CN105087562A - 一种辅酶q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类球红细菌噬菌体检测领域，特别涉及一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体快速检测方法，选择特定的三对引物中的任一对引物，并以每对引物对应的探针进行荧光定量PCR检测即可。该检测方法针对辅酶Q10发酵生产过程中污染类球红细菌的状况，选用特定的引物及其探针测定类球红细菌的污染情况，检测快速且灵敏度高，直接取任一阶段和规模的发酵生产中的发酵物提取基因组DNA，通过荧光定量PCR检测即可，方法简单，检测全过程大概需要两个小时，实现了快速准确的噬菌体检测，若发现有噬菌体污染，立即停止本次发酵产物的扩大生产，这样可以完全避免后一阶段的扩大生产中的噬菌体污染事件发生，减少不必要的损失。
Description
技术领域
本发明涉及类球红细菌噬菌体检测领域，具体而言，涉及一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体快速检测方法。
背景技术
辅酶Q10是一种抗氧化剂，广泛使用于心血管药物、保健品和化妆品。目前，全球的辅酶Q10主要在中国生产，大多是采用一系列不同规模的发酵设备来逐级放大规模地培养类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)，然后从发酵物中提取产品。和其他产品的细菌发酵生产一样，细菌发酵过程中如果发生噬菌体污染将导致产量和产品质量下降甚至停产，给生产厂家带来巨大的损失。因此，在生产过程中，避免和控制噬菌体污染一直是发酵行业一个严重和难以解决的问题。
目前，辅酶Q10生产过程中的噬菌体检测主要采用常规的双层板培养的检测方法，这种方法需要的时间比生产本身需要的时间还要略长。等检测结果出来，该批次发酵产物已经介入下一阶段的放大生产，不具备指导生产的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体快速检测方法，选用特定的引物进行测定，取任一阶段和规模的发酵生产中的待检测样品进行PCR检测全过程大概需要两个小时，实现了快速准确的噬菌体检测，若发现有噬菌体污染，立即停止本次发酵产物的扩大生产，这样可以完全避免后一阶段的扩大生产中的噬菌体污染事件发生，减少不必要的损失。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种类球红细菌噬菌体的基因组片段，如SEQIDNo.1所示。
该基因片段为类球红细菌噬菌体所特有，以SEQIDNo.1基因序列设计引物，可检测是否有类球红细菌噬菌体的存在。
优选地，以SEQIDNo.1基因序列设计引物，即可对辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体进行定量PCR检测。
针对辅酶Q10发酵生产过程中污染类球红细菌的状况，通过大量试验验证，测定出SEQIDNo.1基因序列为类球红细菌特异片段，在其他细菌中不存在；以该基因序列设计引物，进行定量检测，特异性好，检测简便。
一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，选择以下三对引物中的任一对引物，并以每对引物对应的探针进行荧光定量PCR检测即可；
每对引物及其对应的探针如下所示：
组1：以PF1和PR1作为引物，并以probe1作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，
PF1：GCGCTCTATTTCATCCCCGA；
PR1：CGGTATATTATGACCGGCGC；
probe1：CGGAACACTTTGTCAAGCGA；
组2：以PF2和PR2作为引物，并以probe2作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，
PF2：CTCGTCGCCATTCCAATCGG；
PR2：CGGGGCCACAAACTTAGGTA；
probe2：GCTCGGACTGCCAGAAAATC；
组3：以PF3和PR3作为引物，并以probe3作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，
PF3：ATGAACGCGACCCTTAAGCT；
PR3：ACGATTATGTTGGGCGTTGC；
probe3：GTCCTGAAAATGCGAGGGTG。
本发明提供的一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，针对辅酶Q10发酵生产过程中污染类球红细菌的状况，选用特定的引物及其探针测定类球红细菌的污染情况，检测快速且灵敏度高，直接取任一阶段和规模的发酵生产中的发酵物提取基因组DNA，通过荧光定量PCR检测即可，方法简单，检测全过程大概需要两个小时，实现了快速准确的噬菌体检测，若发现有噬菌体污染，立即停止本次发酵产物的扩大生产，这样可以完全避免后一阶段的扩大生产中的噬菌体污染事件发生，减少不必要的损失。
