WO2022032742A1 - 一种使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法，通过qPCR检测方法定量检测样品中的ESRG基因数量，从而检测样品中的iPSC残留。该方法采用ESRG基因片段作为通用标记基因，可以针对包括内皮祖细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体等一系列细胞进行检测，不需要更换标记基因；同时能够在短时间内进行检测，大大提高了检测效率。该方法在检测时，仅需要mRNA提取、反转录以及qPCR试剂，成本低，准确性高。
Description
本发明涉及一种使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法，属于生物技术领域。
诱导多能干细胞(iPSC)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。诱导多能干细胞(iPSC)技术的出现为再生医学疗法铺平了道路。从理论上讲，iPSC可以分化为我们体内任何类型的细胞，并且科学家已经开发出了将iPSC分化为特定细胞类型的各种方案，包括神经细胞，心肌细胞，内皮细胞，视网膜色素上皮细胞，胰岛小体和肝细胞等等。除此之外，iPSC在类器官技术中也得到了广泛的使用。
iPSC拥有无限增殖的能力，在体内可以形成畸胎瘤；因此，要将iPSC技术应用于再生医学并为患者提供可移植的细胞或者组织，我们必须确保iPSC来源的细胞或者器官安全性，即，必须确保未分化的iPSC细胞被排除在分化细胞之外。因此，检测iPSC分化来源的功能细胞中的iPSC细胞残留也就成为了iPSC在临床使用中的重中之重。
诱导多能干细胞(iPSC)是一种类似胚胎干细胞(ESC)的多能干细胞，主要反映在iPSC和ESC基因表达及其相似。当我们鉴定iPSC或者ESC时，可以通过检测干性相关基因的表达来实现，在不同的组织细胞中iPSC或者ESC可能表达不同的干性相关基因，我们需要挑出只在iPSC/ESC中表达， 在其他的组织细胞中不表达，或者只在极少数细胞/组织中表达的基因，用这些挑出的基因作为iPSC/ESC残留检测的标记基因。
常见的干细胞相关基因为SOX2、POU5F1、ESRG，lin28A以及NANOG等，ESRG是一个干细胞相关基因，在iPSC和ESC中表达，但ESRG目前对于干细胞的功能尚不明确。
用于iPSC残留检测的基因需要满足一些条件：a.该基因特异性的在iPSC中大量表达；b.该基因在分化的细胞中不表达或者微量表达；c.该基因在分化细胞中有表达时，其表达水平在分化细胞和iPSC细胞中存在显著差异。
目前存在一些检测分化细胞中未分化的iPSC细胞方法。一种方法是扩增培养，即使用iPSC/ESC培养基，培养待检细胞10-14天，未分化的iPSC/ESC培养10-14天后，形成肉眼可见的克隆，检测克隆的碱性磷酸酶活性或者干性基因。这种方法可以有效的检测到iPSC残留，但是该方法需要10到14天检测时间，同时会有残留iPSC自分化产生假阴性可能。另外一种方法则是通过qPCR手段，检测iPSC特定表达的基因，进而实现检测iPSC残留的目的。例如，现有技术能够通过qPCR检测lin28A用于检测iPSC诱导的视网膜色素上皮细胞(RPE)中残留的iPSC细胞，该方法已应用于患者。但是这种方法通常针对特定的功能细胞，并不总是适用于功能细胞。例如，研究表明lin28A就不能检测iPSC诱导的肝细胞、内皮祖细胞以及胰岛小体等的iPSC细胞残留。
另外，现有技术中的检测方法还存在检测效率低、成本高的缺点。而通过细胞培养扩大的检测方式中，还存在过低的浓度细胞不易成活以及iPSC容易分化出现假阳性的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法。
本发明解决上述技术问题的一种技术方案如下：一种用于检测iPSC分化细胞中iPSC残留的通用标记基因，所述通用标记基因为ESRG基因。
本发明提供一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，所述检测方法使用的标记基因为如权利要求1所述的通用标记基因。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述检测方法通过qPCR定量检测样品中的ESRG基因，并将其与标准品进行对比，从而得到样品中iPSC残留的数量。
进一步，包括以下步骤：
1)截取所述ESRG基因片段作为目的序列，通过分子生物学方法构建含有目的基因序列的ESRG标记基因结构；
2)采用载体质粒制备含有所述ESRG标记基因结构的质粒DNA，以其为标准品，并对所述标准品进行梯度稀释；
3)根据所述目的基因序列设计引物，并将引物和所述标准品通过qPCR进行检测，制作所述标准品的溶解曲线和标准曲线；
4)将待测iPSC分化来源的细胞通过总mRNA提取和反转录方法制备样品，将所述样品和所述引物通过qPCR进行检测以检测样品中的ESRG标记基因，根据熔解曲线对比检出所述引物的特异性，并根据标准曲线得到iPSC残留量。
进一步，步骤1)中，所述目的基因序列为，在ESRG的cDNA序列中任意选取一段大于200bp的序列。
