDMFDDFSEGRECVNCGAMSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGINRPLIKPQRRLSASRRVGLSCANCQTTTTTLWRRNAEGEPVCNACGLYMKLHGVPRPLAMRKEGIQTRKRKPKNLNKSKTPAAPSGSESLPPASGASSNSSNATTSSSEEMRPIKTEPGLSSHYGHSSSVSQTFSVSAMSGHGPSIHPVLSALKLSPQGYASPVSQSPQTSSKQDSWNSLVLADSHGDIITA
SEQ ID NO：29
SOX17，登录号：NP_071899；基因：SOX17
MYQSLAMAANHGPPPGAYEAGGPGAFMHGAGAASSPVYVPTPRVPSSVLGLSYLQGGGAGSASGGASGGSSGGAASGAGPGTQQGSPGWSQAGADGAAYTPPPVSPRFSFPGTTGSLAAAAAAAAAREAAAYSSGGGAAGAGLAGREQYGRAGFAGSYSSPYPAYMADVGASWAAAAAASAGPFDSPVLHSLPGRANPAARHPNLVDMFDDFSEGRECVNCGAMSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMNGINRPLIKPQRRLSASRRVGLSCANCQTTTTTLWRRNAEGEPVCNACGLYMKLHGVPRPLAMRKEGIQTRKRKPKNLNKSKTPAAPSGSESLPPASGASSNSSNATTSSSEEMRPIKTEPGLSSHYGHSSSVSQTFSVSAMSGHGPSIHPVLSALKLSPQGYASPVSQSPQTSSKQDSWNSLVLADSHGDIITA
SEQ ID NO：30
肝细胞核因子3-β(HNF3B)，登录号：NP_068556；基因：FOXA2
MHSASSMLGAVKMEGHEPSDWSSYYAEPEGYSSVSNMNAGLGMNGMNTYMSMSAAAMGSGSGNMSAGSMNMSSYVGAGMSPSLAGMSPGAGAMAGMGGSAGAAGVAGMGPHLSPSLSPLGGQAAGAMGGLAPYANMNSMSPMYGQAGLSRARDPKTYRRSYTHAKPPYSYISLITMAIQQSPNKMLTLSEIYQWIMDLFPFYRQNQQRWQNSIRHSLSFNDCFLKVPRSPDKPGKGSFWTLHPDSGNMFENGCYLRRQKRFKCEKQLALKEAAGAAGSGKKAAAGAQASQAQLGEAAGPASETPAGTESPHSSASPCQEHKRGGLGELKGTPAAALSPPEPAPSPGQQQQAAAHLLGPPHHPGLPPEAHLKPEHHYAFNHPFSINNLMSSEQQHHHSHHHHQPHKMDLKAYEQVMHYPGYGSPMPGSLAMGPVTNKTGLDASPLAADTSYYQGVYSRPIMNSS
SEQ ID NO：31
C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)，登录号：NP_001008540；基因：CXCR4
MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESES
SSFHSS
SEQ ID NO：32
延胡索二酰乙酰(FAH)，登录号：NP_000128；基因：FAH
MSFIPVAEDSDFPIHNLPYGVFSTRGDPRPRIGVAIGDQILDLSIIKHLFTGPVLSKHQDVFNQPTLNSFMGLGQAAWKEARVFLQNLLSVSQARLRDDTELRKCAFISQASATMHLPATIGDYTDFYSSRQHATNVGIMFRDKENALMPNWLHLPVGYHGRASSVVVSGTPIRRPMGQMKPDDSKPPVYGACKLLDMELEMAFFVGPGNRLGEPIPISKAHEHIFGMVLMNDWSARDIQKWEYVPLGPFLGKSFGTTVSPWVVPMDALMPFAVPNPKQDPRPLPYLCHDEPYTFDINLSVNLKGEGMSQAATICKSNFKYMYWTMLQQLTHHSVNGCNLRPGDLLASGTISGPEPENFGSMLELSWKGTKPIDLGNGQTRKFLLDGDEVIITGYCQGDGYRIGFGQCAGKVLPALLPS
SEQ ID NO：33
酪氨酸氨基转移酶(TAT)，登录号：NP_000344；基因：TAT
MDPYMIQMSSKGNLPSILDVHVNVGGRSSVPGKMKGRKARWSVRPSDMAKKTFNPIRAIVDNMKVKPNPNKTMISLSIGDPTVFGNLPTDPEVTQAMKDALDSGKYNGYAPSIGFLSSREEIASYYHCPEAPLEAKDVILTSGCSQAIDLCLAVLANPGQNILVPRPGFSLYKTLAESMGIEVKLYNLLPEKSWEIDLKQLEYLIDEKTACLIVNNPSNPCGSVFSKRHLQKILAVAARQCVPILADEIYGDMVFSDCKYEPLATLSTDVPILSCGGLAKRWLVPGWRLGWILIHDRRDIFGNEIRDGLVKLSQRILGPCTIVQGALKSILCRTPGEFYHNTLSFLKSNADLCYGALAAIPGLRPVRPSGAMYLMVGIEMEHFPEFENDVEFTERLVAEQSVHCLPATCFEYPNFIRVVITVPEVMMLEACSRIQEFCEQHYHCAEGSQEECDK
SEQ ID NO：34
葡萄糖激酶(GCK)，登录号：NP_000153；基因：GCK
MLDDRARMEAAKKEKVEQILAEFQLQEEDLKKVMRRMQKEMDRGLRLETHEEASVKMLPTYVRSTPEGSEVGDFLSLDLGGTNFRVMLVKVGEGEEGQWSVKTKHQMYSIPEDAMTGTAEMLFDYISECISDFLDKHQMKHKKLPLGFTFSFPVRHEDIDKGILLNWTKGFKASGAEGNNVVGLLRDAIKRRGDFEMDVVAMVNDTVATMISCYYEDHQCEVGMIVGTGCNACYMEEMQNVELVEGDEGRMCVNTEWGAFGDSGELDEFLLEYDRLVDESSANPGQQLYEKLIGGKYMGELVRLVLLRLVDENLLFHGEASEQLRTRGAFETRFVSQVESDTGDRKQIYNILSTLGLRPSTTDCDIVRRACESVSTRAAHMCSAGLAGVINRMRESRSEDVMRITVGVDGSVYKLHPSFKERFHASVRRLTPSCEITFIESEEGSGRGAALVSAVACKKACMLGQ
SEQ ID NO：35
转甲状腺素蛋白(TTR)，登录号：AAH20791；基因：TTR
MASHRLLLLCLAGLVFVSEAGPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTTEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYSTTAVVTNPKE
SEQ ID NO：36
麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(MGAM)，登录号：NP_004659；基因：GLUI
MARKKLKKFTTLEIVLSVLLLVLFIISIVLIVLLAKESLKSTAPDPGTTGTPDPGTTGTPDPGTTGTTHARTTGPPDPGTTGTTPVSAECPVVNELERINCIPDQPPTKATCDQRGCCWNPQGAVSVPWCYYSKNHSYHVEGNLVNTNAGFTARLKNLPSSPVFGSNVDNVLLTAEYQTSNRFHFKLTDQTNNRFEVPHEHVQSFSGNAAASLTYQVEISRQPFSIKVTRRSNNRVLFDSSIGPLLFADQFLQLSTRLPSTNVYGLGEHVHQQYRHDMNWKTWPIFNRDTTPNGNGTNLYGAQTFFLCLEDASGLSFGVFLMNSNAMEVVLQPAPAITYRTIGGILDFYVFLGNTPEQVVQEYLELIGRPALPSYWALGFHLSRYEYGTLDNMREVVERNRAAQLPYDVQHADIDYMDERRDFTYDSVDFKGFPEFVNELHNNGQKLVIIVDPAISNNSSSSKPYGPYDRGSDMKIWVNSSDGVTPLIGEVWPGQTVFPDYTNPNCAVWWTKEFELFHNQVEFDGIWIDMNEVSNFVDGSVSGCSTNNLNNPPFTPRILDGYLFCKTLCMDAVQHWGKQYDIHNLYGYSMAVATAEAAKTVFPNKRSFILTRSTFAGSGKFAAHWLGDNTATWDDLRWSIPGVLEFNLFGIPMVGPDICGFALDTPEELCRRWMQLGAFYPFSRNHNGQGYKDQDPASFGADSLLLNSSRHYLNIRYTLLPYLYTLFFRAHSRGDTVARPLLHEFYEDNSTWDVHQQFLWGPGLLITPVLDEGAEKVMAYVPDAVWYDYETGSQVRWRKQKVEMELPGDKIGLHLRGGYIFPTQQPNTTTLASRKNPLGLIIALDENKEAKGELFWDNGETKDTVANKVYLLCEFSVTQNRLEVNISQSTYKDPNNLAFNEIKILGTEEP
SNVTVKHNGVPSQTSPTVTYDSNLKVAIITDIDLLLGEAYTVEWSIKIRDEEKIDCYPDENGASAENCTARGCIWEASNSSGVPFCYFVNDLYSVSDVQYNSHGATADISLKSSVYANAFPSTPVNPLRLDVTYHKNEMLQFKIYDPNKNRYEVPVPLNIPSMPSSTPEGQLYDVLIKKNPFGIEIRRKSTGTIIWDSQLLGFTFSDMFIRISTRLPSKYLYGFGETEHRSYRRDLEWHTWGMFSRDQPPGYKKNSYGVHPYYMGLEEDGSAHGVLLLNSNAMDVTFQPLPALTYRTTGGVLDFYVFLGPTPELVTQQYTELIGRPVMVPYWSLGFQLCRYGYQNDSEIASLYDEMVAAQIPYDVQYSDIDYMERQLDFTLSPKFAGFPALINRMKADGMRVILILDPAISGNETQPYPAFTRGVEDDVFIKYPNDGDIVWGKVWPDFPDVVVNGSLDWDSQVELYRAYVAFPDFFRNSTAKWWKREIEELYNNPQNPERSLKFDGMWIDMNEPSSFVNGAVSPGCRDASLNHPPYMPHLESRDRGLSSKTLCMESQQILPDGSLVQHYNVHNLYGWSQTRPTYEAVQEVTGQRGVVITRSTFPSSGRWAGHWLGDNTAAWDQLKKSIIGMMEFSLFGISYTGADICGFFQDAEYEMCVRWMQLGAFYPFSRNHNTIGTRRQDPVSWDVAFVNISRTVLQTRYTLLPYLYTLMHKAHTEGVTVVRPLLHEFVSDQVTWDIDSQFLLGPAFLVSPVLERNARNVTAYFPRARWYDYYTGVDINARGEWKTLPAPLDHINLHVRGGYILPWQEPALNTHLSRQKFMGFKIALDDEGTAGGWLFWDDGQSIDTYGKGLYYLASFSASQNTMQSHIIFNNYITGTNPLKLGYIEIWGVGSVPVTSVSISVSGMVITPSFNNDPTTQVLSIDVTDRNISLHNFTSLTWISTL
SEQ ID NO：37
含有延胡索酰乙酰乙酸盐水解酶结构域的2A(FAHD2A)，登录号：AAI10912；基因：FAHD2A
MLVSGRRRLLTVLLQAQKWPFQPSRDMRLVQFRAPHLVGPHLGLETGNGGGVINLNAFDPTLPKTMTQFLEQGEATLSVARRALAAQLPVLPRSEVTFLAPVTRPDKVVCVGMNYVDHCKEQNVPVPKEPIIFSKFASSIVGPYDEVVLPPQSQEVDWEVELAVVIGKKGKHIKATDAMAHVAGFTVAHDVSARDWQMRRNGKQWLLGKTFDTFCPLGPALVTKDSVADPHNLKICCRVNGEVVQSGNTNQMVFKTEDLIAWVSQFVTFYPGDVILTGTPPGVGVFRKPPVFLKKGDEVQCEIEELGVIINKVV
SEQ ID NO：38
肝细胞核因子1-β(HNF1β)，登录号：NP_000449；基因：HNF1β
MVSKLTSLQQELLSALLSSGVTKEVLVQALEELLPSPNFGVKLETLPLSPGSGAEPDTKPVFHTLTNGHAKGRLSGDEGSEDGDDYDTPPILKELQALNTEEAAEQRAEVDRMLSEDPWRAAKMIKGYMQQHNIPQREVVDVTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREILRQFNQTVQSSGNMTDKSSQDQLLFLFPEFSQQSHGPGQSDDACSEPTNKKMRRNRFKWGPASQQILYQAYDRQKNPSKEEREALVEECNRAECLQRGVSPSKAHGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRQKLAMDAYSSNQTHSLNPLLSHGSPHHQPSSSPPNKLSGVRYSQQGNNEITSSSTISHHGNSAMVTSQSVLQQVSPASLDPGHNLLSPDGKMISVSGGGLPPVSTLTNIHSLSHHNPQQSQNLIMTPLSGVMAIAQSLNTSQAQSVPVINSVAGSLAALQPVQFSQQLHSPHQQPLMQQSPGSHMAQQPFMAAVTQLQNSHMYAHKQEPPQYSHTSRFPSAMVVTDTSSISTLTNMSSSKQCPLQAW
SEQ ID NO：39
肝细胞核因子1-α(HNF1A)，登录号：NP_001293108；基因：HNF1A
MVSKLSQLQTELLAALLESGLSKEALIQALGEPGPYLLAGEGPLDKGESCGGGRGELAELPNGLGETRGSEDETDDDGEDFTPPILKELENLSPEEAAHQKAVVETLLQEDPWRVAKMVKSYLQQHNIPQREVVDTTGLNQSHLSQHLNKGTPMKTQKRAALYTWYVRKQREVAQQFTHAGQGGLIEEPTGDELPTKKGRRNRFKWGPASQQILFQAYERQKNPSKEERETLVEECNRAECIQRGVSPSQAQGLGSNLVTEVRVYNWFANRRKEEAFRHK
LAMDTYSGPPPGPGPGPALPAHSSPGLPPPALSPSKVHGVRYGQPATSETAEVPSSSGGPLVTVSTPLHQVSPTGLEPSHSLLSTEAKLVSAAGGPLPPVSTLTALHSLEQTSPGLNQQPQNLIMASLPGVMTIGPGEPASLGPTFTNTGASTLVIGLASTQAQSVPVINSMGSSLTTLQPVQFSQPLHPSYQQPLMPPVQSHVTQSPFMATMAQLQSPHALYSHKPEVAQYTHTGLLPQTMLITDTTNLSALASLTPTKQEAALLPQVFTSDTEASSESGLHTPASQATTLHVPSQDPAGIQHLQPAHRLSASPTVSSSSLVLYQSSDSSNGQSHLLPSNHSVIETFISTQMASSSQ
SEQ ID NO：40
细胞色素P450家族3亚家族A多肽4(CYP3A4)，登录号：ABI96208；基因：CYP3A4
MALIPDLAMETWLLLAVSLVLLYLYGTHSHGLFKKLGIPGPTPLPFLGNILSYHKGFCMFDMECHKKYGKVWGFYDGQQPVLAITDPDMIKTVLVKECYSVFTNRRPFGPVGFMKSAISIAEDEEWKRLRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNLRREAETGKPVTLKDVFGAYSMDVITSTSFGVNIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFDFLDPFFLSITVFPFLIPILEVLNICVFPREVTNFLRKSVKRMKESRLEDTQKHRVDFLQLMIDSQNSKETESHKALSDLELVAQSIIFIFAGYETTSSVLSFIMYELATHPDVQQKLQEEIDAVLPNKAPPTYDTVLQMEYLDMVVNETLRLFPIAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGVVVMIPSYALHRDPKYWTEPEKFLPERFSKKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALMNMKLALIRVLQNFSFKPCKETQIPLKLSLGGLLQPEKPVVLKVESRDGTVSGA
SEQ ID NO：41
细胞色素P450家族2亚家族C多肽9(CYP2C9)，登录号：AGS09764；基因：CYP2C9
MDSLVVLVLCLSCLLLLSLWRQSSGRGKLPPGPTPLPVIGNILQIGIKDISKSLTNLSKVYGPVFTLYFGLKPIVVLHGYEAVKEALIDLGEEFSGRGIFPLAERANRGFGIVFSNGKKWKEIRRFSLMTLRNFGMGKRSIEDRVQEEARCLVEELRKTKASPCDPTFILGCAPCNVICSIIFHKRFDYKDQQFLNLMEKLNENIKILSSPWIQICNNFSPIIDYFPGTHNKLLKNVAFMKSYILEKVKEHQESMDMNNPQDFIDCFLMKMEKEKHNQPSEFTIESLENTAVDLFGAGTETTSTTLRYALLLLLKHPEVTAKVQEEIERVIGRNRSPCMQDRSHMPYTDAVVHEVQRYIDLLPTSLPHAVTCDIKFRNYLIPKGTTILISLTSVLHDNKEFPNPEMFDPHHFLDEGGNFKKSKYFMPFSAGKRICVGEALAGMELFLFLTSILQNFNLKSLVDPKNLDTTPVVNGFASVPPFYQLCFIPV
SEQ ID NO：42
细胞色素P450，家族2，亚家族C，多肽19(CYP2C19)，登录号：AAV41877；基因：CYP2C19
MDPFVVLVLCLSCLLLLSIWRQSSGRGKLPPGPTPLPVIGNILQIDIKDVSKSLTNLSKIYGPVFTLYFGLERMVVLHGYEVVKEALIDLGEEFSGRGHFPLAERANRGFGIVFSNGKRWKEIRRFSLMTLRNFGMGKRSIEDRVQEEARCLVEELRKTKASPCDPTFILGCAPCNVICSIIFQKRFDYKDQQFLNLMEKLNENIRIVSTPWIQICNNFPTIIDYFPGTHNKLLKNLAFMESDILEKVKEHQESMDINNPRDFIDCFLIKMEKEKQNQQSEFTIENLVITAADLLGAGTETTSTTLRYALLLLLKHPEVTAKVQEEIERVVGRNRSPCMQDRGHMPYTDAVVHEVQRYIDLIPTSLPHAVTCDVKFRNYLIPKGTTILTSLTSVLHDNKEFPNPEMFDPRHFLDEGGNFKKSNYFMPFSAGKRICVGEGLARMELFLFLTFILQNFNLKSLIDPKDLDTTPVVNGFASVPPFYQLCFIPV
SEQ ID NO：43
细胞色素P450家族1，亚家族A，多肽2(CYP1A2)，登录号：AAH67428；基因：CYP1A2
MALSQSVPFSATELLLASAIFCLVFWVLKGLRPRVPKGLKSPPEPWGWPLLGHVLTLGKNPHLALSRMSQRYGDVLQIRIGSTPVLVLSRLDTIRQALVRQGDDFKGRPDLYTSTLITDGQSLTFSTDSGPVWAARRRLAQNALNTFSIASDPASSSSCYLEEHVSKEAKALISRLQELMAGPGHFDPYNQVVVSVANVIGAMCFGQHFPESSDEMLSLVKNTHEFVETASSGNPLDFFPILRYLPNPALQRFKAFNQRFLWFLQKTVQEHYQDFDKNSVRDITGALFKHSKKGPRASGNLIPQEKIVNLVNDIFGAGFDTVTTAISWSLMYLVTKPEIQRKIQKELDTVIGRERRPRLSDRPQLPYLEAFILETFRHSSFLPFTIPHSTTRDTTLNGFYIPKKCVFVNQWQVNHDPELWEDPSEFRPERFLTADGTAINKPLSEKMMLFGMGKRRCIGEVLAKWEIFLFLAILLQQLEFSVPPGVKVDLTPIYGLTMKHARCEHVQARLRFSIN
SEQ ID NO：44
细胞色素P450，家族2亚家族E，多肽1(CYP2E1)，登录号：AAH67435；基因：CYP2E1
MSALGVTVALLVWAAFLLLVSMWRQVHSSWNLPPGPFPLPIIGNLFQLELKNIPKSFTRLAQRFGPVFTLYVGSQRMVVMHGYKAVKEALLDYKDEFSGRGDLPAFHAHRDRGIIFNNGPAWKDIRRFSLTTLRNYGMGKQGNESRIQREAHFLLEALRKTQGQPFDPTFLIGCAPCNVIADILFRKHFDYNDEKFLRLMYLFNENFHLLSTPWLQLYNNFPSFLHYLPGSHRKVIKNVAEVKEYVSERVKEHHQSLDPNCPRDLTDCLLVEMEKEKHSAERLYTMDGITVTVADLFFAGTETTSTTLRYGLLILMKYPEIEEKLHEEIDRVIGPSRIPAIKDRQEMPYMDAVVHEIQRFITLVPSNLPHEATRDTIFRGYLIPKGTVVVPTLDSVLYDNQEFPDPEKFKPEHFLNENGKFKYSDYFKPFSTGKRVCAGEGLARTELFLLLCAILQHFNLKPLVDPKDIDLSPIHIGFGCIPPRYKLCVIPRS
SEQ ID NO：45
细胞色素P450，家族2，亚科D，多肽6(CYP2D6)，登录号：ABB01372；基因：CYP2D6
MGLEALVPLAVIVAIFLLLVDLMHRRQRWAARYSPGPLPLPGLGNLLHVDFQNTPYCFDQLRRRFGDVFSLQLAWTPVVVLNGLAAVREALVTHGEDTADRPPVPITQILGFGPRSQGVFLARYGPAWREQRRFSVSTLRNLGLGKKSLEQWVTEEAACLCAAFANHSGRPFRPNGLLDKAVSNVIASLTCGRRFEYDDPRFLRLLDLAQEGLKEESGFLREVLNAVPVLLHIPALAGKVLRFQKAFLTQLDELLTEHRMTWDPAQPPRDLTEAFLAEMEKAKGNPESSFNDENLRIVVADLFSAGMVTTSTTLAWGLLLMILHPDVQRRVQQEIDDVIGQVRRPEMGDQAHMPYTTAVIHEVQRFGDIVPLGVTHMTSRDIEVQGFRIPKGTTLITNLSSVLKDEAVWEKPFRFHPEHFLDAQGHFVKPEAFLPFSAGRRACLGEPLARMELFLFFTSLLQHFSFSVPTGQPRPSHHGVFAFLVTPSPYELCAVPR