优选地，所述荧光定量PCR检测之前先制作由标准样品的拷贝数和Ct值构成的标准曲线。
其中的标准样品为不同拷贝数浓度的噬菌体基因组DNA特定片段或克隆了该片段的质粒线性化DNA。该片段是对类球红细菌噬菌体的基因组DNA进行PCR扩增所得或者按照本申请提供的序列人工合成所得，该片段含有上述的检测引物和探针的结合位点。
进一步地，所述荧光定量PCR检测采用的待测样品为待测发酵物中提取的总基因组DNA；
待测样品与所述标准标样以相同的PCR体系以及PCR程序进行实时荧光定量PCR，所述待测样品得到的Ct值直接与所述标准曲线比对即可得到前述噬菌体基因组DNA特定片段的拷贝数浓度，即噬菌体浓度。
进一步地，所述荧光定量PCR检测采用的待测样品通过以下方法制备：称取0.05-0.15g的发酵物提取基因组DNA，提取的基因组DNA溶解于50-150μl的超纯水中，即得。达到快速提取的要求，并且提取得到的基因组DNA浓度易于检测。
进一步地，所述标准曲线的纵横坐标分别为起始模板(不同浓度的标准样品)的拷贝数的对数值和定量PCR测定所得的Ct值。Ct值和起始模板的不同拷贝数的对数值具有很好的线性关系，更便于将待测样本的数值与标准曲线比对以得到检测结果。
优选地，所述起始模板由以下方法制备：
(a)、合成目标片段SEQIDNo.1；
(b)、以引物PF和PR对所述目标片段进行PCR扩增，扩增后对目标片段切胶纯化回收，其中
PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
(c)、测定回收的DNA的质量浓度，计算转化为拷贝数浓度，对该样品进行梯度稀释即得到一系列不同拷贝数浓度的标准样品。
先对所述人工合成的片段进行扩增，得到的扩增片段含有本发明提供的三对检测引物和三个探针对应的结合位点，通过片段扩增，以该扩增得到的片段作为标准曲线所用的标准样品。通过对标准样品的定量PCR扩增，得到标准曲线，从而增加待测样本进行荧光定量PCR检测的准确度。
为了进一步纯化标准样品，增加标准曲线的准确度，从而增加对待测样本检测的准确度，优选地，所述步骤(c)还包括：将回收的目标片段连接至载体上，转化到质粒宿主细菌中，培养细菌后提取质粒，该质粒酶切线性化，纯化后测定DNA的质量浓度，计算转化为拷贝数浓度，对该样品进行梯度稀释即得到一系列不同拷贝数浓度的标准样品。
进一步地，所述载体为T载体；
所述质粒扩增具体为：
将回收的目标片段连接至载体，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养。
T载体通过市售即可。
为了得到的标准曲线更稳定，并具有更大的范围，以便于待测样本的比对，进一步地，所述起始模板的不同拷贝数的范围为：1.0×102拷贝-1.0×106拷贝，以10倍进行等分。
另外，一般当噬菌体污染开始出现，检测值在数万拷贝/微升以上，设置该范围能很灵敏的检测到噬菌体的污染。当在小规模的放大发酵中检测到噬菌体后，该批发酵产品应当立即废弃并严格对发酵装备进行消毒。放大发酵一般平行有几个发酵罐，选取没有检测到噬菌体的发酵物接到下一个发酵规模进行生产即可。这样，能够保证接入生产罐的发酵物中没有噬菌体，保证生产罐的正常生产。
起始模板拷贝数的选择主要是为了将得到的样本检测的范围囊括，因此，根据待测样本，可选择设置不同的起始模板的拷贝数。
进一步地，所述荧光定量PCR检测采用TaKaRa公司的PremixExTaqTMII定量PCR试剂盒推荐的步骤进行。
为了得到的检测方法更灵敏和准确，并且减少成本，更优选地，所述荧光定量PCR的反应体系为20μl-25μl，优选为20μl。
优选地，所述荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：Taq酶溶液10μl、每种引物各0.8μl(10pmol/μl)、探针0.8μl(10pmol/μl)、ROX荧光染液0.4μl、待测样品模板2μl、灭菌超纯水补齐至20μl。
待测样本采用该PCR反应体系进行荧光定量PCR，得到的曲线稳定。此外，PCR反应体系的选择可以根据选用的试剂盒推荐进行，还可以选用其他体积，如常用的25μl体系、50μl体系、15μl体系等，其中成分的含量只需要相应地降低或升高即可。
优选地，荧光定量PCR扩增程序为：94-95℃预变性30-35s；94-95℃变性5-7s，60℃退火32-35s，共35-40个循环。以该实时荧光定量PCR扩增程序进行扩增，扩增特异性好，扩增得到的数据稳定。
另外，荧光定量PCR扩增程序根据使用的试剂盒按照试剂盒推荐的程序进行即可。