进一步，所述目的基因序列长度为338bp,其核苷酸序列如序列SEQ ID NO:2所示。
进一步，步骤3)中，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引 物的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:3所示，所述下游引物的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:4所示。
进一步，步骤2)中，所述载体质粒为pUC57-Amp。
进一步，步骤3)中，所述qPCR检测的程序为，94℃30秒,94℃30秒,55℃15秒，72℃10秒；循环数45。
本发明提供一种如上所述通用标记基因的应用，其可用于对由iPSC分化细胞中残留iPSC的定量检测，所述由iPSC分化细胞包括内皮细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体。
本发明的有益效果在于，采用ESRG基因片段作为通用标记基因，可以针对包括内皮细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体等一系列细胞进行检测，不需要更换标记基因；同时能够在短时间内进行检测，检测时间可以缩短为8小时以内，大大提高了检测效率。本发明的方法在检测时，仅需要mRNA提取、反转录以及qPCR试剂，成本低；并且由于ESRG是干细胞特用的基因，使本发明的检测方法具有准确性高的特点，避免了通过细胞培养扩大的检测方式中，过低的密度，细胞不易成活，以及iPSC容易分化出现假阳性。
图1为本发明实施例1中筛选基因的在不同组织器官中的表达图；
图2为本发明实施例1中ESRG、lin28A以及NANOG在iPSC和ESC中的表达水平柱形图；
图3为本发明实施例1中ESRG、lin28A以及NANOG在多种分化细胞中的表达水平的柱形图；
图4为本发明实施例2中含有ESRG标记基因结构的质粒DNA标准品的 结构图；
图5为本发明实施例2中标准品的熔解曲线；
图6为本发明实施例2中标准品的标准曲线；
图7为本发明实施例2中阳性对照组iPSC的熔解曲线；
图8为本发明实施例2中样品iEPC-1组、iEPC-2组以及iEPC-3组的熔解曲线。
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
以下实施例中，总mRNA的提取方法、总mRNA反转录以及qPCR检测涉及的试剂均购买自北京全式金生物科技优先公司；诱导多能干细胞(iPSC)通过赛默飞世尔科技(中国)有限公司重编程试剂盒构建、胚胎干细胞H9来自北京大学分子医学研究所干细胞实验室、诱导的内皮祖细胞(iEPC)、内皮细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体均由北京呈诺医学科技有限公司根据现有文献分化得到；ESRG，lin28以及NANOG的引物合成，载体pUC57-Amp购买自安徽通用生物科技有限公司。
以下实施例中，总mRNA的提取方法为：1)将细胞培养皿中的细胞样品用PBS洗两次后，加入1ml Trizol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；3)4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA 沉淀；6)用75％乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干；视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。
以下实施例中，将总mRNA反转录为cDNA的反转录方法为：1)使用分光光度计测量mRNA浓度并进行计算，按1ug浓度进行反转；2)按照表1中的体系将试剂与总mRNA进行预混；3)将预混后的溶液转移至PCR仪中，使用cDNA模板进行反应(42℃孵育30min,85℃孵育5s)；4)迅速将反转完成的cDNA溶液转移置冰上进行降温，降温时间为1min；5)将降温后的cDNA溶液置于-20℃的环境中保存。
表1试剂与总mRNA的预混体系
以下实施例中，qPCR检测方法为：按表2中的体系将cDNA和qPCR试剂预混：
表2 cDNA和qPCR预混体系
将预混后的体系加入八连管中，每孔18ul，迅速在八连管中加入cDNA 2ul，盖上盖子进行顺离，放入Light cycler仪器中按照3步法进行反应，循环数为45；qPCR反应程序如表3：
表3 qPCR反应程序
实施例1 ESRG基因作为通用标记基因的验证试验
(1)筛选候选基因：通过GTEx Portal官方网址，检索一系列基因在人不同组织中的表达，筛选候选基因。候选基因的标准是，在人体的组织细胞中不表达，或者只在极少数细胞中表达的基因。图1为各基因在人体不同组织中的表达量(TPM)，根据图1所示，ESRG、lin28A以及NANOG符合上述筛选标准，其中，ESRG以及lin28A仅仅在人的生殖器官表达；NANOG在检测的组织中均无表达。
