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可检测多种转基因水稻的质粒标准分子 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定性检测多种转基因水稻的质粒标准分子。该质粒标准分子含转基因水稻中高频率使用的外源调控元件（基因）P-CaMV35S、T-NOS、P-Ubi基因片段，外源标记基因Bar、Hpt片段和水稻内标准基因SPS、PEPC等片段。实验证明：该质粒标准分子可作为阳性标准品用于转基因水稻的定性筛选、监测等工作。

Description

可检测多种转基因水稻的质粒标准分子
技术领域
本发明涉及一种转基因水稻定性筛选检测用质粒DNA，具体涉及一种可检测多种转基因水稻的质粒标准分子。
背景技术
在转基因生物安全管理体系建设中，转基因安全监管问题是当务之急。其中，转基因生物的检测是安全监管的重要组成部分。
在转基因生物的检测中，需要对检测活动设置阳性对照，以进行检测结果的监控。通常以从已知的转基因产品中提取的基因组作为阳性对照，但由于我国对转基因产品控制严格，很难得到传统的阳性对照材料，因此亟需研制新型阳性对照材料。质粒标准分子以其制备快捷，成本经济，易于复制等优点，在转基因检测中具有较好的应用前景。
尽管质粒标准分子已开始出现在转基因作物的定性筛选、监测、定量检测等领域。如转基因水稻克螟稻2号质粒标准分子（中国生物工程杂志，2012）、转基因水稻华恢1号质粒分子（生物技术通报，2012）、转基因玉米NK603质粒分子（农业生物技术学报，2011）、转基因大豆MON89788质粒分子（中国专利，专利号201010106138）等等。
但是，上述报道的质粒分子只能针对单一水稻转化体，而实践中当需要检测多种转基因水稻或检测对象不确定是哪种转化体时，就必须多次检测，既繁琐，且检测成本高，花费时间长。
发明内容
本发明的目的是构建一个可检测转基因水稻质粒标准分子，在转基因水稻筛选检测时，用其作为阳性对照品可检测多种转基因水稻，达到覆盖面积广，单次检测就可获得多重结果的目的。
本发明通过分析我国转基因水稻的转化元件、标记基因等信息和分子特征，筛选出了检测覆盖率可达到98.5%的组合元件，包括P-CaMV35S、T-NOS、P-Ubi、Bar、Hpt五个外源调控元件（包括标记基因）；还筛选出了内标准基因SPS和PEPC。
选用上述任意1-5个外源调控元件和任意1-2个内标准基因，可构建转基因水稻定性筛选检测的质粒标准分子。
上述外源调控基因和内标准基因的序列号及所含核苷酸片段如表1所示：
表1外源调控元件和内标准基因的序列号
因此，本发明的技术方案是：
一种用于转基因水稻定性检测的质粒标准分子，含有选自SEQ ID NO:3～SEQ IDNO:7中任意一个或几个核苷酸片段，且含有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中任意一个或两个核苷酸片段。
本发明经过PCR扩增验证，结果证明上述构建的质粒标准分子可作为转基因水稻筛选检测时阳性对照品。
该质粒可在转基因水稻定性筛选检测时作为阳性对照物质，解决了阳性标准品的缺乏问题。
优选的质粒标准分子是含有SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:9共7个核苷酸片段。
所述七个核苷酸片段可以任意顺序连接。在本发明的实施例1中，将SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:7五个片段连接为SEQ ID NO:1，将SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9连接为SEQID NO:2，然后将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2片段共同构建于pUC57-Amp载体。
一种构建方式是：SEQ ID NO:1片段和SEQ ID NO:2片段分别以平端克隆方式共同构建于pUC57-Amp载体的EcoRV位点。
上述P-CaMV35S、T-NOS、P-Ubi、Bar、Hpt五个外源调控元件分别由SEQ ID NO:10—SEQ ID NO:19五对引物分别进行特异性扩增，并将扩增子进行融合；上述内标准基因SPS和PEPC分别由SEQ ID NO:20—SEQ ID NO:23两对引物分别进行特异性扩增，并将扩增子进行融合。
所用引物的序列号具体见表2：
表2扩增外源调控元件和内标准基因所用引物的序列号
Figure BDA0000398334200000031
本发明得到的质粒标准分子可用于转基因水稻定性筛选、监测中，作为转基因检测用的阳性对照物质或阳性标准品。
由于本发明的质粒分子含有5种不同的外源检测元件、2种内标基因，通过外源元件和内标准基因的不同组合，可用于检测多种转基因水稻，特点是覆盖面积广，单次检测就可获得多重结果。
附图说明
图1是在本发明的一种实施方式中，构建的转基因水稻定性检测用质粒构建物理图。
图2是实施例1所得到的pBJGMM001质粒标准分子验证的电泳图，其中，M100bpmarker，1-2分别为内标准基因SPS（287）、PEPC（271）；3、4、6分别为调控元件CaMV35S（195bp）、NOS（180bp）、Ubi（314bp）；5、7分别为外源标记基因Bar（430bp）、Hpt（472bp)。
具体实施方式
实施例1标准分子构建
1、目标基因序列查找及引物设计
通过查阅转基因水稻转化元件的相关资料，选取使用频率较高的调控元件和标记基因（外源基因）序列片段（SEQ ID NO:1）；选取单拷贝内标准基因片段（SEQ ID NO:2），作为内标准基因。
由于本专利中所涉及的引物、扩增子序列对应的检测方法已通过循环试验，得到有效性验证。本实验需要的所有引物，由上海生工合成。引物序列，扩增产物大小及来源如表3。
表3外源基因和内标准基因引物
Figure BDA0000398334200000041
2、目标DNA片段的获得与标准分子构建
按照表1中对应公告、标准所述的核酸序列，通过基因合成的方式，分别获得序列SEQID NO:1与SEQ ID NO:2。将这两段核酸序列连接后，再与克隆载体pUC57的EcoRV位点连接，从而得到质粒标准分子，命名为pBJGMM001。连接顺序及质粒分子大小见图1。
3、质粒标准分子pBJGMM001的纯化
构建得到的质粒转化入大肠杆菌受体菌中，菌种保藏在-70℃冰箱，以载体氨苄青霉素AMP抗性为筛选标记。质粒的大量制备由保藏的菌种开始，首先使菌种复壮，划平板挑取单克隆菌落在LB培养液中进行大量培养，然后采用质粒提取试剂盒PureYieldTM PlasmidMidiprep System(Promega公司)进行提取和纯化。
实施例2质粒标准分子PCR扩增验证
1、标准质粒验证
利用上述引物对标准质粒pBJGMM001的外源插入基因进行验证，检验构建质粒是否含有预期的所有外源片段，结果如图2。
由图可知，外源插入基因均可被检测到，说明构建的质粒含有预期目的基因。
2、PCR检测的体系和程序
定性PCR扩增采用veriti梯度PCR仪（AB公司），扩增体系如表4。
表4PCR检测反应体系
Figure BDA0000398334200000051
反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35次循环；72℃延伸7min。
实施例3pBJGMM001质粒分子筛选检测适用性研究
标准物质的适用性研究是用研制的标准物（包括标准样品、标准分子或标准器等等）检测或测定已知结果的实际样品，以验证该标准物的可行性和有效性。
在本发明的适用性研究实验中，是采用本发明所得的pBJGMM001的外源基因元件与内标准基因对有产业化前景的转基因水稻样品进行适用性验证。
所用的水稻样品为：我国已颁布转基因安全证书转基因抗虫水稻TT51-1及进入安全评价高阶段水稻如转基因水稻抗优97、科丰6号、科丰8号、KMD1、Bar68-1、Bar66-1为材料，对pBJGMM001质粒分子进行了验证。
结果表明，pBJGMM001质粒分子均能正确检测出每个转化体对应的外源元件及内标准基因，因此证明了此质粒标准分子适用于转基因水稻筛选、检测。实验结果详见表5.
表5pBJGMM001适用性研究结果
注：“+”表示结果有扩增条带，即存在该基因。“-”表示结果无扩增条带，即无对应基因。
Figure IDA0000398334280000011
Figure IDA0000398334280000021
Figure IDA0000398334280000031
Figure IDA0000398334280000041
Figure IDA0000398334280000051

