CN114456273B

CN114456273B - 增强型靶向HIV-1 gp120蛋白CAR-T细胞的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114456273B
Application number: CN202011239681.9A
Authority: CN
Inventors: 朱焕章; 姜正涛
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN114456273A

Abstract

本发明为增强型靶向HIV‑1 gp120蛋白CAR‑T细胞的制备方法及应用，属于生物技术领域，具体涉及一种增强型靶向HIV‑1包膜蛋白gp120的载体、受体、CAR‑T细胞及其制备方法和应用。本发明提供了一种嵌合型抗原受体，该嵌合型抗原受体包括：靶向HIV‑1 gp120的单链抗体ScFv、IgG4铰链区、CD8跨膜区、4‑1BB、白细胞抗原分化群3的ζ链。本发明还提供了一种新型的、增强型的抗HIV CAR‑T细胞的制法。试验表明，本发明的抗HIV CAR‑T细胞可高效特异地清除HIV感染细胞，可用于HIV的细胞免疫治疗，具有良好的应用前景。

Description

增强型靶向HIV-1 gp120蛋白CAR-T细胞的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及增强型靶向清除HIV-1潜伏感染细胞的CAR-T细胞的制备方法及在艾滋病细胞免疫治疗中应用。

背景技术

艾滋病已经成为当今世界严重的公共卫生问题和社会问题。目前抗逆转录病毒疗法(Antiretroviral Therapy，ART)在抑制HIV-1病人体内病毒载量方面取得了巨大成功。但是仅依靠ART疗法无法清除HIV-1潜伏库。一旦停止ART治疗，病人体内HIV-1病毒会迅速反弹，这成为了HIV-1彻底治愈的最大障碍。因此迫切需要寻找一种新的疗法来实现HIV的功能性治愈。

通过回输经基因工程改造的自体T细胞，可以在ART治疗停药以后持久特异性杀伤HIV-1感染细胞，有效避免HIV-1病毒潜伏库反弹，从而实现HIV-1的“功能性治愈”。嵌合抗原受体T细胞疗法(chemical antigen receptor T cell therapy，CAR-T therapy)最早在上世纪90年代就开展了治疗HIV-1病人的临床实验。通过将可溶性CD4分子作为胞外抗原识别区来识别HIV env，并连接至T细胞IgG Fc片段作为胞内活化域来激活T细胞，可以使CD4-CAR基因修饰后的T细胞具有杀灭env表达细胞的能力。但是由于当时采用的第一代CAR载体仅含有一个胞内活化信号域，对T细胞活化程度不足而造成临床试验中抗病毒效果不佳。随着CAR-T疗法近几年在肿瘤治疗领域中取得的技术进步与巨大成功，CAR-T又逐步显示出在抗病毒治疗中的潜能。

已有多项研究对anti-HIV CAR的胞外抗原识别区，胞内信号转导区，效应细胞类型，效应细胞向HIV潜伏器官的转运等环节进行了优化。目前anti-HIV CAR-T研究主要通过在第二代或第三代CAR载体上，连接CD4分子胞外区或广泛中和性抗体来源的单链抗体(Single chain fragment variable，ScFv)作为特异性识别结合HIV env蛋白的胞外抗原识别区，经基因工程修饰后的CAR-T细胞在体外能够有效识别并杀伤HIV-1感染细胞。但是有研究表明伴随着HIV-1慢性感染，患者体内HIV-1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicT lymphocyte，CTL)表面的PD-1，CTLA-4等免疫检查点分子会逐渐上调，导致CTL细胞耗竭并失去杀伤能力。而已有的anti-HIV CAR-T研究并没有考虑anti-HIV CAR-T细胞被免疫抑制的风险。因此，本领域急需一种安全有效的、能够避免免疫抑制作用的增强型anti-HIVCAR-T细胞。

