CN109863242A - 用于治疗病毒感染和其它感染的免疫细胞组合物和使用方法 - Google Patents

用于治疗病毒感染和其它感染的免疫细胞组合物和使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了是免疫细胞的细胞，所述细胞重组表达免疫细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，任选重组表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合。在某些实施方案中，免疫细胞是免疫刺激性细胞，例如T细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是免疫抑制性细胞，例如调节T细胞。本文还公开了识别和对病毒抗原敏感的免疫细胞，所述免疫细胞重组表达免疫细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。可使细胞对是病毒抗原的抗原敏感。本文另提供使用这类细胞治疗有需要的对象的病毒感染的方法。

Description

用于治疗病毒感染和其它感染的免疫细胞组合物和使用方法
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月30日提交的美国临时申请号62/381,219和2017年3月8日提交的美国临时申请号62/468,881的权益，其每一个通过引用以其整体并入本文。
2.电子提交的序列表的引用
本申请通过引用本申请所附序列表并入，序列表为ASCII文本文件，创建于2017年8月22日，大小为59,378字节，标题为“13542-038-228_SL.TXT”。
3.发明领域
本申请总的来说涉及治疗病毒感染，更具体地说涉及治疗病毒感染的免疫疗法。
4.发明背景
已知病毒感染引起多种疾病。急性病毒感染的特征在于病毒复制、扩散、二次复制、组织损伤和脱落(Virgin et al.,Cell 138(1):30-50(2009))。如果受感染的对象经历急性病毒感染后生存，则宿主免疫系统或清除感染，或感染持续下去。
持续病毒感染被描述为不能从个体中清除而在个体细胞保留或持续存在的病毒感染(参见Boldogh et al.,“Persistent Viral Infections”in Medical Microbiology,4th ed.,Baron,editor,Chapter 46,The University of Texas Medical Branch atGalveston(1996)；Virgin et al.,Cell 138(1):30-50(2009))。可将持续病毒感染归类为潜在性、慢性或慢感染(Boldogh等，同上，1996)。
潜在性感染在复发性疾病发作之间缺乏可证实的感染性病毒。在慢性感染中，感染性病毒的持续存在发生在初次侵染之后，并且可能包括慢性或复发性疾病。慢感染涉及长时间的潜伏期接着是进行性疾病(Boldogh等，同上，1996)。与潜在性和慢性感染不同，慢感染不一定始于病毒繁殖的急性期。在持续感染期间，病毒基因组可稳定整合至细胞DNA中或在附加体中保持(参见Boldogh等，同上，1996)。
许多病毒感染有变成持续感染的趋势。这类病毒感染的实例包括被人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染。被人免疫缺陷病毒(HIV)感染可导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和相关医学病况(Bennett et al.,Cecil Textbook ofMedicine,20th ed.,pp.1837-1891,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci etal.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1791-1856,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。被主要影响肝脏的乙型肝炎病毒(HBV)感染，可导致进行性慢性肝病伴肝硬化和某些情况下的肝细胞癌(Bennett et al.,Cecil Textbook ofMedicine,20th ed.,pp.762-767,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci et al.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1677-1681,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。被同样主要影响肝脏的丙型肝炎病毒(HCV)感染，还可导致进行性慢性肝病伴肝硬化和某些情况下的肝细胞癌(Bennett et al.,Cecil Textbook ofMedicine,20th ed.,pp.762-764,767-769,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauciet al.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1677,1681-1682,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。这类病毒感染可导致持续感染。
其它病毒感染包括被单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒或(VZV)、腺病毒、巨细胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)感染。被HSV感染可导致通常由HSV-1引起的龈口炎，例如口唇单纯疱疹(唇疱疹)(Bennett et al.,Cecil Textbook of Medicine,20th ed.,pp.1770-1774,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci et al.,Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,14th ed.,pp.1080-1086,McGraw-Hill,SanFrancisco CA(1998))。被HSV感染还会引起大多由HSV-2引起的生殖器疱疹；通常由HSV-1引起且常常伴发结膜炎的角膜炎；通常由HSV-2引起的新生儿HSV感染和通常由HSV-1引起的单纯疱疹脑炎。被HSV感染可能变成潜在性感染(Bennett et al.,Cecil Textbook ofMedicine,20th ed.,pp.1770-1774,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci etal.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1080-1086,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。
被VZV感染会引起水痘(Bennett et al.,Cecil Textbook of Medicine,20thed.,pp.1763-1765,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci et al.,Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,14th ed.,pp.1086-1089,McGraw-Hill,SanFrancisco CA(1998))。潜在性感染可发展成为带状疱疹(herpes zoster/shingles)，其通常在感觉性神经节中是潜在性的VZV的再活化所引起(Bennett et al.,Cecil Textbookof Medicine,20th ed.,pp.2093-2095,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci etal.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1086-1089,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。被腺病毒感染会引起多种人类上皮组织的疾病，包括眼(咽结膜热；流行性角膜结膜炎)；呼吸道，包括上呼吸道疾病(急性咽炎；渗出性扁桃体炎)和下呼吸道(肺炎)；泌尿系统疾病(出血性膀胱炎)和胃肠疾病(胃肠炎)(Bennett et al.,Cecil Textbook of Medicine,20th ed.,pp.1757-1759,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci et al.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1104-1105,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。
被CMV感染会引起传染性单核细胞增多症和先天性感染(Bennett et al.,CecilTextbook of Medicine,20th ed.,pp.1774-1776,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci et al.,Harrison’s Principles of Internal Medicine,14th ed.,pp.1092-1095,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。被EBV感染会引起传染性单核细胞增多症，包括慢性单核细胞增多症或慢性疲劳综合征，而潜在性EBV感染与免疫抑制患者中的B淋巴瘤有关(Bennett et al.,Cecil Textbook of Medicine,20th ed.,pp.1776-1779,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Fauci et al.,Harrison’s Principles ofInternal Medicine,14th ed.,pp.1089-1091,McGraw-Hill,San Francisco CA(1998))。
T细胞功能受损是许多人类病毒感染特有的(参见Day et al.，Nature 443:350-354(2006)及其中引用的参考文献)。PD-1是活化T细胞的负调节因子，在耗竭性病毒特异性CD8+T细胞的表面显著增量调节(Ishida et al.,EMBO J.11:3887-3895(1992)；Noshimuraet al.,Immunity 11:141-151(1999)；Sharpe et al.,Nat.Rev.Immunol.2:116-126(2002)；Che,Nat.Rev.Immunol.4:336-347(2004)；Barber et al.,Nature 439:682-687(2006))。使用针对PD配体1(PD-L1，亦称为CD274)的抗体阻断该途径恢复CD8+T细胞功能并降低病毒载量(Barber et al.，Nature 439:682-687(2006))。结果表明PD-1在T细胞上显著增量调节，且表达与受损的HIV特异性CD8+T细胞功能相关，以及与疾病发展的预测因子血浆病毒载量正相关并与疾病发展的预测因子CD4+T细胞计数负相关(Day et al.，Nature443:350-354(2006))。CD4+T细胞上的PD-1表达同样显示与病毒载量正相关，与CD4+T细胞计数负相关，阻断该途径增强HIV特异性CD4+和CD8+T细胞功能(Day et al.，Nature 443:350-354(2006))。Day等人(同上，2006)描述的结果表明免疫调节性PD-1/PD-L1途径在人类持续病毒感染期间起作用，并确定了HIV特异性T细胞功能的可逆缺陷(Day et al.，Nature443:350-354(2006))。
PD-1介导的抑制性信号转导不仅仅减弱感染急性期的HBV特异性CD8+T细胞效应子功能，还与疾病消退之后HBV特异性记忆CD8+T细胞的发生有关(Zhang et al.,J.Hepatol.50:1163-1173(2009))。在乙型肝炎患者的研究中，PD-1显著增量调节，随后导致HBV特异性效应CD8+T细胞的功能抑制，因为体外阻断PD-1/PD-L1相互作用提高其增殖和IFN-γ产生(Zhang等，同上，2009)。在疾病消退后，HBV特异性效应CD8+T细胞发育成为记忆T细胞。在这期间，动态的PD-1下降在数值上与HBV特异性CD8+T细胞频率的降低相关，在表型上与CCR7、CD45RA和CD127表达的获得相关，并且在功能上与记忆T细胞的增殖提高和IFN-γ产生相关(Zhang等，同上，2009)。
与急性感染不同，慢性病毒感染导致调节T细胞(Treg细胞)大量扩增及其PD-1增量调节(Park et al.,supra,J.Immunol.194:5801-5811(2015))。与来自未被感染的或急性感染小鼠的相比，来自慢性感染小鼠的Treg细胞(慢性Treg细胞)显示针对抑制CD8+和CD4+T细胞增殖和针对抑制后续细胞因子产生两者的更大的抑制能力(Park等，同上，2015)。Treg和CD8+T细胞间的接触对于CD8+T细胞免疫应答的抑制是必需的。更重要的是，抑制需要细胞特异性表达和慢性Treg细胞上的PD-1和CD8+T细胞上的PD-1配体的相互作用(Park等，同上，2015)。
之前已描述T细胞疗法，其中宿主免疫系统被用来治疗或清除癌症或病毒感染(参见“T Cell Therapies:An Overview”Catapult Cell and Gene Therapy,White Paper 1(ct.catapult.org.uk/wp-content/uploads/2016/03/Review-of-T-cell-Receptor-Therapies-2014_v2.pdf)(2014)；Rooney et al.,Mol.Ther.Nucleic Acids 1:e55,doi:10.1038/mtna.2012.49(2012))。所述疗法包括基因修饰的T细胞受体(TCR)疗法和嵌合抗原受体(CAR)疗法(参见“T Cell Therapies:An Overview”Catapult Cell and GeneTherapy,White Paper 1(ct.catapult.org.uk/wp-content/uploads/2016/03/Review-of-T-cell-Receptor-The rapies-2014_v2.pdf)(2014))。之前描述了CAR疗法在治疗例如癌症等病况中的应用(参见例如Sadelain et al.,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Jensen et al.,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe et al.,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)；Brentjens et al.,Clin.Cancer Res.13:5426-5435(2007)；Gade etal.,Cancer Res.65:9080-9088(2005)；Maher et al.,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kershaw et al.,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain et al.,Curr.Opin.Immunol.21(2):215-223(2009)；Hollyman et al.,J.Immunother.32:169-180(2009)；WO/2015/188141)。
存在提供改进的病毒感染(例如慢性病毒感染)治疗的疗法的需要。本申请的目的满足了这个需要。
5.发明概述
本申请涉及是免疫细胞的细胞，所述细胞重组表达免疫细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，任选重组表达嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合。
一方面，本文提供是免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中CAR与病毒抗原结合。另一方面，本文提供免疫刺激性细胞群或其前体细胞群，所述细胞群包含重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的细胞，其中CAR与病毒抗原结合。在某些实施方案中，免疫刺激性细胞是T细胞。在某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞或造血祖细胞。在一个具体实施方案中，免疫刺激性细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在另一个具体实施方案中，细胞是T细胞。在另一个具体实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在另一个具体实施方案中，细胞是记忆T细胞。在另一个具体实施方案中，记忆T细胞是记忆CD8+T细胞。
另一方面，本文提供识别且对病毒抗原敏感的T细胞，所述T细胞重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。在某些实施方案中，T细胞是免疫刺激性的。在一个具体实施方案中，T细胞是CD4+。在另一个具体实施方案中，T细胞是CD8+。
另一方面，本文提供T细胞群，所述细胞群包含识别和对病毒抗原敏感并重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的T细胞。在某些实施方案中，T细胞是免疫刺激性的。在一个具体实施方案中，T细胞是CD4+。在另一个具体实施方案中，T细胞是CD8+。
在本发明的某些实施方案中，细胞或细胞群来源于人。在本发明的某些实施方案中，病毒抗原是作为人病原体的病毒的抗原。在本发明的某些实施方案中，病毒抗原可诱导被病毒感染的人类对象的免疫应答。
在本发明的某些实施方案中，病毒抗原选自由人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原、单纯疱疹病毒(HSV)抗原、水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原、腺病毒抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原和埃-巴二氏病毒(EBV)抗原组成的组。在一个具体实施方案中，病毒抗原是HIV抗原，所述HIV抗原选自由群特异性抗原(gag)蛋白、p55、p24、p18、包膜糖蛋白(env)、gp160、gp120、gp41、反转录酶(pol)、p66和p31组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是HBV抗原，所述HBV抗原选自由HBV包膜蛋白S、HBV包膜蛋白M、HBV包膜蛋白L和HBV包膜蛋白S、M或L的S结构域组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是HCV抗原，所述HCV抗原选自由核心蛋白、包膜蛋白E1、包膜蛋白E2、NS2、NS3、NS4(例如NS4A或NS4B)和NS5(例如NS5A或NS5B)组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是HSV抗原，所述选自由gE、gI、gB、gD、gH、gL、gC、gG、gK、gM和gE的胞外结构域组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是VZV抗原，所述VZV抗原，选自由gE和gI组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是腺病毒抗原，所述腺病毒抗原选自由六邻体蛋白和五邻体蛋白组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是CMV抗原，所述CMV抗原选自由pp65、即刻早期(IE)抗原和IE1组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是EBV抗原，所述EBV抗原选自由潜伏膜蛋白2(LMP2)、埃-巴二氏病毒核抗原1(EBNA1)和BZLF1组成的组。
在本发明的某些实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点(immune checkpoint)抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160组成的组。在一个具体实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1。在另一个实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
在本发明的某些实施方案中，本发明的细胞还重组表达自杀基因。在一个具体实施方案中，自杀基因包含诱导型胱天蛋白酶9。
另一方面，本文提供识别且对病毒抗原敏感的调节T细胞，所述调节T细胞重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。另一方面，本文提供调节T细胞群，所述细胞群包含识别和对病毒抗原敏感，且重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的T细胞。在本发明的某些实施方案中，调节T细胞自患有慢性病毒感染的对象分离。
另一方面，本文提供自患有病毒感染的对象分离的调节T细胞，所述调节T细胞重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。另一方面，本文提供自患有病毒感染的对象分离的调节T细胞群，所述细胞群包含重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的调节T细胞。在某些实施方案中，细胞或细胞群来源于人。在某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是慢性病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是被HCV、HBV、HIV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