此外，标准曲线也采用相同的PCR反应体系和PCR扩增程序得到数据，其中，PCR反应体系的模板即为不同浓度的标准样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，测定出SEQIDNo.1基因序列为类球红细菌特异片段，在其他细菌中不存在；以该基因序列设计引物，进行定量检测，特异性好，检测简便。
(2)本发明提供的辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，选用特定的引物及其探针测定类球红细菌的污染情况，检测快速且灵敏度高，直接取任一阶段和规模的发酵生产中的发酵物提取基因组，通过荧光定量PCR检测即可，方法简单，实现了快速准确的噬菌体检测，若发现有噬菌体污染，立即停止本次发酵产物的扩大生产，这样可以完全避免后一阶段的扩大生产中的噬菌体污染事件发生，减少不必要的损失。
(3)本发明提供的辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染。
(4)本发明提供的辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，通过标准曲线的制作实现对供试材料中类球红细菌噬菌体的定量检测；检测过程只需要2小时左右，大大简化了检测步骤，缩短了检测的时间，且灵敏度高。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
实施例1
按照SEQIDNo.1人工合成目标片段；
以引物PF和PR对所述目标片段进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收，其中，
PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
回收的目标片段，将回收的目标片段连接至T载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒用EcoRI酶切线性化，纯化后得到起始模板；
将起始模板稀释，不同拷贝数的起始模板，其范围为：1.0×102拷贝-1.0×106拷贝，以10倍进行等分；
采用TaKaRa公司的PremixExTaqTMII定量PCR试剂盒推荐的步骤进行PCR，具体为：
PCR反应体系为20μl：Taq酶溶液10μl、PF1和PR1引物各0.8μl(10pmol/μl)、probe1探针0.8μl(10pmol/μl)、ROX荧光染液0.4μl、待测样品模板2μl、灭菌超纯水补齐至20μl；
荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，共40个循环；
得到标准曲线，标准曲线的回归方程为：Y＝-3.24log(x)+43.37，其中，Y为Ct值，x为起始模板的不同拷贝数的对数值，相关系数R2达0.999，扩增效率E为103.7％，结果标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系；
称取0.1g的辅酶Q10的发酵物作为待测样本，提取基因组DNA，提取的基因组DNA溶解于100μl的超纯水中，得到待测样本模板；
按与标准曲线同样的试剂以及PCR反应体系和程序进行荧光定量PCR，测定得到待测样本模板中类球红细菌噬菌体的拷贝数，未检测到类球红细菌噬菌体。
另外，还对不同发酵阶段的发酵物进行检测以及检测结果的验证，共检测50个样本，2个样本中检测到类球红细菌噬菌体的拷贝数分别为2.5×102拷贝和3.72×104拷贝。对各样本进行验证，验证正确率为100％。
实施例2
按照SEQIDNo.1人工合成目标片段；
以引物PF和PR对所述目标片段进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收，其中，
PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
回收的目标片段，将回收的目标片段连接至T载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒用EcoRI酶切线性化，纯化后得到起始模板；
将起始模板稀释，不同拷贝数的起始模板，其范围为：1.0×102拷贝-1.0×106拷贝，以10倍进行等分；
采用TaKaRa公司的PremixExTaqTMII定量PCR试剂盒推荐的步骤进行PCR，具体为：
PCR反应体系为20μl：Taq酶溶液10μl、PF1和PR1引物各0.8μl(10pmol/μl)、probe1探针0.8μl(10pmol/μl)、ROX荧光染液0.4μl、待测样品模板2μl、灭菌超纯水补齐至20μl；
荧光定量PCR扩增程序为：94℃预变性35s；94℃变性7s，60℃退火35s，共35个循环；
得到标准曲线，标准曲线的回归方程为：Y＝-3.25log(x)+43.52，其中，Y为Ct值，x为起始模板的不同拷贝数的对数值，相关系数R2达0.998，扩增效率E为103.6％，结果标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系；