SEQ ID NO：46
细胞色素P450，家族3亚家族A，多肽7(CYP3A7)，登录号：AAH67436；基因：CYP3A7
MDLIPNLAVETWLLLAVSLILLYLYGTRTHGLFKKLGIPGPTPLPFLGNALSFRKGYWTFDMECYKKYRKVWGIYDCQQPMLAITDPDMIKTVLVKECYSVFTNRRPFGPVGFMKNAISIAEDEEWKRIRSLLSPTFTSGKLKEMVPIIAQYGDVLVRNLRREAETGKPVTLKHVFGAYSMDVITSTSFGVSIDSLNNPQDPFVENTKKLLRFNPLDPFVLSIKVFPFLTPILEALNITVFPRKVISFLTKSVKQIKEGRLKETQKHRVDFLQLMIDSQNSKDSETHKALSDLELMAQSIIFIFAGYETTSSVLSFIIYELATHPDVQQKVQKEIDTVLPNKAPPTYDTV
LQLEYLDMVVNETLRLFPVAMRLERVCKKDVEINGMFIPKGVVVMIPSYVLHHDPKYWTEPEKFLPERFSKKNKDNIDPYIYTPFGSGPRNCIGMRFALVNMKLALVRVLQNFSFKPCKETQIPLKLRFGGLLLTEKPIVLKAESRDETVSGA
SEQ ID NO：47
细胞色素P450家族1，亚家族A，多肽1(CYP1A1)，登录号：AAH23019；基因：CYP1A1
MLFPISMSATEFLLASVIFCLVFWVIRASRPQVPKGLKNPPGPWGWPLIGHMLTLGKNPHLALSRMSQQYGDVLQIRIGSTPVVVLSGLDTIRQALVRQGDDFKGRPDLYTFTLISNGQSMSFSPDSGPVWAARRRLAQNGLKSFSIASDPASSTSCYLEEHVSKEAEVLISTLQELMAGPGHFNPYRYVVVSVTNVICAICFGRRYDHNHQELLSLVNLNNNFGEVVGSGNPADFIPILRYLPNPSLNAFKDLNEKFYSFMQKMVKEHYKTFEKGHIRDITDSLIEHCQEKQLDENANVQLSDEKIINIVLDLFGAGFDTVTTAISWSLMYLVMNPRVQRKIQEELDTVIGRSRRPRLSDRSHLPYMEAFILETFRHSSFVPFTIPHSTTRDTSLKGFYIPKGRCVFVNQWQINHDQKLWVNPSEFLPERFLTPDGAIDKVLSEKVIIFGMGKRKCIGETIARWEVFLFLAILLQRVEFSVPLGVKVDMTPIYGLTMKHACCEHFQMQLRS
SEQ ID NO：48
细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽5(CYP3A5)，登录号：NP_000768；基因：CYP3A5
MDLIPNLAVETWLLLAVSLVLLYLYGTRTHGLFKRLGIPGPTPLPLLGNVLSYRQGLWKFDTECYKKYGKMWGTYEGQLPVLAITDPDVIRTVLVKECYSVFTNRRSLGPVGFMKSAISLAEDEEWKRIRSLLSPTFTSGKLKEMFPIIAQYGDVLVRNLRREAEKGKPVTLKDIFGAYSMDVITGTSFGVNIDSLNNPQDPFVESTKKFLKFGFLDPLFLSIILFPFLTPVFEALNVSLFPKDTINFLSKSVNRMKKSRLNDKQKHRLDFLQLMIDSQNSKETESHKALSDLELAAQSIIFIFAGYETTSSVLSFTLYELATHPDVQQKLQKEIDAVLPNKAPPTYDAVVQMEYLDMVVNETLRLFPVAIRLERTCKKDVEINGVFIPKGSMVVIPTYALHHDPKYWTEPEEFRPERFSKKKDSIDPYIYTPFGTGPRNCIGMRFALMNMKLALIRVLQNFSFKPCKETQIPLKLDTQGLLQPEKPIVLKVDSRDGTLSGE
SEQ ID NO：49
细胞色素P450，家族27，亚家族A，多肽1(CYP27A1)，登录号：AAH40430；基因：CYP27A1
MAALGCARLRWALRGAGRGLCPHGARAKAAIPAALPSDKATGAPGAGPGVRRRQRSLEEIPRLGQLRFFFQLFVQGYALQLHQLQVLYKAKYGPMWMSYLGPQMHVNLASAPLLEQVMRQEGKYPVRNDMELWKEHRDQHDLTYGPFTTEGHHWYQLRQALNQRLLKPAEAALYTDAFNEVIDDFMTRLDQLRAESASGNQVSDMAQLFYYFALEAICYILFEKRIGCLQRSIPEDTVTFVRSIGLMFQNSLYATFLPKWTRPVLPFWKRYLDGWNAIFSFGKKLIDEKLEDMEAQLQAAGPDGIQVSGYLHFLLASGQLSPREAMGSLPELLMAGVDTTSNTLTWALYHLSKDPEIQEALHEEVVGVVPAGQVPQHKDFAHMPLLKAVLKETLRLYPVVPTNSRIIEKEIEVDGFLFPKNTQFVFCHYVVSRDPTAFSEPESFQPHRWLRNSQPATPRIQHPFGSVPFGYGVRACLGRRIAELEMQLLLARLIQKYKVVLAPETGELKSVARIVLVPNKKVGLQFLQRQC
SEQ ID NO：50
细胞色素P450，家族2，亚科B，多肽6(CYP2B6)，登录号：NP_000758；基因：CYP2B6
MELSVLLFLALLTGLLLLLVQRHPNTHDRLPPGPRPLPLLGNLLQMDRRGLLKSFLRFREKYGDVFTVHLGPRPVVMLCGVEAIREALVDKAEAFSGRGKIAMVDPFFRGYGVIFANGNRWKVLRRFSVTTMRDFGMGKRSVEERIQEEAQCLIEELRKSKGALMDPTFLFQSITANIICSIVFGKRFHYQDQEFLKMLNLFYQTFSLISSVFGQLFELFSGFLKYFPGAHRQVYKNLQEINAYIGHSVEKHRETLDPSAPKDLIDTYLLHMEKEKSNAHSEFSHQNLNLNTLSLFFAGTETTSTTLRYGFLLMLKYPHVAERVYREIEQVIGPHRPPELHDRAKMPYTEAVIYEIQRFSDLLPMGVPHIVTQHTSFRGYIIPKDTEVFLILSTALHDPHYFEKPDAFNPDHFLDANGALKKTEAFIPFSLGKRICLGEGIARAELFLFFTTILQNFSMASPVAPEDIDLTPQECGVGKIPPTYQIRFLPR
SEQ ID NO：51
角蛋白，I型细胞骨架18(KRT18)，登录号：NP_954657；基因：KRT18
MSFTTRSTFSTNYRSLGSVQAPSYGARPVSSAASVYAGAGGSGSRISVSRSTSFRGGMGSGGLATGIAGGLAGMGGIQNEKETMQSLNDRLASYLDRVRSLETENRRLESKIREHLEKKGPQVRDWSHYFKIIEDLRAQIFANTVDNARIVLQIDNARLAADDFRVKYETELAMRQSVENDIHGLRKVIDDTNITRLQLETEIEALKEELLFMKKNHEEEVKGLQAQIASSGLTVEVDAPKSQDLAKIMADIRAQYDELARKNREELDKYWSQQIEESTTVVTTQSAEVGAAETTLTELRRTVQSLEIDLDSMRNLKASLENSLREVEARYALQMEQLNGILLHLESELAQTRAEGQRQAQEYEALLNIKVKLEAEIATYRRLLEDGEDFNLGDALDSSNSMQTIQKTTTRRIVDGKVVSETNDTKVLRH
SEQ ID NO：52
prospero同源盒蛋白1(PROX1)，登录号：NP_002754；基因：PROX1
MPDHDSTALLSRQTKRRRVDIGVKRTVGTASAFFAKARATFFSAMNPQGSEQDVEYSVVQHADGEKSNVLRKLLKRANSYEDAMMPFPGATIISQLLKNNMNKNGGTEPSFQASGLSSTGSEVHQEDICSNSSRDSPPECLSPFGRPTMSQFDMDRLCDEHLRAKRARVENIIRGMSHSPSVALRGNENEREMAPQSVSPRESYRENKRKQKLPQQQQQSFQQLVSARKEQKREERRQLKQQLEDMQKQLRQLQEKFYQIYDSTDSENDEDGNLSEDSMRSEILDARAQDSVGRSDNEMCELDPGQFIDRARALIREQEMAENKPKREGNNKERDHGPNSLQPEGKHLAETLKQELNTAMSQVVDTVVKVFSAKPSRQVPQVFPPLQIPQARFAVNGENHNFHTANQRLQCFGDVIIPNPLDTFGNVQMASSTDQTEALPLVVRKNSSDQSASGPAAGGHHQPLHQSPLSATTGFTTSTFRHPFPLPLMAYPFQSPLGAPSGSFSGKDRASPESLDLTRDTTSLRTKMSSHHLSHHPCSPAHPPSTAEGLSLSLIKSECGDLQDMSEISPYSGSAMQEGLSPNHLKKAKLMFFYTRYPSSNMLKTYFSDVKFNRCITSQLIKWFSNFREFYYIQMEKYARQAINDGVTSTEELSITRDCELYRALNMHYNKANDFEVPERFLEVAQITLREFFNAIIAGKDVDPSWKKAIYKVICKLDSEVPEIFKSPNCLQELLHE
SEQ ID NO：53
肝细胞核因子6，登录号：NP_004489；基因：HNF6
MNAQLTMEAIGELHGVSHEPVPAPADLLGGSPHARSSVAHRGSHLPPAHPRSMGMASLLDGGSGGGDYHHHHRAPEHSLAGPLHPTMTMACETPPGMSMPTTYTTLTPLQPLPPISTVSDKFPHHHHHHHHHHHPHHHQRLAGNVSGSFTLMRDERGLASMNNLYTPYHKDVAGMGQSLSPLSSSGLGSIHNSQQGLPHYAHPGAAMPTDKMLTPNGFEAHHPAMLGRHGEQHLTPTSAGMVPINGLPPHHPHAHLNAQGHGQLLGTAREPNPSVTGAQV
SNGSNSGQMEEINTKEVAQRITTELKRYSIPQAIFAQRVLCRSQGTLSDLLRNPKPWSKLKSGRETFRRMWKWLQEPEFQRMSALRLAACKRKEQEHGKDRGNTPKKPRLVFTDVQRRTLHAIFKENKRPSKELQITISQQLGLELSTVSNFFMNARRRSLDKWQDEGSSNSGNSSSSSSTCTKA
SEQ ID NO：54
白蛋白，登录号：AAH36003；基因：ALB
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADD
RADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
SEQ ID NO：55
受体型酪氨酸蛋白磷酸酶C(CD45)，登录号：NP_002829；基因：CD45
MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTGQSPTPSPTGLTTAKMPSVPLSSDPLPTHTTAFSPASTFERENDFSETTTSLSPDNTSTQVSPDSLDNASAFNTTGVSSVQTPHLPTHADSQTPSAGTDTQTFSGSAANAKLNPTPGSNAISDVPGERSTASTFPTDPVSPLTTTLSLAHHSSAALPARTSNTTITANTSDAYLNASETTTLSPSGSAVISTTTIATTPSKPTCDEKYANITVDYLYNKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPDKTLILDVPPGVEKFQLHDCTQVEKADTTICLKWKNIETFTCDTQNITYRFQCGNMIFD
NKEIKLENLEPEHEYKCDSEILYNNHKFTNASKIIKTDFGSPGEPQIIFCRSEAAHQGVITWNPPQRSFHNFTLCYIKETEKDCLNLDKNLIKYDLQNLKPYTKYVLSLHAYIIAKVQRNGSAAMCHFTTKSAPPSQVWNMTVSMTSDNSMHVKCRPPRDRNGPHERYHLEVEAGNTLVRNESHKNCDFRVKDLQYSTDYTFKAYFHNGDYPGEPFILHHSTSYNSKALIAFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPY
DYNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQDAN
CVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS
SEQ ID NO：56
T淋巴细胞激活抗原CD80，登录号：NP_005182；基因：CD80
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDNLLPSWAITLISVNGIFVICCLTYCFAPRCRERRRNERLRRESVRPV
SEQ ID NO：57
T淋巴细胞激活抗原CD86，登录号：NP_787058；基因：CD86
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTMEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF
SEQ ID NO：58
整联蛋白α-X(CD11c)，登录号：NP_001273304；基因：CD11c
MTRTRAALLLFTALATSLGFNLDTEELTAFRVDSAGFGDSVVQYANSWVVVGAPQKITAANQTGGLYQCGYSTGACEPIGLQVPPEAVNMSLGLSLASTTSPSQLLACGPTVHHECGRNMYLTGLCFLLGPTQLTQRLPVSRQECPRQEQDIVFLIDGSGSISSRNFATMMNFVRAVISQFQRPSTQFSLMQFSNKFQTHFTFEEFRRSSNPLSLLASVHQLQGFTYTATAIQNVVHRLFHASYGARRDAAKILIVITDGKKEGDSLDYKDVIPMADAAGIIRYAIGVGLAFQNRNSWKELNDIASKPSQEHIFKVEDFDALKDIQNQLKEKIFAIEGTETTSSSSFELEMAQEGFSAVFTPDGPVLGAVGSFTWSGGAFLYPPNMSPTFINMSQENVDMRDSYLGYSTELALWKGVQSLVLGAPRYQHTGKAVIFTQVSRQWRMKAEVTGTQIGSYFGASLCSVDVDSDGSTDLVLIGAPHYYEQTRGGQVSVCPLPRGWRRWWCDAVLYGEQGHPWGRFGAALTVLGDVNGDKLTDVVIGAPGEEENRGAVYLFHGVLGPSISPSHSQRIAGSQLSSRLQYFGQALSGGQDLTQDGLVDLAVGARGQVLLLRTRPVLWVGVSMQFIPAEIPRSAFECREQVVSEQTLVQSNICLYIDKRSKNLLGSRDLQSSVTLDLALDPGRLSPRATFQETKNRSLSRVRVLGLKAHCENFNLLLPSCVEDSVTPITLRLNFTLVGKPLLAFRNLRPMLAADAQRYFTASLPFEKNCGADHICQDNLGISFSFPGLKSLLVGSNLELNAEVMVWNDGEDSYGTTITFSHPAGLSYRYVAEGQKQGQLRSLHLTCDSAPVGSQGTWSTSCRINHLIFRGGAQITFLATFDVSPKAVLGDRLLLTANVSSENNTPRTSKTTFQLELPVKYAVYTVVSSHEQFTKYLNFSESEEKESHVAMHRYQVNNLGQRDLPVSINFWVPVELNQEAVWMDVEVSHPQNPSLRCSSEKIAPPASDFLAHIQKNPVLDCSIAGCLRFRCDVPSFSVQEELDFTLKGNLSFGWVRQILQKKVSVVSVAEITFDTSVYSQLPGQEAFMRAQTTTVLEKYKVHNPTPLIVGSSIGGLLLLALITAVLYKVGFFKRQYKEMMEEANGQIAPENGTQTPSPPTPHYPQDNV
SEQ ID NO：59
膜伯胺氧化酶(VAP1)，登录号：NP_003725；基因：AOC
MNQKTILVLLILAVITIFALVCVLLVGRGGDGGEPSQLPHCPSVSPSAQPWTHPGQSQLFADLSREELTAVMRFLTQRLGPGLVDAAQARPSDNCVFSVELQLPPKAAALAHLDRGSPPPAREALAIVFFGRQPQPNVSELVVGPLPHPSYMRDVTVERHGGPLPYHRRPVLFQEYLDIDQMIFNRELPQASGLLHHCCFYKHRGRNLVTMTTAPRGLQSGDRATWFGLYYNISGAGFFLHHVGLELLVNHKALDPARWTIQKVFYQGRYYDSLAQLEAQFEAGLVNVVLIPDNGTGGSWSLKSPVPPGPAPPLQFYPQGPRFSVQGSRVASSLWTFSFGLGAFSGPRIFDVRFQGERLVYEISLQEALAIYGGNSPAAMTTRYVDGGFGMGKYTTPLTRGVDCPYLATYVDWHFLLESQAPKTIRDAFCVFEQNQGLPLRRHHSDLYSHYFGGLAETVLVVRSMSTLLNYDYVWDTVFHPSGAIEIRFYATGYISSAFLFGATGKYGNQVSEHTLGTVHTHSAHFKVDLDVAGLENWVWAEDMVFVPMAVPWSPEHQLQRLQVTRKLLEMEEQAAFLVGSATPRYLYLASNHSNKWGHPRGYRIQMLSFAGEPLPQNSSMARGFSWERYQLAVTQRKEEEPSSSSVFNQNDPWAPTVDFSDFINNETIAGKDLVAWVTAGFLHIPHAEDIPNTVTVGNGVGFFLRPYNFFDEDPSFYSADSIYFRGDQDAGACEVNPLACLPQAAACAPDLPAFSHGGFSHN
SEQ ID NO：60
Stabilin-1(STAB1)，登录号：NP_055951；基因：STAB1
MAGPRGLLPLCLLAFCLAGFSFVRGQVLFKGCDVKTTFVTHVPCTSCAAIKKQTCPSGWLRELPDQITQDCRYEVQLGGSMVSMSGCRRKCRKQVVQKACCPGYWGSRCHECPGGAETPCNGHGTCLDGMDRNGTCVCQENFRGSACQECQDPNRFGPDCQSVCSCVHGVCNHGPRGDGSCLCFAGYTGPHCDQELPVCQELRCPQNTQCSAEAPSCRCLPGYTQQGSECRAPNPCWPSPCSLLAQCSVSPKGQAQCHCPENYHGDGMVCLPKDPCTDNLGGCPSNSTLCVYQKPGQAFCTCRPGLVSINSNASAGCFAFCSPFSCDRSATCQVTADGKTSCVCRESEVGDGRACYGHLLHEVQKATQTGRVFLQLRVAVAMMDQGCREILTTAGPFTVLVPSVSSFSSRTMNASLAQQLCRQHIIAGQHILEDTRTQQTRRWWTLAGQEITVTFNQFTKYSYKYKDQPQQTFNIYKANNIAANGVFHVVTGLRWQAPSGTPGDPKRTIGQILASTEAFSRFETILENCGLPSILDGPGPFTVFAPSNEAVDSLRDGRLIYLFTAGLSKLQELVRYHIYNHGQLTVEKLISKGRILTMANQVLAVNISEEGRILLGPEGVPLQRVDVMAANGVIHMLDGILLPPTILPILPKHCSEEQHKIVAGSCVDCQALNTSTCPPNSVKLDIFPKECVYIHDPTGLNVLKKGCASYCNQTIMEQGCCKGFFGPDCTQCPGGFSNPCYGKGNCSDGIQGNGACLCFPDYKGIACHICSNPNKHGEQCQEDCGCVHGLCDNRPGSGGVCQQGTCAPGFSGRFCNESMGDCGPTGLAQHCHLHARCVSQEGVARCRCLDGFEGDGFSCTPSNPCSHPDRGGCSENAECVPGSLGTHHCTCHKGWSGDGRVCVAIDECELDMRGGCHTDALCSYVGPGQSRCTCKLGFAGDGYQCSPIDPCRAGNGGCHGLATCRAVGGGQRVCTCPPGFGGDGFSCYGDIFRELEANAHFSIFYQWLKSAGITLPADRRVTALVPSEAAVRQLSPEDRAFWLQPRTLPNLVRAHFLQGALFEEELARLGGQEVATLNPTTRWEIRNISGRVWVQNASVDVADLLATNGVLHILSQVLLPPRGDVPGGQGLLQQLDLVPAFSLFRELLQHHGLVPQIEAATAYTIFVPTNRSLEAQGNSSHLDADTVRHHVVLGEALSMETLRKGGHRNSLLGPAHWIVFYNHSGQPEVNHVPLEGPMLEAPGRSLIGLSGVLTVGSSRCLHSHAEALREKCVNCTRRFRCTQGFQLQDTPRKSCVYRSGFSFSRGCSYTCAKKIQVPDCCPGFFGTLCEPCPGGLGGVCSGHGQCQDRFLGSGECHCHEGFHGTACEVCELGRYGPNCTGVCDCAHGLCQEGLQGDGSCVCNVGWQGLRCDQKITSPQCPRKCDPNANCVQDSAGASTCACAAGYSGNGIFCSEVDPCAHGHGGCSPHA
