CN102216445A

CN102216445A - 诱导多能干细胞的标记

Info

Publication number: CN102216445A
Application number: CN2009801458029A
Authority: CN
Inventors: 徐文华; 胡家荣
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2008-09-18
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2011-10-12
Also published as: AU2009292707A1; WO2010033084A1; JP2012502653A; IL211764A0; EP2331675B1; SG160248A1; US20110171183A1; EP2331675A4; CA2739368A1; EP2331675A1

Abstract

本发明披露内容涉及在诱导多能干细胞表面上的足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的表达，并且特别(虽然不完全)涉及PODXL作为诱导多能干细胞的标记的应用。

Description

诱导多能干细胞的标记

技术领域

本发明涉及在诱导多能干细胞的表面上足糖萼蛋白(足萼蛋白，podocalyxin)样蛋白(PODXL)的表达，并且特别(虽然不完全)涉及PODXL作为诱导多能干细胞的标记的应用。

背景技术

胚胎干细胞和其它多能干细胞在治疗中具有很大的潜力。上述细胞可以用于再生医学来修复由疾病或受伤所损伤的组织。然而，在医学上，胚胎干细胞的使用受到限制，这是由于与人类胚胎的使用有关的重要的伦理问题。最近，Yamanaka Lab²和Thomson Lab³表明，通过少数基因的瞬时过度表达，可以将人成纤维细胞重新编程成诱导多能干细胞(IPSC)，其功能和表型上类似hESC。因此，可以获得多能干细胞，而无需破坏胚胎。

这些IPSC功能和表型上类似胚胎干细胞(ESC)，并且无需破坏胚胎。一些IPSC，如hESC，表达Oct-4和其它细胞表面标记，如Tra-1-60/81和SSEA-3/4。然而，IPSC与ESC并不相同，如较慢的倍增时间¹¹、全局基因表达模式的差异^2，3以及DNA甲基化状态²所表明的。核重编程是否是完全的¹⁰，因而在分化期间IPSC是否按照与hESC类似的途径目前仍然不清楚。

这种重要突破提供了以下可能性：利用患者专用的输入细胞的细胞疗法在未来可能成为现实。不同于其中存在伦理问题和可能的免疫排斥问题的hESC，IPSC可以产生自供体，重新编程，分化为适当的细胞类型以及移植回供体。尽管它的潜力，但在分化以后由残余IPSC引起的畸胎瘤形成问题仍然存在并需要解决。

在IPSC已成功产生自人细胞的报道公开以前，在WO 2007/102787(其内容由此结合于本申请中以供参考)中，我们描述了在未分化人胚胎干细胞(hESC)¹上相对于表面抗原产生一组单克隆抗体(mAb)(还参见此文的图10)。这些mAb相对于未分化的hESC系呈现强反应性，但相对于分化的(胚胎样体)hESC系则并不呈现反应性。上述mAb并不与小鼠成纤维细胞交叉反应，并且相对于人胚胎癌性细胞呈现弱至没有反应性。因此，这些mAb呈现结合于hESC的非常高的特异性，并且随着hESC分化，这种结合会失去。值得注意的是，一种抗体(mAb 84)，其结合足糖萼蛋白样蛋白-1(PODXL)，以浓度依赖性、补体无关的方式，对未分化hESC和NCCIT细胞具有细胞毒性。在温育的30分钟内，mAb 84诱导未分化的hESC的细胞死亡，但并不诱导分化hESC的细胞死亡，并且mAb-抗原复合物的免疫沉淀揭示了，抗原是足糖萼蛋白样蛋白-1。重要的是，当在移植到SCID小鼠中以前用mAb 84处理hESC时，没有观测到肿瘤形成。这种早期数据表明mAb84可用于从用于临床应用的分化细胞群体中消除残余hESC。

虽然未分化多能干细胞本身可以用于细胞治疗，但认为有益的是，使用已开始分化、或被分化的细胞。促进未分化的人多能干细胞分化成特定细胞谱系的方法在本领域是众所周知的。一旦此分化过程已开始或继续，有利的是，除去或破坏未分化多能干细胞，其否则可以形成不良畸胎瘤。

因此，可以看出，有用的是，鉴定或分离未分化人多能干细胞(因为它们本身可以用于治疗或可以被促进以分化成可以用于治疗的特定细胞谱系)。还有用的是，从细胞的混合物除去或破坏未分化人多能干细胞，其中一些细胞已开始分化、或被分化，因为这些分化细胞可用于治疗。

发明内容

本发明源于以下发现：足糖萼蛋白样蛋白-1(PODXL)是未分化诱导多能干细胞(IPSC)的标记。

在本发明中，已发现结合于并表征IPSC的抗体。此外，进一步研究了mAb 84杀伤IPSC的能力。

因此，提供了用来鉴定、分离、分开、纯化、富集或除去分化或未分化IPSC的方法。还提供了破坏未分化IPSC的方法。优选地，这些方法涉及能够结合PODXL的结合部分结合于表达PODXL的细胞。

在本发明的一个方面，提供了在包含一种或多种未分化诱导多能干细胞的样品中鉴定一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括鉴定在样品中的在它们的表面上表达足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的一种或多种细胞。

在一些实施方式中，使样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述一种或多种未分化诱导多能干细胞借助于被结合于结合部分而被鉴定。

在一些实施方式中，该方法进一步包括分离在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞，其中该方法包括：(i)使样品与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及(ii)使结合于结合部分的细胞与未结合于该部分的细胞分离。

提供了通过该方法获得的分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞。

在本发明的另一个方面，提供了使未分化诱导多能干细胞与已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞分离的方法，其中未分化诱导多能干细胞和已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞存在于样品中，该方法包括：(i)使样品与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及(ii)使结合于结合部分的细胞与未结合于该部分的细胞分离。

提供了通过该方法获得的分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞。还提供了通过该方法获得的分离的一种或多种分化诱导多能干细胞。

在本发明的另一个方面，提供了从包含未分化诱导多能干细胞的样品中分离一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括分离在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在一些实施方式中，使样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述一种或多种未分化诱导多能干细胞借助于被结合于结合部分而从样品中分离。

提供了通过该方法分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞。

在本发明的又一个方面，提供了从包含未分化诱导多能干细胞和已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的混合物中富集未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括：(i)使混合物与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在混合物中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及(ii)使结合于该部分的细胞与未结合于该部分的细胞分离，以便产生富集有未分化诱导多能干细胞的细胞群体。

在本发明的另一个方面，提供了从包含未分化诱导多能干细胞和已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的混合物中富集已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的方法，该方法包括：(i)使混合物与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在混合物中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及(ii)使未结合于该部分的细胞与结合于该部分的细胞分离，以便产生富集有已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的细胞群体。

在本发明的又一个方面，提供了制备包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物的方法，上述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞，该方法包括：(i)提供包含未分化诱导多能干细胞和从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的细胞群体；(ii)使该群体与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及(iii)使未结合于结合部分的细胞与结合于该部分的细胞分离。

在一些实施方式中，该方法进一步包括使分离的未结合于结合部分的细胞与药用载体、佐剂或稀释剂混合。

在本发明的另一个方面，提供了制备包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞的组合物的方法，上述组合物基本上不包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞，该方法包括：(i)提供包含未分化诱导多能干细胞和从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的细胞群体；(ii)使该群体与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及(iii)使结合于结合部分的细胞与未结合于该部分的细胞分离。

在一些实施方式中，该方法进一步包括从分离的结合于结合部分的细胞中离解结合部分。该方法还可以包括使分离的结合于结合部分的细胞与药用载体、佐剂或稀释剂混合的步骤。

在本发明的又一个方面，提供了将能够结合PODXL的结合部分结合于未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括使包含一种或多种未分化诱导多能干细胞的样品与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触。

在本发明的又一个方面，提供了在包含未分化诱导多能干细胞的样品中破坏一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括破坏在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在本发明的另一个方面，提供了从包含未分化诱导多能干细胞的样品中除去一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括从样品中除去在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在一些实施方式中，使样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述一种或多种未分化诱导多能干细胞借助于被结合于结合部分而从样品中除去。

在以上描述的本发明的任何方面，在一些实施方式中，结合部分是抗体，并且在优选的实施方式中为mAb84。

在本发明的又一个方面，提供了包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物，上述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞。

在本发明的另一个方面，提供了包含未分化诱导多能干细胞的组合物，上述组合物基本上不包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞。未分化诱导多能干细胞优选在它们的表面上表达PODXL。

在本发明的又一个方面，提供了治疗需要细胞治疗的患者的方法，该方法包括给予患者下述中的一种或多种：(i)通过本发明的方法获得的分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞；(ii)通过本发明的方法获得的分离的一种或多种分化诱导多能干细胞；或(iii)根据本发明的组合物。

在本发明的又一个方面，提供了下述中的一种或多种在制备用于治疗需要细胞治疗的患者的药物中的应用：(i)通过本发明的方法获得的分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞；(ii)通过本发明的方法获得的分离的一种或多种分化诱导多能干细胞；或(iii)根据本发明的组合物。

在本发明的另一个方面，提供了通过本发明的方法获得的分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞、或通过本发明的方法获得的分离的一种或多种分化诱导多能干细胞、或根据本发明的组合物，用于治疗需要细胞治疗的患者。

在本发明的又一个方面，提供了一种复合物，该复合物包含在它的表面上表达足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的未分化诱导多能干细胞和能够结合PODXL的结合部分，所述结合部分结合于在未分化诱导多能干细胞的表面上表达的PODXL。优选通过结合部分和PODXL的非共价和非离子相互作用来形成复合物。复合物可以提供为分离形式、或作为混合物或样品的一部分，例如，细胞培养物的一部分。

在本发明的又一个方面，提供了试剂盒(套装试剂盒，kit of parts)，该试剂盒包括结合PODXL的结合部分、以及检测另一种诱导多能干细胞标记的另外的制剂。

在本发明的又一个方面，提供了用来产生和鉴定诱导多能干细胞的方法，该方法包括：

(i)将非多能供体细胞诱导成多能状态以产生在它们的表面上表达PODXL的诱导多能干细胞；

(ii)使诱导多能干细胞与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在诱导多能干细胞的表面上表达的PODXL的条件下接触；以及

(iii)鉴定由结合部分结合的细胞。

在本发明的另一个方面，提供了mAb84在破坏未分化诱导多能干细胞中的应用。因此，提供了在包含未分化诱导多能干细胞的样品中破坏一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括使样品中的细胞与mAb84接触以使mAb84可以结合一些细胞。该方法可以进一步包括培养或温育样品足够的时间以便于破坏结合于mAb84的细胞。

在本发明的又一个方面，提供了一种复合物，该复合物包含结合于mAb84的未分化诱导多能干细胞。优选通过结合部分和PODXL的非共价和非离子相互作用来形成复合物。该复合物可以提供为分离形式、或作为混合物或样品的一部分，例如，细胞培养物的一部分。

以下陈述本发明的另外的方面。

在本发明的一个方面，提供了在可以包含未分化诱导多能干细胞的样品中鉴定未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括鉴定在样品中的在它们的表面上表达足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的一种或多种细胞。