另一方面，本文提供免疫抑制性细胞，所述细胞自患有病毒感染的对象分离，所述免疫抑制性细胞重组表达免疫抑制性细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。另一方面，本文提供自患有病毒感染的对象分离的免疫抑制性细胞群，所述细胞群包含重组表达免疫抑制性细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的免疫抑制性细胞群。在某些实施方案中，细胞或细胞群来源于人。在某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是慢性病毒感染。在某些实施方案中，免疫抑制性细胞是调节T细胞。在某些实施方案中，免疫抑制性细胞识别并对病毒感染的病毒的病毒抗原敏感。在某些实施方案中，免疫抑制性细胞重组表达嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合。在一个具体实施方案中，调节T细胞是人CD4+CD25+T细胞。在另一个具体实施方案中，调节T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。
另一方面，本文提供是CD4+CD25+的、对病毒抗原敏感并且重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的人调节T细胞的多克隆群。在某些实施方案中，人调节T细胞是CD127lo/-。
在某些实施方案中，调节T细胞或调节T细胞群来源于人。在某些实施方案中，病毒抗原是作为人病原体的病毒的抗原。在某些实施方案中，病毒抗原可诱导被病毒感染的人类对象的免疫应答。
在调节T细胞或调节T细胞群的某些实施方案中，病毒抗原选自由丙型肝炎病毒(HCV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原、单纯疱疹病毒(HSV)抗原、水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原、腺病毒抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原和埃-巴二氏病毒(EBV)抗原组成的组。在一个具体实施方案中，病毒抗原是HCV抗原，所述HCV抗原选自由核心蛋白、包膜蛋白E1、包膜蛋白E2、NS2、NS3、NS4(例如NS4A或NS4B)和NS5(例如NS5A或NS5B)组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是HIV抗原，所述HIV抗原选自由群特异性抗原(gag)蛋白、p55、p24、p18、包膜糖蛋白(env)、gp160、gp120、gp41、反转录酶(pol)、p66和p31组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是HBV抗原，所述HBV抗原选自由HBV包膜蛋白S，HBV包膜蛋白M、HBV包膜蛋白L和HBV包膜蛋白S、M或L的S结构域组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是HSV抗原，所述HSV抗原选自由gE、gI、gB、gD、gH、gL、gC、gG、gK、gM和gE的胞外结构域组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是VZV抗原，所述VZV抗原选自由gE和gI组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是腺病毒抗原，所述腺病毒抗原选自由六邻体蛋白和五邻体蛋白组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是CMV抗原，所述CMV抗原选自由pp65、即刻早期(IE)抗原和IE1组成的组。在另一个具体实施方案中，病毒抗原是EBV抗原，所述EBV抗原选自由潜伏膜蛋白2(LMP2)、埃-巴二氏病毒核抗原1(EBNA1)和BZLF1组成的组。
在涉及免疫抑制性细胞或调节T细胞的本发明的某些实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160组成的组。在一个具体实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1。在本发明的某些实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。在某些实施方案中，免疫抑制性细胞或调节T细胞或其群体，还重组表达自杀基因。在一个具体实施方案中，自杀基因包含诱导型胱天蛋白酶9。
另一方面，本文提供是免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合；(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和(c)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
另一方面，本文提供免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞群，所述细胞群包含重组表达以下的细胞：(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合；(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和(c)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
在这类细胞的某些实施方案中，第二显性阴性形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的胞内信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，CAR包含共刺激信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，第二显性阴性形式的共刺激信号转导结构域不同于CAR的共刺激信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的胞内信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，免疫刺激性细胞是T细胞。在这类细胞的某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞或造血祖细胞。在这类细胞的某些实施方案中，免疫刺激性细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在这类细胞的某些实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在这类细胞的某些实施方案中，细胞是记忆T细胞。在这类细胞的某些实施方案中，记忆T细胞是记忆CD8+T细胞。
另一方面，本文提供免疫抑制性细胞，所述细胞自患有病毒感染的对象分离，所述免疫抑制性细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合；(b)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和(c)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
另一方面，本文提供自患有病毒感染的对象分离的免疫抑制性细胞群，所述细胞群包含重组表达以下的免疫抑制性细胞：(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合；(b)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和(c)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
在这类细胞的某些实施方案中，共刺激信号转导结构域是4-1BB的胞内信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，CAR包含共刺激信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，权利要求90的细胞或细胞群，其中第二显性阴性形式的共刺激信号转导结构域不同于CAR的共刺激信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的胞内信号转导结构域。在这类细胞的某些实施方案中，细胞或细胞群来源于人。在这类细胞的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在这类细胞的某些实施方案中，病毒感染是慢性病毒感染。在这类细胞的某些实施方案中，免疫抑制性细胞是调节T细胞。在这类细胞的某些实施方案中，调节T细胞是人CD4+CD25+T细胞。在这类细胞的某些实施方案中，调节T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。
另一方面，本文提供是免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中CAR与病原体的抗原结合。另一方面，本文提供免疫刺激性细胞群或其前体细胞群，所述细胞群包含重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的细胞，其中CAR与病原体的抗原结合。
在这类细胞或细胞群的某些实施方案中，免疫刺激性细胞是T细胞。在某些实施方案中，T细胞是CD4+。在某些实施方案中，T细胞是CD8+。在这类细胞或细胞群的某些实施方案中，前体细胞是造血干细胞或造血祖细胞。在这类细胞或细胞群的某些实施方案中，免疫刺激性细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在这类细胞或细胞群的某些实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在这类细胞或细胞群的某些实施方案中，细胞是记忆T细胞。在一个具体实施方案中，记忆T细胞是记忆CD8+T细胞。
另一方面，本文提供识别且对病原体的抗原敏感的T细胞，所述T细胞重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。在这类T细胞的某些实施方案中，T细胞是免疫刺激性的。在一个具体实施方案中，T细胞是CD4+。在另一个具体实施方案中，T细胞是CD8+。
另一方面，本文提供T细胞群，所述细胞群包含识别且对病原体的抗原敏感并重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的T细胞。在这类T细胞的某些实施方案中群，T细胞是免疫刺激性的。
在这类T细胞或这类T细胞群的一个具体实施方案中，T细胞是CD4+。在这类T细胞或这类T细胞群的一个具体实施方案中，T细胞是CD8+。在这类T细胞或这类T细胞群的某些实施方案中，细胞或细胞群来源于人。在这类T细胞或这类T细胞群的一个具体实施方案中，病原体是人病原体。在一个具体实施方案中，病原体的抗原可诱导感染病原体的人类对象的免疫应答。在这类T细胞或这类T细胞群的某些实施方案中，病原体选自由细菌、真菌和原生动物组成的组。
在这类T细胞或这类T细胞群的某些实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160组成的组。在一个具体实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1。在某些实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
在这类T细胞或这类T细胞群的某些实施方案中，细胞还重组表达自杀基因。在一个具体实施方案中，自杀基因包含诱导型胱天蛋白酶9。
另一方面，本文提供包含治疗有效量的本发明的免疫细胞或免疫细胞群和药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是上述免疫刺激性细胞。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是上述T细胞。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是免疫抑制性细胞。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是上述调节T细胞。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的本发明的免疫细胞或细胞群，其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是上述免疫刺激性细胞。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是上述T细胞。另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象包含是上述免疫刺激性细胞的免疫细胞或免疫细胞群的药物组合物，其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。在某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群是上述T细胞。在所述方法的某些实施方案中，对象是人。在所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。在某些实施方案中，显性阴性形式的表达促进病毒特异性记忆细胞的产生。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的上述调节T细胞或调节T细胞群，其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象包含上述调节T细胞或调节T细胞群的药物组合物，其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的上述免疫抑制性细胞或免疫抑制性细胞群。另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象包含上述免疫抑制性细胞或免疫抑制性细胞群的药物组合物。
在给予调节T细胞或免疫抑制性细胞或其群体或包含所述细胞或细胞群的药物组合物的方法的某些实施方案中，对象是人。在给予调节T细胞或免疫抑制性细胞或其群体或包含所述细胞或细胞群的药物组合物的方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在给予调节T细胞或免疫抑制性细胞或其群体或包含所述细胞或细胞群的药物组合物的方法的某些实施方案中，病毒感染是慢性病毒感染。在给予调节T细胞或免疫抑制性细胞或其群体或包含所述细胞或细胞群的药物组合物的方法的某些实施方案中，病毒感染是被HCV、HIV、HBV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从对象中分离病毒特异性T细胞；(b)在细胞中表达PD-1的显性阴性形式；和(c)将细胞给予对象。在一个具体实施方案中，病毒感染是被HIV感染。另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从对象中分离病毒特异性T细胞；(b)在细胞中表达PD-1的显性阴性形式，其中PD-1的显性阴性形式的表达促进病毒特异性记忆细胞的产生；和(c)将细胞给予对象。在一个具体实施方案中，病毒感染是被HBV感染。另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从患有慢性病毒感染的对象中分离调节T细胞；(b)在细胞中表达PD-1的显性阴性形式；和(c)将细胞给予对象。在一个具体实施方案中，病毒感染是被HCV感染。在所述方法的某些实施方案中，对象是人。在所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
在本发明方法的某些实施方案中，免疫细胞或免疫细胞群或包含免疫细胞或免疫细胞群的药物组合物的给予是通过胸膜内给药、静脉内给药、皮下给药、结节内给药、肝内给药、鞘内给药、腹膜内给药、颅内给药或向胸腺直接给药。在本发明方法的某些实施方案中，细胞以104-1010个细胞/千克体重的剂量范围给予。在一个具体实施方案中，剂量范围为3x105-3x106个细胞/千克体重。在本发明方法的某些实施方案中，细胞或细胞群是对象自体的。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的细胞或细胞群，其中细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合；(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和(c)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端，且其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。在另一个实施方案中，本发明提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象所述细胞的药物组合物，其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
在本发明所述方法的某些实施方案中，对象是人。在本所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。在本所述方法的某些实施方案中，第一显性阴性形式的表达促进对象中病毒特异性记忆细胞的产生。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的细胞或细胞群，其中细胞从患有病毒感染的对象中分离，所述免疫抑制性细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合；(b)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和(c)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端；其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。在另一个实施方案中，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象细胞的药物组合物，其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
在本发明所述方法的某些实施方案中，对象是人。在本发明所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。在本发明所述方法的某些实施方案中，第一显性阴性形式的表达促进对象中病毒特异性记忆细胞的产生。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的(a)第一细胞或所述第一细胞的第一群，其中第一细胞是免疫刺激性细胞并重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合且其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(B)跨膜结构域；和(b)第二细胞或所述第二细胞的第二群，其中第二细胞是免疫刺激性细胞且重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合且其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中显性阴性形式是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(B)跨膜结构域，和(C)共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。在本所述方法的某些实施方案中，对象是人。在本所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的(a)第一细胞或所述第一细胞的第一群，其中第一细胞是免疫抑制性细胞且重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合且其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(B)跨膜结构域；和(b)第二细胞或所述第二细胞的第二群，其中第二细胞是免疫抑制性细胞且重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR与病毒抗原结合且其中病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中显性阴性形式是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(B)跨膜结构域，和(C)共刺激信号转导结构域的融合物，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
本所述方法的某些实施方案中，对象是人。在本所述方法的某些实施方案中，病毒感染是被是人病原体的病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。在本所述方法的某些实施方案中，细胞或细胞群是对象自体的。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的由病原体引起的感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的细胞或细胞群，其中细胞或细胞群重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中CAR与病原体的抗原结合，其中CAR与之结合的病原体的抗原是引起感染的病原体的抗原。另一方面，本文提供治疗有需要的对象中的病原体所引起的感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的细胞或细胞群，其中细胞是，或细胞群包含识别且对病原体的抗原敏感的T细胞，所述T细胞重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中T细胞对其敏感的病原体的抗原是引起感染的病原体的抗原。在某些实施方案中，T细胞是免疫刺激性的。在某些实施方案中，T细胞是CD4+。在某些实施方案中，T细胞是CD8+。
另一方面，本文提供治疗有需要的对象的由病原体引起的感染的方法，所述方法包括给予对象包含细胞或细胞群的药物组合物，其中细胞或细胞群重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中CAR与病原体的抗原结合，其中CAR与之结合的病原体的抗原是引起感染的病原体的抗原。另一方面，本文提供治疗有需要的对象的由病原体引起的感染的方法，所述方法包括给予对象包含识别且对病原体的抗原敏感的T细胞或T细胞群的药物组合物，所述T细胞重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中T细胞对其敏感的病原体的抗原是引起感染的病原体的抗原。
