发明内容
为了解决现有技术存在的问题,本发明提供了一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。本发明在分析CHO细胞核酸重复序列的基础上,选择了一系列高度重复序列作为定量分析基因,使用Taqman探针法qPCR技术将检测灵敏度大大提高2个数量级(5pg/mL),且在DNA浓度在5pg~50000ng/mL时有良好的线性范围(R 2≥0.99)。
本发明的目的是提供一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列。
本发明的再一目的是提供所述序列的引物。
本发明的再一目的是提供所述引物的探针。
本发明的再一目的是提供一种定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法。
根据本发明的用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列,所述序列包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j中的任意一个或多个;所述序列a的序列如SEQ ID NO:1所示,所述序列b的序列如SEQ ID NO:2所示,所述序列c的序列如SEQ ID NO:3所示,所述序列d的序列如SEQ ID NO:4所示,所述序列e的序列如SEQ ID NO:5所示,所述序列f的序列如SEQ ID NO:6所示,所述序列g的序列如SEQ ID NO:7所示,所述序列h的序列如SEQ ID NO:8所示。
其中,SEQ ID NO:1为:
TGCCTTACAGAGGCCCCCATGTCTTACAGAGGCCTCCATGTCCTACAGAGGCCCCCATGTCCTTCAGAGGTCCTCATGTTCTACAGAGGCTCCCTTGTCTTACAGAGGCTCCCCTGTCTTACAGAGGCCCCCA;
SEQ ID NO:2为:
GTCGTGGGAAAGGGAAGGAAGAGTGACCTGTACCCAGATTCAGGGAGCTCCTCCCTGCCTGGGCGTGTCTACTCCAAGCATGCACAAGCCTGGGGAGATCTGCGTGAATGGCGCTTTGGACAGGAGTTGGGTAAGAACAGGGAGTCACTCACCTCGTTGTGATCT;
SEQ ID NO:3为:
CCCTTTCCGTGGACTCATCGCAGACCAGGTGAGCCACCCCCTGCTTTTACCCAATTCTTGTCCTAAGCGCCATCCACCCAGATCCCTCCAGGCTCGTCCCTGCTTGAAACAGACACGCCCAGGTAGGGTGGAGCTTCCTGAATCTGGCTTGGTTCAGGACACTCTTCCTT;
SEQ ID NO:4为:
CGGAAAGGGAAGGAAGAGTGTCCTGAACCAAGCCAGATTCAGGAAGCTCCACCCTACCTGGGCGTGTCTGTTTCAAGCAGGGACGAGCCTGGAGGGATCTGGGTGGATGGCGCTTAGGACAAGAATTGGGTAAAAGCAGGGGGTGGCTCACCTGGTCTGCGATGAGTCCA;
SEQ ID NO:5为:
AGCCAGATTCAGGAAGCTCCACCCTACCTGGGCGTGTCTGTTTCAAGCAGGGACGAGCCTGGAGGGATCTGGGTGGATGGCGCTTAGGACAAGAATTGGGTAAAAGCAGGGGGTGGCTCACCTGGTCTGCGATGAGTCCACGGAAAGGGAAGGAAGAGTGTCCTGAACCA;
SEQ ID NO:6为:
GCTTCCTGAATCTGGCTTGGTTCAGGACACTCTTCCTTCCCTTTCCGTGGACTCATCGCAGACCAGGTGAGCCACCCCCTGCTTTTACCCAATTCTTGTCCTAAGCGCCATCCACCCAGATCCCTCCAGGCTCGTCCCTGCTTGAAACAGACACGCCCAGGTAGGGTGGA;
SEQ ID NO:7为:
GGTTGGTCCAGAGAGCTGGTTGATCCAGGCAGCTGGTTGGTCCTGGGAGCTGGGTGGTCCAGGGAGCTGGTTGGCCCAGGCATCTGGTTGGTCCTGGTAGCTAGTTGGTCTAGGGAGCTGGTTTGTCCAGGGAGCTGGTTGGTCCTGGAAGCTGGTTGGTCCAGGCAGCTGGTTGGCCCAGGAAGCTGATGATCCTGACTGCCCATAACAAAGCA;
SEQ ID NO:8为:
TGTGTATGAGTTCATGTGTATAGATTTCACAGCAGAGATTTAAAAATAATCATGTCGCAGCCACAGAAAGAGAAGACATAAGTGTTGGAATCTAGTGTGCTTTAATAGTGAAATCGCAGCACACACACACACACACACACTCACACACACACACACACAGGAAGTTTAAACTAAGTAGTTTATTTCTTTAGGAAACTACAACCTCTTTTCCTTCTCCCTCTTCTGTGTGG。