目前，利用CAR-T疗法和免疫检查点抑制疗法的联合使用来靶向治疗肿瘤的研究已有报道。但是对该联合疗法靶向清除HIV-1感染细胞的研究未见报道及专利。

发明内容

本发明的目的是提供增强型靶向清除HIV-1潜伏感染细胞的CAR-T细胞的制备方法及在艾滋病细胞免疫治疗中应用。

具体的，本发明构建了一种用于制备避免免疫抑制作用的增强型anti-HIV CAR-T细胞的载体。

本发明的另一个目的是制备一种安全有效的、能够避免免疫抑制作用的增强型anti-HIV CAR-T细胞。

本发明在第二代CAR载体的基础上连接HIV-1广泛中和性抗体3BNC117来源的ScFv作为胞外抗原识别区，构建了3BNC117 CAR(3B CAR)和增强型3BNC117-DNR CAR(3BD CAR)。其中3BD-CAR携带有竞争性抑制内源PD-1分子的阴性PD-1元件DNR(PD-1dominantnegative Receptor，DNR)，DNR元件由人源PD-1分子的胞外区连接CD8分子铰链区和CD8跨膜区组成，而不包含胞内信号转导结构域，因此在与内源性PD-1分子竞争性结合PD-L1/2受体的过程中不会产生抑制性信号，可以有效避免CAR-T细胞被免疫抑制。

本发明提供了一种嵌合型抗原受体，该嵌合型抗原受体包括：靶向HIV-1 gp120的单链抗体ScFv、IgG4铰链区、CD8跨膜区、4-1BB、白细胞抗原分化群3的ζ链。

另一种较好的嵌合抗原受体，所述的嵌合型抗原受体还包括PD-1分子胞外区、CD8铰链区。

其中，靶向HIV-1 gp120的单链抗体ScFv是能够识别艾滋病病毒HIV-1病毒gp120蛋白并与之结合的ScFv。所述单链抗体ScFv能够识别HIV病毒感染细胞表面的gp120，是通过串联针对HIV病毒感染细胞表面的gp120的抗体轻链、重链可变区而得。单链抗体ScFv作为整个CAR分子的胞外结合结构域，其氨基酸序列来源于3BNC117-pTRPE质粒。

IgG4铰链区即IgG4 hinge，是链接3BNC117 ScFv与CD8跨膜区的铰链分子，其序列可参见SEQ ID NO.3-4。

CD8跨膜区是链接嵌合抗原受体胞外区结构和胞内区结构的跨膜分子，其序列可参见SEQ ID NO.5-6。

4-1BB是一种胞内信号共刺激域，其序列可参见SEQ ID NO.7-8。

白细胞抗原分化群3的ζ链(CD3ζ)是一种胞内信号刺激域，其序列可参见SEQ IDNO.9-10。

PD-1分子胞外区是结合PD-L1分子的胞外功能域，其序列可参见SEQ ID NO.11-12。

CD8铰链区是链接PD-1分子胞外区与CD8跨膜区的铰链分子，其序列可参见SEQ IDNO.13-14。

具体而言，本发明提供了一种治疗HIV感染的嵌合型抗原受体3BD-CAR。该嵌合型抗原受体是通过N端到C端顺次拼接单链抗体ScFv、IgG4 hinge、CD8跨膜区、4-1BB和白细胞抗原分化群3的ζ链CD3，在EF1a启动子后分别连接PD-1分子胞外区，CD8 hinge，CD8跨膜区得到的。

本发明还包括所述嵌合型抗原受体的编码序列。

本发明还提供了一种增强型靶向HIV-1 gp120的载体，所述的载体包括3BNC117-DNR CAR的编码序列；

所述的3BNC117-DNR CAR通过下述方法获得：

pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro质粒为骨架，使用内切酶切开MCS区；

以pTRPE-3BNC117-G4H-BBz质粒为模板，扩增出3BNC117 CAR片段；

将酶切产物与3BNC117 CAR片段连接；

得到阳性质粒pCDH-CMV-3BNC117-EF1α；

以pCDH-CMV-3BNC117-EF1α质粒为模板，利用内切酶去除Puro片段；

以DNR-pUC57-Amp质粒(由金唯智公司全基因合成)为模板，扩增出含有PD-1胞外区、CD8分子铰链区、CD8分子跨膜区的DNR片段；

将酶切产物与所述的DNR片段连接；

得到阳性质粒3BNC117-DNR CAR。

较好的DNR元件由，PD-1胞外区序列，CD8分子铰链序列，CD8分子跨膜区序列均来源于NCBI。

较好的，3B CAR重组载体也来源于pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro。

本发明中还提供了增强型靶向HIV包膜蛋白gp120的CAR表达载体。具体而言，增强型靶向HIV包膜蛋白gp120的CAR的质粒构建可以按照如下方法：将3BNC117 CAR与DNR元件依次克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro质粒中，获得增强型靶向HIV包膜蛋白gp120的CAR表达载体。

pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro是第二代慢病毒骨架质粒，购自优宝生物。

pTRPE-3BNC117-G4H-BBz质粒：表达3BNC117-CAR的慢病毒载体质粒，来自于OttoO.Yang教授的馈赠并由本实验室保存。DNR序列及PD-1ScFv序列由苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成。

