CN103710455B - 一种获得寡核苷酸探针的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得寡核苷酸探针的方法，该获得寡核苷酸探针的方法包括以下步骤：从NCBI网站中下载pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的原始序列；用生物信息学软件DNAMAN，对下载的各序列进行分析，寻找这些序列中重复的核心单元，再回到NCBI网站中利用blastn工具进行比对，力争找到长度在60bp以下的核心寡核苷酸序列，以用作探针合成；将初步筛选出的众多寡核苷酸序列进行探针合成；待探针合成后，逐条进行FISH试验，验证探针的功能，验证合成的寡核苷酸序列是否能起到pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的FISH效果；获得寡核苷酸探针。本发明省去了现有探针标记技术的繁琐过程，消除了探针标记失败的问题，降低了成本。

Description

一种获得寡核苷酸探针的方法
技术领域
本发明属于植物分子染色体工程育种技术领域，尤其涉及一种获得寡核苷酸探针的方法。
背景技术
在植物远缘杂交育种、异源多倍化及植物染色体进化研究中，FISH技术是必须的。在小麦族植物相关研究中，FISH技术也是必不可少的。小麦族植物FISH实验中，重复序列pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1是常用的探针。用这些重复序列作探针能准确鉴定小麦及其近缘种属的染色体，这对于在小麦育种中，将外源有利基因导入小麦极其有用，在小麦品种改良中具有重要的应用价值。然而，目前利用这些序列作探针比较费时费力。因此，有必要对这些探针进行改进，使其能被简便、高效地应用。
FISH(fluorescenceinsituhybridization,荧光原位杂交)：用经标记的核苷酸序列（通常是重复序列）作探针，与染色体进行杂交，明确探针序列在染色体上的分布，从而达到识别染色体，了解染色体和基因组进化的目的。
pSc119.2：是从黑麦中克隆出来的一段120bp长的串联重复序列(Contentoetal.2005)，该串联重复序列在普通小麦及小麦的近缘种属中都有分布，且在不同染色体上分布情况不同，可以用作探针，鉴定小麦及其近缘种属的染色体。
pAs1:是从小麦近缘种属山羊草中克隆的一段约200bp长的串联重复序列（Nagakietal.1995）。该序列在小麦及其一些近缘种属如山羊草的染色体上有分布，主要分布在D组染色体上，不同D组染色体分布不同，可以用作探针鉴定D组染色体。
pTa-535：是从普通小麦中克隆的一段类似pAs1的序列，全长640bp(Komuroetal.2013)。该序列主要分布在小麦D组染色体和部分A组染色体上，因此能用该序列作探针鉴定小麦A染色体和D染色体。
pTa71:是从小麦中克隆的一段9.05kb长的DNA片段，包含了18S,5.8S和26SrDNA基因及基因间隔区域(Barkeretal.1988)，通常用作探针检测小麦及其近缘种属的核仁组织区。
pAWRC.1:是从黑麦中克隆的一段长约3.4Kb，黑麦染色体着丝粒特异的重复序列(Francki2001)。该序列通常被用作探针检测黑麦染色体的着丝粒结构，并将黑麦着丝粒和其它小麦族植物的着丝粒区分开。
CCS1:是禾谷类染色体着丝粒特异重复序列(Aragón-Alcaideetal.1996)，通常用作探针检测小麦及其近缘种属和其它禾谷类染色体的着丝粒结构。
目前利用pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1序列作探针，主要通过自己实验室进行标记，其标记步骤及方案如下：
在探针制备中，首先要用DNA克隆技术从植物基因组中获得这些探针的序列片段，将其连接在克隆载体中，将载体转化到大肠杆菌细胞中进行大量繁殖，而后从大肠杆菌细胞中提取大量的克隆序列，或用PCR的方法从麦类植物基因组DNA中扩增出这些序列，用胶回收试剂盒回收序列，用纯化试剂盒进行纯化，通过这些方法得到的序列才能用作探针标记；其次要购买探针标记试剂盒，在自己实验室内对这些获得的序列进行探针标记；然后检测探针是否标记成功；最后用标记成功的探针对试验材料进行FISH试验。
目前FISH的探针标记技术十分繁杂，很容易遇到探针标记失败，成本较高。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种获得寡核苷酸探针的方法，旨在解决目前FISH的探针标记技术十分繁杂，很容易遇到探针标记失败，成本较高的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种获得寡核苷酸探针的方法，该获得寡核苷酸探针的方法包括以下步骤：
步骤一，从NCBI网站中下载pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的原始序列；
步骤二，用生物信息学软件DNAMAN，对下载的各序列进行分析，寻找这些序列中重复的单元，再回到NCBI网站中利用blastn工具进行比对，力争找到长度在60bp以下的核心寡核苷酸序列，以用作探针合成；
步骤三，将初步筛选出的众多寡核苷酸序列进行探针合成；
步骤四，待探针合成后，逐条进行FISH试验，验证探针的功能，验证合成的寡核苷酸序列是否能起到pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的FISH效果；获得寡核苷酸探针。
进一步，寡核苷酸序列包括：Oligo-pAs1-1、Oligo-pAs1-2、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa535-2、Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pSc119.2-2、Oligo-pTa71-2、Oligo-pAWRC.1、Oligo-CCS1。