根据本发明所述的序列对应的引物,其中,所述引物包含分别对应序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g和序列h的序列a引物F、序列a引物R、序列b引物F、序列b引物R、序列c引物F、序列c引物R、序列d引物F、序列d引物R、序列e引物F、序列e引物R、序列f引物F、序列f引物R、序列g引物F、序列g引物R、序列h引物F、序列h引物R中的任意一组或多组;所述序列a引物F的序列如SEQ ID NO:9所示,所述序列a引物R的序列如SEQ ID NO:10所示,所述序列b引物F的序列如SEQ ID NO:11所示,所述序列b引物R的序列如SEQ ID NO:12所示,所述序列c引物F的序列如SEQ ID NO:13所示,所述序列c引物R的序列如SEQ ID NO:14所示,所述序列d引物F的序列如SEQ ID NO:15所示,所述序列d引物R的序列如SEQ IDNO:16所示,所述序列e引物F的序列如SEQ ID NO:17所示,所述序列e引物R的序列如SEQ IDNO:18所示,所述序列f引物F的序列如SEQ ID NO:19所示,所述序列f引物R的序列如SEQ IDNO:20所示,所述序列g引物F的序列如SEQ ID NO:21所示,所述序列g引物R的序列如SEQ IDNO:22所示,所述序列h引物F的序列如SEQ ID NO:23所示,所述序列h引物R的序列如SEQ IDNO:24所示。
其中,SEQ ID NO:9为:CCTCCATGTCCTACAGAG;
SEQ ID NO:10为:GAGCCTCTGTAAGACAAG;
SEQ ID NO:11为:GAAGGAAGAGTGACCTGTA;
SEQ ID NO:12为:GTGAGTGACTCCCTGTTC;
SEQ ID NO:13为:ACCCAATTCTTGTCCTAAG;
SEQ ID NO:14为:CAAGCCAGATTCAGGAAG;
SEQ ID NO:15为:CAAGCCAGATTCAGGAAG;
SEQ ID NO:16为:ACCCAATTCTTGTCCTAAG;
SEQ ID NO:17为:GTGTCTGTTTCAAGCAGG;
SEQ ID NO:18为:CACTCTTCCTTCCCTTTC;
SEQ ID NO:19为:CTTCCTGAATCTGGCTTG;
SEQ ID NO:20为:CGCTTAGGACAAGAATTGG;
SEQ ID NO:21为:CAGAGAGCTGGTTGATCC;
SEQ ID NO:22为:CTCCCTAGACCAACTAGC;
SEQ ID NO:23为:CACAGAAAGAGAAGACATAA;
SEQ ID NO:24为:GGTTGTAGTTTCCTAAAGAA。
根据本发明所述的序列对应的探针,其中,所述探针包括分别对应序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g和序列h的序列a探针、序列b探针、序列c探针、序列d探针、序列e探针、序列f探针、序列g探针和序列h探针;所述序列a探针的序列如SEQ ID NO:25所示,所述序列b探针的序列如SEQ ID NO:26所示,所述序列c探针的序列如SEQ ID NO:27所示,所述序列d探针的序列如SEQ ID NO:28所示,所述序列e探针的序列如SEQ ID NO:29所示,所述序列f探针的序列如SEQ ID NO:30所示,所述序列g探针的序列如SEQ ID NO:31所示,所述序列h探针的序列如SEQ ID NO:32所示。
其中,SEQ ID NO:25为CTTCAGAGGTCCTCATGTTCTACAGAG;
SEQ ID NO:26为CCCAACTCCTGTCCAAAGCG;
SEQ ID NO:27为CCTACCTGGGCGTGTCTGTTTC;
SEQ ID NO:28为CCTACCTGGGCGTGTCTGTT;
SEQ ID NO:29为TGGCTCACCTGGTCTGCGAT;
SEQ ID NO:30为CACCTGGTCTGCGATGAGTCC;
SEQ ID NO:31为ACCAGGACCAACCAGATGCC;
SEQ ID NO:32为CTTTAATAGTGAAATCGCAGCACACAC。
本申请中,在探针的5’端标记荧光基团6-FAM,3’端标记淬灭基团BHQ1。
根据本发明所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法,所述方法使用权利要求1-3中任意一组或多组序列及序列的引物和探针。
根据所述定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法,其中,所述方法包括以下步骤:
A、处理蛋白样品,得到待测DNA溶液;
B、使用一系列浓度梯度的CHO标准品,进行qPCR扩增,以标准品log10对数值为X轴,qPCR扩增Ct值为Y轴,制备标准曲线,并进行线性回归方程拟合获得线性方程;
C、对步骤A得到的待测DNA溶液进行qPCR扩增,得到待测DNA溶液的qPCR扩增Ct值,进而根据步骤B得到的线性方程得到待测DNA溶液中CHO DNA的含量。