NCTKVAPGQRTCTCQDGYMGDGELCQEINSCLIHHGGCHIHAECIPTGPQQVSCSCREGYSGDGIRTCELLDPCSKNNGGCSPYATCKSTGDGQRTCTCDTAHTVGDGLTCRARVGLELLRDKHASFFSLRLLEYKELKGDGPFTIFVPHADLMSNLSQDELARIRAHRQLVFRYHVVGCRRLRSEDLLEQGYATALSGHPLRFSEREGSIYLNDFARVVSSDHEAVNGILHFIDRVLLPPEALHWEPDDAPIPRRNVTAAAQGFGYKIFSGLLKVAGLLPLLREASHRPFTMLWPTDAAFRALPPDRQAWLYHEDHRDKLAAILRGHMIRNVEALASDLPNLGPLRTMHGTPISFSCSRTRAGELMVGEDDARIVQRHLPFEGGLAYGIDQLLEPPGLGARCDHFETRPLRLNTCSICGLEPPCPEGSQEQGSPEACWRFYPKFWTSPPLHSLGLRSVWVHPSLWGRPQGLGRGCHRNCVTTTWKPSCCPGHYGSECQACPGGPSSPCSDRGVCMDGMSGSGQCLCRSGFAGTACELCAPGAFGPHCQACRCTVHGRCDEGLGGSGSCFCDEGWTGPRCEVQLELQPVCTPPCAPEAVCRAGNSCECSLGYEGDGRVCTVADLCQDGHGGCSEHANCSQVGTMVTCTCLPDYEGDGWSCRARNPCTDGHRGGCSEHANCLSTGLNTRRCECHAGYVGDGLQCLEESEPPVDRCLGQPPPCHSDAMCTDLHFQEKRAGVFHLQATSGPYGLNFSEAEAACEAQGAVLASFPQLSAAQQLGFHLCLMGWLANGSTAHPVVFPVADCGNGRVGIVSLGARKNLSERWDAYCFRVQDVACRCRNGFVGDGISTCNGKLLDVLAATANFSTFYGMLLGYANATQRGLDFLDFLDDELTYKTLFVPVNEGFVDNMTLSGPDLELHASNATLLSANASQGKLLPAHSGLSLIISDAGPDNSSWAPVAPGTVVVSRIIVWDIMAFNGIIHALASPLLAPPQPQAVLAPEAPPVAAGVGAVLAAGALLGLVAGALYLRARGKPMGFGFSAFQAEDDADDDFSPWQEGTNPTLVSVPNPVFGSDTFCEPFDDSLLEEDFPDTQRILTVK
SEQ ID NO：61
血小板内皮细胞粘附分子(CD31)，登录号；基因：NP_000433，CD31
MQPRWAQGATMWLGVLLTLLLCSSLEGQENSFTINSVDMKSLPDWTVQNGKNLTLQCFADVSTTSHVKPQHQMLFYKDDVLFYNISSMKSTESYFIPEVRIYDSGTYKCTVIVNNKEKTTAEYQVLVEGVPSPRVTLDKKEAIQGGIVRVNCSVPEEKAPIHFTIEKLELNEKMVKLKREKNSRDQNFVILEFPVEEQDRVLSFRCQARIISGIHMQTSESTKSELVTVTESFSTPKFHISPTGMIMEGAQLHIKCTIQVTHLAQEFPEIIIQKDKAIVAHNRHGNKAVYSVMAMVEHSGNYTCKVESSRISKVSSIVVNITELFSKPELESSFTHLDQGERLNLSCSIPGAPPANFTIQKEDTIVSQTQDFTKIASKSDSGTYICTAGIDKVVKKSNTVQIVVCEMLSQPRISYDAQFEVIKGQTIEVRCESISGTLPISYQLLKTSKVLENSTKNSNDPAVFKDNPTEDVEYQCVADNCHSHAKMLSEVLRVKVIAPVDEVQISILSSKVVESGEDIVLQCAVNEGSGPITYKFYREKEGKPFYQMTSNATQAFWTKQKASKEQEGEYYCTAFNRANHASSVPRSKILTVRVILAPWKKGLIAVVIIGVIIALLIIAAKCYFLRKAKAKQMPVEMSRPAVPLLNSNNEKMSDPNMEANSHYGHNDDVRNHAMKPINDNKEPLNSDVQYEVQVSSAESHKDLGKKDTETVYSEVRKAVPDAVESRYSRTEGSLDGT
SEQ ID NO：62
神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，登录号：AAB22581；基因：GFAP
MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM
SEQ ID NO：63
波形蛋白(VIM)，登录号：AAH66956；基因：VIM
MSTRSVSSSSYRRMFGGPGTASRPSSSRSYVTTSTRTYSLGSALRPSTSRSLYASSPGGVYATRSSAVRLRSSVPGVRLLQDSVDFSLADAINTEFKNTRTNEKVELQELNDRFANYIDKVRFLEQQNKILLAELEQLKGQGKSRLGDLYEEEMRELRRQVDQLTNDKARVEVERDNLAEDIMRLREKLQEEMLQREEAENTLQSFRQDVDNASLARLDLERKVESLQEEIAFLKKLHEEEIQELQAQIQEQHVQIDVDVSKPDLTAALRDVRQQYESVAAKNLQEAEEWYKSKFADLSEAANRNNDALRQAKQESTEYRRQVQSLTCEVDALKGTNESLERQMREMEENFAVEAANYQDTIGRLQDEIQNMKEEMARHLREYQDLLNVKMALDIEIATYRKLLEGEESRISLPLPNFSSLNLRETNLDSLPLVDTHSKRTLLIKTVETRDGQVINETSQHHDDLE
SEQ ID NO：64
LIM/同源盒蛋白Lhx2，登录号：NP_004780；基因：LHX2
MLFHSLSGPEVHGVIDEMDRRAKSEAPAISSAIDRGDTETTMPSISSDRAALCAGCGGKISDRYYLLAVDKQWHMRCLKCCECKLNLESELTCFSKDGSIYCKEDYYRRFSVQRCARCHLGISASEMVMRARDLVYHLNCFTCTTCNKMLTTGDHFGMKDSLVYCRLHFEALLQGEYPAHFNHADVAAAAAAAAAAKSAGLGAAGANPLGLPYYNGVGTVQKGRPRKRKSPGPGADLAAYNAALSCNENDAEHLDRDQPYPSSQKTKRMRTSFKHHQLRTMKSYFAINHNPDAKDLKQLAQKTGLTKRVLQVWFQNARAKFRRNLLRQENTGVDKSTDAALQTGTPSGPASELSNASLSPSSTPTTLTDLTSPTLPTVTSVLTSVPGNLEGHEPHSPSQTTLTNLF
SEQ ID NO：65
卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)，登录号：AAD13529；基因：LRAT
MKNPMLEVVSLLLEKLLLISNFTLFSSGAAGKDKGRNSFYETSSFHRGDVLEVPRTHLTHYGIYLGDNRVAHMMPDILLALTDDMGRTQKVVSNKRLILGVIVKVASIRVDTVEDFAYGANILVNHLDESLQKKALLNEEVARRAEKLLGFTPYSLLWNNCEHFVTYCRYGTPISPQSDKFCETVKIIIRDQRSVLASAVLGLASIVCTGLVSYTTLPAIFIPFFLWMAG
SEQ ID NO：66
血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)，登录号：NP_002600；基因：PDGFRβ
MRLPGAMPALALKGELLLLSLLLLLEPQISQGLVVTPPGPELVLNVSSTFVLTCSGSAPVVWERMSQEPPQEMAKAQDGTFSSVLTLTNLTGLDTGEYFCTHNDSRGLETDERKRLYIFVPDPTVGFLPNDAEELFIFLTEITEITIPCRVTDPQLVVTLHEKKGDVALPVPYDHQRGFSGIFEDRSYICKTTIGDREVDSDAYYVYRLQVSSINVSVNAVQTVVRQGENITLMCIVIGNEVVNFEWTYPRKESGRLVEPVTDFLLDMPYHIRSILHIPSAELEDSGTYTCNVTESVNDHQDEKAINITVVESGYVRLLGEVGTLQFAELHRSRTLQVVFEAYPPPTVLWFKDNRTLGDSSAGEIALSTRNVSETRYVSELTLVRVKVAEAGHYTMRAFHEDAEVQLSFQLQINVPVRVLELSESHPDSGEQTVRCRGRGMPQPNIIWSACRDLKRCPRELPPTLLGNSSEEESQLETNVTYWEEEQEFEVVSTLRLQHVDRPLSVRCTLRNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYEIRWKVIESVSSDGHEYIYVDPMQLPYDSTWELPRDQLVLGRTLGSGAFGQVVEATAHGLSHSQATMKVAVKMLKSTARSSEKQALMSELKIMSHLGPHLNVVNLLGACTKGGPIYIITEYCRYGDLVDYLHRNKHTFLQHHSDKRRPPSAELYSNALPVGLPLPSHVSLTGESDGGYMDMSKDESVDYVPMLDMKGDVKYADIESSNYMAPYDNYVPSAPERTCRATLINESPVLSYMDLVGFSYQVANGMEFLASKNCVHRDLAARNVLICEGKLVKICDFGLARDIMRDSNYISKGSTFLPLKWMAPESIFNSLYTTLSDVWSFGILLWEIFTLGGTPYPELPMNEQFYNAIKRGYRMAQPAHASDEIYEIMQKCWEEKFEIRPPFSQLVLLLERLLGEGYKKKYQQVDEEFLRSDHPAILRSQARLPGFHGLRSPLDTSSVLYTAVQPNEGDNDYIIPLPDPKPEVADEGPLEGSPSLASSTLNEVNTSSTISCDSPLEPQDEPEPEPQLELQVEPEPELEQLPDSGCPAPRAEAEDSFL
SEQ ID NO：67
心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2(HAND2)，登录号：NP_068808，HAND2
MSLVGGFPHHPVVHHEGYPFAAAAAAAAAAAASRCSHEENPYFHGWLIGHPEMSPPDYSMALSYSPEYASGAAGLDHSHYGGVPPGAGPPGLGGPRPVKRRGTANRKERRRTQSINSAFAELRECIPNVPADTKLSKIKTLRLATSYIAYLMDLLAKDDQNGEAEAFKAEIKKTDVKEEKRKKELNEILKSTVSSNDKKTKGRTGWPQHVWALELKQ
SEQ ID NO：68
细胞间粘附分子1(ICAM1)，登录号：NP_000192；基因：ICAM1
MAPSSPRPALPALLVLLGALFPGPGNAQTSVSPSKVILPRGGSVLVTCSTSCDQPKLLGIETPLPKKELLLPGNNRKVYELSNVQEDSQPMCYSNCPDGQSTAKTFLTVYWTPERVELAPLPSWQPVGKNLTLRCQVEGGAPRANLTVVLLRGEKELKREPAVGEPAEVTTTVLVRRDHHGANFSCRTELDLRPQGLELFENTSAPYQLQTFVLPATPPQLVSPRVLEVDTQGTVVCSLDGLFPVSEAQVHLALGDQRLNPTVTYGNDSFSAKASVSVTAEDEGTQRLTCAVILGNQSQETLQTVTIYSFPAPNVILTKPEVSEGTEVTVKCEAHPRAKVTLNGVPAQPLGPRAQLLLKATPEDNGRSFSCSATLEVAGQLIHKNQTRELRVLYGPRLDERDCPGNWTWPENSQQTPMCQAWGNPLPELKCLKDGTFPLPIGESVTVTRDLEGTYLCRARSTQGEVTRKVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIMGTAGLSTYLYNRQRKIKKYRLQQAQKGTPMKPNTQATPP
SEQ ID NO：69
血管细胞粘附蛋白1(VCAM1)，登录号：NP_001069；基因：VCAM1
MPGKMVVILGASNILWIMFAASQAFKIETTPESRYLAQIGDSVSLTCSTTGCESPFFSWRTQIDSPLNGKVTNEGTTSTLTMNPVSFGNEHSYLCTATCESRKLEKGIQVEIYSFPKDPEIHLSGPLEAGKPITVKCSVADVYPFDRLEIDLLKGDHLMKSQEFLEDADRKSLETKSLEVTFTPVIEDIGKVLVCRAKLHIDEMDSVPTVRQAVKELQVYISPKNTVISVNPSTKLQEGGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYVCEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESPSFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGIQVELYSFPRDPEIEMSGGLVNGSSVTVSCKVPSVYPLDRLEIELLKGETILENIEFLEDTDMKSLENKSLEMTFIPTIEDTGKALVCQAKLHIDDMEFEPKQRQSTQTLYVNVAPRDTTVLVSPSSILEEGSSVNMTCLSQGFPAPKILWSRQLPNGELQPLSENATLTLISTKMEDSGVYLCEGINQAGRSRKEVELIIQVTPKDIKLTAFPSESVKEGDTVIISCTCGNVPETWIILKKKAETGDTVLKSIDGAYTIRKAQLKDAGVYECESKNKVGSQLRSLTLDVQGRENNKDYFSPELLVLYFASSLIIPAIGMIIYFARKANMKGSYSLVEAQKSKV
SEQ ID NO：70
神经细胞粘附分子1(NCAM1)，登录号：NP_000606；基因：NCAM1
MLQTKDLIWTLFFLGTAVSLQVDIVPSQGEISVGESKFFLCQVAGDAKDKDISWFSPNGEKLTPNQQRISVVWNDDSSSTLTIYNANIDDAGIYKCVVTGEDGSESEATVNVKIFQKLMFKNAPTPQEFREGEDAVIVCDVVSSLPPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNYLQIRGIKKTDEGTYRCEGRILARGEINFKDIQVIVNVPPTIQARQNIVNATANLGQSVTLVCDAEGFPEPTMSWTKDGEQIEQEEDDEKYIFSDDSSQLTIKKVDKNDEAEYICIAENKAGEQDATIHLKVFAKPKITYVENQTAMELEEQVTLTCEASGDPIPSITWRTSTRNISS
EEKTLDGHMVVRSHARVSSLTLKSIQYTDAGEYICTASNTIGQDSQSMYLEVQYAPKLQGPVAVYTWEGNQVNITCEVFAYPSATISWFRDGQLLPSSNYSNIKIYNTPSASYLEVTPDSENDFGNYNCTAVNRIGQESLEFILVQADTPSSPSIDQVEPYSSTAQVQFDEPEATGGVPILKYKAEWRAVGEEVWHSKWYDAKEASMEGIVTIVGLKPETTYAVRLAALNGKGLGEISAASEFKTQPVQGEPSAPKLEGQMGEDGNSIKVNLIKQDDGGSPIRHYLVRYRALSSEWKPEIRLPSGSDHVMLKSLDWNAEYEVYVVAENQQGKSKAAHFVFRTSAQPTAIPANGSPTSGLSTGAIVGILIVIFVLLLVVVDITCYFLNKCGLFMCIAVNLCGKAGPGAKGKDMEEGKAAFSKDESKEPIVEVRTEEERTPNHDGGKHTEPNETTPLTEPEKGPVEAKPECQETETKPAPAEVKTVPNDATQTKENESKA
SEQ ID NO：71
胶原蛋白α-1(I)链蛋白(COL1A1)，登录号：NP_000079；基因：COL1A1
MFSFVDLRLLLLLAATALLTHGQEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAPQLSYGYDEKSTGGISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQGFQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEAGKPGRPGERGPPGPQGARGLPGTAGLPGMKGHRGFSGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRGLPGERGRPGAPGPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAKGEAGPQGPRGSEGPQGVRGEPGPPGPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGANGAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGARGSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPPGSPGEQGPSGASGPAGPRGPPGSAGAPGKDGLNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSFLPQPPQEKAHDGGRYYRADDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEGSRKNPARTCRDLKMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCVYPTQPSVAQKNWYISKNPKDKRHVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAIQLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTGNLKKALLLQGSNEIEIRAEGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLPIIDVAPLDVGAPDQEFGFDVGPVCFL
SEQ ID NO：72
肌动蛋白，主动脉平滑肌(α-SMA)，登录号：NP_001307784；基因：ACTA2
MCEEEDSTALVCDNGSGLCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTLKYPIEHGIITNWDDMEKIWHHSFYNELRVAPEEHPTLLTEAPLNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVTHNVPIYEGYALPHAIMRLDLAGRDLTDYLMKILTERGYSFVTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFENEMATAASSSSLEKSYELPDGQVITIGNERFRCPETLFQPSFIGMESAGIHETTYNSIMKCDIDIRKDLYANNVLSGGTTMYPGIADRMQKEITALAPSTMKIKIIAPPERKYSVWIGGSILASLSTFQQMWISKQEYDEAGPSIVHRKCF
SEQ ID NO：73
胰高血糖素(GCG)，登录号：AAH05278；基因：GCG
MKSIYFVAGLFVMLVQGSWQRSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKRHSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIAKRHDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITDRK
SEQ ID NO：74
胰岛素，登记号：AAA59172；基因：INS
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO：75
生长抑素，登录号：AAH32625；基因：SST
MLSCRLQCALAALSIVLALGCVTGAPSDPRLRQFLQKSLAAAAGKQELAKYFLAELLSEPNQTENDALEPEDLSQAAEQDEMRLELQRSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
SEQ ID NO：76
同源盒蛋白Nkx-6.1，登录号：NP_006159；基因：NKX6.1
MLAVGAMEGTRQSAFLLSSPPLAALHSMAEMKTPLYPAAYPPLPAGPPSSSSSSSSSSSPSPPLGTHNPGGLKPPATGGLSSLGSPPQQLSAATPHGINDILSRPSMPVASGAALPSASPSGSSSSSSSSASASSASAAAAAAAAAAAAASSPAGLLAGLPRFSSLSPPPPPPGLYFSPSAAAVAAVGRYPKPLAELPGRTPIFWPGVMQSPPWRDARLACTPHQGSILLDKDGKRKHTRPTFSGQQIFALEKTFEQTKYLAGPERARLAYSLGMTESQVKVWFQNRRTKWRKKHAAEMATAKKKQDSETERLKGASENEEEDDDYNKPLDPNSDDEKITQLLKKHKSSSGGGGGLLLHASEPESSS
SEQ ID NO：77
同源盒蛋白质Nkx-2.2，登录号：NP_002500；基因：NKX2.2
MSLTNTKTGFSVKDILDLPDTNDEEGSVAEGPEEENEGPEPAKRAGPLGQGALDAVQSLPLKNPFYDSSDNPYTRWLASTEGLQYSLHGLAAGAPPQDSSSKSPEPSADESPDNDKETPGGGGDAGKKRKRRVLFSKAQTYELERRFRQQRYLSAPEREHLASLIRLTPTQVKIWFQNHRYKMKRARAEKGMEVTPLPSPRRVAVPVLVRDGKPCHALKAQDLAAATFQAGIPFSAYSAQSLQHMQYNAQYSSASTPQYPTAHPLVQAQQWTW
SEQ ID NO：78
神经原分化因子1(NEUROD1)，登录号：NP_002491；基因：NEUROD1
MTKSYSESGLMGEPQPQGPPSWTDECLSSQDEEHEADKKEDDLEAMNAEEDSLRNGGEEEDEDEDLEEEEEEEEEDDDQKPKRRGPKKKKMTKARLERFKLRRMKANARERNRMHGLNAALDNLRKVVPCYSKTQKLSKIETLRLAKNYIWALSEILRSGKSPDLVSFVQTLCKGLSQPTTNLVAGCLQLNPRTFLPEQNQDMPPHLPTASASFPVHPYSYQSPGLPSPPYGTMDSSHVFHVKPPPHAYSAALEPFFESPLTDCTSPSFDGPLSPPLSINGNFSFKHEPSAEFEKNYAFTMHYPAATLAGAQSHGSIFSGTAAPRCEIPIDNIMSFDSHSHHERVMSAQLNAIFHD