称取0.15g的辅酶Q10的发酵物作为待测样本，提取基因组DNA，提取的基因组DNA溶解于150μl的超纯水中，得到待测样本模板；
按与标准曲线同样的试剂以及PCR反应体系和程序进行荧光定量PCR，测定得到待测样本模板中类球红细菌噬菌体的拷贝数，未检测到类球红细菌噬菌体。
另外，还对不同发酵阶段的发酵物进行检测以及检测结果的验证，共检测50个样本，2个样本中检测到类球红细菌噬菌体的拷贝数分别为3.1×102拷贝和1.93×104拷贝。对各样本进行验证，验证正确率为100％。
实施例3
按照SEQIDNo.1人工合成目标片段；
以引物PF和PR对所述目标片段进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收，其中，
PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
回收的目标片段，将回收的目标片段连接至T载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒用EcoRI酶切线性化，纯化后得到起始模板；
将起始模板稀释，不同拷贝数的起始模板，其范围为：1.0×102拷贝-1.0×106拷贝，以10倍进行等分；
采用TaKaRa公司的PremixExTaqTMII定量PCR试剂盒推荐的步骤进行PCR，具体为：
PCR反应体系为20μl：Taq酶溶液10μl、PF2和PR2引物各0.8μl(10pmol/μl)、probe2探针0.8μl(10pmol/μl)、ROX荧光染液0.4μl、待测样品模板2μl、灭菌超纯水补齐至20μl；
荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性32s；95℃变性6s，60℃退火35s，共38个循环，得到标准曲线；标准曲线的回归方程为：Y＝-3.589log(x)+37.581，其中，Y为Ct值，x为起始模板的不同拷贝数的对数值，相关系数R2达0.999，扩增效率E为89.952％，结果标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系；
称取0.05g的辅酶Q10的发酵物作为待测样本，提取基因组DNA，提取的基因组DNA溶解于50μl的超纯水中，得到待测样本模板；
按与标准曲线同样的试剂以及PCR反应体系和程序进行荧光定量PCR，测定得到待测样本模板中类球红细菌噬菌体的拷贝数，未检测到类球红细菌噬菌体。
另外，还对不同发酵阶段的发酵物进行检测以及检测结果的验证，共检测50个样本，1个样本中检测到类球红细菌噬菌体的拷贝数分为3.2×102拷贝。对各样本进行验证，验证正确率为100％。
实施例4
按照SEQIDNo.1人工合成目标片段；
以引物PF和PR对所述目标片段进行PCR扩增，扩增后对目标片段回收，其中，
PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
回收的目标片段，将回收的目标片段连接至T载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养，扩增后提取质粒，经鉴定正确后，该质粒用EcoRI酶切线性化，纯化后得到起始模板；
将起始模板稀释，不同拷贝数的起始模板，其范围为：1.0×102拷贝-1.0×106拷贝，以10倍进行等分；
采用TaKaRa公司的PremixExTaqTMII定量PCR试剂盒推荐的步骤进行PCR，具体为：
PCR反应体系为20μl：Taq酶溶液10μl、PF3和PR3引物各0.8μl(10pmol/μl)、probe3探针0.8μl(10pmol/μl)、ROX荧光染液0.4μl、待测样品模板2μl、灭菌超纯水补齐至20μl；
荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性6s，60℃退火35s，共36个循环，得到标准曲线；标准曲线的回归方程为：Y＝-3.575log(x)+35.577，其中，Y为Ct值，x为起始模板的不同拷贝数的对数值，相关系数R2达0.999，扩增效率E为90.434％，结果标准品起始模板浓度与Ct值均呈现良好的线性关系；
称取0.1g的辅酶Q10的发酵物作为待测样本，提取基因组DNA，提取的基因组溶解于100μl的超纯水中，得到待测样本模板；
按与标准曲线同样的试剂以及PCR反应体系和程序进行荧光定量PCR，测定得到待测样本模板中类球红细菌噬菌体的拷贝数，未检测到类球红细菌噬菌体。
另外，还对不同发酵阶段的发酵物进行检测以及检测结果的验证，共检测50个样本，1个样本中检测到类球红细菌噬菌体的拷贝数为5.1×105拷贝。对各样本进行验证，验证正确率为100％。
实施例1-4所用的引物和探针的基因序列如表1所示。
表1引物及探针序列