本发明的制备方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法实现，拼接序列则可能采用酶切、退火、连接粘性末端等方法实现。

本发明中，所适用宿主包括各种真核生物。

本发明中，携带3BNC117-CAR和DNR的表达质粒系统应用的宿主细胞可以是静止细胞或者分裂细胞。

本发明中，携带3BNC117-CAR和DNR的表达质粒系统已经被证实可以制备抗HIV-1CAR-T细胞。

3BNC117-IgG4 Hinge-CD8跨膜区-4-1BB-CD3ζ氨基酸序列为：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLLQSGAAVTKPGASVRVSCEASGYNIRDYFIHWWRQAPGQGLQWVGWINPKTGQPNNPRQFQGRVSLTRHASWDFDTFSFYMDLKALRSDDTAVYFCARQRSDYWDFDVWGSGTQVTVSSASTKGPGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDTVTITCQANGYLNWYQQRRGKAPKLLIYDGSKLERGVPSRFSGRRWGQEYNLTINNLQPEDIATYFCQVYEFVVPGTRLDLKRTVAAPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO.1)。

相应的核苷酸序列为：

ATGCTGCTGCTGGTGACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCTGCCTTTCTGCTGATCCCCCAGGTGCAGCTGCTGCAGAGCGGAGCCGCCGTGACAAAGCCTGGCGCTTCTGTGCGGGTGTCCTGCGAGGCCAGCGGCTACAACATCCGGGACTACTTCATCCACTGGTGGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGCAGTGGGTGGGATGGATCAACCCCAAGACCGGCCAGCCCAACAACCCCCGGCAGTTCCAGGGCCGGGTGTCCCTGACAAGACACGCCAGCTGGGACTTCGACACCTTCAGCTTCTACATGGACCTGAAGGCCCTGCGGAGCGACGATACCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGACAGCGGAGCGACTACTGGGATTTCGACGTGTGGGGCAGCGGCACCCAGGTCACAGTGTCCAGCGCCAGCACAAAGGGACCTGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGCAGCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACACCGTGACCATCACCTGTCAGGCCAACGGATACCTGAACTGGTATCAGCAGCGGAGAGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGGCAGCAAGCTGGAACGGGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGAAGATGGGGCCAAGAGTACAACCTGACCATCAACAACCTGCAGCCCGAGGATATTGCCACATACTTTTGCCAGGTGTACGAGTTCGTGGTGCCCGGGACCCGGCTGGATCTGAAGAGAACCGTGGCCGCTCCCGAGAGCAAATACGGGCCCCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQID NO.2)。

IgG4 Hinge氨基酸序列为：

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKD(SEQ ID NO.3)。

相应的核苷酸序列为：

GAGAGCAAATACGGGCCCCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGGAT(SEQ ID NO.4)。

CD8跨膜区氨基酸序列为：

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.5)。

相应的核苷酸序列为：

ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO.6)。

4-1BB氨基酸序列为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.7)

相应的核苷酸序列为：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO.8)

CD3ζ氨基酸序列为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.9)。

相应的核苷酸序列为：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO.10)。

PD-1分子胞外区氨基酸序列为：

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRSAGQFQ(SEQ ID NO.11)。

相应的核苷酸序列为：

atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcggccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggtcagccggccagttccaa(SEQ ID NO.12)。

CD8铰链区氨基酸序列为：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO.13)。

相应的核苷酸序列为：

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat(SEQ IDNO.14)。

另一方面，所述的嵌合型抗原受体可以用于制备基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞，靶向HIV-1 gp120。

本发明提供了一种基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞，所述的CD3⁺T淋巴细胞表面表达上述的嵌合型抗原受体。