SEQ ID NO：79
转录因子MafA(MAFA)，登录号：NP_963883；基因：MAFA
MAAELAMGAELPSSPLAIEYVNDFDLMKFEVKKEPPEAERFCHRLPPGSLSSTPLSTPCSSVPSSPSFCAPSPGTGGGGGAGGGGGSSQAGGAPGPPSGGPGAVGGTSGKPALEDLYWMSGYQHHLNPEALNLTPEDAVEALIGSGHHGAHHGAHHPAAAAAYEAFRGPGFAGGGGADDMGAGHHHGAHHAAHHHHAAHHHHHHHHHHGGAGHGGGAGHHVRLEERFSDDQLVSMSVRELNRQLRGFSKEEVIRLKQKRRTLKNRGYAQSCRFKRVQQRHILESEKCQLQSQVEQLKLEVGRLAKERDLYKEKYEKLAGRGGPGSAGGAGFPREPSPPQAGPGGAKGTADFFL
SEQ ID NO：80
胰蛋白酶-1，登录号：NP_002760；基因：PRSS
MNPLLILTFVAAALAAPFDDDDKIVGGYNCEENSVPYQVSLNSGYHFCGGSLINEQWVVSAGHCYKSRIQVRLGEHNIEVLEGNEQFINAAKIIRHPQYDRKTLNNDIMLIKLSSRAVINARVSTISLPTAPPATGTKCLISGWGNTASSGADYPDELQCLDAPVLSQAKCEASYPGKITSNMFCVGFLEGGKDSCQGDSGGPVVCNGQLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAANS
SEQ ID NO：81
羧肽酶A1(CPA1)，登录号：NP_001859；基因：CPA1
MRGLLVLSVLLGAVFGKEDFVGHQVLRISVADEAQVQKVKELEDLEHLQLDFWRGPAHPGSPIDVRVPFPSIQAVKIFLESHGISYETMIEDVQSLLDEEQEQMFAFRSRARSTDTFNYATYHTLEEIYDFLDLLVAENPHLVSKIQIGNTYEGRPIYVLKFSTGGSKRPAIWIDTGIHSREWVTQASGVWFAKKITQDYGQDAAFTAILDTLDIFLEIVTNPDGFAFTHSTNRMWRKTRSHTAGSLCIGVDPNRNWDAGFGLSGASSNPCSETYHGKFANSEVEVKSIVDFVKDHGNIKAFISIHSYSQLLMYPYGYKTEPVPDQDELDQLSKAAVTALASLYGTKFNYGSIIKAIYQASGSTIDWTYSQGIKYSFTFELRDTGRYGFLLPASQIIPTAKETWLALLTIMEHTLNHPY
SEQ ID NO：82
α-淀粉酶，登录号：AAA52279；基因：AMY1
MKLFWLLFTIGFCWAQYSSNTQQGRTSIVHLFEWRWVDIALECERYLAPKGFGGVQVSPPNENVAIHNPFRPWWERYQPVSYKLCTRSGNEDEFRNMVTRCNNVGVRIYVDAVINHMCGNAVSAGTSSTCGSYFNPGSRDFPAVPYSGWDFNDGKCKTGSGDIENYNDATQVRDCRLSGLLDLALGKDYVRSKIAEYMNHLIDIGVAGFRIDASKHMWPGDIKAILDKLHNLNSNWFPEGSKPFIYQEVIDLGGEPIKSSDYFGNGRVTEFKYGAKLGTVIRKWNGEKMSYLKNWGEGWGFMPSDRALVFVDNHDNQRGHGAGGASILTFWDARLYKMAVGFMLAHPYGFTRVMSSYRWPRYFENGXDVNDWVGPPNDNGVTKEVTINPDTTCGNDWVCEHRWRQIRNMVNFRNVVDGQPFTNWYDNGSNQVAFGRGNRGFIVFNNDDWTFSLTLQTGLPAGTYCDVISGDKINGNCTGIKIYVSDDGKAHFSISNSAEDPFIAIHAESKL
SEQ ID NO：83
胰凝乳蛋白酶C，登录号；基因：NP_009203
MLGITVLAALLACASSCGVPSFPPNLSARVVGGEDARPHSWPWQISLQYLKNDTWRHTCGGTLIASNFVLTAAHCISNTRTYRVAVGKNNLEVEDEEGSLFVGVDTIHVHKRWNALLLRNDIALIKLAEHVELSDTIQVACLPEKDSLLPKDYPCYVTGWGRLWTNGPIADKLQQGLQPVVDHATCSRIDWWGFRVKKTMVCAGGDGVISACNGDSGGPLNCQLENGSWEVFGIVSFGSRRGCNTRKKPVVYTRVSAYIDWINEKMQL
SEQ ID NO：84
绒毛蛋白-1，登录号：NP_009058；基因：Villin-1
MTKLSAQVKGSLNITTPGLQIWRIEAMQMVPVPSSTFGSFFDGDCYIILAIHKTASSLSYDIHYWIGQDSSLDEQGAAAIYTTQMDDFLKGRAVQHREVQGNESEAFRGYFKQGLVIRKGGVASGMKHVETNSYDVQRLLHVKGKRNVVAGEVEMSWKSFNRGDVFLLDLGKLIIQWNGPESTRMERLRGMTLAKEIRDQERGGRTYVGVVDGENELASPKLMEVMNHVLGKRRELKAAVPDTVVEPALKAALKLYHVSDSEGNLVVREVATRPLTQDLL
SHEDCYILDQGGLKIYVWKGKKANEQEKKGAMSHALNFIKAKQYPPSTQVEVQNDGAESAVFQQLFQKWTASNRTSGLGKTHTVGSVAKVEQVKFDATSMHVKPQVAAQQKMVDDGSGEVQVWRIENLELVPVDSKWLGHFYGGDCYLLLYTYLIGEKQHYLLYVWQGSQASQDEITASAYQAVILDQKYNGEPVQIRVPMGKEPPHLMSIFKGRMVVYQGGTSRTNNLETGPSTRLFQVQGTGANNTKAFEVPARANFLNSNDVFVLKTQSCCYLWCGKGCSGDEREMAKMVADTISRTEKQVVVEGQEPANFWMALGGKAPYANTKRLQEENLVITPRLFECSNKTGRFLATEIPDFNQDDLEEDDVFLLDVWDQVFFWIGKHANEEEKKAAATTAQEYLKTHPSGRDPETPIIVVKQGHEPPTFTGWFLAWDPFKWSNTKSYEDLKAELGNSRDWSQITAEVTSPKVDVFNANSNLSSGPLPIFPLEQLVNKPVEELPEGVDPSRKEEHLSIEDFTQAFGMTPAAFSALPRWKQQNLKKEKGLF
SEQ ID NO：85
CCAAT/增强子结合蛋白，登录号：NP_001274353；基因：CEBP
MRGRGRAGSPGGRRRRPAQAGGRRGSPCRENSNSPMESADFYEAEPRPPMSSHLQSPPHAPSSAAFGFPRGAGPAQPPAPPAAPEPLGGICEHETSIDISAYIDPAAFNDEFLADLFQHSRQQEKAKAAVGPTGGGGGGDFDYPGAPAGPGGAVMPGGAHGPPPGYGCAAAGYLDGRLEPLYERVGAPALRPLVIKQEPREEDEAKQLALAGLFPYQPPPPPPPSHPHPHPPPAHLAAPHLQFQIAHCGQTTMHLQPGHPTPPPTPVPSPHPAPALGAAGLPGPGSALKGLGAAHPDLRASGGSGAGKAKKSVDKNSNEYRVRRERNNIAVRKSRDKAKQRNVETQQKVLELTSDNDRLRKRVEQLSRELDTLRGIFRQLPESSLVKAMGNCA
SEQ ID NO：86
角蛋白，II型细胞骨架8(KRT8)，登录号：NP_001243211；基因：KRT8
MNGVSWSQDLQEGISAWFGPPASTPASTMSIRVTQKSYKVSTSGPRAFSSRSYTSGPGSRISSSSFSRVGSSNFRGGLGGGYGGASGMGGITAVTVNQSLLSPLVLEVDPNIQAVRTQEKEQIKTLNNKFASFIDKVRFLEQQNKMLETKWSLLQQQKTARSNMDNMFESYINNLRRQLETLGQEKLKLEAELGNMQGLVEDFKNKYEDEINKRTEMENEFVLIKKDVDEAYMNKVELESRLEGLTDEINFLRQLYEEEIRELQSQISDTSVVLSMDNSRSLDMDSIIAEVKAQYEDIANRSRAEAESMYQIKYEELQSLAGKHGDDLRRTKTEISEMNRNISRLQAEIEGLKGQRASLEAAIADAEQRGELAIKDANAKLSELEAALQRAKQDMARQLREYQELMNVKLALDIEIATYRKLLEGEESRLESGMQNMSIHTKTTSGYAGGLSSAYGGLTSPGLSYSLGSSFGSGAGSSSFSRTSSSRAVVVKKIETRDGKLVSESSDVLPK
SEQ ID NO：87
NOTCH2，登录号：AAG37073；基因：NOTCH2
MPALRPALLWALLALWLCCATPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKCPEGFLGEYCQHRDPCEKNRCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRPCLNGGTCHMLSRDTYECTCQVGFTGKECQWTDACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCETDVNECDIPGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCLQGFTGQYCDSLYVPCAPSPCVNGGTCRQTGDFTFECNCLPGFEGSTCERNIDDCPNHRCQNGGVCVDGVNTYNCRCPPQWTGQFCTEDVDECLLQPNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPGSTCIDRVASFSCMCPEGKAGLLCHLDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVDECAMANSNPCEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTCLCMPGFKGVHCELEINECQSNPCVNNGQCVDKVNRFQCLCPPGFTGPVCQIDIDDCSSTPCLNGAKCIDHPNGYECQCAT
GFTGVLCEENIDNCDPDPCHHGQCQDGIDSYTCICNPGYMGAICSDQIDECYSSPCLNDGRCIDLVNGYQCNCQPGTSGVNCEINFDDCASNPCIHGICMDGINRYSCVCSPGFTGQRCNIDIDECASNPCRKGATCINGVNGFRCICPEGPHHPSCYSQVNECLSNPCIHGNCTGGLSGYKCLCDAGWVGINCEVDKNECLSNPCQNGGTCDNLVNGYRCTCKKGFKGYNCQVNIDECASNPCLNQGTCFDDISGYTCHCVLPYTGKNCQTVLAPCSPNPCENAAVCKESPNFESYTCLCAPGWQGQRCTIDIDECISKPCMNHGLCHNTQGSYMCECPPGFSGMDCEEDIDDCLANPCQNGGSCMDGVNTFSCLCLPGFTGDKCQTDMNECLSEPCKNGGTCSDYVNSYTCKCQAGFDGVHCENNINECTESSCFNGGTCVDGINSFSCLCPVGFTGSFCLHEINECSSHPCLNEGTCVDGLGTYRCSCPLGYTGKNCQTLVNLCSRSPCKNKGTCVQKKAESQCLCPSGWAGAYCDVPNVSCDIAASRRGVLVEHLCQHSGVCINAGNTHYCQCPLGYTGSYCEEQLDECASNPCQHGATCSDFIGGYRCECVPGYQGVNCEYEVDECQNQPCQNGGTCIDLVNHFKCSCPPGTRGLLCEENIDDCARGPHCLNGGQCMDRIGGYSCRCLPGFAGERCEGDINECLSNPCSSEGSLDCIQLTNDYLCVCRSAFTGRHCETFVDVCPQMPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCQSSCGQVKCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPRDCESGCASSPCQHGGSCHPQRQPPYYSCQCAPPFSGSRCELYTAPPSTPPATCLSQYCADKARDGVCDEACNSHACQWDGGDCSLTMENPWANCSSPLPCWDYINNQCDELCNTVECLFDNFECQGNSKTCKYDKYCADHFKDNHCDQGCNSEECGWDGLDCAADQPENLAEGTLVIVVLMPPEQLLQDARSFLRALGTLLHTNLRIKRDSQGELMVYPYYGEKSAAMKKQRMTRRSLPGEQEQEVAGSKVFLEIDNRQCVQDSDHCFKNTDAAAALLASHAIQGTLSYPLVSVVSESLTPERTQLLYLLAVAVVIILFIILLGVIMAKRKRKHGSLWLPEGFTLRRDASNHKRREPVGQDAVGLKNLSVQVSEANLI
GTGTSEHWVDDEGPQPKKVKAEDEALLSEEDDPIDRRPWTQQHLEAADIRRTPSLALTPPQAEQEVDVLDVNVRGPDGCTPLMLASLRGGSSDLSDEDEDAEDSSANIITDLVYQGASLQAQTDRTGEMALHLAARYSRADAAKRLLDAGADANAQDNMGRCPLHAAVAADAQGVFQILIRNRVTDLDARMNDGTTPLILAARLAVEGMVAELINCQADVNAVDDHGKSALHWAAAVNNVEATLLLLKNGANRDMQDNKEETPLFLAAREGSYEAAKILLDHFANRDITDHMDRLPRDVARDHMHHDIVRLLDEYNVTPSPPGTVLTSALSPVICGPNRSFLSLKHTPMGKKSRRPSAKSTMPTSLPNLAKEAKDAKGSRRKKSLSEKVQLSESSVTLSPVDSLESPHTYVSDTTSSPMITSPGILQASPNPMLATAAPPAPVHAQHALSFSNLHEMQPLAHGASTVLPSVSQLLSHHHIVSPGSGSAGSLSRLHPVPVPADWMNRMEVNETQYNEMFGMVLAPAEGTHPGIAPQSRPPEGKHITTPREPLPPIVTFQLIPKGSIAQPAGAPQPQSTCPPAVAGPLPTMYQIPEMARLPSVAFPTAMMPQQDGQVAQTILPAYHPFPASVGKYPTPPSQHSYASSNAAERTPSHSGHLQGEHPYLTPSPESPDQWSSSSPHSASDWSDVTTSPTPGGAGGGQRGPGTHMSEPPHNNMQVYA
SEQ ID NO：88
囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)，登录号：NP_000483；基因：CFTR
MQRSPLEKASVVSKLFFSWTRPILRKGYRQRLELSDIYQIPSVDSADNLSEKLEREWDRELASKKNPKLINALRRCFFWRFMFYGIFLYLGEVTKAVQPLLLGRIIASYDPDNKEERSIAIYLGIGLCLLFIVRTLLLHPAIFGLHHIGMQMRIAMFSLIYKKTLKLSSRVLDKISIGQLVSLLSNNLNKFDEGLALAHFVWIAPLQVALLMGLIWELLQASAFCGLGFLIVLALFQAGLGRMMMKYRDQRAGKISERLVITSEMIENIQSVKAYCWEEAMEKMIENLRQTELKLTRKAAYVRYFNSSAFFFSGFFVVFLSVLPYALIKGIILRKIFTTISFCIVLRMAV
TRQFPWAVQTWYDSLGAINKIQDFLQKQEYKTLEYNLTTTEVVMENVTAFWEEGFGELFEKAKQNNNNRKTSNGDDSLFFSNFSLLGTPVLKDINFKIERGQLLAVAGSTGAGKTSLLMVIMGELEPSEGKIKHSGRISFCSQFSWIMPGTIKENIIFGVSYDEYRYRSVIKACQLEEDISKFAEKDNIVLGEGGITLSGGQRARISLARAVYKDADLYLLDSPFGYLDVLTEKEIFESCVCKLMANKTRILVTSKMEHLKKADKILILHEGSSYFYGTFSELQNLQPDFSSKLMGCDSFDQFSAERRNSILTETLHRFSLEGDAPVSWTETKKQSFKQTGEFGEKRKNSILNPINSIRKFSIVQKTPLQMNGIEEDSDEPLERRLSLVPDSEQGEAILPRISVISTGPTLQARRRQSVLNLMTHSVNQGQNIHRKTTASTRKVSLAPQANLTELDIYSRRLSQETGLEISEEINEEDLKECFFDDMESIPAVTTWNTYLRYITVHKSLIFVLIWCLVIFLAEVAASLVVLWLLGNTPLQDKGNSTHSRNNSYAVIITSTSSYYVFYIYVGVADTLLAMGFFGLPLVHTLITVSKILHHKMLHSVLQAPMSTLNTLKAGGILNRFSKDIAILDDLLPLTIFDFIQLLLIVIGAIAVVAVLQPYIFVATVPVIVAFIMLRAYFLQTSQQLKQLESEGRSPIFTHLVTSLKGLWTLRAFGRQPYFETLFHKALNLHTANWFLYLSTLRWFQMRIEMIFVIFFIAVTFISILTTGEGEGRVGIILTLAMNIMSTLQWAVNSSIDVDSLMRSVSRVFKFIDMPTEGKPTKSTKPYKNGQLSKVMIIENSHVKKDDIWPSGGQMTVKDLTAKYTEGGNAILENISFSISPGQRVGLLGRTGSGKSTLLSAFLRLLNTEGEIQIDGVSWDSITLQQWRAFGVIPQKVFIFSGTFRKNLDPYEQWSDQEIWKVADEVGLRSVIEQFPGKLDFVLVDGGCVLSHGHKQLMCLARSVLSKAKILLLDEPSAHLDPVTYQIIRRTLKQAFADCTVILCEHRIEAMLECQQFLVIEENKVRQYDSIQKLLNERSLFRQAISPSDRVKLFPHRNSSKCKSKPQIAALKEETEEEVQDTRL
SEQ ID NO：89
UDP葡糖醛酸基转移酶家族1成员A1(UGT1A1)，登录号：NP_000454；基因：UGT1A1
MAVESQGGRPLVLGLLLCVLGPVVSHAGKILLIPVDGSHWLSMLGAIQQLQQRGHEIVVLAPDASLYIRDGAFYTLKTYPVPFQREDVKESFVSLGHNVFENDSFLQRVIKTYKKIKKDSAMLLSGCSHLLHNKELMASLAESSFDVMLTDPFLPCSPIVAQYLSLPTVFFLHALPCSLEFEATQCPNPFSYVPRPLSSHSDHMTFLQRVKNMLIAFSQNFLCDVVYSPYATLASEFLQREVTVQDLLSSASVWLFRSDFVKDYPRPIMPNMVFVGGINCLHQNPLSQEFEAYINASGEHGIVVFSLGSMVSEIPEKKAMAIADALGKIPQTVLWRYTGTRPSNLANNTILVKWLPQNDLLGHPMTRAFITHAGSHGVYESICNGVPMVMMPLFGDQMDNAKRMETKGAGVTLNVLEMTSEDLENALKAVINDKSYKENIMRLSSLHKDRPVEPLDLAVFWVEFVMRHKGAPHLRPAAHDLTWYQYHSLDVIGFLLAVVLTVAFITFKCCAYGYRKCLGKKGRVKKAHKSKTH
SEQ ID NO：90
UDP葡糖醛酸基转移酶家族2成员B15(UGT2B15)，登录号：NP_001067；基因：UGT2B15
MSLKWTSVFLLIQLSCYFSSGSCGKVLVWPTEYSHWINMKTILEELVQRGHEVTVLTSSASTLVNASKSSAIKLEVYPTSLTKNYLEDSLLKILDRWIYGVSKNTFWSYFSQLQELCWEYYDYSNKLCKDAVLNKKLMMKLQESKFDVILADALNPCGELLAELFNIPFLYSLRFSVGYTFEKNGGGFLFPPSYVPVVMSELSDQMIFMERIKNMIHMLYFDFWFQIYDLKKWDQFYSEVLGRPTTLFETMGKAEMWLIRTYWDFEFPRPFLPNVDFVGGLHCKPAKPLPKEMEEFVQSSGENGIVVFSLGSMISNMSEESANMIASALAQIPQKVLWRFDGKKPNTLGSNTRLYKWLPQNDLLGHPKTKAFITHGGTNGIYEAIYHGIPMVGIPLFADQHDNIAHMKAKGAALSVDIRTMSSRDLLNALKSVINDPVYKENVMKLSRIHHDQPMKPLDRAVFWIEFVMRHKGAKHLRVAAHNLTWIQYHSLDVIAFLLACVATVIFIITKFCLFCFRKLAKKGKKKKRD
SEQ ID NO：91
UDP葡糖醛酸基转移酶家族2成员B7(UGT2B7)，登录号：NP_001065；基因：UGT2B7
MSVKWTSVILLIQLSFCFSSGNCGKVLVWAAEYSHWMNIKTILDELIQRGHEVTVLASSASILFDPNNSSALKIEIYPTSLTKTELENFIMQQIKRWSDLPKDTFWLYFSQVQEIMSIFGDITRKFCKDVVSNKKFMKKVQESRFDVIFADAIFPCSELLAELFNIPFVYSLSFSPGYTFEKHSGGFIFPPSYVPVVMSELTDQMTFMERVKNMIYVLYFDFWFEIFDMKKWDQFYSEVLGRPTTLSETMGKADVWLIRNSWNFQFPYPLLPNVDFVGGLHCKPAKPLPKEMEDFVQSSGENGVVVFSLGSMVSNMTEERANVIASALAQIPQKVLWRFDGNKPDTLGLNTRLYKWIPQNDLLGHPKTRAFITHGGANGIYEAIYHGIPMVGIPLFADQPDNIAHMKARGAAVRVDFNTMSSTDLLNALKRVINDPSYKENVMKLSRIQHDQPVKPLDAVFWIEFVMRHKGAKHLRVAAHDLTWFQYHSLDVIGFLLVCVATVIFIVTKCCLFCFWKFARKAKKGKND
SEQ ID NO：92
