CN113234805A - 一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法 - Google Patents

一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，包括以下步骤：S1：将hESC与hESC‑MSC按照比例进行混样并标明组份；S2：各组细胞样品进行RNA提取：S3：RNA定量并反转录以得到反转录产物；S4：H‑ESRG基因引物设计，该引物为跨内含子引物；S5：采用qPCR检测反转录产物中H‑ESRG基因mRNA水平的表达。本发明使用H‑ESRG基因检测人hESC残留，并采用低成本的SYBR Green的qPCR方法检测，测得人hESC到最低检测限为0.0025％。在测得最低检测限相同情况下，使用本检测方法所用的成本较低，相关系数接近1，准确性高。

Description

一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中 hESC残留的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种低成本且高灵敏度的体外检测 hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法。
背景技术
人胚胎干细胞相关基因(human embryonic stem cell related gene,H-ESRG)蛋白位于人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)细胞核内。H-ESRG是一种新的、敏感的和特异性的胚胎癌的生物标志物，在hESC的未分化状态或自我更新方面发挥了重要作用。
实时聚合酶链反应(qPCR)是基于PCR的革命性方法，这一技术是PCR高灵敏度和实时检测相结合的结果。实时定量聚合酶链反应的独特特征就是把目的基因的扩增与荧光信号联系起来，并将其量化。在定量基因表达分析,目前有两种方法最受欢迎,荧光染料法(SYBR Green)和寡核苷酸探针(TaqMan)。
在分化细胞中未分化细胞残留问题，多数文献使用Taqman探针法，且检出的分化细胞中未分化细胞的最低检测线为0.0025％。Taqman探针法需要大规模实验时耗费成本高，且因为需要好的引物和探针，需要更长的时间来设计实验。传统的荧光染料法(SYBRGreen)检测方法成本较低，适合大规模的实验；在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计，然而SYBR Green qPCR的检测方法的引物特异性不如Taqman qPCR的高。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种的低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，包括以下步骤：
S1：将hESC与hESC-MSC按照比例进行混样并标明组份；
S2：各组细胞样品进行RNA提取，得到总RNA：
S3：RNA定量并反转录以得到反转录产物；
S4：H-ESRG基因引物设计，该引物为跨内含子引物；
S5：采用qPCR检测反转录产物中H-ESRG基因mRNA水平的表达。
可选的，所述S4中基因引物包括H-ESRG-F和H-ESRG-R。
可选的，所述H-ESRG-F的基因序列为TGGGATGGAGCCATAGAAGT。
可选的，所述H-ESRG-R的基因序列为TGGGTCTTTCAAGAAGTTCCTC。
可选的，所述S5中在qPCR反应的扩增程序后采集熔解曲线，并获得扩增图，检测特异性扩增及引物二聚体出现。通过检测有无特异性扩增及引物二聚体出现，以确定设计引物的特异性。
可选的，所述S1中的样品分组包括A组、B组、C组、D组、hESC组及 hESC-MSC组，其中A组中hESC占MSC百分比为0.0025％，B组中hESC占 MSC百分比为0.005％，C组中hESC占MSC百分比为0.0075％，D组中hESC 占MSC百分比为0.01％，hESC组中hESC占MSC百分比为100％，hESC-MSC 组中hESC占MSC百分比为0％。
可选的，所述A组、B组、C组、D组分别设置有多组平行对照，hESC组、 hESC-MSC组分别设置1组平行对照。通过设置平行对照，防止偶然误差的产生。
可选的，所述S2中RNA提取用试剂盒采用TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit，并对各组细胞样品分别提取得到总RNA。
可选的，所述S3中反转录用试剂盒采用TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit(with gDNA Eraser)，且所述S3的具体步骤如下：
S3.1：测量总RNA中mRNA的浓度并进行计算，并定量后进行反转录；
S3.2：去除总RNA中的gDNA污染，得到反应液I；
S3.3：对所述反应液I进行反转录反应，得到cDNA溶液。
可选的，所述S5的具体步骤为：在所述cDNA溶液中加qPCR试剂，混匀后的样品加入到96孔板中，贴上荧光定量透明封板膜，瞬时离心，放入荧光定量PCR仪器中，检测H-ESRG基因mRNA水平的表达。