在治疗由病原体引起的感染的方法的某些实施方案中，对象是人。在本所述方法的某些实施方案中，病原体是人病原体。
6.附图描述
图1A-1E显示用CD28或4-1BB共刺激的嵌合抗原受体(CAR)显示在初始抗原刺激时体外相等的效应细胞因子分泌和增殖。图1A。第一第一代和第二代CAR。图1B。靶向间皮素(MSLN)的CAR仅含有CD3ζ胞内域(Mz，第一代CAR)或含有CD3ζ胞内域与CD28(M28z)或4-1BB(MBBz)共刺激结构域(第二代CAR)的组合。实验中包括用CD28共刺激的前列腺特异性膜抗原(PSMA)导向的CAR(P28z)以及PSMA表达靶标(PSMA+)作为阴性对照。CYT，胞质结构域；LS，前导序列；LTR，长末端重复序列；SA，剪接受体；SD，剪接供体；TM，跨膜。图1C-1E。CAR转导的T细胞的抗原特异性效应子功能。图1C。MSLN表达靶标(MSLN+)，但非PSMA+靶标的裂解，通过铬释放测定法测量。图1D。在CAR T细胞与MSLN+细胞共培养后4-1BB和CD28共刺激提高细胞因子分泌，通过Luminex测定法评价。图1E。在用MSLN+细胞刺激后M28z和MBBz CAR促进稳固的T细胞蓄积。数据表示一式三份的均值±SEM(图1C，1E)或并以各点作图(图1D)。***P<0.001，通过斯氏t检验，将经刺激的CAR T细胞(M28z或MBBz)与第一代受体(Mz)比较；应用用于多重比较的Bonferroni校正测定显著性。
图2显示人T细胞的有效反转录病毒转导以表达Mz、M28z和MBBz CAR。(上)显示了基因转移后4天的代表性FACS分析。采用荧光扣除对照染色(Fluorescence minus onestaining)在活/死染色排除非存活细胞后设置阳性选通。所有实验使用具有50％-70％CAR转导效率的T细胞；T细胞群间的转导百分比为彼此间的5％内。(下)CD4+和CD8+T细胞亚群两者被有效转导。显示了针对CAR T细胞选通后的CD4+和CD8+百分比。
图3A-3D显示CAR T细胞在体内抗原暴露后耗尽，虽然MBBz CAR T细胞优先保持效应细胞因子分泌和细胞毒性。图3A。胸膜内给予CAR T细胞后6天，将M28z和MBBz CAR T细胞从肿瘤和脾中分离，并进行离体抗原刺激。图3B。离体刺激时的铬释放测定法表明在M28z中降低但持续的MBBz细胞溶解功能(E:T比为1:5)。图3C。细胞因子分泌测量表明效应细胞因子分泌因CAR T细胞降低，虽然MBBz CAR T细胞能够更好地保持分泌。图3D。由收获的CAR T细胞的GzB、IFN-γ和IL-2的表达的RT-PCR测量与蛋白质水平测量极相关。数据表示相对于体外未受刺激的M28z CAR T细胞的mRNA表达的倍数变化。数据表示各条件下3个单独孔的均值±SEM。进行了斯氏t检验，应用用于多重比较的Bonferroni校正测定统计显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。结果重现于用于两个实验中各自的2个单独小鼠组。在图3B-3D的每个中，每对柱状图从左到右显示M28z、MBBZ。
图4A-4E显示CAR T细胞在体外重复抗原刺激时被耗尽，然而MBBz CAR T细胞在体外和体内肿瘤再次激发时优先保持效应细胞因子分泌和细胞毒性。图4A。M28z和MBBz CART细胞两者在体外重复抗原刺激时保持增殖能力。还针对细胞毒性通过铬释放测定法并针对细胞因子分泌通过Luminex测定法对T细胞进行测试(图4B-4D)。图4B。CAR T细胞表明在第一次刺激时相等的杀伤(左)和在重复抗原刺激时细胞溶解功能的丧失，然而MBBz CAR T细胞能够更好地保持细胞溶解功能，正如通过铬释放测定法所测定的(圆形，MZ；三角形，M28z；菱形，MBBz)。图4C。通过CD107a表达测量的细胞毒性颗粒释放(如第3次刺激所示)与铬释放测定法相关(图4B)。数据表示相对于未受刺激的CAR T细胞的CD107a MFI的倍数变化的均值±SD(一式三份)(每对柱状图从左到右显示M28z、MBBZ)。图4D。细胞因子分泌测量同样表明重复抗原遭遇时CAR T细胞效应子功能丧失；MBBz CAR T细胞再次能够更好地保持其功能(以上每套符号“Stim 1”、“Stim 2”和“Stim 3”从左到右为Mz、M28z、MBBZ)。图4E。虽然同样持续，但MBBz CAR T细胞表明优越的功能持续性。在胸膜肿瘤根除(在单剂量的1e5CAR T细胞后)28天后，将1e6MSLN+肿瘤细胞注射入胸腔(肿瘤再次激发)。MBBz CAR T细胞在所有小鼠中防止肿瘤生长，而在最初用M28z CAR T细胞治疗的4只小鼠的2只中观察到肿瘤生长和死亡。进行了斯氏t检验，并采用Bonferroni校正测定统计显著性(*P<0.05；***P<0.001)。数据表示一式三份的均值±SEM或以各个点作图。
图5显示与M28z CAR T细胞相比，MBBz CAR T细胞表达较少耗尽的更有效的表型。4-1BB-和CD28共刺激的T细胞随重复抗原刺激扩增，在第3次刺激后20小时提取mRNA并进行RT-PCR分析。数据以相对于CD4+未转导T细胞的mRNA表达的倍数变化表示。MBBz CAR T细胞表达较高水平的EOMES(Eomesodermin)和TBX21(T-bet)和较低水平的PDCD1(PD-1)和FOXP3(Foxp3)。所有比较在P<0.001时显著。在使用不同供体的3个单独实验中结果类似。每组柱状图从左到右显示UT(未转导T细胞用作对照)、M28z、MBBZ。
图6A-6F显示PD-1受体及其配体体内增量调节(图6A-6D，收获的T细胞；图6E-6F，肿瘤细胞)。图6A。在其给药后6天肿瘤浸润性M28z和MBBz CAR T细胞表达抑制受体，但MBBzCAR T细胞表达较低水平的PD-1。图6B。在胸膜内给药后6天肿瘤浸润性CAR T细胞(TIL)的PD-1受体表达的平均荧光强度(MFI)。图6C。在胸膜内给药后6天肿瘤浸润性CAR T细胞CD4和CD8亚群中PD-1mRNA的相对表达。数据以相对于未受刺激的M28z T细胞的PD-1mRNA表达的倍数变化表示(对于每对柱状图，M28z，左，MBBz，右)。图6D。自发展中肿瘤中分离的肿瘤浸润性M28z CAR T细胞表达抑制受体PD-1、Tim-3和Lag-3。图6E。从用M28z CAR T细胞治疗的小鼠中收获的单细胞肿瘤悬液表达高水平的PD-1结合配体。图6F。体外培养的间皮瘤肿瘤细胞表达PD-1受体的配体(PD-L1、PD-L2)，且表达在与IFN-γ和TNF-α一起孵育24小时后进一步增量调节。
图7显示M28z和MBBz CAR T细胞与其它抑制受体一起共表达PD-1。在胸膜内给予胸膜荷瘤小鼠后6天收获肿瘤浸润性M28z和MBBz CAR T细胞。细胞用针对PD-1和LAG-3(左)或TIM-3(右)的抗体共染色，并通过流式细胞术分析。同种型染色对照(上)被用来建立阳性选通。
图8A-8D显示PD-L1抑制CAR T细胞效应子功能。图8A。将3T3成纤维细胞转导以单独表达间皮素(MSLN+，左)或除PD-L1以外还共表达MSLN(MSLN+PD-L1+，右)。图8B-8D。在用3T3MSLN+或MSLN+PD-L1+靶标刺激后对M28z和MBBz CAR T细胞效应子功能进行评价。PD-L1抑制重复抗原刺激时的M28z和MBBz CAR T细胞蓄积(图8B)，在用MSLN+PD-L1+肿瘤细胞刺激两次后的细胞溶解功能(图8C)，和第一次刺激时的Th1效应细胞因子分泌(图8D)。数据表示一式三份的均值±SEM或以各个点作图。
图9A-9E显示PD-1显性阴性受体(PD-1DNR)的共转导体外和体内拯救自PD-1配体介导的抑制的M28z CAR T细胞。图9A。(左)CD28共刺激的T细胞通过内源PD-1受体(发出共抑制信号)或缺乏抑制性信号转导结构域的共转导PD-1DNR结合肿瘤配体的图示。(右)对于体外和体内实验，将M28z CAR T细胞用空载体(EV；SFG-mCherry)或PD-1DNR(SFG-2A-PD-1DNR)共转导。然后将针对mCherry表达分选的CAR T细胞与用IFN-γ和TNF-α处理的MSLN+肿瘤细胞孵育24小时以增量调节PD-1配体。M28z PD-1DNR CAR T细胞在蓄积上显示在重复抗原刺激时少的却统计显著性的增加(图9B；三角形，M28z EV；正方形，M28z PD-1DNR)，在用MSLN+PD-L1+肿瘤细胞第3次刺激时通过铬释放测定法测定的细胞溶解功能增加(图9C；三角形，M28z EV；正方形，M28z PD-1DNR)，且在初始刺激时Th1上清液细胞因子的表达增加(图9D)。进行了斯氏t检验，应用用于多重比较的Bonferroni校正测定统计显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。数据表示一式三份的均值±SEM或以各个点作图。图9E。比较胸膜给予的单剂量5e4M28z EV(n＝19)或M28z PD-1DNR(n＝16)的体内功效的肿瘤BLI(左)和Kaplan-Meier存活分析(右)。所示数据是两个独立实验的合并。符号表示死亡。中值存活期以天数表示。存活曲线应用log-rank检验分析(P＝0.001)。各独立实验的log-rank检验显著性达P<0.05水平；两个实验合并说明。尽管重复性肿瘤再次激发，该实验中一组小鼠(M28z PD-1DNR)存活超过450天，表明用PD-1DNR转导的CAR T细胞的“功能持续性”。
图10A-10E显示PD-1受体打靶shRNA的共转导体外自PD-L1/PD-1介导的抑制拯救M28z CAR T细胞。图10A。(左)在有或没有PD-1打靶shRNA共表达的情况下，通过内源PD-1受体的CD28共刺激的T细胞结合肿瘤表达的PD-L1的图示。(右)所有实验包括用两种PD-1打靶shRNA之一(共表达dsRED报道分子的sh1或sh2)或用靶向细菌序列的shRNA(KanR)共转导的M28z CAR T细胞。图10B。与KanR转导的细胞相比，用PD-1打靶shRNA共转导的M28z CAR T细胞显示在用植物凝集素刺激时PD-1受体蛋白质表达的60％-70％敲减(图自左向右相当于430、722、813和1411)。将细胞与过量表达PD-L1的3T3成纤维细胞(3T3MSLN+PD-L1+)或用IFN-γ和TNF-α处理的间皮瘤肿瘤细胞一起孵育以增量调节PD-L1和PD-L2。M28z PD1shRNACAR T细胞表明在重复抗原刺激时蓄积增加(图10C)，通过剩余的活肿瘤细胞的萤光素酶活性所测量的在低效应子/靶标比时细胞溶解功能增强(图10D；每组柱状图从左到右为Sh1、Sh2、ShK)和Th1细胞因子分泌增加(图10E；每组柱状图从左到右为Sh1、Sh2、ShK)(**P<0.01；***P<0.001)。进行了斯氏t检验，应用用于多重比较的Bonferroni校正测定统计显著性。数据表示一式三份的均值±SEM。
图11显示PD-1DNR对与Fc结构域融合的PD-L1和PD-L2重组蛋白的粘附测定。将用mCherry标记和用PD-1DNR转导的T细胞暴露于用与Fc融合的PD-L1(“PD-L1Fc”)、与Fc融合的PD-L2(“PD-L2Fc”)或对照同种型Fc(“Iso Fc”)包被的板。以在存在(“+PD-1Ab”)或缺乏PD-1抗体时测量与板结合的T细胞作为绝对mcherry+T细胞计数。柱状图显示各个包被的板每个的结合，从左到右为仅T细胞(“T细胞”)、在存在PD-1抗体时的T细胞(T细胞+PD-1ab”)、用PD-1DNR转导的T细胞(“PD-1DNR T细胞”)和在存在PD-1抗体时用PD-1DNR转导的T细胞(“PD-1DNR T细胞+PD-1Ab”)。
图12A-12D显示PD-1DNR，其抑制T细胞活化的PD-L1-或PD-L2介导的抑制，可转化成阳性共刺激信号。图12A显示说明CAR和PD-1DNR共表达的示意图。图12B显示说明通过使共刺激结构域(以4-1BB为例)与同PD-1的配体结合结构域融合的跨膜结构域融合转化成共刺激构建体的CAR和PD-1DNR的共表达的示意图。图12C显示在用M28z CAR、M28z CAR加PD-1DNR或M28z CAR加PD-1 4-1BB转换受体构建体转导的T细胞中在第0天和在第7天CAR T细胞的蓄积。条形柱从左到右分别为：M28z CAR、M28z CAR+PD-1DNR和M28z CAR+PD-1 4-1BB转换受体构建体。图12D显示用M28z CAR、M28z CAR加PD-1DNR或M28z CAR加PD-1 4-1BB转换受体构建体转导的T细胞中干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子分泌。条形柱从左到右分别为：M28zCAR、M28z CAR+PD-1DNR和M28z CAR+PD-1 4-1BB转换受体构建体。
7.发明详述
本申请涉及治疗病毒感染的组合物和方法。这类病毒感染包括但不限于被人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等感染。如本文所述，免疫刺激性免疫细胞可被遗传工程改造以内在表达是显性阴性突变体且抑制限制免疫细胞活性的阻断物的蛋白质。通过抑制阻断物，允许是免疫刺激性的遗传改造的免疫细胞提供针对病毒感染的更有效的免疫应答。在另一个实施方案中，免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)，其显示免疫抑制靶定病毒抗原的免疫刺激性细胞的免疫活性例如CD8+和/或CD4+T细胞，可被遗传工程改造以内在表达是显性阴性突变体且抑制免疫抑制性细胞对免疫刺激性细胞的免疫抑制作用的蛋白质。
7.1细胞
在一个实施方案中，本发明提供是免疫细胞、尤其免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达：(i)与病毒抗原结合的CAR和(ii)细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式(下文称为“DN形式”)，尤其免疫细胞介导的。这类实施方案中的免疫细胞优选为CD4+或CD8+T细胞或其组合。在另一个实施方案中，本发明提供对病毒抗原敏感的免疫细胞，例如T细胞，尤其是免疫刺激性T细胞，其中细胞表达细胞(尤其T细胞)介导的免疫应答抑制剂的DN形式。在又一个实施方案中，本发明提供是免疫抑制性细胞的免疫细胞(例如调节T细胞)，其中细胞表达细胞(优选调节T细胞)介导的免疫应答抑制剂的DN形式。在一个具体实施方案中，免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)，从患有慢性病毒感染的对象中分离。重组细胞可用来加强或提供针对靶标(例如病毒)的免疫应答。优选，细胞来源于人(在重组前是人源的)(和人衍生细胞对于在本发明的治疗方法中给予人是特别优选的)。
是免疫刺激性细胞的免疫细胞。本发明的免疫细胞可以是淋巴系的免疫刺激性细胞。免疫刺激性细胞在对象中介导免疫应答。可用作免疫刺激性细胞的淋巴系的细胞的非限制性实例包括T细胞和天然杀伤(NK)细胞。T细胞表达T细胞受体(TCR)，其中大多数细胞表达α和β链，较小群表达γ和δ链。可用作本发明的免疫刺激性细胞的T细胞可以是CD4+或CD8+，并可包括但不限于T辅助细胞(CD4+)、细胞毒性T细胞(亦称为细胞毒性T淋巴细胞，CTL；CD8+T细胞)和记忆T细胞，包括中枢性记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或stem-like记忆T细胞)和效应性记忆T细胞，例如TEM细胞和TEMRA(CD45RA+)细胞、天然杀伤T细胞、黏膜相关恒定T细胞(MAIT)和γδT细胞。其它示例性免疫刺激性细胞包括但不限于巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)例如树突细胞或介导免疫应答和表达细胞介导的免疫应答抑制剂(例如免疫检查点抑制剂途径受体例如PD-1)的任何免疫细胞(虽然无意受机制束缚，但提出细胞中DN形式的表达抑制细胞介导的免疫应答的抑制剂以促进细胞的持续活化)。举例来说，可按照本发明使用、如上所述重组表达DN形式或共表达CAR和DN形式的免疫刺激性细胞的前体细胞是造血干和/或祖细胞。造血干和/或祖细胞可通过本领域已知方法来源于骨髓、脐带血、细胞因子动员后的成人外周血等，然后将其遗传改造以重组表达DN形式或共表达CAR和DN形式。特别有用的前体细胞是可以分化成淋巴系的那些，例如淋巴系的造血干细胞或祖细胞。
是免疫刺激性细胞的免疫细胞和其前体细胞可通过本领域众所周知的方法，包括市购可获得的分离方法分离(参见例如Rowland-Jones et al.,Lymphocytes:A PracticalApproach,Oxford University Press,New York(1999))。免疫细胞或其前体细胞的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或造血细胞的其它来源。可采用各种技术分开细胞以分离或富集所需免疫细胞。例如阴性选择方法可用来除去不是所需免疫细胞的细胞。另外，阳性选择方法可用来分离或富集所需免疫细胞或其前体细胞，或可采用阳性和阴性选择方法的组合。单克隆抗体(MAb)可特别用于鉴定与特定细胞谱系和/或阳性和阴性选择两者的分化阶段有关的标志物。如果要分离特定的细胞类型，例如特定的T细胞类型，不同的细胞表面标志物或标志物的组合，包括但不限于CD3、CD4、CD8、CD34(对于造血干和祖细胞)等，可用来分离细胞，正如本领域众所周知的(参见Kearse,T Cell Protocols:Development andActivation,Humana Press,Totowa NJ(2000)；De Libero,T Cell Protocols,Vol.514ofMethods in Molecular Biology,Humana Press,Totowa NJ(2009))。
用于分离可用于CAR重组表达的免疫细胞的各种方法之前已有描述并且可以使用，包括但不限于使用外周供体淋巴细胞(Sadelain et al.,Nat.Rev.Cancer 3:35-45(2003)；Morgan et al.,Science 314:126-129(2006)和使用利用人工抗原呈递细胞(AAPC)或树突细胞的选择性体外扩增的抗原特异性外周血白细胞(Dupont et al.,CancerRes.65:5417-5427(2005)；Papanicolaou et al.,Blood 102:2498-2505(2003))。在使用干细胞的情况下，细胞可通过本领域众所周知的方法分离(参见例如Klug et al.,Hematopoietic Stem Cell Protocols,Humana Press,New Jersey(2002)；Freshney etal.,Culture of Human Stem Cells,John Wiley&Sons(2007))。
在另一个实施方案中，本发明提供识别和对病毒抗原敏感、并用还重组表达免疫细胞介导的免疫应答(例如在T细胞的情况下为T细胞介导的免疫应答)的抑制剂的DN形式的免疫细胞，例如T细胞。这类免疫细胞(例如T细胞)，可能但不必表达与病毒抗原结合的CAR，因为细胞已经是病毒抗原特异性的，因此其免疫应答(例如细胞毒性)被这类病毒抗原特异性地刺激。识别和对病毒抗原敏感的这类免疫细胞(例如T细胞)，可通过已知方法获得，举例来说，采用初始T细胞(参见例如Wolfl et al.,Nat.Protocols 9:950-966(2014))或造血祖细胞(参见van Lent et al.,J.Immunol.179:4959-4968(2007))的体外敏化法；或可获自暴露于病毒抗原并发起针对病毒抗原的免疫应答的对象，例如患有病毒感染的对象(即体内敏化的免疫细胞)。自对象分离抗原特异性T细胞的方法是本领域众所周知的。所述方法包括但不限于细胞因子俘获系统或细胞因子分泌测定法，所述方法基于可用来鉴定和分离抗原特异性的抗原刺激性T细胞的细胞因子的分泌和体外细胞扩增(参见Assenmacher et al.,Cytometric Cytokine Secretion Assay,in Analyzing T CellResponses:How to Analyze Cellular Immune Responses Against Tumor AssociatedAntigens,Nagorsen et al.,eds.,Chapter 10,pp.183-195,Springer,The Netherlands(2005)；Haney et al.,J.Immunol.Methods 369:33-41(2011)；Bunos et al.,VoxSanguinis DOI:10.1111/vox.12291(2015)；Montes et al.,Clin.Exp.Immunol.142:292-302(2005)；Adusumilli et al.,Sci Transl Med.6:261ra151(2014))。这类细胞因子包括但不限于干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α。抗原特异性T细胞可采用上述有效分离免疫细胞的众所周知的技术分离，包括但不限于流式细胞术、磁珠、固相淘洗等。抗原特异性T细胞分离技术也是市购可获得的，可用于临床应用，并可使之适用于临床应用(参见例如MiltenyiBiotec，Cambridge，MA；Proimmune，Oxford，UK；等)。
是免疫抑制性细胞的免疫细胞。是免疫抑制性细胞的本发明的免疫细胞可以是淋巴系的细胞。可用作免疫抑制性细胞的淋巴系的细胞的非限制性实例包括调节T细胞(Treg)、滤泡调节T细胞、调节B细胞等。本发明的免疫抑制性细胞表达细胞介导的免疫应答的抑制剂，例如免疫检查点抑制剂途径受体，例如PD-1。
可被遗传工程改造以重组表达细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式的免疫抑制性细胞可通过本领域众所周知的方法，包括市购可获得的分离方法分离(参见例如Rowland-Jones et al.,Lymphocytes:A Practical Approach,Oxford UniversityPress,New York(1999))。其免疫抑制性细胞的来源包括但不限于外周血、脐带血、骨髓或淋巴系细胞的其它来源。各种技术可用来分开细胞以分离或富集所需的免疫抑制性细胞。例如阴性选择方法可用来除去不是所需的免疫抑制性细胞的细胞。另外，阳性选择方法可用来分离或富集所需的免疫抑制性细胞，或可采用阳性和阴性选择方法的组合。单克隆抗体(MAb)可特别用于鉴定与特定细胞谱系和/或分化阶段有关的标志物，并可用作阳性和阴性选择两者的试剂。免疫抑制性细胞的一种特定类型可根据不同的细胞表面标志物或标志物的组合，或缺乏标志物来分离，包括但不限于用于阳性选择的CD4和/或CD8连同用于阴性选择的CD127，正如本领域众所周知的(参见Kearse,T Cell Protocols:Development andActivation,Humana Press,Totowa NJ(2000)；De Libero,T Cell Protocols,Vol.514ofMethods in Molecular Biology,Humana Press,Totowa NJ(2009)；Su et al.,MethodsMol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone et al.,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara et al.,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu et al.,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)