在本发明的另一个方面，提供了从包含未分化诱导多能干细胞的样品中分离未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括分离在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在本发明的另一个方面，提供了从包含未分化诱导多能干细胞的样品中除去未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括从样品中除去在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在本发明的另一个方面，提供了在包含未分化诱导多能干细胞的样品中破坏未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括破坏在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在本发明的另一个方面，提供了通过从包含未分化诱导多能干细胞的样品中分离未分化诱导多能干细胞的方法而分离的未分化诱导多能干细胞，上述方法包括分离在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

在本发明的另一个方面，提供了在其表面上表达PODXL的分离的未分化诱导多能干细胞。

在本发明的另一个方面，提供了包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物，上述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞。

在本发明的另一个方面，提供了治疗需要细胞治疗的患者的方法，该方法包括给予患者通过从包含未分化诱导多能干细胞的样品中分离未分化诱导多能干细胞的方法而分离的未分化诱导多能干细胞、或在其表面上表达PODXL的分离的未分化诱导多能干细胞、或包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物，上述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞。

在本发明的另一个方面，提供了根据本发明的上述方面的细胞或根据本发明的上述方面的组合物在制备用于治疗需要细胞治疗的患者的药物中的应用。

在本发明的另一个方面，提供了根据本发明的上述方面的方法，其中使样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述诱导多能干细胞借助于被结合于结合部分而在样品中被鉴定或从样品中被分离或从样品中被除去。优选地，结合部分是抗体。

在本发明的另一个方面，提供了试剂盒，该试剂盒包括结合PODXL的部分，以及检测另一种诱导多能干细胞标记的另外的制剂。

以下编号的段落包含本文披露的本发明的技术特征的广泛组合的陈述。

1.一种在可以包含未分化诱导多能干细胞的样品中鉴定未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括鉴定在样品中的在它们的表面上表达足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的一种或多种细胞。

2.一种从包含未分化诱导多能干细胞的样品中分离未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括分离在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

3.一种从包含未分化诱导多能干细胞的样品中除去未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括从样品中除去在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

4.一种在包含未分化诱导多能干细胞的样品中破坏未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括破坏在样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。

5.通过段落2的方法分离的未分化诱导多能干细胞。

6.在其表面上表达PODXL的分离的未分化诱导多能干细胞。

7.一种包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物，上述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞。

8.一种治疗需要细胞治疗的患者的方法，该方法包括给予患者按照段落5或6所述的细胞或按照段落7所述的组合物。

9.按照段落5或6所述的细胞或按照段落7所述的组合物在制备用于治疗需要细胞治疗的患者的药物中的应用。

10.按照段落1至3中任一段落所述的方法，其中使样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述诱导多能干细胞借助于被结合于结合部分而在样品中被鉴定或从样品中被分离或从样品中被除去。

11.按照段落10所述的方法，其中所述结合部分是抗体。

12.一种试剂盒，包括结合PODXL的部分，以及检测另一种诱导多能干细胞标记的另外的制剂。

优选具体实施方式的描述

方法

根据本发明的方法优选涉及PODXL结合部分与在它们的表面上表达PODXL的细胞的结合。

根据本发明的方法可以包括：

(a)鉴定未分化诱导多能干细胞；

(b)分离未分化或分化诱导多能干细胞；

(c)使未分化诱导多能干细胞与其它细胞分离，例如与分化诱导多能干细胞分离；

(d)富集未分化或分化诱导多能干细胞；

(e)制备分化诱导多能干细胞的组合物，该组合物基本上不具有未分化诱导多能干细胞；或

(f)制备未分化诱导多能干细胞的组合物，该组合物基本上不具有分化诱导多能干细胞。

根据本发明的方法可以涉及使样品与能够结合于PODXL的部分(PODXL结合部分)接触的步骤。这可以在适合于允许结合部分与PODXL结合的条件下。上述条件是本领域普通技术人员众所周知的，例如包括生理pH和生理缓冲液。

可以使样品与PODXL结合部分接触足够的时间以允许结合部分结合于PODXL。足够的时间可以例如是5分钟、10分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟或长于2小时。

在优选的实施方式中，根据本发明的方法包括使样品与PODXL结合部分接触，从而便于PODXL结合部分结合于在细胞表面上的PODXL并确定哪些细胞具有与其结合的PODXL结合部分。

根据本发明的方法可以包括鉴定由PODXL结合部分结合的细胞的步骤。根据本发明的方法可以包括分离由PODXL结合部分结合的细胞的步骤。根据本发明的方法可以包括分配、除去、分离或纯化由PODXL结合部分结合的细胞的步骤。根据本发明的方法可以包括破坏由PODXL结合部分结合的细胞的步骤。根据本发明的方法可以进一步包括量化已被鉴定、分离、分开、分配、富集、结合或除去的细胞的步骤。

本文披露的鉴定未分化诱导多能干细胞的方法可用于成像未分化IPSC，尤其是在细胞标记有可检测标记的情况下，以及用于表征IPSC。

涉及将PODXL结合部分结合于在IPSC表面上表达的PODXL的方法可用于IPSC的研究、以及IPSC的临床进展。

结合于在细胞表面上表达的PODXL的PODXL结合部分形成结合部分和PODXL的复合物。表达结合部分结合的PODXL的细胞形成复合物的一部分。

本发明的一些方法包括检测复合物的步骤，例如通过检测结合部分的存在或通过检测偶联于结合部分的可检测标记。

本发明的一些方法包括分配那些来自样品或来自样品中的其它非复合细胞的复合物的步骤，并且可以进一步包括检测复合物的步骤，例如通过检测结合部分或偶联于结合部分的可检测标记的存在。

本发明的一些方法包括以下步骤：使样品与PODXL结合部分接触足够的时间以便于形成结合部分和PODXL的复合物，以及从样品中除去复合细胞。上述方法可用于分化和/或未分化诱导多能干细胞的分离和/或纯化。

在本发明的方法中，可以将PODXL结合部分固定于，例如共轭于固体载体，使得可以通过亲和结合来结合诱导多能干细胞。方便地，固体载体包括任何适宜的基质如琼脂糖、丙烯酰胺、Sepharose^TM以及Sephadex^TM。固体载体可以是固体基质如微量滴定板或片、或柱。

在一些实施方式中，磁性标记(直接或间接地)结合部分，使得当被结合时在提供适宜磁场以后可以从样品的其余部分中分离人胚胎干细胞。用于磁性细胞分选的微珠经常称作MACS胶体超顺磁性微珠。通过磁性活化细胞分类法(MACS)可以分选以这种方式标记的诱导多能干细胞。

分离包含特定细胞标记的细胞的其它方法在本领域中是已知的并且包括FACS(荧光激活细胞分选)，为此用荧光分子标记结合部分。

根据本发明的方法可以包括培养已被结合、鉴定、分离、分开、富集或除去的未分化或分化诱导多能干细胞的步骤。这些方法还可以包括分化这样得到的未分化诱导多能干细胞的步骤。

根据本发明的方法可以用来提供分化或未分化诱导多能干细胞的富集的或基本上分离的组合物。可以以各种方式来使用这样的组合物，例如它可以用于细胞治疗或它可以用作细胞源，然后上述细胞源被促进分化成特定细胞谱系，其可用于特定治疗，或它可以用来研究(体外或体内)便于使细胞分化成其它细胞的因素。

通常，诱导多能胚胎干细胞的富集组合物包含至少50％的细胞作为分化或未分化人胚胎干细胞，优选至少70％或至少90％或至少95％。优选地，在组合物中的所有细胞是所述分化或未分化诱导多能干细胞。

用于富集细胞群体的方法优选涉及，绝对地或相对于样品中其它细胞的数目，增加样品中细胞的浓度或增加细胞群体(即给定类型的细胞的数目)。

本发明还提供了破坏未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括破坏样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种细胞。在一些实施方式中，使细胞样品与PODXL结合部分接触足够的时间以便于该部分结合于那些在它们的表面上表达PODXL的细胞。该部分可以包括能够破坏它已结合的细胞的细胞毒性剂。可替换地，可以通过结合部分本身、或由于结合部分的附着，来破坏细胞。可替换地，可以通过结合部分与细胞毒性剂的相互作用来破坏细胞。因此，该方法可以包括添加能够与结合部分相互作用的细胞毒性剂以便破坏结合于结合部分的细胞。

在一些方法中，通过细胞胀亡机制，PODXL结合部分介导细胞死亡，上述机制是细胞死亡的一种形式，其来自膜损伤，从而导致细胞通透性(如对染料如碘化丙啶/台盼蓝的通透性所证明的)和细胞收缩的增加。在通过本发明的方法诱导细胞死亡以前可以进行细胞膜的穿孔、起泡和/或细胞凝集。在破坏未分化IPSC的优选方法中，能够结合于PODXL的部分可以是mAb84。

可以连接于抗体或其它结合部分的适宜细胞毒性部分，包括放射性原子、细胞毒性药物、细胞毒性蛋白以及酶系统，其可以将前药转化成细胞毒性药物。这些在本领域是众所周知的。

在一个优选的实施方式中，本发明包括在包含未分化诱导多能干细胞的样品中破坏未分化诱导多能干细胞的方法，该方法包括以下步骤：使样品与对于所述细胞具有毒性的PODXL结合部分接触，使结合部分结合于在所述细胞的表面上的PODXL，以及使结合部分杀伤所述细胞。结合部分可以是抗体，其本身对于所述细胞具有细胞毒性，或可以包括对于细胞是毒性的另外部分。

在一些实施方式中，与细胞毒性剂同时或顺序地将PODXL结合部分给予样品或细胞。可以连同一种或多种其它制剂一起给予PODXL结合部分，其中上述制剂能够结合于其它干细胞相关分子以便确保残余IPSC的彻底去除。

破坏未分化IPSC的方法可以用来从已被诱导以分化的IPSC群体中除去未分化细胞。在移植组织或器官以前，用于破坏未分化IPSC的方法可以用来消除残余IPSC，从而增加移植的成功和安全，尤其是通过降低畸胎瘤形成的风险。

本发明提供了在其表面上表达PODXL的分离的未分化诱导多能干细胞、以及在其结合于PODXL结合部分的表面上表达PODXL的分离的未分化诱导多能干细胞。

本发明还提供了从样品中产生和鉴定重新编程的诱导多能干细胞的方法。这使得能够从还未成功重新编程的细胞中选择成功重新编程的诱导多能干细胞。

这样的方法包括将非多能供体细胞诱导成多能状态以产生在它们的表面上表达PODXL的诱导多能干细胞，使诱导多能干细胞与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在诱导多能干细胞的表面上表达的PODXL的条件下接触，以及鉴定由结合部分结合的细胞。

用于将非多能供体细胞诱导成多能状态的技术在本领域是已知的。例如，那些由Takahashi et al((2007)Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.Cell 131(5)：861-72)and Yu et al((2007)Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.Science 318(5858)：1917-20)报道的技术，上述两者结合于本文以供参考。