所述的CD3⁺T淋巴细胞的制备方法包括：

(1)将权利要求5所述的3BNC117-DNR CAR表达载体转染293T细胞获得慢病毒载体；

(2)使用步骤(1)获得的慢病毒载体转导CD3⁺T淋巴细胞。

较好的，所述的步骤(2)包括：

从外周血分离PBMC；

获得CD3⁺T细胞，经anti-CD3/28刺激；

在CD3⁺T细胞的培养环境中加入3BNC117-DNR CAR重组表达载体的慢病毒；

慢病毒感染24小时后换液(MOI＝10)。

在本发明的一个优选例中，基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞由以下方法制备得到：

从外周血分离单个核细胞PBMC后再用磁珠阳选获得CD3⁺T细胞，经anti-CD3/28磁珠(细胞与磁珠比例为1:1)刺激24小时后，加入重组3BD-CAR分子的慢病毒感染24小时后换液(MOI＝10)。从病毒感染后第四天开始，细胞计数并根据细胞状态和增殖情况补加培养基，细胞浓度调整至0.5x10⁶/mL，并补充IL-2100U/mL，进一步扩增细胞直到满足回输的细胞数。

本发明在自主构建的HIV-1体外细胞模型中发现，3BD-CAR-T细胞显示出比3BCAR-T细胞更强的增殖能力，细胞杀伤能力和细胞因子释放能力。

本发明提供一种新型的、增强型的抗HIV CAR-T细胞，使得HIV-1感染细胞可以被高效，持久，特异地清除，为长期控制病人体内HIV-1病毒载量奠定了基础。

本发明还提供了上述基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞在制备抗HIV感染的活细胞药物中的应用。

本发明涉及一种增强型靶向HIV-1包膜蛋白gp120的载体、受体、CAR-T细胞及其制备方法和应用。本发明提供了一种基于广泛中和性抗体3BNC117的CAR-T疗法与PD-1免疫检查点阻断疗法结合的慢病毒载体。本发明还提供了一种新型的、增强型的抗HIV CAR-T细胞的制法。试验表明，本发明的抗HIV CAR-T细胞可高效特异地清除HIV感染细胞，可用于HIV的细胞免疫治疗，具有良好的应用前景。本发明中，携带3BNC117-CAR和DNR的表达质粒系统制备的CAR-T细胞已经被证实可以在体外特异性杀伤HIV-1细胞，效率高达70％-90％。本发明将HIV CAR-T疗法与免疫检查点抑制疗法进行了结合，提供了一种HIV CAR-T疗法可选的方法，为HIV-1功能性治愈探索提供了一种可行的思路。

附图说明

图1. 3B CAR；3BD-CAR重组载体克隆方法示意图。

图2. 3B CAR；3BD-CAR重组载体结构示意图，

其中，3BNC117-CAR和3BNC117-CARDNR分别对应3B CAR和3BD CA；黑色的区段表示CD8跨膜区。

图3. 3B CAR-T；3BD CAR-T细胞表型鉴定，

其中，UTD是未经任何处理的T细胞作为对照；纵坐标FS-A是前项散色光，横坐标CAR表示利用FITC-goat anti-human IgG流式抗体染色后，检测到CAR阳性率比例，横坐标DNR表示利用PE-mouse anti-human CD279流式抗体染色后，检测到DNR阳性比例；

结果显示，制备的3B CAR-T与3BD CAR-T细胞CAR分子表达效率约在85％，3BDCAR-T细胞DNR分子表达效率约在80％。

图4. 3B CAR-T；3BD CAR-T细胞增殖活性的比较，

纵坐标是细胞计数统计的细胞数量，横坐标是以共孵育为起点的天数，可见共孵育后第7天时，3BD CAR-T细胞增殖数量约为3B CAR-T细胞的1.5倍。

图5. 3B CAR-T；3BD CAR-T细胞靶向杀伤HIV-1细胞活性的检测，其中，

纵坐标是杀伤百分比Specific lysis，单位％，指靶细胞被杀伤的比例，计算公式为

横坐标ratio是指效应细胞数量与靶细胞数量比例；

结果显示，在不同共孵育比例下，3BD CAR组对LEL6细胞的杀伤作用均要高于3BCAR组。

图6. 3B CAR-T；3BD CAR-T细胞细胞因子释放能力的比较，其中

纵坐标是三种细胞因子的浓度，结果显示，在与LEL6细胞共孵育后，3BD CAR组TNF-α、IL-2、IFN-γ细胞因子释放能力强于3B CAR组。^***p<0.001。