(2)检测候选基因在iPSC和ESC中的表达水平：采用的ESC为胚胎干细胞H9；首先通过上述总mRNA的提取方法提取iPSC和胚胎干细胞H9的mRNA，然后通过上述反转录方法将iPSC和胚胎干细胞H9的总mRNA反转录为cDNA，最后，通过qPCR检测方法检测iPSC和胚胎干细胞H9中ESRG、lin28A以及NANOG的表达；ESRG的上游引物(ESRG-F)的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:3所示(atgaaaggga agacatacaa)、下游引物(ESRG-R)的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:4所示(tgaacatagc aagggaaa)；lin28A的上游引物(LIN28A-F)的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:5所示(agcgcagatc aaaaggagac a)、lin28A的下游引物(LIN28A-R)的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:6所示(cctctcgaaa gtaggttggc t)；NANOG的上游引物(NANOG-F)的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:7(tttgtgggcc tgaagaaaac t)、NANOG的下游引物(NANOG-R)的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:8：(agggctgtcc tgaataagca g)。
如图2所示，通过qPCR检测，ESRG，lin28A在iPSC和胚胎干细胞中大量表达，但是NANOG表达水平不高。
(3)检测候选基因在其他多种分化细胞中的表达水平：按照上述同样的方法检测ESRG、lin28A以及NANOG在内皮细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体中的表达，如图3所示，通过qPCR检测，lin28A在iPSC诱导的内皮细胞、神经干细胞、肝细胞、心肌细胞以及胰岛小体中均有大量表达，因此lin28A不适用于通用检测iPSC残留，但是仅可以用于视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞中iPSC残留检测，无法作为iPSC检测的通用标记基因。通过qPCR检测，ESRG和NANOG在iPSC诱导的内皮细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体中均检测不到表达。
综合以上两个检测结果，相对于lin28A和NANOG在iPSC和ESC以及其他多种分化细胞中的表达水平，ESRG能够作为通用型iPSC残留检测的标记基因。
实施例2检测iPSC来源的iEPC中iPSC残留
(1)设计ESRG标记基因的结构：通过NCBI查找ESRG的cDNA序列，核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:1所示(gctgactctc ttttcggact cagcccgcct gcacccaggt gaaataaaca gcctcgttgc tcacacaaag cctgtttggt ggtctcttca cacggacgcg catgaaattt ggtgccgtga ctcggatcgg gggacctccc ttgggagatc aatcccctgt cctcctgctc tttgctccgt gagaaagatc cacctacgac ctcaggtcct cagaccaacc agcccaagaa acatctcacc aatttcaaat ccggtaagcg gcctcttttt actctgttct ccaacctccc tcactatccc tcaacctctt tctcctttca atcttggcgc cacacttcaa tctctccctt ctcttaattt caattccttt cattctctgg tagagacaaa agagacatgt tttatccgtg aacccaaaac tccggcgccg gtcacggact gggaaggcag tcttcccttg gtgtttaatc attgcaggga cgcctctctg atttcacgtt tcagaccacg cagggatgcc tgccttggtc cttcaccctt agcggcaagt cccgctttcc tggggcaggg gcaagtaccc ctcaacccct tctccttcac ccttagcggc aagtcccgct tttctggggc aggggcaagt acccctcaac cccttctcct tcacccttag cagcaagtcc cgctttccta gggggcaaga accccccaat cgcttatttt cacgccccaa cctcttatct ctgtgcccca