上述技术包括用干细胞相关基因和/或转录因子利用病毒载体来转染供体细胞。上述基因和因子可以包括Oct-3/4(Pouf51)Sox2、c-Myc、Klf4、Nonaog以及LIN28中的一种或多种，如在以下“诱导多能干细胞”中所说明的。

供体细胞可以包括成年体细胞，例如成纤维细胞，如在以下“诱导多能干细胞”中所描述的。

优选体外进行根据本发明的方法。术语“体外”用来包括用培养物中的细胞进行的实验，而术语“体内”用来包括用完整的多细胞生物体进行的实验。

试剂盒

根据本发明的一些方面，提供了一种试剂盒。在一些实施方式中，标记是Oct4、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81以及GCTM-2中的一种或多种。另外的制剂可以是mAb 5、mAb 8、mAb 14、mAb 63、mAb 84、mAb 85、mAb 95、mAb 375、mAb 432、mAb 529中的任何一种或多种。

在一些实施方式中，试剂盒包括相对于PODXL的抗体以及相对于Oct4、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81以及GCTM-2中的一种或多种的抗体。典型地，试剂盒还可以包含下述中的一种或多种：用于免疫化学的制剂；固定于固体载体的抗体；用于标记抗体的工具；用来将抗体连接于细胞毒性部分的工具。

样品

本发明的一些方法涉及含有细胞的样品。样品可以是任何数量的细胞，其包含、或被怀疑包含一种或多种未分化诱导多能干细胞。样品可以是体外生长的细胞的培养物。例如，培养物可以包含细胞的悬浮液或在培养板或培养皿中培养的细胞。

在优选的实施方式中，样品包含未分化诱导多能干细胞。在一些实施方式中，样品包含未分化诱导多能干细胞和已经历分化或正经历分化的诱导多能干细胞。已经历分化或正经历分化的诱导多能干细胞可以不再是多能的并且优选在它们的表面上并不表达PODXL。

样品可以是这样一种样品，其中未分化诱导多能干细胞已被促进(或激励)以分化成特定细胞谱系，因而样品可以包含未分化和分化细胞的混合物(因为分化并不经常是有效过程)。通常，在这样的样品中，未分化诱导多能干细胞构成细胞总数的几个百分点。通常，在样品中的分化细胞可以是心肌细胞、胰岛、神经元祖细胞或间充质干细胞，其源自(通过分化)诱导多能干细胞。在包含分化细胞的样品的临床应用以前，从(或在)这样的样品中除去(或破坏)未分化诱导多能干细胞会是有用的，因为，潜在地，未分化细胞可以形成不良畸胎瘤。通常，除去或破坏至少95％的未分化诱导多能干细胞。优选地，除去或破坏所有所述细胞。

在一些实施方式中，样品并不包含非诱导多能细胞，例如，胚胎干细胞(ESC)。在一些优选的实施方式中，样品并不包含人胚胎干细胞或非诱导人多能细胞。

样品可以包含在它们的表面上表达PODXL的未分化IPSC。在一些情况下，样品源自己被诱导成具有多能性的体细胞。在其它情况下，样品可以包含IPSC，其已被诱导以分化成其它细胞。样品可以包含其它非多能细胞，例如饲养细胞或成纤维细胞。

足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)

本文中称作足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的足糖萼蛋白样蛋白1前体的氨基酸序列给出在图11中(SEQ ID NO：1)并且还参见通过EntrezPubMed可进入的NCBI蛋白质序列数据库的登录号O00592(还参见Kershaw et al(1997)J.Biol.Chem.272，15708-15714)。它还称作PCLPl和PODXL。为了方便，此后它将称作PODXL。PODXL可以具有在图11中给出的精确序列，或它可以是其自然发生的变体(例如，参见图16)。例如，按照O00592，R是T在残基62处的变体，以及S是L在残基196处的变体。

成熟PODXL是528个残基糖基化细胞表面多肽，其中残基1-22是信号肽，以及残基23-528表示成熟蛋白。残基23-431被认为是蛋白的胞外部分以及残基432-452是跨膜区。残基23-304是Ser/Thr丰富区。优选的是，如果结合于PODXL的结合部分结合于PODXL的胞外区，例如在Ser/Thr丰富区内、或在此区的外侧。

足糖萼蛋白样蛋白是唾粘蛋白(唾液黏蛋白)家族的成员。PODXL最初鉴定为肾小球足细胞的重要成分。足细胞是高度分化的上皮细胞，其中交错足突覆盖肾小球基底膜的外部方面。PODXL的其它生物活性包括在具有Na+/H+交换调节因子的膜蛋白复合物中结合于细胞内细胞骨架元件、在造血细胞分化中发挥作用、被表达在血管内皮细胞中以及结合于L-选择蛋白。

PODXL是属于唾粘蛋白的CD34家族的重糖基化I型跨膜蛋白。PODXL起初被描述为在肾小球的足细胞上的主要唾液蛋白，但后来发现被表达在血管内皮细胞和早期造血祖细胞上。最近，PODXL已涉及作为在乳腺癌、肝癌、以及前列腺癌中的肿瘤攻击性中的指示剂。人PODXL位于染色体7q32-q33上并编码528个氨基酸的蛋白。然而，由于PODXL的胞外域被广泛糖基化以具有唾液酸化O-连接碳水化合物和用于N-连接糖基化的5个潜在位点，所以PODXL的近似分子量为160-165kDa。

功能上，PODXL已报道具有相当不同的作用，其取决于细胞类型。在足细胞中，PODXL作为抗粘附分子，该抗粘附分子通过电荷排斥保持在足细胞足突之间的滤过隙打开。然而，在高内皮微静脉中，PODXL作为粘附分子，该粘附分子结合于L-选择蛋白并介导淋巴细胞的牵引和滚动。

在hESC中，PODXL被转录鉴定为高度表达在未分化hESC中^5，6。通过表达的序列标记频率分析，PODXL表达水平在7-8天胚胎样体中被下调几乎2.5倍，并在神经外胚层样细胞和肝细胞样细胞中分别被下调大约7和12倍⁵。此结果得到hESC和8天EB的免疫组织化学的支持，其中在后者中的染色显著降低⁷。在Wei等人的比较hESC和mESC的转录物组分布的独立研究中，他们观测到，与hESC相比，在mESC系E-14中通过MPSS未检测到PODXL的表达⁸。在蛋白水平，Schopperle和DeWolf⁹报道，在两个胚胎性癌系暴露于视黄酸以后，PODXL经历翻译后糖基化变化(MW从200kDa降低至170kDa)。抗TRA-1-60/81抗体未能结合于修饰PODXL促使它们提示在胚胎干细胞上干细胞PODXL(SC-PODXL)的存在。在一起，在ESC中PODXL表达的这些独立的报告密切对应于我们通过流式细胞术所获得的mAb 84的观测结果，其中，与未分化hESC相比，在第8天胚胎样体中结合反应性降低。伴随地，分别对FGF2-饥饿的hESC和第22天EB的mAb 84-介导杀伤的降低或丧失可以归因于在分化以后PODXL表达的下调。此外，在胚胎样体形成期间，结合于hESC的mAb 84和TRA-1-60的同时减少可能涉及在分化期间SC-PODXL的丧失。

在本发明的优选方法中，PODXL是人PODXL。人PODXL可以具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或GenBank登录号O00592.2GI：229462740(SEQ ID NO：2；图12)或GenBank登录号AAI43319.1GI：219520307(SEQ ID NO：3；图13)的氨基酸序列。一些实施方式涉及PODXL变体如在图16(SEQ ID NO：8&9)中所披露的那些变体。

在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列，PODXL蛋白包括60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性之一。在一些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列(不包括氨基酸1-22)，PODXL蛋白包括60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性之一。优选的PODXL蛋白是mAb84能够结合的那些PODXL蛋白。

PODXL结合部分

适宜的结合部分包括核酸适体(例如由Systematic Evolution of Ligands通过EXponential富集(SELEX)所获得的)、抗体(包括多克隆和单克隆抗体以及抗体片段)、配体、酶以及其它生物分子。

应当明了，对于本发明的所有实施方式，优选的是，PODXL结合部分是选择性的。因此，优选的是，PODXL结合部分选择性地结合PODXL，即，以比其它人蛋白更高亲和力，结合PODXL。通常，抗PODXL抗体以选择性方式基本上不结合其它人蛋白。

方便地，结合部分是抗体，借助于此术语，我们包括其片段或衍生物、或合成抗体或合成抗体片段。

会结合于PODXL的抗体已经是已知的。例如，对于人足糖萼蛋白具有特异性的山羊IgG，其多克隆抗血清结合于胞外域，可获自R&D Systems，Inc，目录号为AF1658。此外，单克隆抗人足糖萼蛋白抗体(小鼠IgG2A)可获自R&D Systems，Inc，目录号为MAB1658。鉴于与单克隆抗体技术有关的今天的技术，可以相对于大多数抗原来制备抗体。抗原结合部分可以是抗体的一部分(例如Fab片段)或合成抗体片段(例如单链Fv片段[ScFv])。相对于所选抗原的适宜的单克隆抗体可以通过已知技术来制备，例如在″Monoclonal Antibodies：A manual of techniques″，H Zola(CRC Press，1988)以及在″Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications″，J G R Hurrell(CRC Press，1982)中所披露的那些技术。Neuberger等人讨论了嵌合抗体(1988，8th International Biotechnology Symposium Part 2，792-799)。

单克隆抗体(mAb)可用于本发明的方法并且是特异性地靶向抗原上的单表位的抗体的同源群体。因此，结合PODXL的mAb可以潜在地用来纯化或消除呈现抗原库的活细胞的子集，其中上述抗原库表征未分化细胞或分化成具体谱系的细胞。

多克隆抗体可用于本发明的方法。单特异性多克隆抗体是优选的。可以利用本领域众所周知的方法来制备适宜的多克隆抗体。

还可以使用抗体的片段，如Fab和Fab₂片段，如可以使用基因工程抗体和抗体片段。抗体的可变重(V_H)和可变轻(V_L)域是与抗原识别有关的，这是通过早期蛋白酶消化实验首先认识到的事实。通过啮齿动物抗体的“人源化”发现了进一步确认。可以将啮齿动物起源的可变域融合于人类起源的恒定域，使得获得的抗体保留啮齿动物亲代抗体的抗原特异性(Morrison et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 81，6851-6855)。

根据涉及抗体片段(均包含一个或多个可变域)的细菌表达的实验，已知抗原特异性由可变域赋予并独立于恒定域。这些分子包括Fab样分子(Better et al(1988)Science 240，1041)；Fv分子(Skerra et al(1988)Science240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中V_H和V_L配偶体域经由柔性寡肽相连(Bird et al(1988)Science 242，423；Huston et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sd.USA 85，5879)；以及单域抗体(dAb)，其包含分离的V域(Ward et al(1989)Nature 341，544)。与抗体片段(其保留它们的特异性结合位点)的合成有关的技术的一般评论可参见Winter & Milstein(1991)Nature 349，293-299。