；Seddiki et al.,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena et al.,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen et al.,J.Immunol.183:4094-4102(2009)
；Putnam et al.,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam et al.,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013))。在一个具体实施方案中，CD4+CD25+调节T细胞例如使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒(Dynal牌，Invitrogen，Carlsbad，CA)来分离(参见Lee et al.,Cancer Res.71:2871-2881(2011))。还描述了调节T细胞(iTreg)的体外产生(参见例如Lan et al.,J.Mol.Cell.Biol.4:22-28(2012)；Yamagiwa et al.,J.Immunol.166:7282-7289(2001)；Zheng et al.,J.Immunol.169:4183-4189(2002)))。之前描述了分离可用于重组表达CAR的免疫细胞的各种方法(Sadelain et al.,Nat.Rev.Cancer 3:35-45(2003)；Morgan et al.,Science 314:126-129(2006)；Panelliet al.,J.Immunol.164:495-504(2000)；Panelli et al.,J Immunol.164:4382-4392(2000)；Dupont et al.,Cancer Res.65:5417-5427(2005)；Papanicolaou et al.,Blood102:2498-2505(2003)；MacDonald et al.,J Clin.Invest.126:1413-1424(2016)))。在一个具体实施方案中，免疫抑制性细胞，尤其调节T细胞从患有病毒感染(例如慢性病毒感染，例如被HCV、HBV或HIV慢性感染)的对象中分离。在一个具体实施方案中，调节T细胞从患有慢性病毒感染、患者处于急性感染缓解期的患者中分离。在免疫抑制性细胞从患有病毒感染的患者中分离的情况下，免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)，不一定但可能是对病毒抗原有特异性的抗原。
任选可使免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)对病毒抗原敏感。从对象中分离抗原特异性免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)的方法是本领域众所周知的(参见例如Noyan etal.,Eur.J.Immunol.44:2592-2602(2014)；Brusko et al.,PLoS One 5(7)e11726(doi:10.1371)(2010)；Bacher et al.,Mucosal Immunol.7:916-928(2014)；Koenen et al.,J.Immunol.174:7573-7583(2005))。
在一个实施方案中，免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)从患有病毒感染(例如慢性病毒感染)的患者中分离。这类分离的细胞或其子代可任选经遗传修饰以表达与导致病毒感染的病毒的抗原结合的CAR。
分离和扩增调节T细胞的方法是本领域众所周知的(参见例如Su et al.,MethodsMol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone et al.,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara et al.,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu et al.,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki et al.,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena et al.,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen et al.,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam et al.,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam et al.,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013)；Lee et al.,CancerRes.71:2871-2881(2011)；MacDonald et al.,J Clin.Invest.126:1413-1424(2016))。还描述了调节T细胞(iTreg)的体外产生(参见例如Lan et al.,J.Mol.Cell.Biol.4:22-28(2012)；Yamagiwa et al.,J.Immunol.166:7282-7289(2001)；Zheng et al.,J.Immunol.169:4183-4189(2002))。一般而言，本发明的调节T细胞为CD4+，例如CD4+CD25+，尤其是CD4+CD127lo/-CD25+。这类调节T细胞表达Foxp3(叉头框P3)，其是转录因子的叉头/翼状螺旋家族(Bluestone et al.,J.Clin.Invest.125:2250-2260(2015)；Riley et al.,Immunity 30:656-665(2009))。是本发明的免疫抑制性细胞的调节T细胞也可以是CD8+调节T细胞(Guillonneau et al.,Curr.Opin.Organ Transplant.15:751-756(2010))。分离和扩增调节T细胞的方法也是市购可获得的(参见例如BD Biosciences,San Jose,CA；STEMCELL Technologies Inc.,Vancouver,Canada；eBioscience,San Diego,CA；Invitrogen,Carlsbad,CA)。本发明的免疫抑制性细胞还可以是滤泡调节T细胞(T(FR))(Sage et al.,Nat.Immunol.14:152-161(2013))。在一个具体实施方案中，本发明的滤泡调节T细胞是CD4+CXCR5+并表达Foxp3(Sage等，同上，2013)。
在一些实施方案中，本发明的免疫抑制性细胞是调节B细胞。调节B细胞在B细胞中具有产生白介素10(IL10)的特殊能力(参见例如Lykken et al.,InternationalImmunol.27:471-477(2015)；Miyagaki et al.,International Immunol.27:495-504(2015))。描述了分离调节B细胞的方法(参见例Masson et al.,in Regulatory B Cells:Methods and Protocols,Vitale and Mion,eds.,Chapter 4,pp.45-52,Humana Press,New York(2014))。所述方法基于细胞表面标志物例如CD24highCD38high的表达和IL10的表达(Masson等，同上，2014)。调节B细胞的其它标志物包括CD24hiCD27+(参见Lykken等，同上，2015)。
免疫细胞的分离方法包括但不限于密度梯度离心、与改变细胞密度的颗粒偶联、用抗体包被的磁珠进行磁分离、亲和层析法；与单克隆抗体(mAb)连接或联用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；以及用固体基质(例如板或芯片)连接的抗体淘洗、淘洗法、流式细胞术或任何其它合适的技术(参见例如Recktenwald et al.,Cell SeparationMethods and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1998))。要了解，用于本发明方法的免疫细胞可以是基本纯的细胞或可以是多克隆群。在一些实施方案中，可针对所需免疫细胞富集多克隆群。这类富集可发生在遗传工程改造细胞以按需表达DN形式或CAR和DN形式之前或之后。
免疫细胞或其前体细胞对于向其给予本发明的治疗方法的对象可为自体的或非自体的。自体细胞从向其给予经改造的细胞的对象中分离。任选细胞可通过白细胞除去法(其中白细胞从所抽取的血液中选择性去除)获得，进行重组，然后重新输回给供体。或者，可使用来自不是对象的非自体供体的同种异体细胞。在非自体供体的情况下，针对人白细胞抗原(HLA)对细胞选型和匹配以确定相容性的适当水平，正如本领域众所周知的。对于自体和非自体细胞两者，可任选将细胞冷藏以备采用本领域众所周知的方法用于遗传操作和/或给予对象。
可将免疫细胞或其前体细胞置于有利于免疫细胞或其前体细胞的保持或扩增的条件下(参见Kearse,T Cell Protocols:Development and Activation,Humana Press,Totowa NJ(2000)；De Libero,T Cell Protocols,Vol.514 of Methods in MolecularBiology,Humana Press,Totowa NJ(2009)；Parente-Pereira et al.,J.Biol.Methods 1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；Movassagh et al.,Hum.Gene Ther.11:1189-1200(2000)；Rettig et al.,Mol.Ther.8:29-41(2003)；Agarwal et al.,J.Virol.72:3720-3728(1998)；Pollok et al.,Hum.Gene Ther.10:2221-2236(1999)；Quinn et al.,Hum.Gene Ther.9:1457-1467(1998)；Su et al.,Methods Mol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone et al.,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara et al.,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu et al.,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki et al.,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena et al.,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen et al.,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam et al.,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnam et al.,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013)；Lee et al.,Cancer Res.71:2871-2881(2011)；MacDonald et al.,J Clin.Invest.126:1413-1424(2016)；另参见市购可获得的方法例如DynabeadsTM人T细胞激活剂产品，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA))。免疫细胞或其前体细胞或病毒抗原敏化的免疫细胞(例如T细胞)，可任选在离体遗传工程之前或之后扩增。细胞的扩增特别可用于增加给予对象的细胞数目。扩增免疫细胞的这类方法是本领域众所周知的(参见Kaiser et al.,Cancer Gene Therapy 22:72-78(2015)；Wolfl etal.,Nat.Protocols 9:950-966(2014)；Su et al.,Methods Mol.Biol.806:287-299(2012)；Bluestone et al.,Sci.Transl.Med.7(315)(doi:10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015)；Miyara et al.,Nat.Rev.Rheumatol.10:543-551(2014)；Liu et al.,J.Exp.Med.203:1701-1711(2006)；Seddiki et al.,J.Exp.Med.203:1693-1700(2006)；Ukena et al.,Exp.Hematol.39:1152-1160(2011)；Chen et al.,J.Immunol.183:4094-4102(2009)；Putnam et al.,Diabetes 58:652-662(2009)；Putnamet al.,Am.J.Tranplant.13:3010-3020(2013)；Lee et al.,Cancer Res.71:2871-2881(2011))。此外，可任选将细胞在基因工程细胞分离和/或遗传工程和/或扩增之后冷藏(参见Kaiser等，同上，2015))。冷藏细胞的方法是本领域众所周知的(参见例如Freshney,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,4th ed.,Wiley-Liss,NewYork(2000)；Harrison and Rae,General Techniques of Cell Culture,CambridgeUniversity Press(1997))。
在一个具体实施方案中，分离的免疫细胞为刺激性免疫细胞或其前体细胞，其经离体遗传改造用于重组表达DN形式和CAR。在一个具体实施方案中，分离的T细胞经离体遗传改造用于重组表达DN形式。在一个具体实施方案中，免疫抑制性细胞(例如调节T细胞)经离体遗传改造用于重组表达DN形式。细胞可通过本领域众所周知的方法经遗传工程改造用于重组表达。
在其中使用重组表达DN形式的病毒抗原敏化的免疫细胞(例如T细胞)且其中这类细胞通过体外敏化获得的一个实施方案中，所述敏化可发生在免疫细胞经遗传改造重组表达DN形式之前或之后。在其中敏化的免疫细胞(例如T细胞)从体内来源分离的一个实施方案中，不言而喻的，遗传工程改造发生在已敏化的免疫细胞中。
就产生重组表达DN形式或CAR和DN形式的细胞而言，使用合适的表达载体，将编码DN形式或CAR和DN形式的一种或多种核酸导入免疫细胞或其前体细胞。免疫细胞(例如T细胞或调节T细胞)或其前体细胞优选用编码DN形式或CAR和DN形式的一种或多种核酸转导。在表达CAR和DN形式两者的情况下，CAR和DN形式编码核酸可按需在单独的载体上或在相同载体上。例如，可采用众所周知的分子生物学技术，将编码本发明的CAR或DN形式的多核苷酸克隆至合适的载体(例如反转录病毒载体)中，并导入免疫细胞(参见Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。可使用适于在本发明的细胞，尤其人免疫细胞或其前体细胞中表达的任何载体。载体含有合适的表达元件例如供免疫细胞中所编码的核酸表达的启动子。在反转录病毒载体的情况下，可任选激活细胞以提高转导效率(参见Parente-Pereira et al.,J.Biol.Methods 1(2)e7(doi 10.14440/jbm.2014.30)(2014)；Movassagh et al.,Hum.Gene Ther.11:1189-1200(2000)；Rettig et al.,Mol.Ther.8:29-41(2003)；Agarwalet al.,J.Virol.72:3720-3728(1998)；Pollok et al.,Hum.Gene Ther.10:2221-2236(1998)；Quinn et al.,Hum.Gene Ther.9:1457-1467(1998)；另参见市购可获得的方法，例如DynabeadsTM人T细胞激活剂产品，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。用于在调节T细胞中表达多肽(例如CAR)的方法可为本领域已知的任一种，例如Lee et al.,CancerRes.71:2871-2881(2011)中所述方法。
在一个实施方案中，载体是用于将CAR或DN形式导入免疫细胞或其前体细胞的反转录病毒载体，例如γ反转录病毒或慢病毒载体。对于表达CAR和/或DN形式的细胞的遗传修饰，通常将反转录病毒载体用于转导。然而，要了解可以使用任何合适的病毒载体或非病毒递送系统。反转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白可用于感染人细胞。已知各种产生兼嗜性病毒的细胞系列，包括但不限于PA12(Miller et al.,Mol.Cell.Biol.5:431-437(1985))；PA317(Miller et al.,Mol.Cell.Biol.6:2895-2902(1986))以及CRIP(Danos et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464(1988))。非兼嗜性病毒颗粒也是合适的，例如用VSVG、RD114或GALV包膜假型化的颗粒和本领域已知的任何颗粒(Relander et al.,Mol.Therap.11:452-459(2005))。转导的可能方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养(例如Bregni et al.,Blood 80:1418-1422(1992))，或在含或不含合适的生长因子和聚阳离子时与仅病毒上清液或浓缩载体原液一起培养(参见例如Xuet al.,Exp.Hemat.22:223-230(1994)；Hughes,et al.J.Clin.Invest.89:1817-1824(1992))。
一般而言，所选的载体显示高效率的感染和稳定的整合和表达(参见例如Cayouette et al.,Human Gene Therapy 8:423-430(1997)；Kido et al.,Current EyeResearch 15:833-844(1996)；Bloomer et al.,J.Virol.71:6641-6649(1997)；Naldiniet al.,Science 272:263 267(1996)；以及Miyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319-10323(1997))。可以使用的其它病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺伴随病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒衍生载体或疱疹病毒，例如埃-巴二氏病毒(参见例如Miller,Hum.Gene Ther.1(1):5-14(1990)；Friedman,Science244:1275-1281(1989)；Eglitis et al.,BioTechniques 6:608-614(1988)；Tolstoshevet al.,Current Opin.Biotechnol.1:55-61(1990)；Sharp,Lancet 337:1277-1278(1991)；Cornetta et al.,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.36:311-322(1989)；Anderson,Science 226:401-409(1984)；Moen,Blood Cells 17:407-416(1991)；Milleret al.,Biotechnology 7:980-990(1989)；Le Gal La Salle et al.,Science 259:988-990(1993)；以及Johnson,Chest 107:77S-83S(1995))。反转录病毒载体得到极好地发展，并已用于临床背景(Rosenberg et al.,N.Engl.J.Med.323:370(1990)；Anderson et al.,美国专利号5,399,346)。
表达本发明的CAR和/或DN形式的特别有用的载体包括已用于人类基因疗法的载体。在一个非限制性实施方案中，载体是反转录病毒载体。已描述了在T细胞或其它免疫细胞，包括工程改造的CAR T细胞中表达的反转录病毒载体的应用(参见Scholler et al.,Sci.Transl.Med.4:132-153(2012；Parente-Pereira et al.,J.Biol.Methods 1(2):e7(1-9)(2014)；Lamers et al.,Blood 117(1):72-82(2011)；Reviere et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6733-6737(1995))。在一个实施方案中，载体是SGF反转录病毒载体例如SGFγ-反转录病毒载体，其是洛尼鼠白血病型反转录病毒载体。之前描述了SGF载体(参见例如Wang et al.,Gene Therapy 15:1454-1459(2008))。
本发明的载体使用在特定宿主细胞中表达的合适启动子。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。在一个具体实施方案中，表达载体的启动子提供在免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞或调节T细胞中表达。也可使用非病毒载体，只要载体含有在免疫细胞或其前体细胞中表达的合适表达元件。可将一些载体，例如反转录病毒载体，整合至宿主基因组。需要时，可应用例如核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或成簇有规间隔短回文重复序列(CRISPR)等技术，通过同源重组等进行靶向整合(Gersbach et al.,Nucl.Acids Res.39:7868-7878(2011)；Vasileva,et al.Cell DeathDis.6:e1831.(Jul 23 2015)；Sontheimer,Hum.Gene Ther.26(7):413-424(2015))。