综上所述，本发明的有益效果为：
1、使用H-ESRG基因检测人hESC残留，并采用低成本的SYBR Green 的qPCR方法检测，测得人hESC到最低检测限为0.0025％。在测得最低检测限相同情况下，使用本检测方法所用的成本较低，相关系数接近1，准确性高。并且根据检测限度可以推算出具体的人hESC残留细胞数目。
2、本方法中H-ESRG基因引物设为跨内含子引物，无特异性扩增与无引物二聚体出现，从而确定检测结果可靠。
附图说明
图1为本发明的qPCR反应后采集的熔解曲线图。
图2为本发明的qPCR反应的扩增图。
图3为本发明中hESC组与hESC-MSC组中ESRG mRNA表达量图。
图4为本发明中A-D组中mRNA的表达量图。
图5为本发明中A-D组mRNA的表达量的线性关系图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
在定量基因表达分析中,目前常用的有SYBR Green和TaqMan这两种方法，以下表1简要分析这两种方法的优缺点。
表1 SYBR Green和TaqMan的优缺点
Figure BDA0003139263800000031
如图1-5所示，一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，该方法通过检测H-ESRG的mRNA水平的表达来处理 hESC残留问题，包括以下步骤：
S1：hESC与hESC-MSC(人胚胎干细胞(hESC)分化来源的间充质干细胞(MSC))按照比例进行混样并标明组份。
将hESC与hESC-MSC使用TryPLE消化成单细胞后重悬，计数，按照表2 进行人hESC与人hESC-MSC加样品，并进行标注，再次离心，使用DPBS重悬后，离心，弃上清，将细胞沉淀加入RNA裂解液(具体分组见表2)。
表2样品分组
Figure BDA0003139263800000041
S2：各组细胞样品进行RNA提取：严格按照TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit操作步骤进行。
所述S2的具体步骤如下：总RNA的提取方法(此步骤在已灭菌的超净工作台中进行)
S2-1、将含有裂解Buffer RL的上述组别，在室温静置2分钟，再加入等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀；
S2-2、立即将混合液全部转入到RNA Spin Column(含2ml Collection Tube) 中；12000rpm，离心1分钟，弃滤液。将RNA Spin Column放回至2ml Collection Tube中；
S2-3、将500ul的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12000rpm，离心30秒，弃滤液；
S2-4、将600ul的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12000rpm，离心30秒，弃滤液；
S2-5、重复上一步骤；
S2-6、将RNA Spin Column重新安置于2ml Collection Tube上，12000rpm，离心2分钟；
S2-7、将RNA Spin Column安置于1.5ml的RNase Free Collection Tube上，在RNASpin Column膜中央加入50ul的RNase Free dH2O，室温静置5分钟；
S2-8、12000rpm离心2分钟洗脱RNA。
S3：RNA定量并反转录以得到反转录产物：严格按照TaKaRa PrimeScriptTM RTreagent Kit(with gDNA Eraser)操作步骤进行。
所述S3的具体步骤如下：
S3-1、使用分光光度计测量mRNA浓度并进行计算，以1ug定量进行反转录；
S3-2、去除基因组DNA反应，按照下表3体系将试剂与总mRNA进行加样，混匀后转移至PCR仪器上，反应程序为：42℃2分钟，4℃保存；
S3-3、反转录反应，按照按照下表4体系将试剂进行加样，混匀后转移至 PCR仪器上，反应程序为：37℃15分钟，85℃5秒，4℃保存。得到的cDNA 溶液可放于-20℃保存。具体试剂的加样量见下表3与表4；
表3去除基因组DNA反应体系
试剂 使用量
5xgDNA Eraser Buffer 2.0ul
gDNA Eraser 1.0ul
Total RNA 1ug
RNase Free dH<sub>2</sub>O Up to 10ul
表4反转录反应体系
试剂 使用量
步骤S3-2的反应液 10ul
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0ul
RT Primer Mix 1.0ul
5x PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4.0ul
RNase Free dH<sub>2</sub>O 4.0ul
Total 20ul
S4：H-ESRG基因引物设计,引物序列如表5所示。
表5 H-ESRG基因引物序列
Figure BDA0003139263800000051