根据所述定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法,其中,步骤A中,先取蛋白样品,依次加入Proteinase K、ddH2O和缓冲液,然后进行温育消化,然后依次加入异丙酮、核酸助沉剂和磁珠,进行孵育后收集磁珠,去除上清,然后向磁珠加入洗脱液,孵育后收集磁珠,取上清液,即为待测DNA溶液。
进一步的,步骤A包括以下流程:
1)取200μL蛋白样品,然后按照1mg蛋白加入10μL Proteinase K的比例加入Proteinase K,加入ddH2O补足至400μL,加入400μL 2×结合缓冲液;
2)55℃温育消化2h,期间颠倒混匀2-3次以充分消化;
3)加入等体积的异丙醇,1μL核酸助沉剂,10μL磁珠,室温旋转孵育10min;
4)磁力架上收集磁珠,去除上清;
5)加入1mL洗涤液,旋转孵育5min,磁力架上收集磁珠,去除上清;
6)重复步骤4)一次,尽可能去除上清后,开盖晾干;
7)磁珠加入50μL洗脱液,65℃旋转孵育10min;磁力架上收集磁珠,转移上清至新的EP管中,即得到待测DNA溶液。
根据所述定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法,其中,步骤B中,CHO标准品的浓度梯度依次为:5000pg/10ul、500pg/10ul、50pg/10ul、5pg/10ul、0.5pg/10ul和0.05pg/10ul。
根据所述定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法,其中,步骤B和步骤C中的qPCR扩增程序为:先在95℃温度下预变性10min;然后进行40个循环,其中每个循环依次进行95℃,15s和60℃,1min。
根据所述定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法,其中,步骤B和步骤C中,使用的探针标记为FAM荧光团。
本发明的有益效果为:
本发明在分析CHO细胞核酸重复序列的基础上,选择了一系列高度重复序列作为定量分析基因,使用Taqman探针法qPCR技术将检测灵敏度大大提高2个数量级(5pg/mL),且在DNA浓度在5pg~50000ng/mL时有良好的线性范围(R2≥0.99)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例为序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j的验证性实验,使用一系列浓度梯度的CHO标准品,进行qPCR扩增,以标准品log10对数值为X轴,qPCR扩增Ct值为Y轴,制备标准曲线,并进行线性回归方程拟合获得线性方程;
具体操作为:
CHO标准品梯度制备
1)标记7支1.5ml离心管:分别标号SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、NTC;SD管是用来连续稀释的,NTC管是阴性对照;
2)取90ul DNA稀释液分别加入到:SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6和NTC管中;
3)将CHO标准品取出置于冰上待DNA解除冰冻,置于掌上离心机上微离心;
4)取10ul CHO标准品到SD1管中,涡旋15s混匀后微离心,SD1管中CHO DNA含量为5000pg/10ul;
5)从SD1管中取10ul到SD2中,涡旋15s混匀后微离心,SD2管中CHO DNA含量为500pg/10ul;
6)类似操作依次稀释获得SD3、SD4、SD5、SD6,SD3管、SD4管、SD5管和SD6管中CHODNA含量分别为50pg/10ul、5pg/10ul、0.5pg/10ul和0.05pg/10ul。
qRT-PCR
1)对不同浓度梯度的CHO标准品分别进行qRT-PCR,按照下表配制PCR混合液
试剂 |
用量(ul) |
2×PCR Master Mix |
15 |
CHO Primer/Probe Mix |
3.6 |
ddH2O |
1.4 |
总体积(ul) |
30 |
2)将PCR混合液按照每管20ul分装,并记录样品对应PCR管;
3)采用CFX96仪器检测,探针标记为FAM荧光团,检测荧光通道为第一通道
PCR扩增程序:95℃10min;95℃15s 60℃1min;40个循环。
qRT-PCR数据分析
针对标准品CHO DNA含量分别对数log10转换,以标准品log10对数值为X轴,qPCR扩增Ct为Y轴,制备标准曲线,并进行线性回归方程拟合获得线性方程。
本实施例中,分别得到的使用序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j的CHO DNA扩增曲线图和标准曲线图,如图1-16所示。
从图中能够看出:使用上述序列和引物进行CHO宿主细胞DNA残留检测,检测灵敏度高,标准品与CHO宿主细胞残留DNA浓度之间呈良好的线性关系,线性范围广,在宽广的线性范围内能够得到高的扩增效率。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。