钠/胆汁酸协同转运蛋白(NTCP)，登录号：NP_003040；基因：NTCP
MEAHNASAPFNFTLPPNFGKRPTDLALSVILVFMLFFIMLSLGCTMEFSKIKAHLWKPKGLAIALVAQYGIMPLTAFVLGKVFRLKNIEALAILVCGCSPGGNLSNVFSLAMKGDMNLSIVMTTCSTFCALGMMPLLLYIYSRGIYDGDLKDKVPYKGIVISLVLVLIPCTIGIVLKSKRPQYMRYVIKGGMIIILLCSVAVTVLSAINVGKSIMFAMTPLLIATSSLMPFIGFLLGYVLSALFCLNGRCRRTVSMETGCQNVQLCSTILNVAFPPEVIGPLFFFPLLYMIFQLGEGLLLIAIFWCYEKFKTPKDKTKMIYTAATTEETIPGALGNGTYKGEDCSPCTA
SEQ ID NO：93
溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B3(OATP1B3)，登录号：NP_062818；基因：OATP1B3
MDQHQHLNKTAESASSEKKKTRRCNGFKMFLAALSFSYIAKALGGIIMKISITQIERRFDISSSLAGLIDGSFEIGNLLVIVFVSYFGSKLHRPKLIGIGCLLMGTGSILTSLPHFFMGYYRYSKETHINPSENSTSSLSTCLINQTLSFNGTSPEIVEKDCVKESGSHMWIYVFMGNMLRGIGETPIVPLGISYIDDFAKEGHSSLYLGSLNAIGMIGPVIGFALGSLFAKMYVDIGYVDLSTIRITPKDSRWVGAWWLGFLVSGLFSIISSIPFFFLPKNPNKPQKERKISLSLHVLKTNDDRNQTANLTNQGKNVTKNVTGFFQSLKSILTNPLYVIFLLLTLLQVSSFIGSFTYVFKYMEQQYGQSASHANFLLGIITIPTVATGMFLGGFIIKKFKLSLVGIAKFSFLTSMISFLFQLLYFPLICESKSVAGLTLTYDGNNSVASHVDVPLSYCNSECNCDESQWEPVCGNNGITYLSPCLAGCKSSSGIKKHTVFYNCSCVEVTGLQNRNYSAHLGECPRDNTCTRKFFIYVAIQVINSLFSATGGTTFILLTVKIVQPELKALAMGFQSMVIRTLGGILAPIYFGALIDKTCMKWSTNSCGAQGACRIYNSVFFGRVYLGLSIALRFPALVLYIVFIFAMKKKFQGKDTKASDNERKVMDEANLEFLNNGEHFVPSAGTDSKTCNLDMQDNAAAN

Claims (197)

1.一种肝类器官，其包含至少两种选自肝细胞、胆管细胞、肝特异性内皮细胞(LSEC)、星状细胞、肝成肌纤维细胞和成肝细胞的细胞类型。
2.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述肝细胞
a)表达白蛋白(ALB)；
b)表达选自以下的至少一种肝细胞标志物：HNF4a(NCBI:3172)、FAH(NCBI:2184)、TAT(NCBI:6898)、GCK(NCBI:2645)、TTR(NCBI:7276)、MET(NCBI:4233)、GLUl/MGAM(NCBI:8972)、FAHD2A(NCBI:51011)、HNF1B(NCBI:6928)、HNF1A(NCBI:6927)、CYP3A4(NCBI:1576)、CYP2C9(NCBI:1559)、CYP2C19(NCBI:1557)、CYP1A2(NCBI:1544)、CYP2E1(NCBI:1571)、CYP2D6(NCBI:1565)、CYP3A7(NCBI:1551)、CYP1A1(NCBI:1543)、CYP3A5(NCBI:1577)、CYP27A1(NCBI:1593)、MRP2(NCBI:1244)、NTCP(NCBI:6554)、OATP1B3(NCBI:28234)、UGT2B7(NCBI:7364)、UGT2B15(NCBI:7366)、UGT1A1(NCBI:54658)、CEBP(NCBI:1050)、KRT8(NCBI:3856)、NOTCH2(NCBI:4853)和CYP2B6(NCBI:1555)543)、CYP3A5(NCBI:1577)、CYP27A1(NCBI:1593)、MRP2(NCBI:1244)、NTCP(NCBI:6554)、OATP1B3(NCBI:28234)、UGT2B7(NCBI:7364)、UGT2B15(NCBI:7366)、UGT1A1(NCBI:54658)、CEBP(NCBI:1050)、KRT8(NCBI:3856)、NOTCH2(NCBI:4853)和CYP2B6(NCBI:1555)；和
c)不表达胆管细胞标志物细胞角蛋白7(CK7)。
3.根据权利要求2的所述肝类器官，其中所述肝细胞表达以下肝细胞标志物HNF4a(NCBI:3172)、FAH(NCBI:2184)、TAT(NCBI:6898)、GCK(NCBI:2645)、TTR(NCBI:7276)、MET(NCBI:4233)、GLUl/MGAM(NCBI:8972)、FAHD2A(NCBI:51011)、HNF1B(NCBI:6928)、HNF1A(NCBI:6927)、CYP3A4(NCBI:1576)、CYP2C9(NCBI:1559)、CYP2C19(NCBI:1557)、CYP1A2(NCBI:1544)、CYP2E1(NCBI:1571)、CYP2D6(NCBI:1565)、CYP3A7(NCBI:1551)、CYP1A1(NCBI:1543)、CYP3A5(NCBI:1577)、CYP27A1(NCBI:1593)、MRP2(NCBI:1244)、NTCP(NCBI:6554)、OATP1B3(NCBI:28234)、UGT2B7(NCBI:7364)、UGT2B15(NCBI:7366)、UGT1A1(NCBI:54658)、CEBP(NCBI:1050)、KRT8(NCBI:3856)、NOTCH2(NCBI:4853)和CYP2B6(NCBI:1555)。
4.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述胆管细胞表达CK7但不表达白蛋白(ALB)。
5.根据权利要求4所述的肝类器官，其中所述胆管细胞还表达选自CFTR(NCBI：1080)、CK19(NCBI：3880)、HNF1B(NCBI：6928)或SOX9(NCBI：6662)的标志物。
6.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述成肝细胞表达选自以下的至少一种标志物：SOX9(NCBI:6662)、CK19(NCBI:3880)、CK18(NCBI:3875)、HNF4a(NCBI:3172)、PROX1(NCBI:5629)、ONECUT1(NCBI:3175)、AFP(NCBI:174)和ALB(NCBI:213)。
7.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述肝脏特异性内皮细胞(LSEC)表达选自CD45、CD80、CD86、CD11c、VAP1、STAB1和CD31的至少一种标志物，其中CD31表达主要在细胞质中而不在细胞表面上。
8.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述星状细胞表达选自GFAP、VIM、LHX2、LRAT、PDGFRb、HAND2、ICAM-1、VCAM-1和N-CAM-1的至少一种标志物。
9.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述肝成肌纤维细胞表达选自COL1A1和α-SMA的标志物。
10.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述实质细胞类型源自相同的干细胞。
11.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述细胞在不使用细胞外基质的情况下悬浮培养。
12.根据权利要求1所述的肝类器官，其中所述类器官能够执行肝功能并且显示在肝中观察到的空间组织结构。
13.根据权利要求所述12的肝类器官，其中所述肝功能选自：肝特异性代谢活性、白蛋白分泌、糖原贮存、低密度脂蛋白摄取、胆汁酸产生、药物代谢和细胞色素酶活性。
14.根据权利要求12所述的肝类器官，其中所述空间组织结构包含肝细胞的核心和由所述肝细胞的核心周围的胆管细胞形成的外周胆管样结构。
15.根据权利要求12所述的肝类器官，其中所述空间组织结构包括内源性细胞外基质粘附分子。
16.根据权利要求12所述的肝类器官，其中所述空间组织结构包括所述类器官内部和外部两者的肝实质细胞。
17.根据权利要求14所述的肝类器官，其中所述肝细胞通过胆小管网络与胆管细胞胆管样结构连接。
18.一种用于产生肝类器官的培养基，其包含：
a)STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
b)作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
c)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
e)类固醇；
f)至少一种用于诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
g)调节胆汁酸合成和/或激活FGF和MAPK途径的分子。
19.根据权利要求18所述的培养基，其还包含WNT信号传导激活剂。
20.一种用于产生肝类器官的培养基，其包含：
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
属于白细胞介素6组细胞因子的多效性细胞因子；
γ-分泌酶抑制剂；和
类固醇。
21.一种衍生和维持肝(肝脏)类器官的方法，包括：
a)在第一细胞培养基中培养内胚层干细胞以获得早期肝祖细胞；
b)将在a)中获得的所述细胞转移并在第二细胞培养基中的悬浮培养系统中培养以获得晚期肝祖细胞；和
c)在第三细胞培养基中的悬浮培养系统中培养b)中获得的晚期肝祖细胞以获得肝(肝脏)类器官。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述内胚层干细胞是早期内胚层祖细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、MESP或成体肝干细胞。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一培养基包含：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
WNT信号传导激活剂；
类固醇；
至少一种诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
激活FGF和MAPK途径的分子。
24.根据权利要求21所述的方法，其中a)中的培养与细胞载体或细胞外基质一起进行。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞外基质促进细胞分化并且由选自基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素、其他合成聚合物或聚合物支架和固体支持材料的材料组成。
26.根据权利要求21-25所述的方法，其中a)中的培养持续1至10天或1至8天或1至6天。
27.根据权利要求21所述的方法，其中b)中的培养持续6至12天或4至10天或6至8天。
28.根据权利要求21所述的方法，其中c)中的培养持续18至26天或20至24天或19至22天。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂是浓度为约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/m，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的肝细胞生长因子(HGF)。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的所述分子是选自以下的化合物：烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米，浓度为约0.1mM至1.0M，或约2mM至约0.8M，或约4mM至0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM。
31.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中的TGF-β抑制剂的特征在于以下任一种：
a)抑制TGF-βI型受体ALK5激酶；
b)抑制I型激活素/节结受体ALK4；
c)抑制I型节结受体ALK7；
d)抑制SMAD2/3磷酸化；和/或
e)抑制激活素/TGFβ/SMAD信号传导途径。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中的所述TGF-β抑制剂选自：
A83-01 3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺，
A 77-01 4-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉，
SD-208 2-(5-氯-2-氟苯基)-N-吡啶-4-基喋啶-4-胺，
LY2157299 4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-甲酰胺，
SB 431542 4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺，
GW788388N-(环氧乙烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺，
SB505124 2-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-叔丁基-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶，
SB525334 6-[2-叔丁基-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉，
IN 1130 2-[3-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-4-甲基-1,3-噻唑-3-鎓-5-基]乙醇，
ITD 1(6,6-二甲基-5,7-二氢咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-4-鎓-3-基)甲基N,N'-二环己基硫代氨基甲酰亚胺酸酯，
LY2109761 4-[2-[4-(2-吡啶-2-基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-7-基]氧乙基]吗啉，
K02288 3-[6-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基]苯酚，
TGF-βRI激酶抑制剂[3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑]，
以及它们的衍生物。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中的所述TGF-β抑制剂浓度为约0.5nM至20μM，或100nM至10μM，或250nM至5μM，或400nM至2.5μM，或0.5nM至1μM，或0.5nM至0.5μM，或者约1.5nM至0.4μM，或者约10nM至0.3μM，或者约30nM至0.2μM，或者约40nM至0.1μM，或者约50nM至85nM，或者约1、5、15、25、30、35、45、50、65、75、130、150、170、250、350或450nM，或约0.5、0.7、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、9、10、12、14、16、18或20μM。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述SMAD2/3抑制剂选自Smad2/3磷酸化抑制剂和靶向SMAD2和SMAD3转录物的mRNA的siRNA。
35.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中的所述WNT信号传导激活剂是糖原合酶激酶3(GSK3)抑制剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述第一培养基中的所述GSK3抑制剂选自：
CHIR-99021 6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基]乙氨基]吡啶-3-甲腈，
BIO 6-溴靛玉红-3'-肟，
SB 216763 3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
CHIR-98014 6-N-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-咪唑-1-基嘧啶-2-基]氨基]乙基]-3-硝基吡啶-2,6-二胺，
TWS119 3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚，
IM-12 3-[2-(4-氟苯基)乙氨基]-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
1-氮杂坎帕罗酮9-溴-7,12-二氢吡啶并[3',2':2,3]吖庚因并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮，
AR-A014418 1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲，
SB415286 3-(3-氯-4-羟基苯胺基)-4-(2-硝基苯基)吡咯-2,5-二酮，
AZD1080(3E)-3-[5-(吗啉-4-基甲基)-1H-吡啶-2-亚基]-2-氧代-1H-吲哚-5-甲腈，
AZD2858 3-氨基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基苯基]-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺，
靛玉红(3E)-3-(3-氧代-1H-吲哚-2-亚基)-1H-吲哚-2-酮，
以及它们的衍生物。
37.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中的所述WNT信号传导激活剂浓度为约0.1μM至10μM，或约0.5μM至8μM，或约1μM至7μM，或约2μM至6μM，或约3μM至5μM，或约0.2、0.3、0.4、3、4、4.5、5、6、7.5、8.5、9、9.5或10μM。
38.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一种培养基中的所述类固醇能够抑制NF-κB途径、激活PI3K/AKT/mTOR途径、抑制TGF-β信号传导途径和抑制IGF信号传导途径。
39.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中的所述类固醇是皮质类固醇。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述皮质类固醇是糖皮质激素或抗炎糖皮质激素。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述糖皮质激素选自：
地塞米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮，
皮质醇(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，
可的松(8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-十氢环戊二烯并[a]菲-3,11-二酮，
泼尼松17,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮，
泼尼松龙(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
甲基泼尼松龙(1S,2R,8S,10S,11S,14R,15S,17S)-14,17-二羟基-14-(2-羟基乙酰基)-2,8,15-三甲基四环[8.7.0.02,7.011,15]十七碳-3,6-二烯-5-酮，
倍他米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-3-酮，
曲安西龙(11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
倍氯米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氯-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-氧代-17-[2-(丙酰基氧)乙酰基]-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-17-基丙酸酯，
醋酸氟氢可的松9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢环戊二烯并[a]菲-3酮，
醛固酮11β,21-二羟基-3,20-二氧代孕甾-4-烯-18-醛，
以及它们的衍生物。
42.根据权利要求23所述的方法，其中所述类固醇浓度为约0.5μM至200μM，或约1.5μM至150μM，或约5μM至100μM，或约10μM至90μM，或约20μM至80μM，或约30μM至70μM，或约40μM至60μM，或约2、8、15、25、30、35、45、65、75、110、130、140、160、170或190μM。
43.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的所述至少一种分子选自BMP4、BMP2、BMP3、BMP5、BMP6和BMP7。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一培养基中诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的所述分子是BMP4和BMP7。