本发明实施例中所用的噬菌体基因组抽提采用北京天根生物生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒；荧光定量PCR采用AppliedBiosystems公司的7500型定量PCR仪。
本发明提供辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，选用特定的引物及其探针测定类球红细菌的污染情况，特异性强，灵敏度高，检测快速，直接取任一阶段和规模的发酵生产中的发酵物提取基因组，通过荧光定量PCR检测即可，方法简单，实现了快速准确的噬菌体检测，以减少不必要的损失。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (10)
1.一种类球红细菌噬菌体的基因组片段，其特征在于，如SEQIDNo.1所示。
2.一种辅酶Q10生产中的类球红细菌噬菌体的检测方法，其特征在于，选择以下三对引物中的任一对引物，并以每对引物对应的探针进行荧光定量PCR检测即可；
每对引物及其对应的探针如下所示：
组1：以PF1和PR1作为引物，并以probe1作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，
PF1：GCGCTCTATTTCATCCCCGA；
PR1：CGGTATATTATGACCGGCGC；
probe1：CGGAACACTTTGTCAAGCGA；
组2：以PF2和PR2作为引物，并以probe2作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，
PF2：CTCGTCGCCATTCCAATCGG；
PR2：CGGGGCCACAAACTTAGGTA；
probe2：GCTCGGACTGCCAGAAAATC；
组3：以PF3和PR3作为引物，并以probe3作为探针进行荧光定量PCR检测，其中，
PF3：ATGAACGCGACCCTTAAGCT；
PR3：ACGATTATGTTGGGCGTTGC；
probe3：GTCCTGAAAATGCGAGGGTG。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测之前先采用不同拷贝数的标准样品来制作标准曲线，确定标准样品的拷贝数与Ct值的代数关系。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测采用的待测样品为待测的发酵物样品中提取的基因组DNA混合物；
待测样品与所述标准样品以相同的PCR体系以及PCR程序进行实时荧光定量PCR，所述待测样本得到的Ct值直接与所述标准曲线比对即可得到待测样品的拷贝数浓度。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测采用的待测样品通过以下方法制备：称取0.05-0.15g的发酵物提取基因组DNA，提取的基因组DNA溶解于50-150μl的超纯水中，即得。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述标准样品由以下方法制备：
(a)、合成目标片段SEQIDNo.1；
(b)、以引物PF和PR对所述目标片段进行PCR扩增，扩增后对目标片段切胶纯化回收，其中，
PF：TTTCGTCGTATCCGTCTCGGT；
PR：GATGTCTACCTCTTGATATAC；
(c)、测定回收的DNA的质量浓度，计算转化为拷贝数浓度，对该样品进行梯度稀释即得到一系列不同拷贝数浓度的标准样品。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(c)还包括：将回收的目标片段连接至载体上，转化到质粒宿主细菌中，培养细菌后提取质粒，该质粒酶切线性化，纯化后测定DNA的质量浓度，计算转化为拷贝数浓度，对该样品进行梯度稀释即得到一系列不同拷贝数浓度的标准样品。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述载体为T载体；
所述质粒扩增具体为：
将回收的目标片段连接至载体，转化至E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行增菌培养。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述起始模板的不同拷贝数的范围为：1.0×102拷贝-1.0×106拷贝，以10倍进行等分。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测采用TaKaRa公司的PremixExTaqTMII定量PCR试剂盒推荐的步骤进行。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105087562B (zh) | 2017-09-22 |
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