可任选将载体和构建体设计成包括报道分子。例如载体可被设计成表达报道蛋白质，其可用来鉴定包含载体或载体上提供的核酸(例如整合至宿主染色体的核酸)的细胞。在一个实施方案中，报道分子可表达为具有CAR或DN形式的双顺反子或多顺反子表达构建体。示例性的报道蛋白质包括但不限于荧光蛋白，例如mCherry；绿色荧光蛋白(GFP)；蓝色荧光蛋白，例如EBFP、EBFP2、Azurite和mKalama1；青色荧光蛋白，例如ECFP、Cerulean和CyPet，以及黄色荧光蛋白，例如YFP、Citrine、Venus和YPet。在其它实施方案中，载体构建体可包含P2A序列，其供报道分子的任选共表达。P2A是自切割肽序列，其可用于蛋白质序列的双顺反子或多顺反子表达(参见Szymczak et al.,Expert Opin.Biol.Therapy 5(5):627-638(2005))。
采用常规分子生物学技术，测定法可用来测定CAR和/或DN形式的转导效率。如果构建体中包括标记(例如荧光蛋白)，则可通过定量测定转导的(例如GFP+)免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞或调节T细胞的FACS分析和/或通过定量PCR监测基因转移效率。使用成熟的共培养系统(Gade et al.,Cancer Res.65:9080-9088(2005)；Gong et al.,Neoplasia 1:123-127(1999)；Latouche et al.,Nat.Biotechnol.18:405-409(2000))，可测定表达癌抗原的成纤维细胞AAPC(与对照)是否指导细胞因子从表达CAR的转导T细胞中释放(用于IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的细胞上清液LUMINEX(Austin TX)测定法)、T细胞增殖(通过羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记)和T细胞存活(通过膜联蛋白V染色)。可评价CD80和/或4-1BBL对T细胞存活、增殖和功效的影响。可将T细胞暴露于经由靶抗原阳性细胞的反复刺激，并可测定T细胞增殖和细胞因子反应是保持相似还是随反复刺激降低。在一个优选的实施方案中，可将表达CAR的T细胞暴露于经由癌抗原阳性靶细胞的反复刺激中，并可测定T细胞增殖和细胞因子反应是保持相似还是随反复刺激降低。可将含或不含病毒抗原CAR构建体的细胞在相同测定条件下一起比较。有多个E:T比率的细胞毒性测定可采用铬释放测定法进行。
需要时，可对编码用于本发明的细胞遗传工程的多肽(例如DN形式或CAR)的核酸，进行密码子优化以提高免疫细胞或其前体细胞中的表达效率。可采用密码子优化以在给定细胞中达到较高的表达水平。涉及蛋白质表达的不同阶段的因素包括密码子适应性、mRNA结构和转录和翻译中的各种顺式元件。可采用本领域技术人员已知的任何合适的密码子优化方法或技术来修饰编码多肽的多核苷酸。这类密码子优化方法是众所周知的，包括市购可获得的密码子优化服务，例如OptimumGeneTM(GenScript；Piscataway，NJ)；Encor优化(EnCor Biotechnology；Gainseville FL)；Blue Heron(Blue Heron Biotech；Bothell,WA)等。任选多密码子优化可根据不同的算法进行，综合优化结果以得到编码多肽的密码子优化核酸。
可将更多修饰引入本发明的免疫细胞或其前体细胞。例如，可修饰细胞以克服免疫难题和/或免疫细胞靶向健康或非靶组织。例如，需要时可将自杀基因导入细胞以供细胞耗竭。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型Caspase 9自杀基因(iCasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(EGFRt)多肽。将药剂给予已向其给予含有自杀基因的细胞的对象，包括但不限于适于hsv-tk的更昔洛韦(GCV)(Greco et al.,Frontiers Pharmacol.6:95(2015)；Barese et al.,Mol.Therapy 20:1932-1943(2012))、适于iCasp-9的AP1903(Di Stasi et al.,N.Engl.J.Med.365:1673-1683(2011)和适于EGFRt的西妥昔单抗(美国专利号8,802,374)促进细胞死亡。在一个实施方案中，给予经设计激活自杀基因的前药，例如可激活iCasp-9的AP1903的前药，可引发自杀基因活化细胞的凋亡。在一个实施方案中，iCasp9由通过Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:28)接头与编码人胱天蛋白酶9(CASP9；GenBank编号，NM001229(NM_001229.4，GI:493798577))的基因连接的具有F36V突变的人FK506结合蛋白(FKBP12；GenBank编号，AH002818(AH002818.2，GI:1036032368))的序列组成，其已剔除了其内源胱天蛋白酶活化和募集结构域。FKBP12-F36V以高亲和力与非生物惰性小分子二聚化作用剂AP1903结合。在存在AP1903时，iCasp9分子前体二聚化并激活内源细胞凋亡途径，导致细胞死亡(Di Stasi et al.,N.Engl.J.Med.365:1673-1683(2011))。在另一个实施方案中，自杀基因是EGFRt多肽。EGFRt多肽可通过给予抗EGFR单克隆抗体，例如西妥昔单抗以供细胞清除。自杀基因可在单独的载体上表达或任选在编码CAR或DN形式的载体内表达，并且可以是与CAR或DN形式编码核酸连接的双顺反子或多顺反子构建体。
7.2嵌合抗原受体(CAR)
由本发明的细胞重组表达的CAR具有与病毒抗原结合的抗原结合结构域。在具体的实施方案中，CAR可以是“第一代”、“第二代”或“第三代”CAR(参见例如Sadelain et al.,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Jensen et al.,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe et al.,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)；Brentjens et al.,Clin.CancerRes.13:5426-5435(2007)；Gade et al.,Cancer Res.65:9080-9088(2005)；Maher etal.,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kershaw et al.,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain et al.,Curr.Opin.Immunol.21(2):215-223(2009)；Hollyman et al.,J.Immunother.32:169-180(2009))。
“第一代”CAR通常由与跨膜结构域融合的胞外抗原结合结构域(例如单链可变片段(scFv))组成，所述跨膜结构域与T细胞受体链的胞质/胞内域融合。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ-链的胞内域，所述CD3ζ-链是来自内源T细胞受体(TCR)的信号的主要递质(参见图1A中的示例性第一代CAR)。独立于HLA介导的抗原呈递，“第一代”CAR可提供新生抗原识别并通过其在单一融合分子中的CD3ζ链信号转导结构域引起包括CD4+和CD8+T细胞两者在内的T细胞活化。用于本发明的“第二代”CAR包含与能够激活免疫细胞(例如T细胞)的胞内信号转导结构域融合的抗原结合结构域和设计成提高免疫细胞(例如T细胞)效能和持久性的共刺激结构域(Sadelain et al.,Cancer Discov.3:388-398(2013))。CAR设计因此可联合抗原识别与信号转导，即生理上由两种单独的复合物(TCR异二聚体和CD3复合物)承担的两种功能。“第二代”CAR包括在CAR的胞质尾区中的来自不同共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40等)的胞内域以向细胞提供额外的信号(参见图1A中的示例性第二代CAR)。“第二代”CAR提供例如通过CD28或4-1BB结构域的共刺激和例如通过CD3ζ信号转导结构域的活化两者。“第三代”CAR提供例如通过包含CD28和4-1BB结构域两者的多重共刺激和例如通过包含CD3ζ活化结构域的活化。
在本文公开的实施方案中，CAR通常包含如上所述的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内域，其中胞外抗原结合结构域与病毒抗原结合。在一个具体的非限制性实施方案中，胞外抗原结合结构域是scFv。
如本文公开的，本发明的方法包括给予经工程改造共表达病毒抗原CAR和细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式(“DN形式”)的细胞。CAR的胞外抗原结合结构域通常来源于单克隆抗体(mAb)或受体或其配体。
CAR的设计是本领域众所周知的(参见例如Sadelain et al.,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Jensen et al.,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe et al.,Dis.Model Mech.8(4):337-350(2015)的综述和其中引用的参考文献)。导向所需抗原的CAR可采用用于设计CAR的众所周知的方法(包括本文所述方法)产生。可通过使病毒抗原结合活性(例如导向病毒抗原的scFv抗体)与免疫细胞信号转导结构域(例如T细胞受体胞质/胞内域)融合，来容易地设计CAR，不论第一、第二还是第三代CAR。如上所述，CAR通常具有作为胞外结构域的至少一部分的、与跨膜结构域融合的具有病毒抗原结合活性(例如scFv的细胞表面受体的结构，所述跨膜结构域在免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞中与具有细胞信号转导活性的胞内域融合。病毒抗原CAR可包括本文所述的共刺激分子。本领域技术人员可容易地选择如本文描述和本领域已知的合适的跨膜结构域和胞内域以在免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞中提供所需的信号转导能力。
用于本发明的CAR包含包括与抗原病毒结合的抗原结合结构域的胞外结构域。在一个具体实施方案中，抗原结合结构域与靶病毒上的抗原结合，或与在靶T细胞或组织中表达的病毒抗原结合。这类抗原结合结构域一般来源于抗体。在一个实施方案中，抗原结合结构域可以是scFv或Fab，或抗体的任何合适的抗原结合片段(参见Sadelain et al.,CancerDiscov.3:38-398(2013))。许多抗体或来源于与病毒抗原结合的抗体的抗原结合结构域是本领域已知的。或者，这类抗体或抗原结合结构域可通过常规方法产生。产生抗体的方法是本领域众所周知的，包括产生单克隆抗体或筛选库以获得抗原结合多肽的方法，包括筛选人Fab的库(Winter and Harris,Immunol.Today 14:243-246(1993)；Ward et al.,Nature341:544-546(1989)；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988)；Hilyard et al.,Protein Engineering:A practicalapproach(IRL Press 1992)；Borrabeck,Antibody Engineering,2nd ed.(OxfordUniversity Press 1995)；Huse et al.,Science 246:1275-1281(1989))。对于CAR，来源于抗体的抗原结合结构域按需要可为人、人源化、嵌合、CDR移植的等。例如，如果小鼠单克隆抗体是产生CAR的抗原结合结构域的源抗体，则可通过将小鼠抗体的CDR移植到人构架中使这类抗体人源化(参见Borrabeck，同上，1995)，这对于将CAR给予人类对象是有益的。在一个优选的实施方案中，抗原结合结构域是scFv。scFv的产生是本领域众所周知的(参见例如Huston,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Ahmad et al.,Clin.Dev.Immunol.2012:ID980250(2012)；美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美国专利公开号20050196754和20050196754))。
至于获取病毒抗原结合活性，如本文公开的，采用产生和筛选与所需抗原结合的抗体，包括产生在CAR中是特别有用的与病毒抗原结合的scFv的任何众所周知的方法，本领域技术人员可容易地获得合适的病毒抗原结合活性，例如抗体。另外，许多病毒抗原抗体，特别是单克隆抗体是市购可获得的，并也用作病毒抗原结合活性(例如scFv)的来源以产生CAR(参见例如Sigma-Aldrich,St.Louis,MO；Meridian Life Science,Memphis,TN；ProSpec-Tany Technogene,East Brunswick,NJ等)。
或者对于来源于抗体的抗原结合结构域，CAR胞外结构域可包含配体或受体的胞外配体结合结构域(参见Sadelain et al.,Cancer Discov.3:388-398(2013)；Sharpe etal.,Dis.Model Mech.8:337-350(2015))。在这种情况下，配体或受体的胞外配体结合结构域向CAR提供将表达CAR的细胞靶向相应受体或配体的能力。在靶向病毒的情况下，示例性的实施方案是使用单纯疱疹病毒(HSV)的gE/gI糖蛋白(参见Polcicova et al.,J.Virol.79:11990-12001(2005)。HSV gE/gI糖蛋白在细胞连接处蓄积，并介导HSV的细胞至细胞的扩散(Polcicova等，同上，2005)。在一个具体实施方案中，CAR胞外结构域包含HSVgE的胞外结构域，以将表达CAR的免疫细胞靶向细胞连接处，HSV在此从细胞向细胞扩散。
对于导向病毒抗原的CAR，选择CAR的抗原结合结构域，使其与靶病毒的病毒抗原或在含有病毒的细胞(例如在其细胞表面上表达病毒抗原的感染细胞)中表达的病毒抗原结合。这类病毒抗原可以只在病毒上表达，或相对于非病毒感染的细胞或组织，病毒抗原可在病毒上或病毒感染的组织或细胞过量表达。一般而言，病毒抗原只由病毒或病毒感染的细胞或组织表达，并且在被感染的生物中非天然地表达。选择被CAR结合的病毒抗原以供超过非病毒感染的细胞或组织地靶向表达CAR的细胞。在治疗病毒感染的本发明方法的一个实施方案中，免疫细胞或其前体细胞被设计成通过在细胞中表达与患者的病毒感染的合适病毒抗原结合的CAR连同本文所述DN形式，来治疗患有病毒感染的患者。
任何合适的病毒抗原可根据待治疗的对象(患有病毒感染的患者)表现的病毒感染类型选择。要了解，所选的病毒抗原以病毒抗原可用于被CAR结合的方式表达。一般而言，待被表达CAR的细胞打靶的病毒抗原在病毒表面或对象的病毒感染的细胞或组织表面表达。然而，要了解可用于与CAR结合的任何病毒抗原都适于使CAR表达细胞靶向病毒感染部位或病毒感染组织。优选的病毒包括是病原体，尤其人类病原体，且诱导病毒抗原特异性免疫应答的病毒。在一个具体实施方案中，靶定病毒抗原是作为人类病原体的病毒的抗原，而在一个具体实施方案中，人类病原体的这类病毒抗原可诱导感染病毒的人类患者的免疫应答。可被靶向的示例性病毒及其病毒抗原包括但不限于下表1提供的那些。
表1。病毒和病毒抗原
1Mitsuya et al.,Science 249:1533-1544(1990)；Fauci et al.,Harrison’sPrinciples of Internal Medicine,14th ed.,pp.1814-1816,McGraw-Hill,SanFrancisco CA(1998)；Fauci,Science 239:617-622(1988)；Rosenberg et al.,Science278:1447-1450(1997)；Krebs et al.,Gastroenterol.145:456-465(2013)；Ashfaq etal.,Virol.J.8:161(doi:10.1186/1743-422X-8-161)； et al.,Virol.J.6:84(doi:10.1186/1743-422X-6-84)；Dawson,Antiviral Therap.17:1431-1435(2012)；Polcicova et al.,J.Virol.79:11990-12001(2005)；Bennett et al.,Cecil Textbookof Medicine,20th ed.,p.1770,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996)；Gerdemann etal.,Mol.Ther.21:2113-2121(2013)；Rooney et al.,Mol.Ther.Nucleic Acids 1:e55,doi:10.1038/mtna.2012.49(2012)
在HBV情况下的一个具体实施方案中，靶向S、M或L包膜蛋白的S结构域(参见Krebs等，同上，2013)。在HSV情况下的另一个具体实施方案中，靶向gE的胞外结构域(参见Polcicova等，同上，2005)。要了解，本领域技术人中可容易地确定适于通过本发明的免疫细胞打靶的病毒抗原或病毒抗原的结构域。
要进一步了解，提及病毒，例如表1所列病毒，包括同一病毒的不同毒株或类型。例如HSV以单纯疱疹病毒1型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)存在，这可通过各自的糖蛋白G(gG)辨别(Bennett et al.,Cecil Textbook of Medicine,20th ed.,p.1770,W.B.Saunders,Philadelphia PA(1996))。在一个具体实施方案中，可以选择病毒抗原使得抗原是相同病毒的不同毒株或类型共有的，或是对病毒的特定毒株或类型(例如HSV-1和HSV-2是有特异性的不同抗原。
要了解，例如可通过使用重组表达与这类抗原或表位结合的CAR的这类免疫细胞，或使用对这类抗原或表位离体敏化的这类免疫细胞，或使用对这类抗原或表位体内敏化的这类免疫细胞，通过本发明的免疫细胞(表达DN形式的免疫细胞)靶向上述病毒抗原或其表位的任一种，以及本领域已知的任一种。在一个具体实施方案中，编码CAR和DN形式的一种或多种核酸被用于转导CD4+和CD8+T细胞两者。在这类实施方案中，将转导的T细胞给予对象应在对象内产生辅助和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答两者，导致持续的抗病毒应答。
要进一步了解，涉及治疗病毒感染的免疫细胞和使用这类细胞治疗病毒感染的方法的本文所述实施方案可以被修改，并且同样适用于治疗被其它病原体(例如是细菌、真菌或原生动物的病原体)的感染。在一个实施方案中，病原体是人类病原体。还要了解的是，例如可通过靶向病原体的细胞表面抗原，靶向病原体的抗原。
如上所述，CAR还含有在表达CAR的免疫细胞或其前体细胞中起作用的信号转导结构域。这类信号转导结构域可来源于例如CDζ或Fc受体γ(参见Sadelain et al.,CancerDiscov.3:388-398(2013))。一般来说，信号转导结构域可在转导的免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞中诱导持久性、运输和/或效应功能(Sharpe et al.,Dis.Model Mech.8:337-350(2015)；Finney et al.,J.Immunol.161:2791-2797(1998)；Krause et al.,J.Exp.Med.188:619-626(1998))。在CDζ或Fc受体γ的情况下，信号转导结构域相当于各个多肽的胞内域，或足以信号转导的胞内域的片段。下面更详细地描述了示例性的信号转导结构域。
本文参照GenBank编号、GI编号和/或SEQ ID NO描述了示例性的多肽。要了解本领域技术人员通过参照序列来源，包括但不限于GenBank(ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和EMBL(embl.org/)，可容易鉴定同源序列。
CD3ζ.在一个非限制性实施方案中，CAR可包含来源于CD3ζ多肽的信号转导结构域，例如来源于CD3ζ的胞内域的信号转导结构域，其可激活或刺激免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞。CD3ζ包含3个免疫-受体-酪氨酸-型-活化-基序(ITAM)，并在抗原被结合后将活化信号传送至细胞，例如淋巴系的细胞例如T细胞。CD3ζ多肽可具有相当于GenBankNo.NP_932170(NP_932170.1，GI:37595565；见下)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CD3ζ多肽具下文提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52-164的氨基酸序列或其对信号转导活性是足够的片段。示例性CAR是Mz，其具有含有包含下文提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52-164的CD3ζ多肽的胞内域。另一个示例性CAR是M28z，其具有含有包含下文提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52-164的CD3ζ多肽的胞内域。再一个示例性CAR是MBBz，其具有含有包含下文提供的CD3ζ多肽序列的氨基酸52-164的CD3ζ多肽的胞内域。又一个示例性CAR是P28z，其具有来源于CD3ζ多肽的胞内域。提及CD3ζ内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-21；胞外结构域，氨基酸22-30；跨膜结构域，氨基酸31-51；胞内域，氨基酸52-164，参见GenBank NP_932170。
要了解“CD3ζ核酸分子”是指编码CD3ζ多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，编码CAR的胞内域所包含的CD3ζ多肽(包括示例性的CAR Mz、M28z或MBBz)的CD3ζ核酸分子，包含以下所列核苷酸序列。
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:2)