“ScFv分子”我们是指这样的分子，其中共价连接V_H和V_L配偶体域，例如通过柔性寡肽。

Fab、Fv、ScFv以及dAb抗体片段均可以表达在大肠杆菌中和分泌自大肠杆菌，因而允许容易生产大量的所述片段。

全抗体、以及F(ab′)₂片段是“二价的”。“二价的”我们是指所述抗体和F(ab′)₂片段具有两个抗原结合位点。与此相反，Fab、Fv、ScFv以及dAb片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。还可以利用如本领域众所周知的噬菌体显示技术来制备结合于PODXL的合成抗体。

在一些方法中，抗体是mAb84。mAb 84的V_H和V_L链的氨基酸序列(以及编码多核苷酸序列)已被确定，如图14(SEQ ID NO：4)和15(SEQ IDNO：5)所示。

在此说明书中，mAb84的参比物包括具有V_L和/或V_H链的抗体，该V_L和/或V_H链相对于SEQ ID NO：4和6具有高百分比序列同一性。mAb84的参比物包括具有V_H链的结合PODXL(优选人PODXL)的抗体，该V_H链相对于SEQ ID NO：6具有至少70％、更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性之一。mAb84的参比物包括具有V_L链的结合PODXL(优选人PODXL)的抗体，该V_L链相对于SEQ ID NO：4具有至少70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性之一。

相对于PODXL的其它mAb以及它们的应用描述在WO 2007/102787中，其结合于本文以供参考。

mAb 84可以用来在分化以后和可选地在动物移植试验以前消除残余未分化诱导多能干细胞以测试它们的分化细胞的功能。

mAb 84(可选地连同其它mAb一起，如在WO 2007/102787中所描述的或如图10中所示)可以在移植以前潜在地用来消除残余未分化hESC或未分化诱导多能干细胞，从而增加在再生临床应用中移植的成功和安全。

本申请的PODXL结合部分可以潜在地用来纯化或消除呈现抗原库的活细胞的子集，上述抗原库表征未分化细胞或分化成具体谱系的细胞。

适宜的结合部分能够结合于多肽，该多肽相对于SEQ ID NO：1至3、8或9之一具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性之一。

在一些优选的实施方式中，结合部分被可检测地标记，或至少能够检测。例如，结合部分可以标记有放射性原子或有色分子或荧光分子或可以以任何其它方式容易检测的分子。适宜的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物、以及放射性示踪标记。结合部分可以直接标记有可检测标记或可以被间接标记。例如，结合部分可以是未标记抗体，该未标记抗体可以通过本身被标记的另一种抗体来检测。可替换地，可以使二抗已结合于生物素，并且经标记的链霉亲和素与生物素的结合用来间接标记一抗。

干细胞

术语“干细胞”通常是指这样的细胞，该细胞在分裂时面临两个发育选项：子细胞可以与原始细胞(自我更新)相同或它们可以是更专门细胞类型(分化)的祖细胞。因而干细胞能够采用一种或其它途径(存在另外的途径，其中可以形成每一种细胞类型之一)。因而，干细胞是这样的细胞，其并不是终末分化的而是能够产生其它类型的细胞。

如在本文中所使用的，术语“干细胞”尤其是指诱导多能干细胞。

胚胎干细胞

胚胎干细胞(ESC)可以从胚泡的内细胞团(ICM)中分离，其中胚泡是当发生移植时胚胎发育的时期。

多能干细胞

多能干细胞是具有在体内获得任何分化细胞的潜力的真正干细胞。然而，它们不能有助于获得源自滋养层的胚外膜。已发现多种类型的多能干细胞。

多能性干细胞

多能性干细胞是真正的干细胞但仅能分化成有限数目的类型。例如，骨髓包含多能性干细胞，该多潜能干细胞产生血液的所有细胞但并不产生其它类型的细胞。多能性干细胞被发现于成年动物中。认为，体内的每个器官包含它们，其中它们可以更换死亡或受损的细胞。

表征干细胞的方法在本领域是已知的，并且包括使用标准分析方法如克隆试验、流式细胞术、长期培养以及分子生物学技术，例如PCR、RT-PCR以及DNA印迹法。

成年干细胞

成年干细胞包括各种各样的类型，包括神经元、皮肤以及造血干细胞，其是骨髓移植中的活性成分。

这些后面的干细胞类型还是脐带源干细胞的主要特点。成年干细胞可以在实验室中和在体内均成熟变成功能性、更专门的细胞类型，虽然细胞类型的确切数目受限于所选干细胞的类型。

诱导多能干细胞

诱导多能干细胞，通常缩写为iPS细胞或iPSC，是一种类型的多能干细胞，该多能干细胞通过插入一些基因人工来自非多能细胞，通常成年体细胞。在Takahashi，K.& Yamanaka(2006)、Yamanaka S等人(2007)、Wernig M等人(2007)、Maherali N等人(2007)、Yu J等人(2007)以及Takahashi等人(2007)(均结合于本文以供参考)中述评和讨论了iPS细胞。

通常通过将一些干细胞相关基因转染成非多能细胞，如成年成纤维细胞，来获得iPS细胞。通常通过病毒载体，例如通过逆转录病毒重新编程，来实现转染。转染基因包括主转录调节子Oct-3/4(Pouf51)和Sox2，虽然教导了其它基因会增强诱导的效率。在3-4周以后，少量转染细胞开始变得形态和生化上类似于多能干细胞，并且通常通过形态选择、倍增时间、或通过报道基因和抗生素感染，来加以分离。

通过用一种或多种转录因子的转染，可以从从体细胞如成纤维细胞诱导IPSC。在一些情况下，用Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4来转化细胞。可以用其它基因另外转染细胞，包括转录因子和/或标记基因。可以利用转座子系统如Cre/loxP重组系统、或利用非整合载体，来引入基因，以便产生没有外源性重新编程基因的iPSC。可以利用病毒载体，如逆转录病毒，来实现转染。病毒可以是双嗜性病毒。在细胞已被转染以后，在转移到ESC培养基以前，它们可以生长在饲养细胞上。

IPSC可以源自兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿动物、猫、狗、猪、羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物或其它非人脊椎动物生物。在优选的实施方式中，IPSC源自人细胞。

可用于本发明的iPS细胞可以源自任何适宜的细胞类型，包括肺细胞、包皮成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、角质细胞、血祖细胞、骨髓细胞、肝细胞、胃上皮细胞、胰腺细胞、神经干细胞、B淋巴细胞、ES源体细胞以及胚胎成纤维细胞。iPS细胞可以源自人、小鼠或其它哺乳动物。优选地，iPS细胞是人细胞。在一些情况下，细胞不是人皮肤成纤维细胞。IPSC可以呈现与ESC类似的基因表达模式和表型。在本发明中，未分化IPSC在它们的表面上表达PODXL。

与ESC一样，通过污染残余的未分化IPSC，分化诱导多能干细胞的未来的治疗应用带有畸胎瘤形成的危险。尽管存在这个问题，但目前并没有开发许多策略来分开这些细胞群体。

本发明特别涉及在细胞表面上表达PODXL的IPSC，即，在它们的表面上具有PODXL的IPSC，其可用于结合于PODXL结合部分。本发明还特别涉及源自人细胞的IPSC。

干细胞的培养

培养干细胞的任何适宜方法可以用于本文描述的方法和组合物。

根据本文描述的方法和组合物，任何适宜的容器可以用来增殖干细胞。适宜的容器包括在美国专利公开US2007/0264713(Terstegge)中所描述的那些容器。

容器可以包括例如生物反应器和旋转器。“生物反应器”，当该术语用于本文中时，是适合于如大规模培养真核细胞，例如动物细胞或哺乳动物细胞的容器。受调节的生物反应器的典型培养容积为20ml至500ml之间。

生物反应器可以包括受调节的生物反应器，其中可以控制或监测一种或多种条件，例如，氧分压。用于测量和调节这些条件的装置在本领域是已知的。例如，氧电极可以用于氧分压。可以经由所选择气体混合物(例如，空气或空气和/或氧气和/或氮气和/或二氧化碳的混合物)的量和组成来调节氧分压。由Bailey，J E.(Bailey，J E.，Biochemical Engineering Fundamentals，second edition，McGraw-Hill，Inc.ISBN 0-07-003212-2Higher Education，(1986))或Jackson A T.Jackson A T.，Verfahrenstechnik in der Biotechnologie，Springer，ISBN 3540561900(1993))描述了用于测量和调节氧分压的适宜装置。

其它适宜的容器包括旋转器。旋转器是受调节的或未受调节的生物反应器，其可以利用各种搅拌器装置如玻璃球搅拌器、叶轮式搅拌器、以及其它适宜的搅拌器进行搅拌。旋转器的培养容积通常为20ml至500ml之间。滚瓶是具有400至2000cm²之间培养面积的由塑料或玻璃制成的圆形细胞培养瓶。沿着这些瓶的整个内表面培养细胞；通过“滚动”运动，即围绕它们的各自的轴旋转瓶，来实现用培养基涂布细胞。

可替换地，培养可以是静态的，即，其中并不采用培养物/培养基的主动搅拌。通过减少培养物的搅拌，可以便于形成细胞的聚集体。虽然一定的搅拌可以用来促进培养基在培养细胞上的分布和流动，但这可以被使用以便不会显著扰乱聚集体形成。例如，可以采用低rpm搅拌，例如小于30rpm或小于20rpm。

利用传代的增殖

本文描述的方法和组合物可以包括在培养期间的传代、或分裂。该方法可以涉及连续或持续传代。

“持续的”或“连续的”我们是指，我们的方法能够以一定方式来生长干细胞，上述方式使得它们能够被传代，例如，取走它们在其上生长的平板或微载体，并转移到其它平板、微载体或颗粒，并且此过程可以重复至少一次，例如两次、三次、四次、五次等。在一些情况下，这可以重复任何数目的次数，例如不确定或无限次数。

在培养物中的细胞可以从底物或烧瓶中离解，以及通过稀释到组织培养基中并再平板接种，被“分裂”、继代培养或传代。

可以将生长在颗粒上的细胞传代回到颗粒培养物中。可替换地，可以将它们传代回到常规(2D)培养物上。可以将生长在平板上的组织培养细胞传代到颗粒培养物上。

术语“传代”一般可以指以下过程：获取等分部分的细胞培养物，完全或部分地离解(或分离)细胞，稀释并接种到培养基中。传代可以重复一次或多次。等分部分可以包括全部或部分的细胞培养物。等分部分的细胞可以是完全、部分或不汇合的。传代可以包括至少一些以下的步骤顺序：吸入、冲洗、胰蛋白酶消化、温育、移去、猝灭、重接种以及等分。可以使用由Hedrick Lab，UC San Diego公开的规程(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。

可以通过任何适宜的方式，如本领域已知的机械或酶方式，来离解细胞。可以通过机械离解，例如利用细胞刮棒或移液管，来破碎细胞。可以通过筛分通过适宜的筛孔尺寸，如通过100微米或500微米筛，来离解细胞。可以通过酶离解，例如通过用收获的胶原酶或trypLE的处理，来分裂细胞。离解可以是完全或部分的。