具体实施方式

实施例1体外构建含有PD-1阻断分子的嵌合抗原受体表达载体

以pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro质粒为骨架，利用EcoRI和SalI内切酶双酶切去除MCS-EF1α-Puro片段。随后以pTRPE-3BNC117-G4H-BBz质粒为模板，利用onestep-3BNC117-F，onestep-3BNC117-R引物PCR扩增出包含有HIV广泛中和性抗体可变区来源的ScFv，IgG4铰链，CD8分子跨膜区，4-1BB和CD3ζ胞内信号转导区的3BNC117CAR片段。最终将双酶切产物与PCR产物胶回收后进行Onestep同源重组连接，连接产物在DH5α感受态中转化后涂在Amp+的平板上筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后抽提质粒并测序验证，得到阳性质粒pCDH-CMV-3BNC117 ScFv-IgG4-CD8Tm-4-1BB-CD3ζ并命名为3BNC117 CAR(缩写为3B CAR)。

PD-1胞外区序列，CD8分子铰链序列，CD8分子跨膜区序列均来源于NCBI，并交由苏州金唯智公司进行全基因合成，并克隆至pUC57-Amp载体。首先以pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro质粒为骨架，利用EcoRI和BamHI内切酶双酶切切开MCS区。随后以pTRPE-3BNC117-G4H-BBz质粒为模板，利用onestep-3BNC117-DNR-1F，onestep-3BNC117-DNR-1R引物PCR扩增出3BNC117 CAR片段。最终将酶切产物与PCR产物胶回收后进行Onestep同源重组连接，连接产物在DH5α感受态中转化后涂在Amp+的平板上筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后抽提质粒并测序验证，得到阳性质粒pCDH-CMV-3BNC117-EF1α。

接着以构建得到的pCDH-CMV-3BNC117-EF1α质粒为模板，利用XmaI和SalI内切酶双酶切切除Puro片段。以DNR-pUC57-Amp质粒为模板，利用onestep-3BNC117-DNR-2F，onestep-3BNC117-DNR-2R引物PCR扩增出含有PD-1胞外区，CD8分子铰链区，CD8分子跨膜区的DNR片段。将酶切产物与PCR产物胶回收后进行Onestep同源重组连接，连接产物在DH5α感受态中转化后涂在Amp+的平板上筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后抽提质粒并测序验证，得到阳性质粒pCDH-CMV-3BNC117 CAR-EF1α-DNR并命名为3BNC117-DNR CAR(3BD-CAR)。

实施例2 3B CAR-T；3BD CAR-T细胞的制备与体外功能验证

为了获得表达3B CAR；3BD-CAR的慢病毒颗粒，将慢病毒骨架质粒，△8.91，VSVG三种质粒共转染进293T细胞，48h后收集病毒上清并过滤，超速离心浓缩后置于-80℃保存备用；

利用携带有3B CAR；3BD CAR元件的慢病毒感染健康人CD3⁺T淋巴细胞制备效应细胞。获得健康供体外周血后，利用淋巴细胞分离液分离得到PBMCs细胞，再利用磁珠法分选得到人CD3⁺T淋巴细胞。随后按照磁珠：细胞＝1:1的比例加入CD3/28活化磁珠；24h后利用表达3B CAR；3BD CAR的慢病毒，以MOI＝20静置感染的方式感染CD3⁺T细胞制备Anti-HIVCAR-T效应细胞，并用未感染CD3⁺T细胞作为对照；

6天后通过Fluorescein(FITC)-conjugatedAffiniPure F(ab')2Fragment GoatAnti-Human IgG(H+L)和PE anti-human CD279(PD-1)Antibody标记，结果发现与UTD组相比3B CAR组CAR阳性率约为86.8％，3BD-CAR组CAR阳性率约为87.9％，DNR阳性率约为80.8％；

通过对细胞增殖的检测，我们发现在与靶细胞进行共孵育后，第7天时通过细胞计数发现，3BD-CAR组细胞数量约是3B CAR组细胞数量的3.86倍，结果表明，通过本发明将3BCAR与DNR元件的结合使用，可以使3BD-CAR组细胞具有更强的细胞增殖能力；