在某些非限制性实施方案中，CAR的胞内域可进一步包含至少一个共刺激信号转导结构域。这类共刺激信号转导结构域可提供活化提高的免疫细胞或其前体细胞。共刺激信号转导结构域来源于CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP10多肽、2B4多肽等。之前描述了包含胞内域(其包含含有4-1BB、ICOS或DAP-10的共刺激信号转导区)的CAR(参见U.S.7,446,190，其通过引用并入本文，其还描述了4-1BB、ICOS和DAP-10的代表性序列)。在一些实施方案中，CAR的胞内域可包含含有2个共刺激分子例如CD28和4-1BB(参见Sadelain et al.,Cancer Discov.3(4):388-398(2013))或CD28和OX40，或本文公开的共刺激配体的其它组合的共刺激信号转导区。
CD28.分化簇28(CD28)是为T细胞活化和存活提供共刺激信号的在T细胞上表达的蛋白质。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体。在一个实施方案中，CAR可包含来源于CD28的共刺激信号转导结构域。例如，如本文公开的，CAR可包括来源于CD28的胞内/胞质结构域的至少一部分，例如起共刺激信号转导结构域作用的胞内/胞质结构域(参见图1B)。CD28多肽可具有相当于具有下文提供的GenBank No.P10747(P10747.1，GI:115973)或NP_006130(NP_006130.1，GI:5453611)的序列的氨基酸序列或其片段。如有需要，除胞内域以外的CD28序列可包括在本发明的CAR内。例如，CAR可包含CD28多肽的跨膜。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于CD28的氨基酸180-220的CD28的胞内域的氨基酸序列或其片段。在另一个实施方案中，CAR可具有包含相当于氨基酸153-179的CD28的跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。M28z是示例性的CAR，其包含相当于CD28的胞内域的共刺激信号转导结构域(参见图1B)。M28z还包含来源于CD28的跨膜域(参见图1B)。因此，M28z是包含来自CD28的2个结构域、共刺激信号转导结构域和跨膜结构域的CAR的实例。在一个实施方案中，CAR具有包含CD28的跨膜结构域和胞内域的氨基酸序列并包含CD28的氨基酸153-220。在另一个实施方案中，CAR如M28z CAR所示，并包含CD28的氨基酸117-220。具有CD28的跨膜结构域和胞内域的另一个示例性CAR是P28z(参见图1B)。在一个实施方案中，CAR可包含来源于包含下文提供的CD28多肽的氨基酸153-179的CD28多肽的跨膜域。提及CD28内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-18；胞外结构域，氨基酸19-152；跨膜结构域，氨基酸153-179；胞内域，氨基酸180-220，参见GenBank NP_006130。要了解，如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的CD28的序列可包括在CAR中。
要了解，CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，编码包含跨膜结构域和胞内域例如共刺激信号转导区的M28z的CD28多肽CD28核酸分子包含下列所列核苷酸序列。
ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:4)
4-1BB.4-1BB，亦称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9，可起肿瘤坏死因子(TNF)配体的作用并具有刺激活性。在一个实施方案中，CAR可包含来源于4-1BB的共刺激信号转导结构域。4-1BB多肽可具有含有相当于GenBank No.P41273(P41273.1，GI:728739)或NP_001552(NP_001552.2，GI:5730095)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于氨基酸214-255的4-1BB的胞内域的共刺激结构域或其片段。在另一个实施方案中，CAR可具有相当于氨基酸187-213的4-1BB的跨膜结构域或其片段。示例性的CAR是MBBz，其具有包含4-1BB多肽的胞内域(例如NP_001552的氨基酸214-255，SEQ ID NO:5)(参见图1B)。提及4-1BB内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-17；胞外结构域，氨基酸1-186；跨膜结构域，氨基酸187-213；胞内域，氨基酸214-255，参见GenBank NP_001552。要了解，如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的4-1BB的序列可包括在CAR中。还要了解“4-1BB核酸分子”是指编码4-1BB多肽的多核苷酸。
OX40.OX40，亦称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4前体或CD134，是受体的TNFR超家族的成员。在一个实施方案中，CAR可包含来源于OX40的共刺激信号转导结构域。OX40多肽可具有相当于具有下面提供的GenBank No.P43489(P43489.1，GI:1171933)或NP_003318(NP_003318.1，GI:4507579)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于氨基酸236-277的OX40的胞内域的共刺激结构域或其片段。在另一个实施方案中，CAR可具有包含相当于OX40的氨基酸215-235的OX40的跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。提及OX40内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-28；胞外结构域，氨基酸29-214；跨膜结构域，氨基酸215-235；胞内域，氨基酸236-277，参见GenBank NP_003318。要了解如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的OX40的序列可包括在CAR中。还要了解“OX40核酸分子”是指编码OX40多肽的多核苷酸。
ICOS.诱导型T细胞共刺激物前体(ICOS)，亦称为CD278，是在活化T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子。在一个实施方案中，CAR可包含来源于ICOS的共刺激信号转导结构域。ICOS多肽可具有相当于具有下面提供的GenBank No.NP_036224(NP_036224.1，GI:15029518)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于ICOS的氨基酸162-199的ICOS的胞内域的共刺激结构域。在另一个实施方案中，CAR可具有包含相当于ICOS的氨基酸141-161的ICOS的跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。提及ICOS内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-20；胞外结构域，氨基酸21-140；跨膜结构域，氨基酸141-161；胞内域，氨基酸162-199，参见GenBank NP_036224。要了解如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的ICOS的序列可包括在CAR中。还要了解“ICOS核酸分子”是指编码ICOS多肽的多核苷酸。
DAP10.DAP10，亦称为造血细胞信号转导物，是与造血细胞中的受体大家族有关的信号转导亚基。在一个实施方案中，CAR可包含来源于DAP10的共刺激结构域。DAP10多肽可具有相当于具有下面提供的GenBank No.NP_055081.1(GI:15826850)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于氨基酸70-93的DAP10的胞内域的共刺激结构域或其片段。在另一个实施方案中，CAR可具有相当于氨基酸49-69的DAP10的跨膜结构域或其片段。提及DAP10内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-19；胞外结构域，氨基酸20-48；跨膜结构域，氨基酸49-69；胞内域，氨基酸70-93，参见GenBank NP_055081.1。要了解如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的DAP10的序列可包括在CAR中。还要了解“DAP10核酸分子”是指编码DAP10多肽的多核苷酸。
CAR的胞外结构域可与指导新生蛋白质进入内质网并且随后转移到细胞表面的前导序列或信号肽融合。要了解，一旦含有信号肽的多肽在细胞表面表达，信号肽一般便在多肽在内质网中加工并转移至细胞表面期间被蛋白水解除去。因此，多肽例如CAR一般作为缺乏信号肽的成熟蛋白质在细胞表面表达，而多肽的前体形式包括信号肽。如果CAR要糖基化和/或锚定在细胞膜中，则信号肽或前导序列可能是必需的。信号序列或前导序列是一般存在于新合成的蛋白质的N端、指导其进入分泌途径的肽序列。信号肽与CAR的胞外抗原结合结构域的N端共价连接作为融合蛋白。在一个实施方案中，信号肽含有包含氨基酸MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:9)的CD8多肽。要了解CD8信号肽的使用是示例性的。本领域众所周知的任何合适的信号肽可适用于CAR以在免疫细胞中提供细胞表面表达(参见Gierasch Biochem.28:923-930(1989)；von Heijne,J.Mol.Biol.184(1):99–105(1985))。特别有用的信号肽可来源于在免疫细胞或其前体细胞中天然表达的细胞表面蛋白质，包括本文公开的多肽的任何信号肽。因此，任何合适的信号肽可用来指导CAR在免疫细胞或其前体细胞的细胞表面表达。
在某些非限制性实施方案中，CAR的胞外抗原合结构域可包含连接胞外抗原合结构域的重链可变区和轻链可变区的接头序列或肽接头。在一个非限制性实例中，接头包含具有GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)所列序列的氨基酸。
在某些非限制性实施方案中，CAR还可包含使CAR的结构域彼此连接的间隔区或序列。例如，间隔区可包括在信号肽和抗原结合结构域之间，在抗原结合结构域和跨膜结构域之间，在跨膜结构域和胞内域之间，和/或在胞内域的结构域之间，例如在刺激结构域和共刺激结构域之间。间隔区可足够柔韧以供不同结构域与其它多肽相互作用，例如以供抗原结合结构域具有定向的柔性以利于抗原识别。间隔区可以是例如来自IgG的铰链区、免疫球蛋白的CH2CH3(恒定)区和/或CD3(分化簇3)的部分或适于作为间隔区的一些其它序列。
CAR的跨膜结构域通常包含跨越至少一部分膜的疏水α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。在抗原识别后，受体簇和信号被传送至细胞。在一个实施方案中，CAR的跨膜结构域可来源于在免疫细胞或其前体细胞中天然表达的另一多肽。在一个实施方案中，CAR可具有来源于CD8、CD28、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA或具有跨膜结构域的免疫细胞或其前体细胞中表达的其它多肽的跨膜结构域，包括本文公开的那些。任选，跨膜结构域可来源于不是在免疫细胞或其前体细胞中天然表达的多肽，只要跨膜结构域可在从与CAR结合的抗原转导信号至胞内信号转导和/或共刺激结构域时起作用。要了解按需要，包含多肽的跨膜结构域的多肽的部分可包括多肽的其它序列，例如邻近跨膜结构域N末端或C末端的其它序列或多肽的其它区。
CD8.分化簇8(CD8)是用作T细胞受体(TCR)的共同受体的跨膜糖蛋白。CD8与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，并对I类MHC蛋白有特异性。在一个实施方案中，CAR可包含来源于CD8的跨膜结构域。CD8多肽可具有相当于具有下面提供的GenBank No.NP_001139345.1(GI:225007536)的序列的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于氨基酸183-203的CD8的跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。在一个实施方案中，CAR可包含来源于CD8的跨膜结构域。在一个实施方案中，示例性的CAR是Mz，其具有来源于CD8多肽的跨膜域(参见图1B)。在另一个实施方案中，示例性的CAR是MBBz，其具有来源于CD8多肽的跨膜域(参见图1B)。在一个非限制性实施方案中，CAR可包含来源于包含氨基酸183-203的CD8多肽的跨膜域。另外，CAR可包含含有下面提供的CD8多肽的氨基酸137-182的铰链结构域。在另一个实施方案中，CAR可包含下面提供的CD8多肽的氨基酸137-203。在又一个实施方案中，CAR可包含下面提供的CD8多肽的氨基酸137-209。提及CD8内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-21；胞外结构域，氨基酸22-182；跨膜结构域氨基酸，183-203；胞内域，氨基酸204-235，参见GenBank NP_001139345.1。要了解如有需要，氨基酸183-203的跨膜结构域以外的CD8的其它序列可包括在CAR中。要进一步了解如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的CD8的序列可包括在CAR中。还要了解“CD8核酸分子”是指编码CD8多肽的多核苷酸。
CD4.分化簇4(CD4)，亦称为T细胞表面糖蛋白CD4，是存在于例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞表面的糖蛋白。在一个实施方案中，CAR可包含来源于CD4的跨膜结构域。CD4以不同的同种型存在。要了解，可选择任何同种型以获得所需功能。示例性同种型包括同种型1(NP_000607.1，GI:10835167)、同种型2(NP_001181943.1，GI:303522479)、同种型3(NP_001181944.1，GI:303522485；或NP_001181945.1，GI:303522491；或NP_001181946.1，GI:303522569)等。下面提供一个示例性同种型序列，同种型1。在一个实施方案中，CAR可具有包含相当于氨基酸397-418的CD4的跨膜结构域的氨基酸序列或其片段。提及CD4内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-25；胞外结构域，氨基酸26-396；跨膜结构域氨基酸，397-418；胞内域，氨基酸419-458，参见GenBank NP_000607.1。要了解如有需要，氨基酸397-418的跨膜结构域以外的CD4的其它序列可包括在CAR中。要进一步了解如有需要，比具体描述的结构域较长或较短的CD4的序列可包括在CAR中。还要了解“CD4核酸分子”是指编码CD4多肽的多核苷酸。
如本文的公开的，间皮素CAR举例说明了可靶向细胞的CAR，且导向其它其它抗原的CAR可采用上述类似方法和众所周知的其它其它产生。要了解本文所述多肽的结构域可用于CAR，以有利地提供例如信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、胞内信号转导结构域和/或共刺激结构域等所需功能。例如，可以按需要选择结构域，例如信号肽、跨膜结构域、胞内信号转导结构域或其它结构域，以向本发明的CAR提供特定功能。可能的所需功能可包括但不限于提供信号肽和/或跨膜结构域。
7.3.细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式
按照本发明，是免疫刺激性细胞的免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞，或是免疫抑制性细胞的免疫细胞(例如调节T细胞)经工程改造以表达细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式(DN形式)。
免疫细胞或其前体细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂，是指起抑制或阻止由免疫细胞或其前体细胞引起的免疫应答的分子。在一个实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂，亦称为检查点阻断。
在一个实施方案中，本发明提供表达免疫细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞或调节T细胞，或共表达CAR和免疫细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞或调节T细胞，例如在免疫检查点抑制剂途径中起作用的受体。免疫检查点途径是抑制免疫细胞的免疫应答的抑制途径。该途径递送阴性信号至免疫细胞(例如T细胞)并减弱TCR介导的信号，导致细胞增殖、细胞因子产生和细胞周期进程下降(参见Pardoll,Nat.Rev.12:252-264(2012)；Wu et al.,Int.J.Biol.Sci.8:1420-1430(2012))。免疫检查点抑制剂途径通常包括配体-受体对。示例性的免疫检查点抑制剂途径受体包括例如PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG-3、CD160、TIGIT、LAIR1、2B4等(参见Chen et al.,Nat.Rev.Immunol.13(4):227-242(2013))。这些受体的相应配体包括例如PD-L1(对于PD-1)；PD-L2(对于PD-1)；CD80、CD86(对于CTLA-4)；HVEM(对于BTLA)；半乳凝素-9、HMGB1(对于TIM-3)；MHC II(对于LAG-3)；HVEM(对于CD160)；CD155、CD112、CD113(对于TIGIT)；C1q、胶原(对于LAIR1)；CD48(对于2B4)等(Chen等，同上，2013)。免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞的DN形式的表达为对细胞是固有的检查点抑制剂途径提供抑制。
是细胞-表面受体(例如免疫检查点抑制剂途径受体)的细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式可通过剔除受体的一些部分来产生以防止胞内信号转导，从而抑制免疫检查点途径和免疫细胞(例如T细胞)的持续活化。本发明的DN形式是包含以下的多肽：(a)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中该部分包含配体结合区，和(b)跨膜结构域，其中多肽是免疫检查点抑制剂的显性阴性形式。一般而言，免疫检查点抑制剂途径受体的抑制剂的DN形式保留受体的大部分或全部，使得胞外结构域保持足够的蛋白质相互作用活性以结合其各自的配体。因此，在一个具体实施方案中，编码DN形式的多肽包含免疫检查点抑制剂的基本所有的胞外结构域。要了解，包含“基本所有的”胞外结构域的多肽包括包含完整胞外结构域或其中1个至几个氨基酸从胞外结构域的N端和/或C端缺失(例如从N端和/或C端缺失1、2、3、4或5个氨基酸)的部分胞外结构域的多肽，只要胞外结构域的其余部分保持足够的蛋白质相互作用活性以结合其各自的配体。本发明的DN形式一般还缺乏信号转导结构域的某些部分或全部，例如胞内/胞质结构域，使得DN形式活性降低或对免疫检查点途径中信号转导无活性。虽不受特定机制或理论的束缚，但配体与DN形式的结合减少配体与完整内源受体和/或含信号转导分子的DN形式复合物(包括内源受体)的结合，导致免疫检查点途径的信号转导减弱。
本发明的DN形式一般具有某些功能特征，包括但不限于在免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞的细胞表面上表达的能力、结合其各自的配体的能力和传送免疫检查点途径的胞内信号的能力缺失或降低。本领域的技术人员可通过改造抑制剂获取这类功能特征而容易地产生细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式。在一个实施方案中，构建DN形式以保留细胞介导的免疫应答的抑制剂的胞外结构域或至少胞外结构域的足够部分以保持配体结合活性。在一个示例性的实施方案，可使用细胞介导的免疫应答的抑制剂的胞外结构域，包括但不限于本文的公开的PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG-3、CD160、TIGIT、LAIR1、2B4的胞外结构域，构建DN形式。本领域的技术人员可容易地了解到，不需要保留细胞介导的免疫应答的抑制剂的完整胞外结构域，且可以引入胞外结构域的N端和/或C端的缺失，只要保持配体结合活性。本领域的技术人员根据受体序列分析以鉴定已知提供配体结合活性的蛋白质基序，可容易地确定这类N端和/或C端缺失的适宜性(参见例如ExPASy(expasy.org),尤其PROSITE(prosite.expasy.org))。另外或备选，合适的N端和/或C端缺失可通过将缺失引入多肽和测量对其各自配体的结合活性，以实验为依据容易地确定。因此，本领域的技术人员可容易地确定细胞介导的免疫应答的抑制剂的合适序列以供本发明的DN形式的配体结合活性。
要了解，无论是否以DN形式使用受体的完整胞外结构域还是部分胞外结构域，其它序列都任选地包括在DN形式的胞外结构域中。这类其它序列可来源于DN形式的亲本多肽，或其它序列可来源于不同的多肽。包含来自亲本多肽和不同多肽的序列的这类多肽是天然存在的嵌合多肽。例如，通常包括信号肽或前导序列肽，使得DN形式可在免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞或调节T细胞的细胞表面上表达。要了解，一旦含有信号肽的多肽在细胞表面表达，信号肽一般便在多肽在内质网加工并转移至细胞表面期间被蛋白水解除去。因此，多肽例如DN形式通常在细胞表面上作为缺乏信号肽的成熟蛋白质表达，而多肽的前体形式包括信号肽。信号肽可以是受体的天然存在的信号肽，或者可来源于不同的蛋白质。本文描述了示例性的信号肽，包括本文所述适用于CAR的那些。为了另外提供在细胞表面上表达，DN形式通常可包括供DN形式保留在细胞表面的跨膜结构域。跨膜结构域可以是受体的天然存在的跨膜，或者可来源于不同的蛋白质。在一个具体实施方案中，来源于另一种蛋白质的跨膜域衍生于在免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞或调节T细胞的细胞表面表达的另一种受体。本文描述了示例性的跨膜结构域，包括本文所述适用于CAR的那些。