Figure BDA0003139263800000061
S5：qPCR检测H-ESRG基因mRNA水平的表达。
取96孔板(荧光定量专用)，配制如表6所示反应体系，每个反转录产物配制3个平行孔。
所述S5的具体步骤如下：
cDNA和qPCR所用试剂按下表6进行加样；混匀后的样品加入到96孔板中，贴上荧光定量透明封板膜，瞬时离心，放入荧光定量PCR仪器中，具体的反应程序为见表7。
表6 qPCR检测反应体系配置表
试剂 使用量(ul)
Temple 4.4
Forward Primer(10um) 0.3
Revene Primer(10um) 0.3
2xPerfectStart<sup>TM</sup> Green qPCR SuperMix 5
Total volume 10
表7 qPCR的反应程序
Figure BDA0003139263800000062
为了规避SYBR Green染料法缺点1与2，设计的ESRG基因荧光定量引物是跨内含子的，并在qPCR反应的扩增程序后采集熔解曲线，来确定设计引物的特异性。优化后最终使用SYBR Green染料法测得的分化细胞中未分化细胞的最低检测线为0.0025％。
实验结果分析：
如图1和图2所示，从熔解曲线和扩增图可以看出，无特异性扩增与无引物二聚体出现，即所得的结果可以使用。如图3所示，在hESC中ESRG mRNA表达量较高，hESC-MSC中未检测到该基因mRNA的表达；如图4所示，目前可检出的最低检测限为0.0025％。如图5所示，统计A-D组组内mRNA的表达量均值的相关关系为0.95(其中R2越接近1，表明相关性越强)。
本发明使用低成本的SYBR Green的qPCR方法检测，检测出的最低限度为0.0025％，且相关系数接近1，准确性高。
以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将hESC与hESC-MSC按照比例进行混样并标明组份；
S2：各组细胞样品进行RNA提取，得到总RNA：
S3：RNA定量并反转录以得到反转录产物；
S4：H-ESRG基因引物设计，该引物为跨内含子引物；
S5：采用qPCR检测反转录产物中H-ESRG基因mRNA水平的表达。
2.根据权利要求1所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述S4中基因引物包括H-ESRG-F和H-ESRG-R。
3.根据权利要求2所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述H-ESRG-F的基因序列为TGGGATGGAGCCATAGAAGT。
4.根据权利要求2所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述H-ESRG-R的基因序列为TGGGTCTTTCAAGAAGTTCCTC。
5.根据权利要求1所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述S5中在qPCR反应的扩增程序后采集熔解曲线，并获得扩增图，检测特异性扩增及引物二聚体出现。
6.根据权利要求1所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述S1中的样品分组包括A组、B组、C组、D组、hESC组及hESC-MSC组，其中A组中hESC占MSC百分比为0.0025％，B组中hESC占MSC百分比为0.005％，C组中hESC占MSC百分比为0.0075％，D组中hESC占MSC百分比为0.01％，hESC组中hESC占MSC百分比为100％，hESC-MSC组中hESC占MSC百分比为0％。
7.根据权利要求6所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述A组、B组、C组、D组分别设置有多组平行对照，hESC组、hESC-MSC组分别设置1组平行对照。
8.根据权利要求1所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述S2中RNA提取用试剂盒采用TaKaRa MiniBESTUniversal RNA Extraction Kit，并对各组细胞样品分别提取得到总RNA。
9.根据权利要求1所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述S3中反转录用试剂盒采用TaKaRa PrimeScriptTM RTreagent Kit(with gDNA Eraser)，且所述S3的具体步骤如下：
S3.1：测量总RNA中mRNA的浓度并进行计算，并定量后进行反转录；
S3.2：去除总RNA中的gDNA污染，得到反应液I；
S3.3：对所述反应液I进行反转录反应，得到cDNA溶液。
10.根据权利要求9所述的一种低成本且高灵敏度的体外检测hESC分化来源功能细胞中hESC残留的方法，其特征在于，所述S5的具体步骤为：在所述cDNA溶液中加qPCR试剂，混匀后的样品加入到96孔板中，贴上荧光定量透明封板膜，瞬时离心，放入荧光定量PCR仪器中，检测H-ESRG基因mRNA水平的表达。
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