45.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的所述至少一种分子浓度为约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
46.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中激活FGF和MAPK途径的所述分子选自FGF7、FGF1、FGF3、FGF10和FGF22。
47.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一培养基中激活FGF和MAPK途径的所述分子浓度为约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
48.根据权利要求23至47中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂，其中所述激活剂是选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、上皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)，并且所述化合物的浓度为约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml。
49.根据权利要求23至48中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含cAMP依赖性途径和/或蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；其中所述激活剂是选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素；并且所述化合物的浓度为约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
50.根据权利要求23至49中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；其中所述抑制剂是选自以下的化合物：丙戊酸(VPA)、丁酸钠、vorinotstat、帕比司他、曲古抑菌素A、mocetinostat、BG45(N-(2-氨基苯基)-2-吡嗪甲酰胺)、4SC-202((E)-N-(2-氨基苯基)-3-(1-((4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基)磺酰基)-1H-吡咯-3-基)丙烯酰胺)、贝里司他、Scriptaid(6-(1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)-N-羟基己酰胺)、M344(4-(二甲基氨基)-N-[7-(羟基氨基)-7-氧代庚基]苯甲酰胺)、达西司特((E)-N-羟基-3-[4-[[2-羟乙基-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)、abexinostat、CUDC-101(7-(4-(3-乙炔基苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)-N-羟基庚酰胺、CUDC-907(N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺)和AR-42((S)-N-羟基-4-(3-甲基-2-苯基丁酰胺)苯甲酰胺)；并且所述化合物的浓度为约0.1μM至5mM，或约0.3μM至4mM，或约0.6μM至3mM，或约0.8μM至2mM，或约1mM至1.5mM，或约0.2、0.4、0.7、0.9、5、10、20、50、70或90μM或约1.5、2.5、3.5mM。
51.根据权利要求23至50中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含Notch受体激活剂；其中所述激活剂是选自以下的化合物：Jagged1蛋白(智人，也称为AGS；AHD；AWS；HJ1；CD339；JAGL1；JAG1)、Jagged2(NCBI 3714)、δ样1(NCBI 28514)、δ样3(NCBI 10683)和δ样4(NCBI 54567)；并且所述化合物的浓度为约10nM至100μM，或约50nM至80μM，或约100nM至60μM，或约500nM至40μM，或约800nM至20μM，或约900nM至10μM，或约20、40、60或80nM，或约1、1.5、15、30、50、60、90或100μM。
52.根据权利要求21至51中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基包含：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
类固醇；
诱导SMAD1和SMAD5磷酸化并激活MAPK信号传导的分子；和
调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的分子。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂如权利要求29中所定义。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子如权利要求30中所定义。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂如权利要求31至33中任一项所定义。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述类固醇如权利要求39至41中任一项所定义。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子如权利要求43或44中所定义。
58.根据权利要求57所述的方法，所述诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的分子的浓度为约1ng/ml至1μg/ml，或约5ng/ml至0.8μg/ml，或约10ng/ml至0.6μg/ml，或约50ng/ml至0.5μg/ml，或约150ng/ml至1μg/ml，或约5、20、50、100、200、250、300、400、500ng/ml，或约1、0.8、0.7或0.9μg/ml。
59.根据权利要求52所述的方法，其中所述调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的化合物选自FGF19、FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20和FGF23。
60.根据权利要求52至59中任一项所述的方法，其中所述调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的分子的浓度为约1ng/ml至1μg/ml，或约5ng/ml至0.8μg/ml，或约10ng/ml至0.6μg/ml，或约50ng/ml至0.5μg/ml，或约150ng/ml至1μg/ml，或约5、20、50、100、200、250、300、400、500ng/ml，或约1.0、0.8、0.7或0.9μg/ml。
61.根据权利要求52至60中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基还包含促进晚期肝祖细胞存活的组分，其中所述组分选自以下组分中的一种或两种或三种或全部：
权利要求48中所定义的AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；
权利要求49中所定义的cAMP依赖性途径的激活剂或蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；
权利要求51中所定义的Notch受体激活剂；和
权利要求50中所定义的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
62.根据权利要求52至61中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基还包含用于诱导晚期肝祖细胞形成的组分。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述组分是WNT信号传导激活剂，其中所述WNT信号传导激活剂如权利要求35至37中任一项所定义。
64.根据权利要求52至62中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基还包含用于诱导晚期肝祖细胞分化的组分，其中所述组分为以下组分中的任何一种或两种：
γ-分泌酶抑制剂；和
YAP抑制剂。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂选自以下：化合物E(C-E)(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-3H-1,4-苯并二吖庚因-3-基]丙酰胺，二苯并吖庚因(DBZ)：(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(7S)-5-甲基-6-氧代-7H-苯并[d][1]苯并吖庚因-7-基]丙酰胺，DAPT：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-苯基乙酸叔丁酯，Begacestat：5-氯-N-[(2S)-4,4,4-三氟-1-羟基-3-(三氟甲基)丁烷-2-基]噻吩-2-磺酰胺，和Flurizan：(2R)-2-(3-氟-4-苯基苯基)丙酸；其中所述γ-分泌酶抑制剂的浓度为约10nM至5μM，或约100nM至4μM，或约200nM至3.5μM，或约300nM至3μM，或约400nM至2.5μM，或约450nM至2μM，或约500nM至1.5μM，或约50、90、150、250、350、450、480、500、650或700nM。
66.根据权利要求64至65中任一项所述的方法，其中所述YAP抑制剂选自：
维替泊芬3-[(23S,24R)-14-乙烯基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-22,23-双(甲氧基羰基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮杂己环[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二烷-9-基]丙酸，
LPA[(2R)-2-羟基-3-膦酰氧基丙基](Z)-十八碳-9-烯酸酯，
S1P[(E,2S,3R)-2-氨基-3-羟基十八-4-烯基]二氢磷酸酯，
凝血酶(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-氨基-2-[[2-[[(2S)-6-氨基-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-氨基-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-氨基-3-羟基丁酰基]氨基]-3-(1H-吲哚-3-基)丙酰基]氨基]-3-羟基丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-4-氧代丁酰基]氨基]-3-甲基丁酰基]氨基]乙酰基]氨基]己酰基]氨基]乙酰基]氨基]-5-氧代戊酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]-3-羟基丙酸，
肾上腺素4-[(1R)-1-羟基-2-(甲氨基)乙基]苯-1,2-二醇，
胰高血糖素(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-5-氨基-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-氨基-3-(1H-咪唑-5-基)丙酰基]氨基]-3-羟基丙酰基]氨基]-5-氧代戊酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-羟基丁酰基]氨基]-3-苯基丙酸，
Dihydrexidine(6aR,12bS)-5,6,6a,7,8,12b-六氢苯并[α]菲啶-10,11-二醇，
多巴酚丁胺4-[2-[4-(4-羟基苯基)丁-2-基氨基]乙基]苯-1,2-二醇，
达沙替尼N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基]氨基]-1,3-噻唑-5-甲酰胺，
拉春库林A(4R)-4-[(1R,4S,5Z,7E,11Z,15R,17R)-17-羟基-4,11-二甲基-13-氧代-14,18-二氧杂双环[13.3.1]十九碳烯-5,7,11-三烯-17-基]-1,3-噻唑烷-2-酮，
拉春库林B(4R)-4-[(1R,4S,5Z,9Z,13R,15R)-15-羟基-4,9-二甲基-11-氧代-12,16-二氧杂双环[11.3.1]十七-5,9-二烯-15-基]-1,3-噻唑烷-2-酮，
细胞松弛素D(3S,3aR,4S,6S,6aR,7E,10S,12R,13E,15R,15aR)-3-苄基-6,12-二羟基-4,10,12-三甲基-5-亚甲基-1,11-二氧代-2,3,3a,4,5,6,6a,9,10,11,12,15-十二氢-1H-环十一碳烯[d]异吲哚-15-基乙酸酯，
Blebbistatin 3α-羟基-6-甲基-1-苯基-2,3-二氢吡咯并[2,3-b]喹啉-4-酮，
ML7 1-(5-碘萘-1-基)磺酰基-1,4-二氮杂环庚烷，
肉毒杆菌C3 4-N-(3-氯-7-甲氧基吖啶-1-基)-1-N,1-N-二乙基戊烷-1,4-二胺；二盐酸盐，
Y27632 4-[(1R)-1-氨基乙基]-N-吡啶-4-基环己烷-1-甲酰胺，
以及它们的衍生物。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述YAP抑制剂是维替泊芬3-[(23S,24R)-14-乙烯基-5-(3-甲氧基-3-氧代丙基)-22,23-双(甲氧基羰基)-4,10,15,24-四甲基-25,26,27,28-四氮杂己环[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]二十八-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-十二烷-9-基]丙酸。
68.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述YAP抑制剂的浓度为约1nM至10μM，或约50nM至8μM，或约200nM至6μM，或约500nM至4μM，或约700nM至2μM，或约1μM至2μM，或约1、10、30、70、130、180、250、350、400、600、800或900nM，或约9、7、5、3、2.5、1.5或1μM。
69.根据权利要求21至68中任一项所述的方法，其中所述第三细胞培养基包含：
TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
属于白细胞介素6组细胞因子的多效性细胞因子；
γ-分泌酶抑制剂；和
类固醇。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述第三细胞培养基还包含促进肝类器官成熟的至少一种或两种或三种或四种或五种或六种组分和/或促进肝类器官存活的至少一种或两种或三种组分。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述促进肝类器官成熟的组分选自：
诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的化合物；
充当促炎细胞因子和抗炎肌动蛋白两者的白细胞介素；
充当调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的激素的化合物；
cAMP依赖性途径的激活剂；
YAP抑制剂；和
具有胆汁酸效力的化合物。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述促进所述肝类器官存活的组分选自：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
糖胺聚糖；和
AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂。
73.根据权利要求72所述的方法，其中STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂如权利要求29中所定义。
74.根据权利要求69所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂如权利要求31至33中任一项所定义。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂如权利要求65中所定义。
76.根据权利要求69所述的方法，其中所述类器官如权利要求38至41中任一项所定义。
77.根据权利要求69所述的方法，其中所述属于细胞因子信号传导的白细胞介素6组的多效性细胞因子选自制瘤素M(OSM)或白血病抑制因子(LIF；NCBI：3976)或心脏营养素-1/CT-1(NCBI：1489)或睫状神经营养因子受体(CNTF；NCBI：1271)、IL-11或IL-31，并且其中所述多效细胞因子的浓度为约0.1ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至约0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
78.根据权利要求71所述的方法，其中所述YAP抑制剂如权利要求66至68中任一项所定义。
79.根据权利要求71所述的方法，其中所述具有胆汁酸效力的化合物具有以下活性中的一种或多种或全部：激活核法尼酯衍生物X受体、增加cAMP和激活PKC信号传导途径。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述具有胆汁酸效力的化合物选自：
牛磺胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙磺酸，
胆酸(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
鹅去氧胆酸(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
甘胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙酸，
脱氧胆酸(4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
甘氨鹅去氧胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙酸，
牛磺鹅去氧胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙磺酸，
石胆酸(4R)-4-[(3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3-羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酸，
以及它们的衍生物。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述具有胆汁酸效力的化合物是牛磺胆酸2-[[(4R)-4-[(3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯并[a]菲-17-基]戊酰基]氨基]乙磺酸。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的方法，其中所述具有胆汁酸效力的化合物的浓度为约1μM至1mM，或约10μM至0.8mM，或约50μM至0.6mM，或约100μM至0.4mM，或约150μM至0.2mM，或约5、15、20、40、60、80、90、100、150、250、350、450、550、650、750或850μM。
83.根据权利要求21至82中任一项所述的方法，其中所述肝(肝脏)类器官包含选自肝细胞、胆管细胞、肝特异性内皮细胞(LSEC)、星状细胞、肝成肌纤维细胞和成肝细胞的多于一种的肝特异性细胞类型。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述肝细胞
a)表达白蛋白(ALB)；
b)表达选自HNF4a(NCBI：3172)，FAH(NCBI：2184)，TAT(NCBI：6898)，GCK(NCBI：2645)，TTR(NCBI：7276)，MET(NCBI：4233)，GLU1/MGAM(NCBI：8972)，FAHD2A(NCBI：51011)，HNF1B(NCBI：6928)，HNF1A(NCBI：6927)，CYP3A4(NCBI：1576)，CYP2C9(NCBI：1559)，CYP2C19(NCBI：1557)，CYP1A2(NCBI：1544)，CYP2E1(NCBI：1571)，CYP2D6(NCBI：1565)，CYP3A7(NCBI：1551)，CYP1A1(NCBI：1543)，CYP3A5(NCBI：1577)，CYP27A1(NCBI：1593)，MRP2(NCBI：1244)，NTCP(NCBI：6554)，OATP1B3(NCBI：28234)，UGT2B7(NCBI：7364)，UGT2B15(NCBI：7366)，UGT1A1(NCBI：54658)，CEBP(NCBI：1050)，KRT8(NCBI：3856)，NOTCH2(NCBI：4853)和CYP2B6(NCBI：1555)的至少一种肝细胞标志物；和
c)不表达胆管细胞标志物细胞角蛋白7(CK7)。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述胆管细胞表达CK7但不表达白蛋白(ALB)，和任选地通过它们表达其他胆管细胞标志物例如CK19(NCBI：3880)、HNF1B(NCBI：6928)和SOX9(NCBI：6662)。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述胆管细胞还表达选自CFTR(NCBI：1080)、CK19(NCBI：3880)、HNF1B(NCBI：6928)或SOX9(NCBI：6662)的标志物。