在免疫检查点途径受体的情况下，通常信号转导结构域驻留在胞内/胞质结构域内。免疫检查点途径受体的信号转导活性通常由细胞表面受体和/或胞内信号转导分子的蛋白质-蛋白质相互作用所介导。在一个实施方案中，DN形式缺乏在传送免疫检查点途径的信号中起作用的完整胞内域或其部分。要了解，不必剔除受体的完整胞内域，只要剔除胞内信号转导结构域的足够部分以抑制或降低来自DN形式的信号转导。另外或备选，可将突变引入胞内信号转导结构域以抑制或降低来自DN形式的信号转导。另外或备选，不含信号转导活性的异源序列可代替受体的胞内信号转导结构域以产生DN形式。本领域的技术人员可容易地了解到，这些和其它众所周知的方法可用来产生本发明的DN形式。
免疫检查点抑制剂的显性阴性形式的一个示例性实施方案是PD-1的显性阴性形式。PD-1的显性阴性形式是细胞介导的免疫应答的抑制剂，包括免疫检查点抑制剂的DN形式的实例。要了解，本文的公开的PD-1DN形式是示例性的。
如本文所述，设计细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式以具有降低或受抑制的胞内信号转导。本发明的DN形式通常基于抑制免疫检查点途径的受体，这起抑制免疫细胞(例如T细胞)活化的功能，例如细胞增殖、细胞因子产生和/或细胞周期进程。本发明的DN形式被设计成除去胞内信号转导结构域或其部分，使得受体的信号转导能力被降低或抑制。DN形式还起抑制内源受体的信号转导的功能。在一个具体实施方案中，被降低或抑制的信号转导克服了检查点阻断，导致免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞的持续信号转导和活化。要了解，DN形式的信号转导活性可被完全敲除或部分敲除，只要与缺乏DN形式相比，活性的部分降低足以提供免疫细胞或其前体细胞活化增强的效果。同样，DN形式不是导致来自内源受体的信号转导完全失活所必须的，但是可以降低足以克服检查点阻断并允许免疫细胞(例如T细胞)或其前体细胞活化的内源受体的活化。本领域的技术人员采用本领域众所周知的测定方法，包括使用体内模型(例如动物模型)的测定法，可容易地测定DN形式对亲本受体的活性的作用，以评价DN形式对DN形式得以在其中表达的免疫细胞的活性的作用，包括例如本文公开的那些测定法。
在使用从患有慢性病毒感染的对象中分离的调节T细胞的情况下，免疫细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂的DN形式(例如PD-1)的表达抑制产生于表达免疫细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂(例如PD-1)的调节T细胞与表达相应配体(例如PD-L1)的免疫刺激T细胞(例如CD8+T细胞)之间相互作用的调节T细胞的抑制活性。在这种情况下，调节T细胞对由配体-表达免疫刺激性细胞介导的免疫应答的抑制活性降低，从而促进针对病毒的免疫应答。
如同用于本发明的CAR一样，尤其当异源序列融合时，任选的接头或间隔区序列可包括DN形式中，例如在信号肽和胞外配体结合结构域之间的接头或间隔区。接头或间隔区还可任选包括在胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间。同样，接头或间隔区可任选包括在跨膜结构域和其余任何胞内域之间。本文描述了这类任选的接头或间隔区。另外，这类接头或间隔区可来源于异源序列。例如如上所述，来源于异源多肽的跨膜域可任选包括在来源于异源多肽的N端和/或C端的其它序列。这类其它序列可起接头或间隔区的功能。
在一个实施方案中，如上所述，DN形式可能缺乏DN形式的跨膜结构域羧基端的任何信号转导结构域(即DN形式可能缺乏胞内信号转导结构域)。
在一个不同的具体实施方案中，本发明的DN形式可任选另包含共刺激信号转导结构域的融合物，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。这类DN形式在本文亦称为“转换受体(switch receptor)”。这类DN形式或转换受体包含细胞的细胞介导的免疫应答的抑制剂(例如免疫检查点抑制剂)胞外区的至少配体结合结构域，所述抑制剂同与免疫刺激分子的共刺激结构域(即胞质信号转导结构域)融合的跨膜结构域融合，因此活性在配体结合时从对细胞免疫活性的抑制转换成对细胞免疫活性的刺激(参见例如Liu et al.,Cancer Res.76:1578-1590(2016))。另包含与共刺激结构域的融合物的DN形式(即转换受体)还在这类构建体中起显性阴性形式的作用，因为免疫检查点抑制剂的信号转导结构域被剔除。在一个实施方案中，另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式在免疫刺激性细胞中表达。在一个实施方案中，另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式在免疫抑制性细胞中表达。在另一个实施方案中，另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式在免疫刺激性细胞中与CAR共表达。在另一个实施方案中，另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式在免疫刺激性细胞中与CAR共表达。
呈DN形式融合多肽的共刺激信号转导结构域可来源于例如受体(例如用于CAR的本文所述共刺激分子)的胞质信号转导结构域，包括但不限于4-1BB多肽、CD28多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP10多肽和2B4多肽。在包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式中，跨膜结构域可来源于共刺激结构域衍生于其中的多肽、DN形式的胞外配体结合结构域衍生于其中的多肽，或它可以是来自与可用来产生CAR或DN形式的跨膜结构域的本文描述类似的另一种多肽的跨膜结构域。
在一个实施方案中，本发明提供重组表达DN形式的免疫细胞(按需要，其可以是免疫刺激性或免疫抑制性的)，其中DN形式另包含共刺激信号转导结构域的融合物，其中共刺激信号转导结构域与DN形式的跨膜结构域的羧基端融合。在本发明的某些实施方案中，本发明的细胞或细胞群重组表达细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中显性阴性形式另包含共刺激信号转导结构域，其中共刺激信号转导结构域与显性阴性形式的跨膜结构域(其进而与含有显性阴性形式的配体结合区的免疫检查点抑制剂的胞外结构域的至少一部分融合)融合。这类细胞任选可共表达缺乏胞内信号转导结构域的显性阴性形式。这类细胞可用来治疗本文公开的病毒感染。本发明提供通过免疫细胞重组表达的转换受体(即另包含共刺激信号转导结构域的DN形式)，所述转换受体包含(i)免疫检查点抑制剂的至少胞外配体结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域。这类重组细胞任选可共表达缺乏胞内信号转导结构域的DN形式。本发明另提供通过免疫细胞重组表达CAR和DN形式两者，所述DN形式另包含共刺激信号转导结构域的融合物(转换受体)，所述DN形式包含(i)免疫检查点抑制剂的至少胞外配体结合结构域，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域。这类细胞任选可共表达缺乏胞内信号转导结构域的DN形式。要了解，在共表达CAR和另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式(转换受体)和任选缺乏胞内信号转导结构域的DN形式的这类免疫细胞中，CAR与待治疗的病毒感染(即病毒感染的相同病毒)的抗原结合。在共表达CAR和包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式的细胞的一个实施方案中，DN形式的共刺激信号转导结构域不同于CAR的共刺激信号转导结构域。在一个具体实施方案中，DN形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的胞内信号转导结构域。在另一个具体实施方案中，在共表达CAR和另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式的免疫细胞中，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的胞内信号转导结构域。在另一个具体实施方案中，本发明提供共表达CAR和另包含与共刺激信号转导结构域的融合物的DN形式及任选共表达缺乏胞内信号转导结构域的DN形式的免疫细胞，其中DN形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的胞内信号转导结构域，CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的胞内信号转导结构域。
下面更详细地描述了免疫检查点抑制剂的示例性DN形式。还预期基本上由所述序列组成的DN形式。
PD-1.程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)是在与其内源巨噬细胞和树突细胞上表达的相应配体PD-L1和PD-L2相遇时，活化T细胞的阴性免疫调节剂。PD-l是268个氨基酸的I型膜蛋白质。PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。蛋白质的结构包含胞外IgV结构域接着跨膜区和胞内尾。胞内尾含有位于基于免疫受体酪氨酸的抑制基序和基于免疫受体酪氨酸的转换基序的两个磷酸化位点。PD-1负调节TCR信号。SHP-1和SHP-2磷酸酶在配体结合时与PD-1的胞质尾结合。PD-L1的增量调节是肿瘤细胞用来逃避宿主免疫系统的一种机制。在临床前和临床试验中，PD-1被拮抗性抗体阻断诱导通过宿主内源免疫系统介导的抗肿瘤反应。
PD-1多肽可具有相当于下面提供的GenBank No.NP_005009.2(GI:167857792)的氨基酸或其片段。提及PD-1的结构域，例如信号肽，氨基酸1-20；胞外结构域，氨基酸21-170；跨膜结构域，氨基酸171-191；胞内域，氨基酸192-288，参见GenBank NP_005009.2。要了解，“PD-1核酸分子”是指编码PD-1多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供呈PD-1显性阴性形式(DN形式)的细胞介导的免疫应答的抑制剂。在一个实施方案中，PD-1DN形式包含PD-1的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，PD-1DN形式包含PD-1的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，PD-1DN形式包含PD-1的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供编码多肽和本发明的PD-1DN形式的核酸。在一个具体实施方案中，PD-1胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，PD-1DN形式是嵌合序列。例如PD-1胞外配体结合结构域可在其N端与任选为异源信号肽(包括本文所述各种信号肽)的信号肽融合。另外，PD-1DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。虽然本文实施例中举例说明的PD-1DN形式包含与PD-1的胞外结构域融合的异源序列，但要了解，PD-1DN形式可只包含PD-1序列。
在一个实施方案中，本发明提供包含PD-1的胞外结构域或其配体结合部分的PD-1DN形式，例如相当于PD-1(GenBank NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的胞外结构域的氨基酸21-170。表达这类PD-1DN形式的细胞在PD-1免疫检查点途径可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，PD-1DN形式是胞内域例如PD-1(GenBank NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸192-288或其部分有缺失的缺失突变体，使得由PD-1介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。下面描述了PD-1的DN形式的其它实施方案。
在一个实施方案中，PD-1DN形式包含含有与CD8的跨膜和铰链结构域融合的PD-1的胞外结构域的氨基酸序列。在一个实施方案中，PD-1DN形式包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸21-165。这类PD-1DN形式包含PD-1的胞外结构域。在另一个实施方案中，本发明提供包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸1-165(前体形式)或氨基酸21-165(成熟形式)的PD-1DN形式。这类DN形式包含PD-1的信号肽氨基酸1-20和胞外结构域氨基酸21-165，而成熟形式缺乏信号肽。在一个实施方案中，PD-1DN形式包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸21-151。在另一个实施方案中，本发明提供包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸1-151(前体形式)或氨基酸21-151(成熟形式)的PD-1DN形式。任选，PD-1DN形式包含始于氨基酸21通过PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸151-165间的氨基酸的胞外配体结合结构域。在另一个实施方案中，PD-1DN形式包含CD8的跨膜结构域，CD8(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸183-203。这类实施方案代表了包含来自不同(异源)多肽的跨膜结构域的嵌合DN形式。如上所述，包含异源结构域例如跨膜结构域的DN形式可任选包括来自异源多肽的其它序列。在这类实施方案中，提供包含来自跨膜结构域的异源多肽N端的其它序列的DN形式。在一个实施方案中，DN形式包含CD8的铰链结构域。在一个具体实施方案中，异源序列包含氨基酸137-182的其它N端序列，或任选限于CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸138或139。在另一个实施方案中，提供包含来自跨膜结构域的异源多肽C端的其它序列的DN形式。在一个具体实施方案中，异源序列包含来自CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸204-209的其它C端序列。在一个实施方案中，PD-1DN形式包含CD8的跨膜结构域氨基酸183-203，任选包含氨基酸137-182(或任选始于氨基酸138或139)的铰链结构域和/或包含氨基酸204-209的其它C端序列。在本发明的一个具体实施方案中，提供包含PD-1序列(NP_005009.2；SEQ ID NO:13)的氨基酸1-165和氨基酸137-209，任选始于CD8序列(NP_001139345.1；SEQ ID NO:11)的氨基酸138或139的PD-1DN形式。
在进一步的具体实施方案中，本发明提供包含下文提供的序列的PD-1DN形式，其中加下划线的序列来源于PD-1，用斜体字的序列来源于CD8。
在其它实施方案中，本发明的DN形式任选包含P2A序列，其供报道分子的任选共表达。P2A是自切割肽序列，其可用于蛋白质序列的双顺反子或多顺反子表达(参见Szymczaket al.,Expert Opin.Biol.Therapy5(5):627-638(2005))。示例性的P2A序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM(SEQ ID NO:15)。在进一步的实施方案中，本发明的DN形式与报道蛋白质共表达。在一个具体实施方案中，报道蛋白质为mCherry荧光蛋白。在一个具体实施方案中，mCherry多肽序列如下文提供的。要了解如本文所述，mCherry只是示例性的，任何所需的报道分子，例如荧光蛋白，都可包括在内作为报道分子。
MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK(SEQ ID NO:16)
在进一步的具体实施方案中，PD-1DN形式作为下文提供的多肽构建体表达，其中加下划线的序列来源于PD-1，用斜体字的序列来源于CD8，P2A序列用双下划线表示，mCherry序列用下划线和斜体字表示。
在一个具体实施方案中，下面提供编码PD-1DNR形式构建体的核酸，其中加下划线的序列编码来源于PD-1DN的氨基酸，用斜体字的序列编码来源于CD8的氨基酸，P2A编码序列用双下划线表示，mCherry编码序列用下划线和斜体字表示，Kozak序列用黑体字与虚线下划线表示，限制位点Age I和Xho I在5ˊ和3ˊ端分别用下划线与点线表示。
CTLA-4.细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA-4)是由活化T细胞表达的抑制性受体，当被其相应配体(分别为CD80和CD86；B7-l和B7-2)占据时，介导活化T细胞抑制或无反应性。在临床前和临床研究两者中，由全身抗体输注所致CTLA-4阻断在临床背景下提高内源抗肿瘤反应，无显著的可预见毒性。CTLA-4含有胞外V结构域、跨膜结构域和胞质尾。表征了编码不同同种型的可变剪接变体。膜结合的同种型起被二硫键互连的同二聚体的作用，而可溶性同种型起单体的作用。胞内域与CD28的类似，因为它没有内在催化活性，并含有一个能够结合PI3K的PP2A和SHP-2的YVKM(SEQ ID NO:29)基序和一个能够结合含SH3的蛋白质的富脯氨酸基序。CTLA-4在抑制T细胞应答中的一个作用似乎是直接通过TCR近侧信号转导蛋白(例如CD3和LAT)的SHP-2和PP2A去磷酸化。CTLA-4还可能与CD28针对CD80/86结合竞争，间接地影响信号转导。还表明CTLA-4与PI3K、CD80、AP2M1和PPP2R5A结合和/或相互作用。
CTLA-4多肽可具有相当于GenBank No.AAH69566.1(GI:46854814)或NP_005205.2(GI:21361212)的氨基酸序列、如下文提供的序列或其片段。提及CTLA-4内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-35；胞外结构域，氨基酸36-161；跨膜结构域，氨基酸162-182；胞内域，氨基酸183-223，参见GenBank NP_005205.2。要了解，“CTLA-4核酸分子”是指编码CTLA-4多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供CTLA-4DN形式。在一个实施方案中，CTLA-4DN形式包含CTLA-4的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，CTLA-4DN形式包含CTLA-4的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，CTLA-4DN形式包含CTLA-4的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的CTLA-4DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，CTLA-4胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，CTLA-4DN形式是嵌合的。例如CTLA-4胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，CTLA-4DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，CTLA-4DN形式可包含CTLA-4的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于CTLA-4(GenBank NP_005205.2；SEQ ID NO:19)的胞外结构域的氨基酸36-161。表达这类CTLA-4DN形式的细胞在CTLA-4免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，CTLA-4DN形式是胞内域例如CTLA-4(GenBank NP_005205.2；SEQ ID NO:19)的氨基酸183-223或其部分有缺失的缺失突变体，使得由CTLA-4介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
BTLA.B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)表达在T细胞活化期间被诱导，且BTLA在Th1细胞但不在Th2细胞中保持表达。BTLA与B7同源物B7H4相互作用。BTLA显示通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)，而不仅仅是细胞表面受体的B7家族相互作用的T细胞抑制。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族，成员14(TNFRSF14)，亦称为疱疹病毒进入介导物(HVEM)的配体。BTLA-HVEM复合物负调节T细胞免疫应答。已表明BTLA活化抑制人CD8+癌症特异性T细胞的功能。BTLA被命名为CD272(分化簇272)。
BTLA多肽可具有相当于GenBank No.AAP44003.1(GI:31880027)或NP_861445.3(GI:145580621)的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及BTLA内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-30；胞外结构域，氨基酸31-157；跨膜结构域，氨基酸15-178；胞内域，氨基酸179-289，参见GenBank NP_861445.3。要了解，“BTLA核酸分子”是指编码BTLA多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供BTLA DN形式。在一个实施方案中，BTLA DN形式包含BTLA的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，BTLA DN形式包含BTLA的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，BTLA DN形式包含BTLA的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的BTLA DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，BTLA胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，BTLA DN形式是嵌合的。例如BTLA胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，BTLA DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，BTLA DN形式可包含BTLA的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于BTLA(GenBank NP_861445.3；SEQ ID NO:20)的胞外结构域的氨基酸31-157。表达这类BTLA DN形式的细胞在BTLA免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，BTLA DN形式是胞内域例如BTLA(GenBank NP_861445.3；SEQ ID NO:20)的氨基酸179-289或其部分有缺失的缺失突变体，使得由BTLA介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