进一步，寡核苷酸序列Oligo-pAs1-1和Oligo-pAs1-2作探针，分别都能代替pAs1鉴定小麦D组染色体。
进一步，寡核苷酸序列Oligo-pTa535-1和Oligo-pTa535-2作探针，分别都能代替pTa-535鉴定小麦A组和D组染色体。
进一步，寡核苷酸序列Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pSc119.2-2作探针，分别都能代替pSc119.2鉴定小麦B组染色体和黑麦的各条染色体。
进一步，寡核苷酸序列Oligo-pTa71-2作探针，可以代替pTa71检测小麦族植物的核仁组织区。
进一步，寡核苷酸序列Oligo-pAWRC.1作探针，可以代替pAWRC.1检测黑麦染色体着丝粒结构，将黑麦着丝粒与其它小麦族植物的着丝粒区分开。
进一步，寡核苷酸序列Oligo-CCS1作探针，可以代替CCS1检测小麦族植物染色体着丝粒结构。
本发明提供的获得寡核苷酸探针的方法，采用寡核苷酸序列，用合成的办法获得探针，根据寡核苷酸序列合成的探针能够替代pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71，pAWRC.1和CCS1序列的功能，省去了现有探针标记技术的繁琐过程，消除了探针标记失败的情况。本发明目前合成探针价格不高，和现有探针标记技术相比，其实验成本会大大降低。因此，本发明能替代pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71，pAWRC.1和CCS1的寡核苷酸序列用作探针，在进行FISH实验时，去掉探针标记过程，提高效率、降低难度、降低成本；
本发明技术带来的有益效果如下：
1.各寡核苷酸序列都能起到应有的功能：
寡核苷酸序列Oligo-pAs1-1和Oligo-pAs1-2作探针，分别都能代替pAs1鉴定小麦D组染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pTa535-1和Oligo-pTa535-2作探针，分别都能代替pTa-535鉴定小麦A组和D组染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pSc119.2-2作探针，分别都能代替pSc119.2鉴定小麦B组染色体和黑麦的各条染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pTa71-2作探针，可以代替pTa71检测小麦族植物的核仁组织区；
寡核苷酸序列Oligo-pAWRC.1作探针，可以代替pAWRC.1检测黑麦染色体着丝粒结构，将黑麦着丝粒与其它小麦族植物的着丝粒区分开。
寡核苷酸序列Oligo-CCS1作探针，可以代替CCS1检测小麦族植物染色体着丝粒结构；
2.使以pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71，pAWRC.1和CCS1为探针的FISH实验变得简便易行；省去了探针的标记过程，通过公司合成后就可直接使用，避免了自己实验室探针标记失败的情况；
3.实验成本大大降低，合成探针的价格低廉。
附图说明
图1是本发明实施例提供的获得寡核苷酸探针的方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明实施例的获得寡核苷酸探针的方法包括以下步骤：
S101：从NCBI网站中下载pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的原始序列；
S102：用生物信息学软件DNAMAN，对下载的各序列进行分析，寻找这些序列中重复的核心单元，再回到NCBI网站中利用blastn工具进行比对，力争找到长度在60bp以下的核心寡核苷酸序列，以用作探针合成；
S103：将初步筛选出的众多寡核苷酸序列进行探针合成；
S104：待探针合成后，逐条进行FISH试验，验证探针的功能，验证合成的寡核苷酸序列是否能起到pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的FISH效果；获得寡核苷酸探针。
在步骤S104获得的能起作用的寡核苷酸序列如下所示：
Oligo-pAs1-1:5’CCTTTCTGACTTCATTTGTTATTTTTCATGCATTTACTAATTATTTTGAGCTATAAGAC3’
Oligo-pAs1-2:5’CATTTCATCCACATAGCATGTGCAAGAAATTTGAGAGGGTTACGGCAAAAACTGGAT3’
Oligo-pTa535-1:5’AAAAACTTGACGCACGTCACGTACAAATTGGACAAACTCTTTCGGAGTATCAGGGTTTC3’
Oligo-pTa535-2:5’GACGAGAACTCATCTGTTACATGGGCACTTCAATGTTTTTTAAACTTATTTGAACTCCA3’
Oligo-pSc119.2-1:5’CCGTTTTGTGGACTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT3’
Oligo-pSc119.2-2:5’TTCCACGATTGACGATTCCGGGGGTGCGTTTACGTGTCCGTCGTC3’
Oligo-pTa71-2：5’GGGCAAAACCACGTACGTGGCACACGCCGCGTA3’
Oligo-pAWRC.1：5’CGTAGGCGCCGATCTTGAAAGAGACTTGCACGGTGTGCTCGACTCGAAGAATTCCGGCGT3’