atcccttatt tccacgcccc aatctcttat ctctgcgccc caatccctta tttccgcgcc ccaacccttt ctctgctttt ctggagggga agaaaccccc accccttctc cgtgtctcta ctcttttctc tgggcttgcc tccttcacta tgggcaagct tccaccttcc attcctttct tctcccttag catgtattct taagaactta aaatctcttc aattctcacc tgacctaaaa tctaagcgtc ttattttctt ctgcaatgcc acttgacccc aatacaaact caacagtagt tccaaatagc cagaaaatgg cactttcaat ttttccaccc tacaagatct aaataattct tggcgtaaaa tgggcaaatg gtgtgaggtg cctgacgtcc aggcattctt ttacacatca gtcccttcct agtctctgtg cccagtgcaa ctcgtcccaa atcttccttc tttccctccc gcctgtcccc tcagtaccaa ccccaagcgt cactgagtct ttctaatctt ccttttctac agacccatct gacctctccc ttcctcccca ggctgctcct tgccaggccg agctaggtcc caattcttcc tcagcctctg ctcctccacc ctataatctt tttatcacct cccctcctca cacctgctcc ggcttacagt ttcattccgt gactagccct ccccgacctg cccagcaatt tattcttaaa aaggtggctg gagctaaacg catagtcaag gttaatgctc ctttttcttt atcccaaatc agatagtgtt taggctcttt ttcatcaaat ataaaaatct agcccagttc atggctcgtt tggcagcaac cctaagacac tttacagccc tagcccctaa aaggtcaaaa ggccatctta ttctcaatat acattttatt acccaatctg ctcccgacat taaataaaac tccaaaaact ggaatctggc cctcaaaccc cacaacagga cttaattaac ctcaccttca aggtgtgaaa taacagaaaa aagttgcaat tccttgcctc cactgtgaga caaaccccag ccacatctcc agcacacaag aacttccaaa cgcctgaact gtagcagcca gacgtttctc cagaacctcc tcccccagga acttgctaca catgccggaa atctggccac tgggccaagg aacgcccgca gcccgggatt cctcctaagc cgcgtcccat ctgtgtggga ccccactgaa aatcggactg ttcaactcac ctggcagcca ctcccagagc tcctggaact ctggcccaag gttctctgac tgactccttc ttggcttact ggctgaagac tgacgctgcc tgatcgcctc agaagccccg cagaccatca tggacgccga gctttagccc gcctgcaccc aggtgaaata aacagccttg ttgctcacac aaagcctgtt tggtggtctc ttcacacaga cgcgcatgaa agggaagaca tacaaaaaca aggcctctga ggtaggtact actgagacag ccaggtggga aggactcctt ggcaaaactc caaccagcct gtacactggg aggaatgtgc actgggatgg agccatagaa gtttgtgtcg tttgcagtgg ggaggagcct ggtccctcct cttcctgtga ggaacctgga attcaatctg tgaggaactt cttgaaagac ccatcaattc ttcaatagaa agcatcaaag gacaatttac accctaagac tgaacccctg acctcaaaat ctttcccttg ctatgttcac caacctcaac agaaatatta ggattcttac ctgatcctag ccaagccccc tccctcatct cccattaaag ggtccatctt caaccaaact taagtctcaa taaatatctg gacattgtcc ttccaactct gggaagctgc taagactctg tccttactgc agaagaaaaa acagccttgt accctggtct tctcaacagg ttgttctgga gatgttctgg ggagactgca