稀释可以具有任何适宜的稀释度。可以以任何适宜的比率来分裂在细胞培养物中的细胞。例如，可以以1∶2或更大、1∶3或更大、1∶4或更大或1∶5或更大的比率来分裂细胞。因此，干细胞可以被传代1个传代或更多。例如，干细胞可以被传代2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25次传代或更多。传代可以表示为细胞生长的产生。我们的方法和组合物使干细胞可以增殖1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代或更多。

传代还可以表示为细胞倍增的数目。我们的方法和组合物使干细胞可以增殖1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个细胞倍增或更高。

干细胞特征的维持

增殖的干细胞可以保留灵长类或人干细胞的至少一种特征。在一次或多次传代以后，干细胞可以保留上述特征。在多次传代以后，它们可以如此。如上所述，在所述数目的传代以后，它们可以如此。

上述特征可以包括形态特征、免疫组织化学特征、分子生物学特征等。上述特征可以包括生物活性。

干细胞特征

通过我们的方法增殖的干细胞可以呈现以下干细胞特征中的任何一种。

干细胞可以呈现Oct4和/或SSEA-1和/或TRA-1-60的增加的表达。与并不自我更新的干细胞相比，自我更新的干细胞可以呈现缩短的细胞周期。

干细胞可以呈现确定的形态。例如，在二维标准显微图像中，人胚胎干细胞在图像平面中呈现高核/质比、突出的核仁、以及紧凑的集落形成(具有不好分辨的细胞连接)。

如下文进一步详细描述的，还可以通过表达的细胞标记物来表征干细胞。

多能标记的表达

保留的生物活性可以包括一种或多种多能标记的表达。

阶段特异性胚胎抗原(SSEA)是一些胚胎细胞类型的特征。用于SSEA标记的抗体可获自Developmental Studies Hybridoma Bank(Bethesda Md.)。利用抗体指定的Tra-1-60和Tra-1-81，其它有用的标记是可检测的(Andrews et al.，Cell Lines from Human Germ Cell Tumors，in E.J.Robertson，1987，上文)。人胚胎干细胞通常是SSEA-1阴性的以及SSEA-4阳性的。hEG细胞通常是SSEA-1阳性的。灵长类多能干细胞(pPS)的体外分化导致SSEA-4、Tra-1-60、以及Tra-1-81表达的丧失，以及SSEA-1的表达增加。还可以通过碱性磷酸酶活性的存在来表征pPS细胞，其中上述碱性磷酸酶活性可以通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Vector Red作为底物进行显影，来检测，如制造商所描述的(Vector Laboratories，Burlingame Calif.)。

胚胎干细胞还通常是端粒末端转移酶阳性的和OCT-4阳性的。可以利用TRAP活性测定来确定端粒末端转移酶活性(Kim et al.，Science 266：2011，1997)，其中利用商用试剂盒(TRAPeze.RTM.XK Telomerase Detection Kit，Cat.s7707；Intergen Co.，Purchase N.Y.；或TeloTAGGG.TM.Telomerase PCR ELISA plus，Cat.2,013,89；Roche Diagnostics，Indianapolis)。还可以通过RT-PCR在mRNA水平下来评价hTERT表达。LightCycler TeloTAGGG^TM hTERT量化试剂盒(Cat.3,012,344；Roche Diagnostics)在商业上可获得，用于研究目的。

增殖的干细胞可以保留这些多能标记中的任何一种或多种，包括FOXD3、PODXL、碱性磷酸酶、OCT-4、SSEA-4、TRA-1-60以及Mab84等。

可以通过本领域已知的任何方式例如免疫学方式来实现标记的检测。可以使用组织化学染色、流式细胞术(FACS)、蛋白质印迹、酶联免疫测定(ELISA)等。

流式免疫细胞化学可以用来检测细胞表面标记。免疫组织化学(例如，固定细胞或组织切片的)可以用于细胞内或细胞表面标记。可以对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。酶联免疫测定可以用于细胞提取物或分泌进入培养基的产物。

为此目的，可以使用相对于多能标记(如可获自商业来源)的抗体。

可以商业上，例如从Chemicon International，Inc(Temecula，CA，USA)，获得用于鉴定干细胞标记的抗体，上述干细胞标记包括阶段特异性胚胎抗原1和4(SSEA-1和SSEA-4)以及肿瘤排斥抗原1-60和1-81(TRA-1-60、TRA-1-81)。利用单克隆抗体进行的这些抗原的免疫检测已广泛用来表征多能干细胞(Shamblott M.J.et.al.(1998)PNAS 95：13726-13731；Schuldiner M.et.al.(2000).PNAS 97：11307-11312；Thomson J.A.et.al.(1998).Science 282：1145-1147；Reubinoff B.E.et.al.(2000).Nature Biotechnology 18：399-404；Henderson J.K.et.al.(2002).Stem Cells20：329-337；Pera M.et.al.(2000).J.Cell Science 113：5-10)。

还可以在mRNA水平下通过RNA印迹分析、斑点杂交分析，或通过逆转录酶引发聚合酶链反应(RT-PCR)并利用标准扩增方法中的序列特异性引物，来检测组织特异性基因产物的表达。列在本文披露内容中的特定标记的序列数据可以获自公共数据库如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov：80/entrez)。关于进一步详情，参见美国专利号5,843,780。

基本上所有的增殖的细胞、或它们的大部分，可以表达标记。例如，表达一种或多种标记的细胞的百分比可以是50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或基本上100％。

细胞生存力

生物活性可以包括在所陈述数目的传代以后的细胞生存力。可以用各种方式，例如通过台盼蓝排除，来测定细胞生存力。

活体染色的规程如下。将适宜体积的细胞悬液(20-200μL)放置在适当的管中，添加等体积的0.4％台盼蓝并轻轻地混合，在室温下静置5分钟。将10μl染色细胞放置在血细胞计数器中并计数活(未染色)和死(染色)细胞的数目。计算在每个象限中未染色细胞的平均数，并乘以2×10⁴以得到细胞/ml。活细胞的百分比是活细胞的数目除以死亡和活细胞的数目。

细胞生存力可以是50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或基本上100％。

核型

在增殖期间或以后，增殖的干细胞可以保留正常核型。“正常”核型是这样的核型，其与干细胞所源自的亲代干细胞的核型相同、类似或基本上类似，或其不同于但并不以任何显著方式不同于上述亲代干细胞的核型。例如，不应存在任何严重异常如易位、染色体的丧失、缺失等。

可以通过许多方法来评估核型，例如光学显微镜下目测。可以制备和分析核型，如在McWhir et al.(2006)，Hewitt et al.(2007)、以及Gallimore和Richardson(1973)中所描述的。还可以利用标准G显带技术(可获自许多临床诊断实验室，其提供常规核型分析服务，如Cytogenetics Lab，Oakland Calif.)对细胞进行核型分析并与发表的干细胞核型进行比较。

所有或大部分的增殖细胞可以保留正常核型。此比例可以是50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或基本上100％。

多能性

增殖的干细胞可以保留分化成所有三种细胞谱系即内胚层、外胚层以及中胚层的能力。诱导干细胞分化成这些谱系中的每一种的方法在本领域是已知的并且可以用来测定增殖的干细胞的能力。所有或大部分的增殖细胞可以保留这种能力。此可以是50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、93％或更高、95％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或基本上100％的增殖干细胞。

可以通过利用适宜的测定来确定所产生的干细胞的多能性。上述测定可以包括：通过观测在SCID小鼠中畸胎瘤形成的程度或胚胎样体的形成，检测多能性的一种或多种标记，例如SSEA-1抗原、碱性磷酸酶活性，检测Oct-4基因和/或蛋白表达。可以通过一种或多种标记如Oct-4、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、SOX-2以及GCTM-2的表达，来定义hESC的多能性。

共培养物和饲养物

方法可以包括在有或没有共培养物存在的情况下培养干细胞。术语“共培养物”是指生长在一起的两种或更多种不同种类的细胞的混合物，例如，基质饲养细胞。两种或更多种不同种类的细胞可以生长在相同表面上，如颗粒或细胞容器表面，或不同表面上。不同种类的细胞可以生长在不同颗粒上。

饲养细胞，当该术语在本文中使用时，可以是指这样的细胞，其用于或需要用于培养不同类型的细胞。在干细胞培养的情况下，饲养细胞具有以下功能：确保生存、增殖、以及维持细胞多能性。可以通过直接共培养饲养细胞来实现细胞多能性。可替换地、或另外，可以在培养基中培养饲养细胞以对其进行调节。受调节的培养基可以用来培养干细胞。

容器如培养皿的内表面可以涂布有小鼠胚胎皮肤细胞的饲养层，其中上述小鼠胚胎皮肤细胞已被处理使得它们不会分裂。饲养细胞将营养物释放到培养基中，其是ES细胞生长所需要的。因而，生长在颗粒上的干细胞可以生长在上述经涂布的容器中。

其中没有或不需要饲养细胞的安排也是可能的。例如，可以使细胞生长在通过饲养细胞或干细胞调节的培养基中。

培养基和饲养细胞

用于分离和增殖多能干细胞的培养基可以具有许多不同配方中的任何一种，只要获得的细胞具有所期望的特征，并且可以进一步增殖。

适宜的来源如下：Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout Dulbecco改良的Eagle培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。典型的含血清胚胎干(ES)培养基用80％DMEM(通常为KO DMEM)、未热灭活的20％限定的胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺、以及0.1mMβ-巯基乙醇制成。过滤培养基并在4摄氏度下存储不长于2周。无血清胚胎干(ES)培养基用80％KO DMEM、20％血清替代品、0.1mM非必需氨基酸、1mML-谷氨酰胺、以及0.1mM β-巯基乙醇制成。一种有效的血清替代品是Gibco#10828-028。过滤培养基并在4摄氏度下存储不长于2周。刚好在使用之前，添加人bFGF至最终浓度为4ng/mL(Bodnar et al.，Geron Corp，International Patent Publication WO 99/20741)。

培养基可以包含Knockout DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)，补充有10％血清替代品培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)、5ng/ml FGF2(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)以及5ng/ml PDGF AB(Peprotech，Rocky Hill，New Jersey)。

可以在mEF培养基中增殖饲养细胞(在使用的情况下)，其中上述mEF培养基包含90％DMEM(Gibco#11965-092)、10％FBS(Hyclone#30071-03)、以及2mM谷氨酰胺。在T150烧瓶(Coming#430825)中增殖mEF，每隔一天用胰蛋白酶分裂细胞1∶2，保持细胞为亚汇合的。为了制备饲养细胞层，以一定剂量照射细胞以抑制增殖但允许支持人胚胎干细胞的重要因子的合成(约4000拉德γ照射)。通过在37摄氏度下用1mL 0.5％明胶/孔温育过夜来涂布6孔培养平板(如Falcon#304)，然后平板接种有375,000个经照射的mEF/孔。通常在平板接种以后5小时至4天使用饲养细胞层。