Oligo-CCS1：5’CCGTTTGATAGAGGCAAAGGTGTCCCGTCTTTTGATGAGA3’
本发明各寡核苷酸序列都能起到应有的功能：
寡核苷酸序列Oligo-pAs1-1和Oligo-pAs1-2作探针，分别都能代替pAs1鉴定小麦D组染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pTa535-1和Oligo-pTa535-2作探针，分别都能代替pTa-535鉴定小麦A组和D组染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pSc119.2-2作探针，分别都能代替pSc119.2鉴定小麦B组染色体和黑麦的各条染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pTa71-2作探针，可以代替pTa71检测小麦族植物的核仁组织区；
寡核苷酸序列Oligo-pAWRC.1作探针，可以代替pAWRC.1检测黑麦染色体着丝粒结构，将黑麦着丝粒与其它小麦族植物的着丝粒区分开；
寡核苷酸序列Oligo-CCS1作探针，可以代替CCS1检测小麦族植物染色体着丝粒结构；
使以pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1为探针的FISH实验变得简便易行；以上核苷酸序列的获得，省去了探针的标记过程，通过公司合成后就可直接使用，避免了自己实验室探针标记失败的情况；实验成本大大降低，合成探针的价格低廉。合成一条探针的单价在350元～1500元人民币之间（根据不同颜色标记而定）；合成一条探针含5个OD值，可以稀释成5000μL的工作液，每个样品按0.2μL～0.5μL用量算，合成一条探针可以做10000个～25000个样品。亦即做10000个～25000个样品的FISH分析，探针成本在350元～1500元人民币。如果自己实验室标记探针，做5000个样品至少需要花费3000元～5000元人民币（根据不同颜色标记而定）。所以，用本发明结果进行FISH试验，成本大大降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种获得寡核苷酸探针的方法，其特征在于，该获得寡核苷酸探针的方法包括以下步骤：
步骤一，从NCBI网站中下载pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的原始序列；
步骤二，用生物信息学软件DNAMAN，对下载的各序列进行分析，寻找这些序列中重复的核心单元，再回到NCBI网站中利用blastn工具进行比对，力争找到长度在60bp以下的核心寡核苷酸序列，以用作探针合成；
步骤三，将初步筛选出的众多寡核苷酸序列进行探针合成；
步骤四，待探针合成后，逐条进行FISH试验，验证探针的功能，验证合成的寡核苷酸序列是否能起到pSc119.2,pAs1,pTa-535,pTa71,pAWRC.1和CCS1的FISH效果；获得寡核苷酸探针；
寡核苷酸序列包括：Oligo-pAs1-1、Oligo-pAs1-2、Oligo-pTa535-1、Oligo-pTa535-2、Oligo-pSc119.2-1、Oligo-pSc119.2-2、Oligo-pTa71-2、Oligo-pAWRC.1、Oligo-CCS1；
Oligo-pAs1-1:5’CCTTTCTGACTTCATTTGTTATTTTTCATGCATTTACTAATTATTTTGAGCTATAAGAC3’；
Oligo-pAs1-2:5’CATTTCATCCACATAGCATGTGCAAGAAATTTGAGAGGGTTACGGCAAAAACTGGAT3’；
Oligo-pTa535-1:5’AAAAACTTGACGCACGTCACGTACAAATTGGACAAACTCTTTCGGAGTATCAGGGTTTC3’；
Oligo-pTa535-2:5’GACGAGAACTCATCTGTTACATGGGCACTTCAATGTTTTTTAAACTTATTTGAACTCCA3’；
Oligo-pSc119.2-1:5’CCGTTTTGTGGACTATTACTCACCGCTTTGGGGTCCCATAGCTAT3’；
Oligo-pSc119.2-2:5’TTCCACGATTGACGATTCCGGGGGTGCGTTTACGTGTCCGTCGTC3’；
Oligo-pTa71-2：5’GGGCAAAACCACGTACGTGGCACACGCCGCGTA3’；
Oligo-pAWRC.1：5’CGTAGGCGCCGATCTTGAAAGAGACTTGCACGGTGTGCTCGACTCGAAGAATTCCGGCGT3’；
Oligo-CCS1：5’CCGTTTGATAGAGGCAAAGGTGTCCCGTCTTTTGATGAGA3’；
寡核苷酸序列Oligo-pAs1-1和Oligo-pAs1-2作探针，分别都能代替pAs1鉴定小麦D组染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pTa535-1和Oligo-pTa535-2作探针，分别都能代替pTa-535鉴定小麦A组和D组染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pSc119.2-2作探针，分别都能代替pSc119.2鉴定小麦B组染色体和黑麦的各条染色体；
寡核苷酸序列Oligo-pTa71-2作探针，可以代替pTa71检测小麦族植物的核仁组织区；
寡核苷酸序列Oligo-pAWRC.1作探针，可以代替pAWRC.1检测黑麦染色体着丝粒结构，将黑麦着丝粒和其它小麦族植物的着丝粒区分开；
寡核苷酸序列Oligo-CCS1作探针，可以代替CCS1检测小麦族植物染色体着丝粒结构。
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