ttaaacacag cttcgcacca ttgaataaac tcagcaacaa gccaatgcat aaaagtaatc tatgcttcag gtcacagaag cttcaagggg aaaaaaacag aatactctag ggccattgtt cacaaactca tctgaaaaca tcctggaaaa attttcccaa acacatggaa agaaagagag gaaaaaagaa gatatctgaa taatgtggac tagaataaag agctgccagg agctgtttat ttaaaaacag tactttcttc tctggctgag tccctggtat tctctgctgc aatctgtagc tgtagaattt tgaagaatgc aattaaattc aaatggtttg atgagtaaaa aaaaaaaaaa aaa)，序列长度3153bp。从中任意选取一段大于200bp的序列，作为标准品构建的目的基因序列，根据目的基因序列设计引物，其中，目的基因序列长度大于或等于引物所扩增的长度；本实施例中选取的ESRG cDNA目的序列长度为338bp,其核苷酸序列如序列SEQ ID NO:2所示(atgaaaggga agacatacaa aaacaaggcc tctgaggtag gtactactga gacagccagg tgggaaggac tccttggcaa aactccaacc agcctgtaca ctgggaggaa tgtgcactgg gatggagcca tagaagtttg tgtcgtttgc agtggggagg agcctggtcc ctcctcttcc tgtgaggaac ctggacttca atctgtgagg aacttcttga aagacccatc aattcttcaa tagaaagcat caaaggacaa tttacaccct aagactgaac ccctgacctc aaaatctttc ccttgctatg ttcaccaacc tcaacagaaa tattagga)。本实施例中，引物为上述的ESRG上游引物(ESRG-F)和ESRG下游引物(ESRG-R)。
本实施例中，标准品为含有ESRG目的基因序列的质粒DNA；采用该质粒DNA作为标准品的优点是PCR产物获取简单，对引物要求较低，不需要通过总mRMA提取，反转录、PCR扩增以及PCR扩增产物纯化等一系列复杂过程；并且能准确定量目的基因，批次稳定。
本实施例中，载体质粒序列为pUC57-Amp；pUC57-Amp作为一种常用的载体质粒序列，其大小仅仅只有2710bp,骨架很小，同时不与ESRG，lin28A以及NANOG等基因引物产生特异性结合，使定量检测更准确。
采用载体质粒制备含有ESRG标记基因结构的质粒DNA作为标准品，该标准品的结构如图4所示，该标准品大小仅有3048bp,结构简单，其中，Amp(氨苄霉素)为筛选标记，Ori是原核生物基因质粒的复制起始位点，ESRG为目的基因。
(2)标准品制备：本实施例中，采用五个梯度作绘制标准曲线，每个梯度进行3-5次平行试验，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。根据通用公式计算第一梯度的标准品的拷贝数进行计算：6.02×1023拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/(MW g/mol)＝copies/ml；平均分子量(MW g/mol)为dsDNA(双链DNA)的平均分子量，并且MW＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；并通过分光光度计测量第一梯度标准品的拷贝数，本实施例中，第一梯度的标准品的拷贝数为2.94×10
9copy/ul。
倍比梯度稀释制备标准品：采用倍比梯度稀释方法对标准品进行稀释；本实施例中，具体的倍比梯度稀释方法为：1体积第一梯度标准品+9体积稀释缓冲液，得第二梯度标准品；1体积第二梯度标准品+9体积稀释缓冲液，得第三梯度标准品；1体积第三梯度标准品+9体积稀释缓冲液，得第四梯度 标准品；1体积第四梯度标准品+9体积稀释缓冲液，得第五梯度标准品；依次倍比稀释，制备出的标准品分别为2.94×10
9copy/ul、2.94×10
8copy/ul、2.94×10
7copy/ul、2.94×10
6copy/ul、2.94×10
5copy/ul、2.94×10
4copy/ul的标准样品各一个。
(3)标准曲线制作：本实施例中，将引物和标准品通过qPCR进行检测，分别得到标准品的熔解曲线和标准曲线。
标准品的熔解曲线如图5所示，本实施例中，图5-A为qPCR检测标准品的荧光强度和温度的曲线，其中，RFU为荧光单位，随着温度的升高，荧光值下降，表明DNA双链在变性成为单链；荧光强度和温度曲线的导数(-d(RFU)/dT)为对应的下降速率，图5-B为上述下降速率的峰图，该峰图体现了标准品具有良好的特异性。在分子生物学中，熔解曲线是为了验证扩增产物的特异性，如果熔解曲线为单峰说明产物只有一条，结果较好；如果为双峰则说明产物特异性较差，可能存在引物二聚体或非特异性扩增。图5-B说明标准品没有出现双峰，因此说明引物的特异性良好