用于培养其它干细胞的条件是已知的，并且按照细胞类型可以适当地进行优化。用于先前部分提及的特定细胞类型的培养基和培养技术提供在引用的参考文献中。

无血清培养基

本文描述的方法和组合物可以包括在无血清培养基中培养干细胞。

术语“无血清培养基”可以包含没有血清蛋白，例如胎牛血清的细胞培养基。无血清培养基在本领域是已知的，并且描述于例如美国专利5,631,159和5,661,034中。无血清培养基可商业上获自，例如，Gibco-BRL(Invitrogen)。

无血清培养基可以是无蛋白的，因为它可以缺乏蛋白、水解产物、以及未知组成的成分。无血清培养基可以包括化学成分确定的培养基，其中所有成分具有已知的化学结构。化学成分确定的无血清培养基是有利的，因为它提供完全确定的体系，其可以消除可变性并提供提高的再现性和更加一致的性能，以及降低不定制剂污染的可能性。

无血清培养基可以包括Knockout DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，Grand Island，New York)。

无血清培养基可以补充有一种或多种成分，如血清替代品培养基，浓度为例如，5％、10％、15％等。无血清培养基可以补充有来自Invitrogen-Gibco(Grand Island，New York)的10％血清替代品培养基。

其中培养离解或解聚的胚胎干细胞的无血清培养基，可以包含一种或多种生长因子。许多生长因子在本领域中是已知的，包括FGF2、IGF-2、头蛋白、活化素A、TGF β1、HRG1β、LIF、S1P、PDGF、BAFF、April、SCF、Flt-3配体、Wnt3A以及其它生长因子。可以以任何适宜浓度如在1pg/ml至500ng/ml之间来使用生长因子。

培养基补充物

培养基可以补充有一种或多种添加剂。例如，这些添加剂可以选自脂质混合物、牛血清白蛋白(例如0.1％BSA)、大豆蛋白的水解产物中的一种或多种。

诱导多能干细胞的来源

现已提供了用于分离多能干细胞的多种方法，其并不导致胚胎的破坏，例如通过转化(诱导)成年体细胞或生殖细胞。这些方法包括：

1.通过细胞核移植的再编程。此技术涉及细胞核从体细胞转移到卵母细胞或合子中。在一些情况下，这可以导致产生动物-人杂交细胞。例如，可以通过人体细胞与动物卵母细胞或合子的融合或人卵母细胞或合子与动物体细胞的融合来产生细胞。

2.通过与胚胎干细胞的融合进行再编程。此技术涉及体细胞与胚胎干细胞的融合。如在上述1中，此技术也可以导致产生动物-人杂交细胞。

3.通过培养自发再编程。此技术涉及在长期培养以后从非多能细胞产生多能细胞。例如，通过原始生殖细胞(PGC)的长期培养，已产生多能胚胎生殖(EG)细胞(Matsui et al.，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture.Cell 70，841-847，1992，其结合于本文以供参考)。还已报道，在源自骨髓的细胞的长期培养以后，多能干细胞的发育(Jiang et al.，Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.Nature 418，41-49，2002，其结合于本文以供参考)。他们指定这些细胞为多能成年祖细胞(MAPC)。Shinohara等人还表明，在来自新生小鼠睾丸的生殖干(GS)细胞的培养期间，可以产生多能干细胞，他们将其指定为多能生殖干(mGS)细胞(Kanatsu-Shinohara et al.，Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell 119，1001-1012，2004)。

4.通过确定因子的再编程。例如，通过将转录因子(如Oct-3/4、Sox2、c-Myc、以及KLF4)逆转录病毒介导引入小鼠胚胎或成年成纤维细胞来产生iPS细胞，例如，如上所述。Kaji等人(Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors.Nature.Online publication 1March 2009)还描述了单一多蛋白表达载体的非病毒转染，上述单一多蛋白表达载体包括用2A肽连接的c-Myc、Klf4、Oct4以及Sox2的编码序列，其可以再编程小鼠和人成纤维细胞两者。借助于这种非病毒载体产生的iPS细胞显示多能标记的强劲表达，这表明功能上通过体外分化测定和成年嵌合小鼠的形成所证实的重新编程状态。他们从具有多能标记的强劲表达的胚胎成纤维细胞成功建立了重新编程的人细胞系。

Shinya Yamanaka在Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells (Cell Stem Cell 1，July 2007^a2007Elsevier Inc)(其结合于本文以供参考)中描述和讨论了方法1-4。

5.从单个卵裂球或活检卵裂球衍生hESC系。参见Klimanskaya I，Chung Y，Becker S，Lu SJ，Lanza R.Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres.Nature 2006；444：512，Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells：current status，problems and challenges.Cell Research (2007)17：682-688，Chung Y，Klimanskaya I，Becker S，et al.Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres.Nature.2006；439：216-219.Klimanskaya I，Chung Y，Becker S，et al.Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres.Nature.2006；444：481-485.Chung Y，Klimanskaya I，Becker S，et al.Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction.Cell Stem Cell.2008；2：113-117以及Dusko Ilic et al( Derivation of human embryonic stem cell lines from biopsied blastomeres on human feeders with a mini

6.hESC系获自静止的胚胎，其体外停止分裂并且未能发育成桑葚胚和胚泡。参见Zhang X，Stojkovic P，Przyborski S，et al.Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos.Stem Cells 2006；24：2669-2676以及Lei et al Xeno-free derivation and culture of human embryonic stem cells：current status，problems and challenges.Cell Research(2007)17：682-688，两者结合于本文以供参考。

7.单性生殖(或孤雌生殖)。此技术涉及未受精卵的化学或电刺激以便引起它发育成卵裂球，从该卵裂球可以衍生胚胎干细胞。例如，参见Lin et al.Multilineage potential of homozygous stem cells derived from metaphase II oocytes.Stem Cells.2003；21(2)：152-61，其采用非受精中期II卵母细胞的化学活化以产生干细胞。

8.胎儿起源的干细胞。就潜力而言，这些细胞位于胚胎和成年干细胞之间并且可以用来衍生多能或多能性细胞。Chris H.Jo等人(Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion.Cell Tissue Res(2008)334：423-433，其结合于本文以供参考)已成功衍生表达多能标记(包括Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、以及Tra-1-81，如β-半乳糖苷酶染色、以及端粒末端转移酶活性的一致表达所表明的衰老的最小证据)的人脐源性胎儿间充质干细胞(UC fMSC)。Winston Costa Pereira等人(Reproducible methodology for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential for cardiomyocyte generation J Tissue Eng Regen Med 2008；2：394-399，其结合于本文以供参考)从人脐带的沃顿氏胶分离了间充质干细胞的纯群体。在Troyer & Weiss(Concise Review：Wharton’s Jelly-Derived Cells Are a primitive Stromal Cell Population.Stem Cells 2008：26：591-599)中还综述了源自沃顿氏胶的间充质干细胞。Kim等人(Ex vivo characteristics of human amniotic membrane-derived stem cells.Cloning Stem Cells 2007Winter；9(4)：581-94，其结合于本文以供参考)成功从人羊膜分离了人羊膜源性间充质细胞。脐带是通常丢弃的组织，并且从此组织衍生的干细胞往往不会引起道德或伦理的反对。

诱导多能干细胞具有以下优点：它们可以通过并不引起胚胎破坏的方法来获得，更特别地通过并不引起人或哺乳动物胚胎破坏的方法获得。因此，通过使用并不专门通过必然涉及人或动物胚胎破坏(从其可以衍生那些细胞)的方法制备的细胞，可以进行或实施本发明的方面。这种可选的限制具体用来考虑到欧洲专利局扩大上诉委员会的2008年11月25日的决定G0002/06。

未分化细胞的分化

IPSC可以被诱导以分化成各种不同的细胞类型。例如，IPSC可以被诱导以分化成心脏细胞(心肌细胞)、肝细胞、神经细胞、软骨(软骨细胞)、肌肉、脂肪(脂肪细胞)、骨(骨细胞)或其它细胞。IPSC可以被诱导以形成组织如上皮组织、中胚层、内胚层、外胚层或表皮。

分化干细胞的方法在本领域是已知的并且描述在例如Itskovitz-Eldor(2000)和Graichen等人(2007)中并且可以与IPSC一起使用。培养的干细胞还可以用于胚胎样体的形成。胚胎样体、以及用于制备它们的方法在本领域是已知的。术语“胚胎样体”是指在培养物中看到的球状集落，其可以通过在悬浮液中的胚胎干细胞的生长来产生。胚胎样体具有混合细胞类型，并且特定细胞类型的出现的分布和定时对应于在胚胎中所观测到的分布和定时。可以通过将胚胎干细胞平板接种到培养基如半固体培养基上来产生胚胎样体。如在Lim et al，Blood.1997；90：1291-1299中所描述的，可以使用甲基纤维素培养基。

胚胎干细胞可以被诱导以形成胚胎样体，例如利用在Itskovitz-Eldor(2000)中所描述的方法。胚胎样体包含所有三种胚层(内胚层、外胚层、中胚层)的细胞。

胚胎样体可以进一步被诱导以分化成不同谱系，例如通过暴露于适当的诱导因子或环境变化。Graichen等人(2007)描述了通过操作p38MAP激酶途径而从人胚胎干细胞形成心肌细胞。Graichen证实了，通过暴露于p38MAP激酶的特异性抑制剂如SB203580(小于10μm)来诱导从干细胞形成心肌细胞。

分化细胞可以用于任何适宜目的，如再生疗法和细胞移植(如本领域已知的)。

治疗用途

通过本发明的方法鉴定和/或分离的分化和未分化IPSC在医学上例如在细胞治疗中具有各种用途。细胞治疗可以包括细胞的植入或移植，或者作为单个细胞的群体、或以细胞凝集体或组织的形式，和/或再生疗法，例如组织再生、替代和/或修复。可以在体外培养物中扩增分化和未分化IPSC并直接给予患者。在创伤以后，它们可以用于损伤组织的种群恢复和/或修复。

IPSC可以直接使用，或用来产生外胚层、中胚层或内胚层祖细胞群体，用于再生疗法。可以通过离体扩增来制造祖细胞或将祖细胞直接给予患者。它们还可以在创伤以后用于损伤组织的种群恢复和/或修复。

因此，造血祖细胞可以用于骨髓替代，而心脏祖细胞可以用于心力衰竭患者。皮肤祖细胞可以用于生长患者的皮肤移植物以及内皮祖细胞用于人工假体如支架或人工心脏的内皮化。

IPSC可以用作外胚层、中胚层或内胚层祖细胞的来源，上述细胞用于治疗变性疾病如糖尿病、亨廷顿病、阿尔茨海默病以及帕金森病。IPSC可以用作中胚层或内胚层祖细胞(用于NK)或树突状细胞(用于癌症的免疫治疗)的来源。

本文描述的方法和组合物使得能够产生外胚层、中胚层或内胚层祖细胞，当然可以利用本领域已知的方法制造上述细胞以进一步分化成终末分化的细胞类型。因此，终末分化的细胞的任何应用同样归因于作为它们的来源的那些外胚层、中胚层或内胚层祖细胞(或干细胞)。

通过本文描述的方法和组合物所产生的IPSC、外胚层、中胚层或内胚层祖细胞以及分化细胞可以用于治疗疾病，或用来制备用于治疗疾病的药物组合物。上述疾病可以包括通过再生疗法可治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、变性疾病如糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病以及癌症。