本发明在体外初步验证了其对HIV-1env⁺细胞模型LEL6靶细胞的杀伤作用，本申请分别将未修饰的CD3⁺T细胞，3B CAR-T细胞，3BD CAR-T细胞与LEL6细胞进行了共孵育，并用Jurkat细胞作为阴性对照，利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)法检测了细胞杀伤效果，结果显示与UTD组相比，在1:1，5:1，10:1三种不同的共孵育比例下，3B CAR组，3BD CAR组均可以有效杀伤靶细胞，并且3BD-CAR组杀伤效果要强于3B CAR组，甚至在10:1共孵育比例时3BD-CAR组均可以达到约90％的杀伤效果，而对于HIV-1env^-的Jurkat细胞，效应细胞不会产生非特异性杀伤作用(图5)。Specific Lysis为杀伤百分比，计算公式为杀伤百分比越高，证实越多的靶细胞被杀灭。

为了进一步检测Anti-HIV CAR-T效应细胞的功能，将Anti-HIV CAR-T效应细胞与LEL6靶细胞按照10:1的比例进行了共孵育，并在24h后检测了IL-2，TNF-α，IFN-γ3种细胞因子的释放，结果显示与LEL6靶细胞进行共孵育后，3B CAR组；3BD-CAR组3种细胞因子的分泌量相比于UTD组均有明显提升，并且3BD-CAR组的分泌量要高于3B CAR组，证明3BD-CAR组细胞因子释放能力强于3B CAR组。进一步证实了3BD-CAR组杀伤靶细胞的能力强于3B CAR组(图6)。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 增强型靶向HIV-1 gp120蛋白CAR-T细胞的制备方法及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 679

<212> PRT

<213> -4-1BB-CD3ζ

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala

20 25 30

Val Thr Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Asn Ile Arg Asp Tyr Phe Ile His Trp Trp Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Gln Gly Leu Gln Trp Val Gly Trp Ile Asn Pro Lys Thr Gly Gln Pro

65 70 75 80

Asn Asn Pro Arg Gln Phe Gln Gly Arg Val Ser Leu Thr Arg His Ala

85 90 95

Ser Trp Asp Phe Asp Thr Phe Ser Phe Tyr Met Asp Leu Lys Ala Leu

100 105 110

Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gln Arg Ser Asp

115 120 125

Tyr Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

165 170 175

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Asn

180 185 190

Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Arg Gly Lys Ala Pro Lys Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Asp Gly Ser Lys Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe

210 215 220

Ser Gly Arg Arg Trp Gly Gln Glu Tyr Asn Leu Thr Ile Asn Asn Leu

225 230 235 240

Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Val Tyr Glu Phe Val

245 250 255

Val Pro Gly Thr Arg Leu Asp Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu

260 265 270

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu

275 280 285

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

500 505 510

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

515 520 525

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

530 535 540

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

545 550 555 560

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

565 570 575

Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

580 585 590

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

595 600 605

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

610 615 620

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

625 630 635 640

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

645 650 655

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

660 665 670

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675

<210> 2

<211> 2040

<212> DNA

<213> -4-1BB-CD3ζ

<400> 2

atgctgctgc tggtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccctgc ctttctgctg 60

atcccccagg tgcagctgct gcagagcgga gccgccgtga caaagcctgg cgcttctgtg 120

cgggtgtcct gcgaggccag cggctacaac atccgggact acttcatcca ctggtggcgg 180

caggccccag gccagggact gcagtgggtg ggatggatca accccaagac cggccagccc 240

aacaaccccc ggcagttcca gggccgggtg tccctgacaa gacacgccag ctgggacttc 300

gacaccttca gcttctacat ggacctgaag gccctgcgga gcgacgatac cgccgtgtac 360

ttctgcgcca gacagcggag cgactactgg gatttcgacg tgtggggcag cggcacccag 420

gtcacagtgt ccagcgccag cacaaaggga cctggcggcg gaggatctgg cggaggcgga 480

agtggcggag ggggcagcga tattcagatg acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc 540

gtgggcgaca ccgtgaccat cacctgtcag gccaacggat acctgaactg gtatcagcag 600

cggagaggca aggcccccaa gctgctgatc tacgacggca gcaagctgga acggggcgtg 660

cccagccggt tcagcggcag aagatggggc caagagtaca acctgaccat caacaacctg 720

cagcccgagg atattgccac atacttttgc caggtgtacg agttcgtggt gcccgggacc 780

cggctggatc tgaagagaac cgtggccgct cccgagagca aatacgggcc cccctgcccc 840

ccttgccctg cccccgagtt cctgggcgga cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc 900

aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc 960

caggaggacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 1020

aagaccaagc cccgggagga gcagttcaat agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc 1080

gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gaatacaagt gtaaggtgtc caacaagggc 1140

ctgcccagca gcatcgagaa aaccatcagc aaggccaagg gccagcctcg ggagccccag 1200

gtgtacaccc tgccccctag ccaagaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1260

ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc 1320

gagaacaact acaagaccac cccccctgtg ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac 1380

agccggctga ccgtggacaa gagccggtgg caggagggca acgtctttag ctgctccgtg 1440

atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgagcctgtc cctgggcaag 1500

gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 1560

atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 1620

atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 1680

gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1740

aagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1800

gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1860

cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1920

attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1980

agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 2040

<210> 3

<211> 230

<212> PRT

<213> IgG4 Hinge

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys Asp

225 230

<210> 4

<211> 690

<212> DNA

<213> IgG4 Hinge

<400> 4

gagagcaaat acgggccccc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60

agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120

gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300

tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360

gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420

accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540

gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600

gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660

aagagcctga gcctgtccct gggcaaggat 690

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> CD8

<400> 5

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 6

<211> 72

<212> DNA

<213> CD8

<400> 6

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 7

<211> 42

<212> PRT

<213> 4-1BB

<400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 8

<211> 126

<212> DNA

<213> 4-1BB

<400> 8

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> CD3ζ

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 339

<212> DNA

<213> CD3ζ

<400> 10

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 11

<211> 167

<212> PRT

<213> PD-1

<400> 11

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Ser Ala Gly Gln Phe Gln

165

<210> 12

<211> 501

<212> DNA

<213> PD-1

<400> 12

atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480

aggtcagccg gccagttcca a 501

<210> 13

<211> 45

<212> PRT

<213> CD8

<400> 13

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 14

<211> 135

<212> DNA

<213> CD8

<400> 14

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

Claims

1.一种嵌合型抗原受体，其特征在于，该嵌合型抗原受体包括3BNC117 CAR和PD-1元件DNR；

3BNC117 CAR包括靶向HIV-1gp120的单链抗体ScFv、IgG4铰链区、CD8跨膜区、4-1BB、白细胞抗原分化群3的ζ链,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

PD-1元件DNR包括PD-1分子胞外区、CD8铰链区、CD8跨膜区；

PD-1分子胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；

CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2.权利要求1所述的嵌合型抗原受体的编码核酸。

3.一种靶向HIV-1gp120的载体，其特征在于，所述的载体包括权利要求1所述的嵌合型抗原受体的编码核酸；

权利要求1所述的嵌合型抗原受体的编码核酸通过下述方法获得：

pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro质粒为骨架，使用内切酶切开MCS区；

以pTRPE-3BNC117-G4H-BBz质粒为模板，扩增出3BNC117CAR片段；

将酶切产物与3BNC117CAR片段连接；

得到阳性质粒pCDH-CMV-3BNC117-EF1α；

以pCDH-CMV-3BNC117-EF1α质粒为模板，利用内切酶去除Puro片段；

以DNR-pUC57-Amp质粒为模板，扩增出含有PD-1胞外区、CD8分子铰链区、CD8分子跨膜区的DNR片段；

将酶切产物与所述的DNR片段连接；

得到阳性质粒3BNC117-DNRCAR。

4.权利要求1所述的嵌合型抗原受体的应用，其特征在于，所述的嵌合型抗原受体用于制备基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞，所述的基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞靶向HIV-1gp120。

5.一种基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞，其特征在于，所述的CD3⁺T淋巴细胞表面表达权利要求1所述的嵌合型抗原受体。

6.权利要求5所述的CD3⁺T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

(1)将权利要求3所述的靶向HIV-1gp120的载体转染293T细胞获得慢病毒载体；

(2)使用步骤(1)获得的慢病毒载体转导CD3⁺T淋巴细胞。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)包括：

从外周血分离PBMC；

获得CD3⁺T细胞，经anti-CD3/28刺激；

在CD3⁺T细胞的培养环境中加入重组有权利要求3所述的3BNC117-DNRCAR表达载体的慢病毒；

慢病毒感染24小时后换液,MOI＝10。

8.权利要求5所述的基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞的用途，其特征在于，所述基因修饰的CD3⁺T淋巴细胞在制备抗HIV感染的活细胞药物中的应用。