标准品的标准曲线如图6所示，横坐标为拷贝数的对数，纵坐标为Ct值，标准曲线方程的R值大于0.99，因此该标准品可用于定量检测。Ct值是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数(log)存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
(4)样品iPSC残留检测：本实施例中，采用诱导的内皮祖细胞(iEPC)作为样品，检测其中残留的iPSC；其中，实验组包括样品iEPC为三组，分别为iEPC-1组、iEPC-2组以及iEPC-3组，对照组包括阳性对照组iPSC。
根据上述总mRNA提取、反转录方法分别制备样品iEPC-1组、iEPC-2组、iEPC-3组以及阳性对照iPSC组的cDNA溶液。
将引物和iEPC-1、iEPC-2、iEPC-3以及阳性对照组的样品分别进行qPCR检测，得到各组的熔解曲线以及Ct值；图7为阳性对照组iPSC细胞的熔解曲线，根据图7-B所示，该熔解曲线没有出现双峰，说明阳性对照组的引物特异性良好；图8为iEPC-1组、iEPC-2组以及iEPC-3组的熔解曲线，根据图8-B所示，上述各实验组均未出现双峰，说明各实验组的引物特异性良好。
通过将各组的Ct值代入标准曲线，即可算出起始拷贝数的log值，从而能够计算出样品中ESRG的起始拷贝数；由于样品中残留的iPSC和阳性对照的iPSC是同一细胞，所以每个iPSC细胞中的ESRG的起始拷贝数是一致的，通过样品中ESRG的起始拷贝数除以阳性对照的iPSC中ESRG的起始拷贝数能够得到残留的iPSC的比例，实现对残留iPSC的检测。上述数据如表5所示。
表5各组CT值、拷贝数以及iPSC的残留比例
上述实施例为本发明的优选实施方式，并不对本发明构成任何限制，其他任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、简化、组合等改变或修饰，均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
- 一种用于检测iPSC分化细胞中iPSC残留的通用标记基因，其特征在于，所述通用标记基因为ESRG基因。
- 一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，所述检测方法使用的标记基因为如权利要求1所述的通用标记基因。
- 根据权利要求2所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，所述检测方法通过qPCR定量检测样品中的ESRG基因，并将其与标准品进行对比，从而得到样品中iPSC残留的数量。
- 根据权利要求3所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)截取所述ESRG基因片段作为目的序列，通过分子生物学方法构建含有目的基因序列的ESRG标记基因结构；2)采用载体质粒制备含有所述ESRG标记基因结构的质粒DNA，以其为标准品，并对所述标准品进行梯度稀释；3)根据所述目的基因序列设计引物，并将引物和所述标准品通过qPCR进行检测，制作所述标准品的溶解曲线和标准曲线；4)将待测iPSC分化来源的细胞通过总mRNA提取和反转录方法制备样品，将所述样品和所述引物通过qPCR进行检测以检测样品中的ESRG标记基因，根据熔解曲线对比检出所述引物的特异性，并根据标准曲线得到iPSC残留量。
- 根据权利要求4所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述目的基因序列为，在ESRG的cDNA序列中任意选取一段大于200bp的序列。
- 根据权利要求5所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法， 其特征在于，所述目的基因序列长度为338bp,其核苷酸序列如序列SEQ ID NO:2所示。
- 根据权利要求4所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:3所示，所述下游引物的核苷酸序列表如序列SEQ ID NO:4所示。
- 根据权利要求4所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述载体质粒为pUC57-Amp。
- 根据权利要求4所述的一种iPSC分化细胞中iPSC残留的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述qPCR检测的程序为，94℃30秒,94℃30秒,55℃15秒，72℃10秒；循环数45。
- 一种如权利要求1所述通用标记基因的应用，其特征在于，可用于对iPSC分化细胞中残留iPSC的定量检测，所述iPSC分化细胞包括内皮祖细胞、神经干细胞、视网膜色素上皮细胞、肝细胞、自然杀伤细胞、心肌细胞以及胰岛小体。
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