Claims (10)

1.一种定性检测多种转基因水稻的质粒标准分子，其特征是含有选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:7中任意一个或几个核苷酸片段，且含有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中任意一个或两个核苷酸片段。
2.权利要求1所述的质粒标准分子，含有SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:9共7个核苷酸片段。
3.权利要求1所述的质粒标准分子，含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸片段。
4.权利要求3所述的质粒标准分子，其特征是将以下核苷酸片段共同构建于载体：
1）选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:7中任意连接顺序的一个或几个核苷酸片段，和
2）选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中任意连接顺序的一个或两个核苷酸片段。
5.权利要求4所述的质粒标准分子，所述共同构建是将1）和2）片段分别以平端克隆方式共同构建于pUC57-Amp载体的EcoRV位点。
6.权利要求2～5中任一所述的质粒标准分子的构建方法，其特征是由下列5个引物对分别进行特异性扩增，并将扩增子进行融合得到SEQ ID NO:1：
引物对1：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；
引物对2：SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
引物对3：SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
引物对4：SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；
引物对5：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
7.权利要求2～5中任一所述的质粒标准分子的构建方法，其特征是由下列2个引物对分别进行特异性扩增，并将扩增子进行融合得到SEQ ID NO:2：
引物对6：SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；
引物对7：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。
8.权利要求1～5中任一所述的质粒标准分子在转基因水稻定性筛选、监测中的应用。
9.权利要求8所述的用途，所述应用是作为转基因水稻检测用的阳性对照物质或阳阳性标准品。
10.以下核苷酸片段在构建检测转基因水稻的质粒标准分子中的应用：
1）选自SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:7中任意一个或几个核苷酸片段，和
2）选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中任意一个或两个核苷酸片段。
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