87.根据权利要求83所述的方法，其中所述成肝细胞表达选自SOX9(NCBI：6662)、CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、PROX1(NCBI：5629)、ONECUT1(NCBI：3175)、AFP(NCBI：174)和ALB(NCBI：213)的标志物。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述肝特异性内皮细胞(LSEC)表达选自CD45、CD80、CD86、CD11c、VAP1、STAB1和CD31中的至少一种标志物，其中所述CD31主要在细胞质中而不是细胞表面上表达。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述星状细胞表达选自GFAP、VIM、LHX2、LRAT、PDGFRb、HAND2、ICAM-1、VCAM-1和N-CAM-1的标志物。
90.根据权利要求85所述的方法，其中所述肝成肌纤维细胞表达选自COL1A1和α-SMA的标志物。
91.根据权利要求21至90中任一项所述的方法，其中所述肝(肝脏)类器官能够执行肝脏功能并且显示在肝脏中观察到的结构组成。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述肝功能选自白蛋白分泌、细胞色素酶活性、糖原贮存、低密度脂蛋白摄取、胆汁酸产生和药物代谢。
93.根据权利要求91所述的方法，其中在肝(肝脏)球状体类器官细胞中发现的在肝脏中观察到的结构组成的特征在于组成肝脏的不同肝细胞类型的非随机分布。
94.根据权利要求71所述的方法，其中所述充当促炎细胞因子和抗炎肌动蛋白两者的白细胞介素激活JAK-STAT，MAPK和AKT/PI3K信号传导，并且其中所述白细胞介素的浓度为约0.1ng/ml至1μg/ml，或约5ng/ml至0.5μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述白细胞介素是IL-6。
96.根据权利要求71所述的培养基，其中所述诱导SMAD1、SMAD5和SMAD8磷酸化并激活MAPK信号传导的化合物如权利要求43至45中任一项所定义。
97.根据权利要求71所述的方法，其中所述调节胆汁酸合成并激活FGF和MAPK途径的化合物如权利要求59-60中任一项所定义。
98.根据权利要求71所述的方法，其中所述cAMP依赖性途径激活剂是选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素；其中所述化合物的浓度为为约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
99.根据权利要求72所述的方法，其中所述AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂是选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、上皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)，并且所述化合物的浓度为约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml。
100.根据权利要求72所述的方法，其中所述糖胺聚糖是肝素，并且所述肝素的浓度为约100ng/ml至1mg/ml，或约100ng/ml至1mg/ml，或约500ng/ml至0.5mg/ml，或约1μg/ml至0.1mg/ml，或约5μg/ml至500μg/ml，或约300、500、700或800ng/ml，或约1、2、3、10、20、40、50、60、100、500、700μg/ml。
101.根据权利要求21至100中任一项所述的方法，其中所述早期肝祖细胞表达任何一种或多种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种或1或2或3或4或5或6或7种或全部以下标志物：SOX9(NCBI：6662)、CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、PROX1(NCBI：5629)、ONECUT1(NCBI：3175)、AFP(NCBI：174)、TBX3(NCBI：6926)。
102.根据权利要求21至101中任一项所述的方法，其中所述晚期肝祖细胞表达任何一种或多种，或至少两种，或至少三种，或至少四种，或至少五种，或至少六种，或1或2或3或4或5或6或7种或全部以下标志物：CK19(NCBI：3880)、CK18(NCBI：3875)、HNF4a(NCBI：3172)、PROX1(NCBI：5629)、ONECUT1(NCBI：3175)、AFP(NCBI：174)、TBX3(NCBI：6926)、ALB(NCBI：213)。
103.通过权利要求21至102中任一项所述的方法获得的肝(肝脏)类器官。
104.一种多能内胚层球状体祖细胞(MESP)，其表达选自以下的1、2、3、4、5、6、7或更多种或全部标志物：HNF4A(NCBI基因：3172)、PDX1(NCBI基因：3651)、CDX2(NCBI基因：1045)、SOX9(NCBI基因：6662)、KRT19(NCBI基因3880)、AFP(NCBI基因174)、ONECUT2(NCBI基因9480)、LGR5(NCBI基因8549)、EPHB2(NCBI基因：2048)、LGR4(NCBI基因：55366)、NR5A2(NCBI基因：2494)、CDH1(NCBI基因：999)、KRT7(NCBI基因：3855)、ZNF503(NCBI基因：84858)、MSX2(NCBI基因：4488)、TRPS1(NCBI基因7227)、ASCL2(NCBI基因430)、IRF8(NCBI基因3394)、HNF4G(NCBI基因3174)、ID2(NCBI基因3398)、CD44(NCBI基因960)、EPCAM(NCBI基因：4072)、MET(NCBI基因：4233)、IHH(NCBI基因：3549)和CLDN3(NCBI基因：1365)。
105.根据权利要求104所述的MESP细胞，其中所述细胞表达标志物HNF4A、PDX1和CDX2。
106.根据权利要求1所述的MESP细胞，其中所述细胞不表达选自以下的标志物：SOX2(NCBI基因：6657)、CER1(NCBI基因：9350)、GATA4(NCBI基因：2626)、SOX17(NCBI基因：64321)、FOXA2(NCBI基因：3170)和CXCR4(NCBI基因：7852)。
107.根据权利要求104所述的MESP细胞，其中所述MESP的核型在培养中至少10代传代是正常的。
108.根据权利要求104所述的MESP细胞，其中所述细胞是极化的。
109.根据权利要求104-108所述的MESP细胞，其中所述细胞经遗传修饰以减少或消除基因产物的表达。
110.根据权利要求109所述的MESP细胞，其中所述基因产物是低密度脂蛋白受体(LDLR)。
111.一种用于衍生和维持内胚层球状体祖细胞的培养基，其包含：
a)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；和
b)WNT信号传导激活剂。
112.根据权利要求111所述的培养基，其中所述培养基还包含c)类固醇。
113.根据权利要求112所述的培养基，其中所述类固醇抑制NF-κB途径、激活PI3K/AKT/mTOR途径、抑制TGF-β信号传导途径和抑制IGF信号传导途径。
114.根据权利要求112至113中任一项所述的培养基，其中所述类固醇是皮质类固醇。
115.根据权利要求114所述的培养基，其中所述皮质类固醇是糖皮质激素或抗炎糖皮质激素。
116.根据权利要求115所述的培养基，其中所述糖皮质激素选自：
地塞米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[a]菲-3-酮，
皮质醇(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，
可的松(8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,12,14,15,16-十氢环戊二烯并[a]菲-3,11-二酮，
泼尼松17,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,11,20-三酮，
泼尼松龙(11β)-11,17,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
甲基泼尼松龙(1S,2R,8S,10S,11S,14R,15S,17S)-14,17-二羟基-14-(2-羟基乙酰基)-2,8,15-三甲基四环[8.7.0.02,7.011,15]十七碳-3,6-二烯-5-酮，
倍他米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-3-酮，
曲安西龙(11β,16α)-9-氟-11,16,17,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，
倍氯米松(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氯-11-羟基-10,13,16-三甲基-3-氧代-17-[2-(丙酰基氧)乙酰基]-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十二氢-3H-环戊二烯并[α]菲-17-基丙酸酯，
醋酸氟氢可的松9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-1,2,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢环戊二烯并[a]菲-3酮，
醛固酮11β,21-二羟基-3,20-二氧代孕甾-4-烯-18-醛，
以及它们的衍生物。
117.根据权利要求115所述的培养基，其中所述糖皮质激素是地塞米松。
118.根据权利要求112至117中任一项所述的培养基，其中所述类固醇的浓度为约0.5μM至200μM，或约1.5μM至150μM，或约5μM至100μM，或约10μM至90μM，或约20μM至80μM，或约30μM至70μM，或约40μM至60μM，或约2、8、15、25、30、35、45、65、75、110、130、140、160、170或190μM。
119.根据权利要求111至118中任一项所述的培养基，其中所述TGF-β抑制剂的特征在于以下任一项：
a)抑制TGF-βI型受体ALK5激酶；
b)抑制I型激活素/节结受体ALK4；
c)抑制I型节结受体ALK7；
d)抑制SMAD2/3磷酸化；和/或
e)抑制激活素/TGFβ/SMAD信号传导途径。
120.根据权利要求111至119中任一项所述的培养基，其中所述TGF-β抑制剂选自：
A83-01 3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺，
A 77-01 4-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)喹啉，
SD-208 2-(5-氯-2-氟苯基)-N-吡啶-4-基喋啶-4-胺，
LY2157299 4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-甲酰胺，
SB 431542 4-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺，
GW788388N-(环氧乙烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺，
SB505124 2-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-2-叔丁基-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶，
SB525334 6-[2-叔丁基-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉，
IN 1130 2-[3-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基]-4-甲基-1,3-噻唑-3-鎓-5-基]乙醇，
ITD 1(6,6-二甲基-5,7-二氢咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-4-鎓-3-基)甲基N,N'-二环己基硫代氨基甲酰亚胺酸酯，
LY2109761 4-[2-[4-(2-吡啶-2-基-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基)喹啉-7-基]氧乙基]吗啉，
K02288 3-[6-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基]苯酚，
TGF-βRI激酶抑制剂[3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑]，
以及它们的衍生物。
121.根据权利要求111至120中任一项所述的培养基，其中所述SMAD2/3抑制剂选自Smad2/3磷酸化抑制剂和靶向SMAD2和SMAD3转录物的mRNA的siRNA。
122.根据权利要求111至121中任一项所述的培养基，其中所述TGF-β抑制剂的浓度为约0.5nM至20μM，或100nM至10μM，或250nM至5μM，或400nM至2.5μM，或0.5nM至1μM，或0.5nM至0.5μM，或者约1.5nM至0.4μM，或者约10nM至0.3μM，或者约30nM至0.2μM，或者约40nM至0.1μM，或者约50nM至85nM，或者约1、5、15、25、30、35、45、50、65、75、130、150、170、250、350或450nM，或约0.5、0.7、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、9、10、12、14、16、18或20μM。
123.根据权利要求111至122中任一项所述的培养基，其中所述WNT信号传导激活剂是GSK3抑制剂。
124.根据权利要求123所述的培养基，其中所述GSK3抑制剂选自：
CHIR-99021 6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基]乙氨基]吡啶-3-甲腈，
BIO 6-溴靛玉红-3'-肟，
SB 216763 3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
CHIR-98014 6-N-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-咪唑-1-基嘧啶-2-基]氨基]乙基]-3-硝基吡啶-2,6-二胺，
TWS119 3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚，
IM-12 3-[2-(4-氟苯基)乙氨基]-1-甲基-4-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)吡咯-2,5-二酮，
1-氮杂坎帕罗酮9-溴-7,12-二氢吡啶并[3',2':2,3]吖庚因并[4,5-b]吲哚-6(5H)-酮，
AR-A014418 1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲，
SB415286 3-(3-氯-4-羟基苯胺基)-4-(2-硝基苯基)吡咯-2,5-二酮，
AZD1080(3E)-3-[5-(吗啉-4-基甲基)-1H-吡啶-2-亚基]-2-氧代-1H-吲哚-5-甲腈，
AZD2858 3-氨基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基苯基]-N-吡啶-3-基吡嗪-2-甲酰胺，
靛玉红(3E)-3-(3-氧代-1H-吲哚-2-亚基)-1H-吲哚-2-酮，
以及它们的衍生物。
125.根据权利要求111至124中任一项所述的培养基，其中所述WNT信号传导激活剂的浓度为约0.1μM至10μM，或约0.5μM至8μM，或约1μM至7μM，或约2μM至6μM，或约3μM至5μM，或约0.2、0.3、0.4、3、4、4.5、5、6、7.5、8.5、9、9.5或10μM。
126.根据权利要求111至125中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；其中所述激活剂是选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、上皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)；并且所述化合物的浓度为约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml。
127.根据权利要求111至126中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂。
128.根据权利要求127所述的培养基，其中所述激活剂是浓度为约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60或70ng/m，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的肝细胞生长因子(HGF)。
129.根据权利要求111至125中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含cAMP依赖性途径和/或蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；其中激活剂是选自以下的化合物：二丁酰基-cAMP(dbCAMP)、毛喉素((3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧代-3-乙烯基十二氢-1H-苯并[f]色满-5-基乙酸酯)、咖啡因、茶碱、霍乱毒素和百日咳毒素；并且所述化合物以约20ng/ml至1μg/ml，或约10ng/ml至0.8μg/ml，或约15ng/ml至0.6μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml的浓度存在。
130.根据权利要求111至129中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含激活Notch受体的化合物，其选自：Jagged1蛋白(智人，也称为AGS；AHD；AWS；HJ1；CD339；JAGL1；JAG1)、Jagged2(NCBI3714)、δ样1(NCBI 28514)、δ样3(NCBI 10683)和δ样4(NCBI 54567)；其中所述化合物的浓度为约10nM至100μM，或约50nM至80μM，或约100nM至60μM，或约500nM至40μM，或约800nM至20μM，或约900nM至10μM，或约20、40、60或80nM，或约1、1.5、15、30、50、60、90或100μM。
131.根据权利要求111至130中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子，其选自：烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米。
132.根据权利要求131所述的培养基，其中所述分子的浓度为约0.1mM至1M，或约2mM至0.8M，或约4mM至约0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM。
133.根据权利要求111至132中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含选自以下的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂：丙戊酸(2-丙基戊酸)、丁酸钠(钠；4-羟基丁酸盐)、vorinotstat(N'-羟基-N-苯基辛二酰胺)、帕比司他((E)-N-羟基-3-[4-[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)、曲古抑菌素A((2E,4E,6R)-7-[4-(二甲基氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧代庚-2,4-二烯酰胺)、mocetinostat(N-(2-氨基苯基)-4-[[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]甲基]苯甲酰胺、BG45(N-(2-氨基苯基)-2-吡嗪甲酰胺)、4SC-202((E)-N-(2-氨基苯基)-3-(1-((4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)苯基)磺酰基)-1H-吡咯-3-基)丙烯酰胺)、贝里司他、Scriptaid(6-(1,3-二氧代-1H-苯并[de]异喹啉-2(3H)-基)-N-羟基己酰胺)、M344(4-(二甲基氨基)-N-[7-(羟基氨基)-7-氧代庚基]苯甲酰胺)、达西司特((E)-N-羟基-3-[4-[[2-羟乙基-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]氨基]甲基]苯基]丙-2-烯酰胺)、abexinostat、CUDC-101(7-(4-(3-乙炔基苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基氧基)-N-羟基庚酰胺、CUDC-907(N-羟基-2-(((2-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-吗啉基噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺)和AR-42((S)-N-羟基-4-(3-甲基-2-苯基丁酰胺)苯甲酰胺)。
134.根据权利要求133所述的培养基，其中所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂的浓度为约0.1μM至5mM，或约0.3μM至4mM，或约0.6μM至3mM，或约0.8μM至2mM，或约1mM至1.5mM，或约0.2、0.4、0.7、0.9、5、10、20、50、70或90μM或约1.5、2.5、3.5mM。
135.根据权利要求111至134中任一项所述的培养基，其中在所述培养基中培养的所述内胚层球状体祖细胞保留分化成胰细胞、肝细胞和肠细胞的能力。
136.一种使用如权利要求111至135中任一项所定义的培养基衍生和维持内胚层球状体祖细胞的方法。
137.一种用于产生多能球状体祖细胞(MESP)的方法，其包括：