按照本文描述的方法和组合物增殖的干细胞(以及从其衍生的分化细胞)可以用于治疗，例如在需要其的个别患者中的组织再构成或再生。可以以一定方式给予细胞，以致允许它们移植到所期望的组织部位并再构成或再生功能缺乏区域。

增殖的干细胞或从其衍生的分化细胞可以用于组织工程学，如用于皮肤移植物的生长。它们可以用于人造器官或组织的生物工程，或用于假体，如支架。分化细胞还可以在需要其的人患者中用于组织再构成或再生。以这样的方式给予细胞，即，允许它们移植到所期望的组织部位和再构成或再生功能缺乏区域。

例如，本文描述的方法和组合物可以用来调节干细胞的分化。分化细胞可以用于组织工程学，如用于皮肤移植物的生长。干细胞分化的调节可以用于人造器官或组织的生物工程，或用于假体，如支架。

在另一个实例中，根据待治疗的疾病，将神经干细胞直接移植到中枢神经系统的实质或鞘内部位中。利用密度为25,000-500,000个细胞/μL的单细胞悬液或小聚集体来进行移植(美国专利号5,968,829)。可以用急性损伤脊髓的大鼠模型来评估神经细胞移植物的功效，如McDonald等人(Nat.Med.5：1410，1999)所描述的。成功的移植物将在2-5周以后在病变处显示存在移植物源性细胞，分化成星形细胞、少突胶质细胞、和/或神经元，并沿着来自病变端的脊髓进行迁移，以及在通道、协调、以及负重方面的改善。

一些神经祖细胞被设计用于治疗对神经系统的急性或慢性损伤。例如，兴奋性中毒已涉及各种病症，包括癫痫、卒中、缺血、亨廷顿病、帕金森病以及阿尔茨海默病。如按照本文描述的方法制造的一些分化细胞还可以适用于治疗髓鞘形成障碍，如佩-梅病、多发性硬化、脑白质营养不良、神经炎以及神经病。适用于这些目的的是富集有用来促进再髓鞘化的少突胶质细胞或少突胶质细胞前体的细胞培养物。

可以用动物模型来评估利用我们的方法制备的肝细胞和肝细胞前体修复肝损伤的能力。一个这样的实例是通过腹腔内注射D-半乳糖胺引起的损伤(Dabeva et al.，Am.J.Pathol.143：1606，1993)。可以通过肝细胞标记的免疫组织化学染色、显微镜测定是否小管结构形成在生长组织中、以及治疗恢复肝特异性蛋白的合成的能力，来确定治疗功效。肝细胞可以通过直接给予来用于治疗，或作为生物辅助装置的一部分，当在暴发性肝功能衰竭以后主体的肝组织再生自身的同时，上述装置提供临时肝功能。

通过例如用SB203580(一种特异性p38MAP激酶抑制剂)调节MAP激酶途径通过诱导干细胞的分化，可以制备心肌细胞，如在Graichen等人(2007)中所描述的。可以用心脏冻伤的动物模型来评估上述心肌细胞的功效，上述心脏冻伤在没有进行治疗的情况下会引起55％的左心室壁组织变成瘢痕组织(Li et al.，Ann.Thorac.Surg.62：654，1996；Sakai et al.，Ann.Thorac.Surg.8：2074，1999，Sakai et al.，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.118：715，1999)。成功的治疗会减少瘢痕面积，限制瘢痕扩张，以及改善心脏功能，如通过收缩压、舒张压、以及扩展压力所确定的。还可以利用在左前降支动脉的远端部分中的栓子形成旋管来建立心脏损伤的模型(Watanabe et al.，Cell Transplant.7：239，1998)，并且可以通过组织学和心脏功能来评价治疗的功效。心肌细胞制剂可以用于治疗以再生心肌以及治疗心脏功能不足(美国专利号5,919,449和WO 99/03973)。

可以引导IPSC分化成各种细胞类型，并提供了可更新来源的置换细胞和组织治疗各种疾病和病症的可能性。这些疾病和病症包括亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病、脊髓损伤、骨损伤(例如骨折)、卒中、烧伤、心脏病、糖尿病、骨关节炎、以及类风湿性关节炎。可以治疗需要可移植组织和器官的疾病和病症，并且尤其是在以下情况下：有用的是，在移植以前破坏未分化细胞，例如防止畸胎瘤的形成。

本发明提供了可以包含通过本发明的任何方法分离的未分化诱导多能干细胞和分化诱导多能干细胞的药物和药物组合物。如上所述，可以提供上述药物和药物组合物用于医疗方法。适宜的药物组合物可以进一步包含药用载体、佐剂或稀释剂。

因此，本发明还提供了包含利用本发明的方法已被处理以破坏未分化IPSC的细胞的药物组合物和药物。

通过PODXL的细胞表面表达来鉴定和选择未分化诱导多能干细胞的能力使得能够提供这样的组合物和药物，其包含未分化诱导多能干细胞和基本上没有分化诱导多能干细胞，或可替换地，分化诱导多能干细胞和基本上没有未分化诱导多能干细胞。术语“基本上没有”包括这样的组合物，其中指定细胞的数目小于组合物中细胞的总数的约10％。更优选，其小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、或小于约1％。在一些实施方式中，指定细胞可以不存在，或以足够低的量存在，以致在检测限度以外，即，组合物具有基本上为0％的指定细胞。

通过根据本发明的方法分离的分化和未分化诱导多能干细胞可以用于医疗方法。医疗方法可以包括给予需要治疗的个体治疗有效量的所述药物或药物组合物。

通过根据本发明的方法和技术获得的分化和未分化诱导多能干细胞可以用来分化成用于医疗方法的另一种细胞类型。因此，分化的细胞类型可以来源于通过所描述的方法和技术所获得的干细胞，以及可以看作是通过所描述的方法和技术所获得的干细胞的产物，其中上述干细胞已随后被允许分化。可以提供包含上述分化细胞的药物组合物，可选地连同药用载体、佐剂或稀释剂。这样的药物组合物可以用于医疗方法。

待治疗的主体可以是任何动物或人。主体优选为哺乳动物，更优选人。主体可以是雄性或雌性。主体可以是患者。治疗用途可以是用于人或动物(兽医使用)。

可以配制根据本发明的方面的药物和药物组合物，用于通过许多途径来给予，包括但不限于胃肠道外途径、静脉内途径、动脉内途径、肌肉途径、肿瘤内途径、口服以及鼻途径。可以配制药物和组合物，用于注射。

优选以“治疗有效量”给予，其足以显示对个体的益处。给予的实际量、以及给予的速率和时程，将取决于待治疗疾病的特性和严重性。治疗处方，例如剂量确定等，在全科医生和其它医生的责任范围内，并且通常考虑到待治疗的疾病、个别患者的状态、递送部位、给予方法以及从业者已知的其它因素。上述技术和规程的实例可以参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams &Wilkins。

配制药用组合物和药物

根据本发明，还提供了用于生产药用组合物的方法，其可以基于如此鉴定的一种或多种细胞。除了本文描述的方法的步骤之外，上述生产方法可以进一步包括选自下述的一个或多个步骤：

(a)鉴定一种或多种未分化或分化诱导多能干细胞；

(b)分离和/或获得一种或多种未分化或分化诱导多能干细胞；

(c)使一种或多种未分化或分化诱导多能干细胞与药用载体、佐剂或稀释剂混合。

步骤(c)优选产生适用于治疗用途的药物组合物或药物的配方/制剂。

序列同一性

序列同一性百分比(％)定义为，在对比序列和引入间隙(如果有必要)(以获得最大序列同一性)以后，在候选序列中与给定列出序列(称作SEQ ID NO)中的残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分。优选在相应序列的整个长度范围内计算序列同一性。

在对比序列具有不同长度的情况下，可以相对于更长给定序列的整个长度来确定更短比较序列的序列同一性，或在比较序列比给定序列更长的情况下，可以相对于更短给定序列的整个长度来确定比较序列的序列同一性。

用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的序列对比可以以本领域技术人员已知的各种方式来实现，例如，利用可公开获得的计算机软件如ClustalW 1.82.T-coffee或Megalign(DNASTAR)软件。当使用上述软件时，优选使用默认参数，例如用于空位罚分和扩展罚分。ClustalW 1.82的默认参数是：蛋白间隙开放罚分＝10.0，蛋白间隙扩展罚分＝0.2，蛋白基质＝Gonnet，蛋白/DNA ENDGAP＝-1，蛋白/DNA GAPDIST＝4。

本发明包括所描述的方面和优选特点的组合，除非这样的组合明显不允许或要明确避免。

本文使用的节标题仅出于组织目的而不应看作限制所描述的主题。

现将参照附图通过实例来描述本发明的方面和实施方式。另外的方面和实施方式对于本领域技术人员来说会是显而易见的。本文提及的所有文献均结合于本文以供参考。

附图说明

现将参照附图来论述说明本发明原理的实施方式和实验，在附图中：

图1-6示出了结合于hESC(HES-3)、IPSC(ES4SKIN、ESIMR90)以及成纤维细胞系(BJ1、IMR90)的mAb的分析。用不同mAb克隆(mAb 5、8、14、63、84、85、329、432以及529)染色细胞，上述克隆是相对于在hESC上的细胞表面抗原、mAb至TRA-1-60或mAb至Oct-4培养的。用FITC-共轭抗小鼠抗体来检测结合于细胞的抗体。红色直方图表示用阴性对照的染色以及绿色直方图表示用一抗的染色。

图7示出了mAb 84对hESC、IPSC以及成纤维细胞系的细胞毒性。(A)在4℃下使用5μg mAb 84(B)或没有使用抗体(对照，A)温育细胞45分钟。其后，收获细胞用于在流式细胞仪上通过PI排除测定进行分析。在散布图中的门控区表示活细胞群体。

图8.细胞毒性mAb84还杀伤诱导多能干细胞。该图示出了根据图7的结果总结。在4℃下在使用5μg mAb 84(深蓝色条)或没有使用抗体(浅蓝色条)温育45分钟以后细胞的生存力百分比。

图9.显微照片示出了通过ES4SKIN和ESIMR90细胞表达多能标记Oct4SSEA 4和Tra-1-60。

图10.表示出了各种单克隆抗体与hESC(HES-3)、IPSC(ES4SKIN和ESIMR90)、包皮以及IMR90细胞的结合(由钩号表示)。

图11.528个氨基酸足糖萼蛋白样蛋白1前体的氨基酸序列(SEQ IDNO：1)。

图12.人PODXL GenBank登录号O00592.2GI：229462740的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图13.人PODXL GenBank登录号AAI43319.1GI：219520307的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

图14.mAb 84的V_L链的氨基酸序列(和编码多核苷酸序列)(SEQ IDNO：4&5)。未加下划线的氨基酸对应于构架区。加下划线的氨基酸对应于互补决定区(CDR)。

图15.mAb 84的V_H链的氨基酸序列(和编码多核苷酸序列)(SEQ IDNO：6&7)。未加下划线的氨基酸对应于构架区。加下划线的氨基酸对应于CDR。

图16.两种PODXL变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：8&9)。

具体实施方式

在下面所附的描述中通过实施例陈述了本发明的一个或多个实施方式的细节，包括本发明人设想的用于实施本发明的最佳方式的具体细节。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，可以实施本发明而不限于这些具体细节。

像hESC一样，分化诱导多能干细胞的未来的治疗应用具有通过污染残余IPSC的畸胎瘤形成的危险。尽管存在该问题，但目前并没有开发许多策略来分开这些细胞群体。mAb是特异性地靶向抗原上的单表位的抗体的同源群体。因此，本申请的mAb可以潜在地用来纯化或消除呈现抗原库的活细胞的子集，其中上述抗原库表征分化成具体谱系的一种或多种未分化细胞。

mAb 84可以在分化以后和在动物移植试验以前用来消除残余诱导多能干细胞以测试它们的分化细胞的功能。

mAb 84(连同其它mAb一起，如在WO 2007/102787中所描述的)可以在移植以前潜在地用来消除残余hESC或诱导多能干细胞，从而在再生医学应用中增加移植的成功和安全。

实施例1

材料与方法

细胞培养

人胚胎干细胞系HES-3获自ES Cell International。在37℃/5％CO₂下在人工基膜涂覆的器官培养皿上培养细胞，其中上述培养皿补充有来自小鼠饲养物的受调节的培养基，ΔE-MEF(无饲养物的培养物)。用于培养hESC的培养基是KNOCKOUT(KO)培养基。如先前所述⁴，对于无饲养物的培养物，在酶处理以后，对hESC进行传代。

人诱导多能干细胞系，ES4SKIN和ESIMR90，获自University of Wisconsin并如先前所述⁴进行培养。人包皮成纤维细胞系，BJ1(CRL-2522)，以及肺成纤维细胞系，IMR90(CCL-186)，购买自American Type Culture Collection并按照供应商的说明进行培养。

流式细胞术分析

利用胰蛋白酶，细胞被收获为单细胞悬液，以2×10⁵个细胞/10μl体积再悬浮在1％BSA/PBS中，然后用每种mAb克隆(5-10μg纯化的mAb，在200μl 1％BSA/PBS中)或TRA-1-60(2.5μg，在200μl 1％BSA/PBS中，Chemicon，MAB4360/4381)温育45分钟。然后用冷1％BSA/PBS洗涤细胞，并进一步用1∶500稀释度的山羊α-小鼠抗体(FITC共轭的)(DAKO)温育15分钟。在温育以后，再次洗涤细胞并再悬浮在1％BSA/PBS和1.25mg/ml碘化丙啶(PI)中，用于在FACScan(Becton Dickinson FACS Calibur)上进行分析。除非另外指出，在4℃下进行所有温育。作为阴性对照，用适当的同型对照对细胞进行染色。

对于Oct-4染色，对单细胞悬液进行固定，透化处理(Caltag Laboratories)，并且用1∶20稀释度的相对于Oct-4(Santa Cruz，sc-5279)的小鼠mAb温育。然后用1％BSA/PBS洗涤细胞，并进一步用1∶500稀释度的山羊α-小鼠抗体(FITC共轭的)(DAKO)温育15分钟。在温育以后，再次洗涤细胞并再悬浮在1％BSA/PBS中供分析。在室温下进行所有温育15分钟。作为阴性对照，用适当的同型对照对细胞进行染色。

细胞毒性测定

利用PI排除测定和流式细胞术来评价mAb 84对细胞的细胞毒性。如上所述，用mAb 84(5μg纯化的mAb，在200μl 1％BSA/PBS中)温育以2×10⁵个细胞/10μl体积的在1％BSA/PBS中的单细胞悬液45分钟。其后，洗涤细胞并再悬浮在1％BSA/PBS和1.25mg/ml碘化丙啶(PI)中，用于通过FACS进行分析。作为阴性对照，在没有一抗的情况下，温育细胞。除非另外指出，在4℃下进行所有温育。

结果

mAb与hESC、IPSC以及成纤维细胞系的反应性

在第一种情况下，测试所有细胞系的多能标记Oct-4和Tra-1-60的表达(分别为图1a和b)。如预期的，仅hESC和IPSC表达两种标记，虽然在两种成纤维细胞系中表达均被显著下调。

随后，对相对于hESC的9种内部的mAb的小组，筛查与5种细胞系的结合(图2-6)。类似于hESC，发现所有9种mAb结合于hESC和IPSC。因为ES4SKIN和ESIMR90重新编程自分别来自包皮和肺的原代成纤维细胞，所以在筛查中并入这些原代细胞系以鉴定仅结合于“重新编程”细胞系但不结合于亲代成纤维细胞系的抗体。基于筛查结果，7种mAb克隆并不结合于原代成纤维细胞。然而，观测到mAb 5和mAb 63的反应性。此结果是与先前的利用hESC的观测结果一致的¹。此结果表明，对于这两种mAb克隆的抗原靶的表达在所有人细胞中可以是保守的，并且尤其是，对于mAb 5来说，与hESC或IPSC相比，在终末分化的原代成纤维细胞中被上调。

细胞毒性抗体mAb 84的表征

为了研究是否mAb 84类似于hESC杀伤IPSC，用mAb 84温育细胞并利用PI排除测定来评价细胞毒性。发现，与对照相比(图7和8)，在用mAb 84温育(在4℃下，45分钟)以后，分别有2.5、7.6以及6.4％的hESC、ES4SKIN以及ESIMR90细胞保持活力。与此相反，对于BJ1和IMR90成纤维细胞系，生存力仍然为100％。一并考虑mAb 84的结合和细胞毒性数据(图6-9)，可以推断mAb 84结合并杀伤hESC和IPSC两者。mAb 84的这种细胞毒性作用相关于mAb与细胞系的结合，因为mAb 84对并不结合mAb(BJ1和IMR90)的细胞并不施加细胞毒性作用。

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Claims

1.一种在包含一种或多种未分化诱导多能干细胞的样品中鉴定一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，所述方法包括鉴定在所述样品中的在它们的表面上表达足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的一种或多种细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述一种或多种未分化诱导多能干细胞借助于被结合于所述结合部分而被鉴定。

3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括分离在它们的表面上表达PODXL的一种或多种所述细胞，其中，所述方法包括：

(i)使所述样品与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在所述样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及

(ii)使结合于所述结合部分的细胞与未结合于所述部分的细胞分离。

4.一种使未分化诱导多能干细胞与已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞分离的方法，其中，所述未分化诱导多能干细胞和已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞存在于样品中，所述方法包括：

(i)使所述样品与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在所述样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及

5.一种通过根据权利要求1至4中任一项所述的方法获得的分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞。

6.一种通过根据权利要求4所述的方法获得的分离的一种或多种分化诱导多能干细胞。

7.一种从包含未分化诱导多能干细胞的样品中分离一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，所述方法包括分离在所述样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种所述细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，使所述样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述一种或多种未分化诱导多能干细胞借助于被结合于所述结合部分而从所述样品中分离。

9.一种通过根据权利要求7或8所述的方法分离的一种或多种未分化诱导多能干细胞。

10.一种从包含未分化诱导多能干细胞和已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的混合物中富集未分化诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：

(i)使所述混合物与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在所述混合物中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及

(ii)使结合于所述部分的细胞与未结合于所述部分的细胞分离，以便产生富集有未分化诱导多能干细胞的细胞群体。

11.一种从包含未分化诱导多能干细胞和已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的混合物中富集已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：

(ii)使未结合于所述部分的细胞与结合于所述部分的细胞分离，以便产生富集有已经历或正在经历分化的诱导多能干细胞的细胞群体。

12.一种制备包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物的方法，所述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞，所述方法包括：

(i)提供包含未分化诱导多能干细胞和从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的细胞群体；

(ii)使所述群体与能够结合足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的结合部分在允许所述部分结合于在所述样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触；以及

(iii)使未结合于所述结合部分的细胞与结合于所述部分的细胞分离。

13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括使分离的所述未结合于所述结合部分的细胞与药用载体、佐剂或稀释剂混合。

14.一种制备包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞的组合物的方法，所述组合物基本上不包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞，所述方法包括：

(iii)使结合于所述结合部分的细胞与未结合于所述部分的细胞分离。

15.根据权利要求14所述的方法，进一步包括从分离的所述结合于所述结合部分的细胞中离解所述结合部分。

16.根据权利要求14或15所述的方法，进一步包括使分离的所述结合于所述结合部分的细胞与药用载体、佐剂或稀释剂混合。

17.一种将能够结合PODXL的结合部分结合于未分化诱导多能干细胞的方法，所述方法包括使包含一种或多种未分化诱导多能干细胞的样品与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在所述样品中在细胞表面上表达的PODXL的条件下接触。

18.一种在包含未分化诱导多能干细胞的样品中破坏一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，所述方法包括破坏在所述样品中的在它们的表面上表达PODXL的一种或多种所述细胞。

19.一种从包含未分化诱导多能干细胞的样品中除去一种或多种未分化诱导多能干细胞的方法，所述方法包括从所述样品中除去在它们的表面上表达PODXL的一种或多种所述细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，使所述样品与结合部分接触，所述部分结合于PODXL，并且所述一种或多种未分化诱导多能干细胞借助于被结合于所述结合部分而从所述样品中除去。

21.根据权利要求2至4、8、10至17或20中任一项所述的方法，其中，所述结合部分是抗体。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述抗体是mAb84。

23.一种包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞的组合物，所述组合物基本上不包含在它们的表面上表达PODXL的未分化诱导多能干细胞。

24.一种包含未分化诱导多能干细胞的组合物，所述组合物基本上不包含从未分化诱导多能干细胞分化的细胞。

25.根据权利要求24所述的组合物，其中，所述未分化诱导多能干细胞在它们的表面上表达PODXL。

26.一种治疗需要细胞治疗的患者的方法，所述方法包括给予所述患者根据权利要求5、6或9中任一项所述的一种或多种细胞或根据权利要求23至25中任一项所述的组合物。

27.根据权利要求5、6或9中任一项所述的一种或多种细胞或根据权利要求23至25中任一项所述的组合物在制备用于治疗需要细胞治疗的患者的药物中的应用。

28.根据权利要求5、6或9中任一项所述的一种或多种细胞或根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，用于治疗需要细胞治疗的患者。

29.一种复合物，包含在它的表面上表达足糖萼蛋白样蛋白(PODXL)的未分化诱导多能干细胞和能够结合PODXL的结合部分，所述结合部分结合于在所述未分化诱导多能干细胞的表面上表达的PODXL。

30.一种试剂盒，包括结合PODXL的结合部分、以及检测另一种诱导多能干细胞标记的另外的制剂。

31.一种产生和鉴定诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：

(ii)使所述诱导多能干细胞与能够结合PODXL的结合部分在允许所述部分结合于在所述诱导多能干细胞的表面上表达的PODXL的条件下接触；以及

(iii)鉴定由所述结合部分结合的细胞。