i)在适于将内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件下，在细胞载体上的第一培养基中培养所述内胚层祖细胞；
ii)在适于将所述定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件下，在第二培养基中培养所述定形内胚层细胞；和
iii)在适于将所述原肠细胞分化成MESP细胞的条件下，在细胞载体上的第三培养基中培养所述原肠细胞。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述适于将所述内胚层祖细胞分化成定形内胚层(DE)细胞的条件以及所述适于将所述定形内胚层细胞分化成原肠细胞的条件包括二维单层培养。
139.根据权利要求137所述的方法，其中所述适于将所述原肠细胞分化成MESP细胞的条件包括三维培养。
140.根据权利要求137所述的方法，其中所述第一培养基包含TGF-β信号传导途径的激活剂。
141.根据权利要求144所述的方法，其中所述TGF-β信号传导途径的激活剂选自激活素和TGF-β。
142.根据权利要求137所述的方法，其中所述第二培养基包含BMP信号传导途径的激活剂和FGF信号传导途径的激活剂。
143.根据权利要求137所述的方法，其中所述第三培养基包含TGF-β信号传导途径的抑制剂、WNT信号传导途径的激活剂和Notch信号传导途径的激活剂。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述第三培养基还包含：
a)SMAD2/3抑制剂；
b)类固醇；
c)AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；
e)STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；
f)cAMP依赖性途径的激活剂，例如蛋白激酶A信号传导途径的激活剂；
h)NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂；或
i)组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。
145.根据权利要求137所述的方法，其中所述细胞载体包含选自以下的材料：基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素和合成聚合物或聚合物支架。
146.一种包含表达标志物PDX1(NCBI 3651)和NKX6.1(NCBI 4825)的细胞的胰腺球状体。
147.一种包含胰腺外分泌和内分泌细胞的胰腺球状体。
148.根据权利要求147所述的胰腺球状体，其中所述细胞表达：
a)选自GCG(NCBI 2641)、INS(NCBI 3630)和SST(NCBI 6750)的内分泌标志物；和/或
b)选自PDX1(NCBI 3651)、NKX6.1(NCBI 4825)、NKX2.2(NCBI 4821)、NEUROD1(NCBI4760)和MAFA(NCBI 389692)的标志物；和/或
c)选自PRSS1(NCBI 5644)、CPA1(NCBI 1357)、AMY1(NCBI 276)和CTRC(NCBI 11330)的腺泡细胞标志物；和/或
d)导管标志物角蛋白19(NCBI 3880)。
149.根据权利要求147所述的胰腺球状体，其中所述细胞分泌选自INS(NCBI 3630)、GCG(NCBI 2641)、SST(NCBI 6750)或PRSS1(NCBI 5644)的一种或多种激素或酶。
150.根据权利要求147所述的胰腺球状体，其中所述细胞不表达EPCAM和SOX9。
151.一种制造胰腺球状体的方法，其中所述方法包括：
a)在第一细胞培养基中培养内胚层祖细胞以获得早期胰腺内胚层祖细胞；
b)将a)中获得的所述细胞转移到第二细胞培养基中并在悬浮培养系统中培养所述细胞以获得晚期胰腺内胚层祖细胞；
c)在第三细胞培养基中在悬浮培养系统中培养b)中获得的所述细胞以获得胰腺类器官。
152.根据权利要求151所述的方法，其中将a)中的所述细胞与细胞外基质一起培养。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述细胞外基质促进细胞分化并且由选自基质胶、明胶、甲基纤维素、胶原蛋白、藻酸盐、藻酸盐珠、琼脂糖、纤维蛋白、纤维蛋白胶、纤维蛋白原、血浆纤维蛋白珠、全血浆或其组分、层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、HSP、壳聚糖、肝素、其他合成聚合物或聚合物支架和固体支持材料的材料组成。
154.根据权利要求151至153中任一项所述的方法，其中a)中的培养持续1至10天或1至8天或1至6天或1至4天。
155.根据权利要求151至154中任一项所述的方法，其中b)中的培养持续8至16天或6至14天或4至12天或5至10天。
156.根据权利要求151至155中任一项所述的方法，其中c)中的培养持续18至26天或20至24天或19至22天或16至20天。
157.根据权利要求151至156中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基如权利要求163至171中任一项所定义。
158.根据权利要求151至155中任一项所述的方法，其中所述第二细胞培养基如权利要求172至183中任一项所定义。
159.根据权利要求193至156中任一项所述的方法，其中所述第一细胞培养基如权利要求184至194中任一项所定义。
160.根据权利要求151至159中任一项所述的方法，其中所述早期胰腺内胚层祖细胞的特征在于一种或多种标志物，其中所述标志物是：SOX9(NCBI：6662)、PDX1(NCBI：3651)、NKX6.1(NCBI：4825)、CK19(3880)。
161.根据权利要求151至160中任一项所述的方法，其中所述晚期胰腺内胚层祖细胞的特征在于一种或多种标志物，其中所述标志物是：PDX1(NCBI：3651)、NKX6.1(NCBI：4825)、NEUROG3(NCBI：50674)、NKX2.2(NCBI：4821)、NEUROD1(NCBI：4760)、PAX6(NCBI：5080)。
162.一种通过权利要求151至161中任一项的方法获得的胰腺球状体。
163.一种用于早期胰腺内胚层祖细胞形成的培养基，其中所述培养基包含：
a)AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；
b)TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂；
c)WNT信号传导激活剂；和
d)FGF和MAPK途径激活剂。
164.根据权利要求163所述的培养基，其中所述培养基还包含作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子。
165.根据权利要求163所述的培养基，其中所述AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂如权利要求126中所定义。
166.根据权利要求164所述的培养基，其中作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子如权利要求131中所定义。
167.根据权利要求163所述的培养基，其中所述TGF-β抑制剂和/或SMAD2/3抑制剂如权利要求119至122中任一项所定义。
168.根据权利要求163所述的培养基，其中所述WNT信号传导激活剂如权利要求123至125中任一项所定义。
169.根据权利要求163所述的培养基，其中所述FGF和MAPK途径激活剂如权利要求48至49中任一项所定义。
170.根据权利要求163至169中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含促进胰腺内胚层存活和增殖的至少一种组分。
171.根据权利要求170所述的培养基，其中所述促进胰腺内胚层存活和增殖的至少一种组分选自以下的任何一种，或任何两种，或任何三种，或任何四种或全部：
STAT3、GAB1介导的细胞粘附和AKT/PI3K信号传导途径的激活剂；浓度为约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至约3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml；
权利要求129中所定义的cAMP依赖性途径激活剂；
权利要求130中所定义的Notch受体激活剂；
权利要求133中所定义的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；和
权利要求112至118中任一项所定义的类固醇。
172.一种用于晚期胰腺内胚层祖细胞形成的培养基，其中所述培养基包含：
视黄醇的代谢物；
(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂；
FGF和MAPK途径激活剂；
蛋白激酶C激活剂；和
Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂。
173.根据权利要求172所述的培养基，其中所述视黄醇的代谢物选自视黄酸、9-顺式-视黄酸、异维甲酸、阿维A、贝沙罗汀和阿利维A酸；其中所述视黄醇的代谢物的浓度为约0.2至5μM，或约0.4至4μM，或约0.6至3μM，或约0.8至2μM，或约1μM至约1.5μM，或约0.3、0.5、0.7、0.9、1、2、2.5、3.5、4.5μM。
174.根据权利要求172至173中任一项所述的培养基，其中所述Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂选自N-[2-[(3'R,7'aR)-3',6',10,11b-四甲基-3-氧代螺[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-十氢苯并[a]芴-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-六氢呋喃并[3,2-b]吡啶]-4'-基]乙基]-6-(3-苯基丙酰氨基)己酰胺(KAAD-环巴胺)、(E)-N-(4-苄基哌嗪-1-基)-1-(3,5-二甲基-1-苯基吡唑-4-基)甲亚胺(SANT-1)和(3S,3'R,3'aS,6'S,6aS,6bS,7'aR,9R,11aS,11bR)-3',6',10,11b-四甲基螺[2,3,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-十氢-1H-苯并[a]芴-9,2'-3a,4,5,6,7,7a-六氢-3H-呋喃并[3,2-b]吡啶]-3-醇(环巴胺)；其中所述Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂的浓度为约25nM至5μM，或约200nM至4μM，或约400nM至3μM，或约600nM至2μM，或约800nM至1μM，或约100、250、350、450、500、700、800nM，或约1.5、2、2.5、3.5及4.5μM。
175.根据权利要求172至174中任一项所述的培养基，其中所述FGF和MAPK途径激活剂如权利要求46或47中所定义。
176.根据权利要求172至175中任一项所述的培养基，其中所述蛋白激酶C激活剂选自：佛波酯，(1S,3S,5Z,7R,8E,11S,12S,13E,15S,17R,20R,23R,25S)-25-乙酰氧基-1,11,20-三羟基-17-[(1R)-1-羟乙基]-5,13-双(2-甲氧基-2-氧代亚乙基)-10,10,26,26-四甲基-19-氧代-18,27,28,29-四氧杂四环[21.3.1.13,7.111,15]二十九碳-8-烯-12-基(2E,4E)-2,4-辛二烯酸酯(苔藓抑素I)、(1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-(乙酰氧基)-4a,7b-二羟基-3-(羟甲基)-1,1,6,8-四甲基-5-氧代-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-十氢-H-环丙并[3,4]苯并[1,2-e]甘菊环-9-基肉豆蔻酸酯(TPA)、5-氯-N-庚基萘-1-磺酰胺(SC-10)、(2Z)-2-甲基-2-丁烯酸(1aR,2S,5R,5aS,6S,8aS,9R,10aR)-1a,2,5,5a,6,9,10,10a-八氢-5,5a-二羟基-4-(羟甲基)-1,1,7,9-四甲基-11-氧代-1H-2,8a-桥亚甲基环戊二烯并[a]环丙并[e]环癸烯-6-基酯(PEP 005)。
177.根据权利要求176所述的培养基，其中所述佛波醇酯是佛波醇12,13二丁酸酯。
178.根据权利要求176或177所述的培养基，其中所述蛋白激酶C激活剂的浓度为约100nM至10μM，或约200nM至约8μM，或约400nM至约6μM，或约400nM至4μM，或约400nM至2μM，或约450nM至约1μM，或约350、475、500、550、600、800或900nM，或约7、5、3、2.5、1.5或1μM。
179.根据权利要求172至178中任一项所述的培养基，其中所述(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂选自头蛋白(NCBI 9241)、6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-a]嘧啶(Dorsomorphin)和4-[6-(4-哌嗪-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹诺酮(LDN193189)；并且其中所述(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂的浓度为约2ng/ml至5μg/ml，或约5ng/ml至5μg/ml，或约10ng/ml至4μg/ml，或约15ng/ml至3μg/ml，或约20ng/ml至2μg/ml，或约5、18、20、25、28、30、50、60、70ng/ml，或约1、2.5、3.5或4.5μg/ml。
180.根据权利要求172至179中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含γ-分泌酶抑制剂，其中所述γ-分泌酶抑制剂选自：DAPT：(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-苯基乙酸叔丁酯、化合物E(C-E)(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-3H-1,4-苯并二吖庚因-3-基]丙酰胺、二苯并吖庚因(DBZ)：(2S)-2-[[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基]-N-[(7S)-5-甲基-6-氧代-7H-苯并[d][1]苯并吖庚因-7-基]丙酰胺、Begacestat：5-氯-N-[(2S)-4,4,4-三氟-1-羟基-3-(三氟甲基)丁烷-2-基]噻吩-2-磺酰胺和Flurizan：(2R)-2-(3-氟-4-苯基苯基)丙酸。
181.根据权利要求180所述的培养基，其中所述γ-分泌酶抑制剂的浓度为约0.1μM至20μM，或约0.5μM至15μM，或约0.8μM至10μM，或约1μM至5μM，或者约0.9μM至2.5μM，或者约0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、7、8、12、17或19μM。
182.根据权利要求172至181中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含选自AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂的用于促进胰腺内胚层祖细胞存活的组分；或选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、上皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)；浓度为约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml。
183.根据权利要求172至182中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含选自作为NFκB活性的阻遏物和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子的用于促进胰腺内胚层祖细胞存活的组分；或选自以下的化合物：烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米；浓度为约0.1mM至1M，或约2mM至0.8M，或约4mM至约0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM。
184.一种用于衍生和维持胰腺球状体的培养基，其中所述培养基包含：
视黄醇的代谢物；
ACTR-IB、TGFβRI和ACTR-IC抑制剂；
(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂；
FGF和MAPK途径激活剂；
γ-分泌酶抑制剂；
Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂；
AMPK信号传导激活剂；和
糖胺聚糖。
185.根据权利要求184所述的培养基，其中所述视黄醇的代谢物如权利要求173中所定义。
186.根据权利要求184或185所述的培养基，其中所述ACTR-IB、TGFβRI和ACTR-IC抑制剂是ALK5抑制剂II，其中所述ACTR-IB、TGFβRI和ACTR-IC抑制剂的浓度为约0.1μM至100μM，或约1μM至50μM，或约4μM至25μM，约6μM至15μM，或约8μM至10μM，或约2、3、5、7、9、9.5、10.5、11、12、12.5、35、60、75或80μM。
187.根据权利要求184至186中任一项所述的培养基，其中所述Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂选自N-[2-[(3'R,7'aR)-3',6',10,11b-四甲基-3-氧代螺[1,2,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-十氢苯并[a]芴-9,2'-3,3a,5,6,7,7a-六氢呋喃并[3,2-b]吡啶]-4'-基]乙基]-6-(3-苯基丙酰氨基)己酰胺(KAAD-环巴胺)、(E)-N-(4-苄基哌嗪-1-基)-1-(3,5-二甲基-1-苯基吡唑-4-基)甲亚胺(SANT-1)和(3S,3'R,3'aS,6'S,6aS,6bS,7'aR,9R,11aS,11bR)-3',6',10,11b-四甲基螺[2,3,4,6,6a,6b,7,8,11,11a-十氢-1H-苯并[a]芴-9,2'-3a,4,5,6,7,7a-六氢-3H-呋喃并[3,2-b]吡啶]-3-醇(环巴胺)；其中所述Smoothened(Smo)和Sonic hedgehog(Shh)抑制剂的浓度为约25nM至5μM，或约200nM至4μM，或约400nM至3μM，或约600nM至2μM，或约800nM至1μM，或约100、250、350、450、500、700、800nM，或约1.5、2、2.5、3.5及4.5μM。
188.根据权利要求184至187中任一项所述的培养基，其中所述FGF和MAPK途径激活剂如权利要求48或49中所定义。
189.根据权利要求184至188中任一项所述的培养基，其中所述γ-分泌酶如权利要求179或180中所定义。
190.根据权利要求184至189中任一项所述的培养基，其中促进发育中胚胎中的体节图案化的蛋白质是权利要求178中所定义的(选择性)ALK2、ALK3和ALK6抑制剂。
191.根据权利要求184至190中任一项所述的培养基，其中所述AMPK信号传导激活剂选自：甲状腺激素3(T3)、5-氨基-1-[(2R,3S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基]咪唑-4-甲酰胺(AICAR)和3-(二氨基亚甲基)-1,1-二甲基胍(二甲双胍)，其中所述AMPK信号传导激活剂的浓度为约10nM至1M，或约200nM至0.8M，或约400nM至0.6M，或约600nM至约0.4M，或约800nM至0.2M，或约1μM至2μM，或约500、700、900、950nM，或约1、1.1、1.5、2、5、7、8、150、500、700或800μM。
192.根据权利要求184至191中任一项所述的培养基，其中所述糖胺聚糖如权利要求100中所定义。
193.根据权利要求184至192中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含AKT/PI3K信号传导途径和MAPK信号传导途径的激活剂；或选自以下的化合物：表皮生长因子(EGF)、双调蛋白(AR)、epigen(EPG)、转化生长因子α(TGFα)、乙胞素(BTC)、上皮调节蛋白(EPR)、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)和神经调节蛋白(NRG)，浓度为约5ng/ml至5μg/ml，或约20ng/ml至4μg/ml，或约30ng/ml至3μg/ml，或约40ng/ml至2μg/ml，或约45ng/ml至500ng/ml，或约50ng/ml至300ng/ml，或约35、40、45、50、60、70、90、100、150、200、250、300、400、450、600、700或800ng/ml。
194.根据权利要求184至193中任一项所述的培养基，其中所述培养基还包含作为NFκB活性的阻遏剂和促分裂原活化蛋白(MAP)激酶ERK、p38和JNK的激活剂的分子；或选自以下的化合物：烟酰胺、烟酸、5-氟烟酰胺、异烟酸酰肼和尼可刹米；浓度为约0.1mM至1M，或约2mM至0.8M，或约4mM至约0.6M，或约6mM至0.4M，或约8mM至0.2M，或约10mM至800mM，或约50mM至500mM，或约3、5、9、15、20、30、50、80、100、120、150、200、250、300、350、400或450mM。
195.一种包含表达肠标志物绒毛蛋白和CDX2的细胞的肠类器官。
196.根据权利要求195所述的肠类器官，其中所述类器官包括具有内腔的盘绕结构。
197.根据权利要求195所述的肠类器官，其中所述细胞是极化的并且包含绒毛蛋白的不对称分布。
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