TIM-3.T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)，亦称为肝炎病毒细胞受体2前体，是调节巨噬细胞活化的Th1特异性细胞表面蛋白质。Tim-3是最早被鉴定为产IFN-γ的CD4+T辅助细胞1(Th1)和CD8+T细胞毒性1(Tc1)T细胞上选择性表达的分子。TIM-3具有V型的N端Ig结构域，后面是黏蛋白结构域。
TIM-3多肽可具有相当于GenBank No.NP_116171.3(GI:49574534)的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及TIM-3内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-21；胞外结构域，氨基酸22-202；跨膜结构域，氨基酸203-223；胞内域，氨基酸224-301，参见GenBank NP_116171.3。要了解，“TIM-3核酸分子”是指编码TIM-3多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供TIM-3DN形式。在一个实施方案中，TIM-3DN形式包含TIM-3的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，TIM-3DN形式包含TIM-3的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，TIM-3DN形式包含TIM-3的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的TIM-3DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，TIM-3胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，TIM-3DN形式是嵌合的。例如TIM-3胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，TIM-3DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，TIM-3DN形式可包含TIM-3的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于TIM-3(GenBank NP_116171.3；SEQ ID NO:21)的胞外结构域的氨基酸22-202。表达这类TIM-3DN形式的细胞在免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，TIM-3DN形式是胞内域例如TIM-3(GenBank NP_116171.3；SEQ ID NO:21)的氨基酸224-301或其部分有缺失的缺失突变体，使得由TIM-3介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
LAG-3.淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)是免疫细胞的阴性免疫调节剂。LAG-3属于免疫球蛋白(Ig)超家族，含有4个胞外Ig样结构域。LAG3基因含有8个外显子。序列数据、外显子/内含子结构和染色体位置全都表明LAG-3与CD4的密切关系。LAG-3已被命名为CD223(分化簇223)。
LAG-3多肽可具有序列相当于GenBank No.CAA36243.3(GI:15617341)或NP_002277.4(GI:167614500)的氨基酸、下文提供的序列或其片段。提及LAG-3内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-22；胞外结构域，氨基酸23-450；跨膜结构域，氨基酸451-471；胞内域，氨基酸472-525，参见GenBank NP_002277.4。要了解，“LAG-3核酸分子”是指编码LAG-3多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供LAG-3DN形式。在一个实施方案中，LAG-3DN形式包含LAG-3的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，LAG-3DN形式包含LAG-3的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，LAG-3DN形式包含LAG-3的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的LAG-3DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，LAG-3胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，LAG-3DN形式是嵌合的。例如LAG-3胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，LAG-3DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，LAG-3DN形式可包含LAG-3的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于LAG-3(GenBank NP_002277.4；SEQ ID NO:22)的胞外结构域的氨基酸23-450。表达这类LAG-3DN形式的细胞在LAG-3免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，LAG-3DN形式是胞内域例如LAG-3(GenBankNP_002277.4；SEQ ID NO:22)的氨基酸472-525或其部分有缺失的缺失突变体，使得由LAG-3介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
TIGIT.具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)是抑制T细胞活化的细胞表面蛋白质。它属于在其N端Ig结构域都具有3个保守序列基序的免疫球蛋白(Ig)蛋白质的脊髓灰质炎病毒受体(PVR)家族。TIGIT多肽可具有相当于GenBank No.NP_776160.2(GI:256600228)的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及TIGIT内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-21；胞外结构域，氨基酸22-141；跨膜结构域，氨基酸142-162；胞内域，氨基酸163-244，参见GenBank NP_776160.2。要了解，“TIGIT核酸分子”是指编码TIGIT多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供TIGIT DN形式。在一个实施方案中，TIGIT DN形式包含TIGIT的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，TIGIT DN形式包含TIGIT的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，TIGIT DN形式包含TIGIT的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的TIGIT DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，TIGIT胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，TIGIT DN形式是嵌合的。例如TIGIT胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，TIGIT DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，TIGIT DN形式可包含TIGIT的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于TIGIT(GenBank NP_776160.2；SEQ ID NO:23)的胞外结构域的氨基酸22-141。表达这类TIGIT DN形式的细胞在TIGIT免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，TIGIT DN形式是胞内域例如TIGIT(GenBank NP_776160.2；SEQ ID NO:23)的氨基酸163-244或其部分有缺失的缺失突变体，使得由TIGIT介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
LAIR1.白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)是对天然杀伤(NK)细胞、B-细胞和T细胞的细胞溶解功能起组成型负调节作用的抑制性受体。LAIR以不同同种型的存在。要了解，可选择任何同种型以实现所需功能。示例性的同种型包括同种型a(NP_002278.2，GI:612407859)、同种型b(NP_068352.2，GI:612407861)、同种型c(NP_001275952.2，GI:612407867)、同种型e(NP_001275954.2，GI:612407869)、同种型f(NP_001275955.2，GI:612407863)、同种型g(NP_001275956.2，GI:612407865)等。下面提供一种示例性同种型序列，同种型a。在一个实施方案中，LAIR1多肽可具有相当于NP_002278.2的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及LAIR1内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-21；胞外结构域，氨基酸22-165；跨膜结构域，氨基酸166-186；胞内域，氨基酸187-287，参见GenBank NP_002278.2。要了解，“LAIR1核酸分子”是指编码LAIR1多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供LAIR1DN形式。在一个实施方案中，LAIR1DN形式包含LAIR1的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，LAIR1DN形式包含LAIR1的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，LAIR1DN形式包含LAIR1的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的LAIR1DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，LAIR1胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，LAIR1DN形式是嵌合的。例如LAIR1胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，LAIR1DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，LAIR1DN形式可包含LAIR1的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于LAIR1(GenBank NP_002278.2；SEQ ID NO:24)的胞外结构域的氨基酸22-165。表达这类LAIR1DN形式的细胞在LAIR1免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，LAIR1DN形式是胞内域例如LAIR1(GenBankNP_002278.2；SEQ ID NO:24)的氨基酸187-287或其部分有缺失的缺失突变体，使得由LAIR1介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
2B4.自然杀伤细胞受体2B4(2B4)介导NK细胞和T细胞亚类上的非MHC限制性细胞杀伤。2B4-S同种型被认为是激活性受体，2B4-L同种型被认为是免疫细胞的负免疫调节剂。2B4在结合其高亲和力配体CD48时被占用。2B4含有基于酪氨酸的转换基序，一种允许蛋白质与各种磷酸酶缔合的分子转换。2B4已被命名为CD244(分化簇244)。
2B4多肽可具有相当于GenBank No.NP_001160135.1(GI:262263435)的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及2B4内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-18；胞外结构域，氨基酸19-229；跨膜结构域，氨基酸230-250；胞内域，氨基酸251-370，参见GenBank NP_001160135.1。要了解，“2B4核酸分子”是指编码2B4多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供2B4DN形式。在一个实施方案中，2B4DN形式包含2B4的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，2B4DN形式包含2B4的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，2B4DN形式包含2B4的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的2B4DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，2B4胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，2B4DN形式是嵌合的。例如2B4胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，2B4DN形式可包含任选为异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，2B4DN形式可包含2B4的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于2B4(GenBank NP_001160135.1；SEQ ID NO:25)的胞外结构域的氨基酸19-229。表达这类2B4DN形式的细胞在2B4免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，2B4DN形式是胞内域例如2B4(GenBank NP_001160135.1；SEQ ID NO:25)的氨基酸251-370或其部分有缺失的缺失突变体，使得由2B4介导的免疫检查点途径的胞内信号转导被降低或抑制。
CD160.CD160是糖基磷脂酰肌醇锚定分子，含有与HVEM结合并对作为共同抑制性受体对T细胞起作用的单一IgV样结构域。CD160多肽可具有相当于GenBank NP_008984.1(GI:5901910)的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及CD160内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-26；胞外结构域，氨基酸27-159，参见GenBank NP_008984.1。要了解，“CD160核酸分子”是指编码CD160多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供CD160DN形式。在一个实施方案中，CD160DN形式包含CD160的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，CD160DN形式包含CD160的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，CD160DN形式包含CD160的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的CD160DN形式的编码多肽和核酸。在一个具体实施方案中，CD160胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，CD160DN形式是嵌合的。例如CD160胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，CD160DN形式可包含是异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
在本发明的一个实施方案中，CD160DN形式可包含CD160的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于CD160(GenBank NP_008984.1；SEQ ID NO:26)的胞外结构域的氨基酸27-159。表达这类CD160DN形式的细胞在免疫检查点途径中可能缺乏信号转导的能力或信号转导的能力降低。在一个实施方案中，CD160DN形式包含CD160的胞外结构域或其配体结合部分和来源于异源多肽的跨膜域，包括但不限于本文所述跨膜结构域的任一种。在一个非限制性实施方案中，CD160DN形式包含CD8的跨膜结构域。在表达CD160DN形式的细胞中，由CD160介导的免疫检查点途径的胞内信号转导将被降低或抑制。
TGF-β受体2型.TGF-β受体2型与TGF-β和I型受体二聚体结合与配体形成杂四聚体复合物。TGF-β受体2型多肽可具有相当于GenBank No.NP_001020018.1(GI:67782326)的氨基酸序列、下文提供的序列或其片段。提及TGF-β受体2型内的结构域，例如信号肽，氨基酸1-22；胞外结构域，氨基酸23-191；跨膜结构域，氨基酸192-212；胞内域，氨基酸213-592，参见GenBank NP_001020018.1(另参见UniProtKB-P37173中的注释)。要了解，“TGF-β受体2型核酸分子”是指编码TGF-β受体2型多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供TGFβ受体DN形式。在一个实施方案中，TGFβ受体DN形式包含TGFβ受体的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，TGFβ受体DN形式包含TGFβ受体的胞外配体结合结构域和跨膜结构域(例如成熟形式)。在另一个实施方案中，TGFβ受体DN形式包含TGFβ受体的胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号肽(例如前体形式)。本发明还提供本发明的TGF-βDN形式的编码多肽和核酸受体。在一个具体实施方案中，TGFβ受体胞外配体结合结构域与一个或多个异源多肽序列融合，即，TGFβ受体DN形式是嵌合的。例如TGFβ受体胞外配体结合结构域在其N端与任选是异源信号肽的信号肽，包括本文所述各种信号肽融合。另外，TGFβ受体DN形式可包含是异源跨膜结构域(包括本文所述各种跨膜结构域的任一种)的跨膜结构域。
之前描述了TGFβ受体DN形式(参见例如Bottinger et al.,EMBO J.16:2621-2633(1997)，描述了包含TGFβ受体胞外和跨膜结构域的DN形式；Foster et al.,J.Immunother.31:500-505(2008)；Bollard et al.,Blood99:3179-3187(2002)；Wieseret al.,Mol.Cell.Biol.13:7239-7247(1993))。在本发明的一个实施方案中，TGFβ受体DN形式可包含TGFβ受体的胞外结构域或其配体结合部分，例如相当于TGFβ受体(GenBank NP_001020018.1，SEQ ID NO:27)的胞外结构域的氨基酸23-191。表达这类TGFβ受体DN形式的细胞在细胞中缺乏转导信号的能力或转导信号的能力降低。在一个实施方案中，TGFβ受体DN形式是胞内域例如TGFβ受体(GenBank NP_001020018.1，SEQ ID NO:27)的氨基酸213-592或其部分有缺失的缺失突变体，使得由TGFβ受体介导的胞内信号转导被降低或抑制(另参见Bottinger et al.,EMBO J.16:2621-2633(1997)；Foster et al.,J.Immunother.31:500-505(2008)；Bollard et al.,Blood 99:3179-3187(2002)；Wieser et al.,Mol.Cell.Biol.13:7239-7247(1993))。
要了解，任选细胞介导的免疫应答的抑制剂，例如免疫检查点抑制剂的第二DN形式，可在本发明的细胞中表达。在这种情况下，可能需要在相同细胞中抑制不止一种细胞介导的免疫应答。因此，细胞可表达两个或更多个DN形式，其各自被导向不同细胞介导的免疫应答的抑制剂，包括上文描述的那些。例如，按需要，PD-1的DN形式可在细胞中与TGF-β受体的DN形式共表达，PD-1的DN形式可与CTLA-4的DN形式共表达，CTLA-4DN形式可与TGF-β的DN形式共表达等，包括上述DN形式任一种的组合。
在一个具体实施方案中，编码DN形式的核酸用来转导CD4+和CD8+T细胞两者。在这类实施方案中，将转导的T细胞给予对象应在对象中产生辅助和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答两者，导致持续的抗病毒应答。
7.4.治疗方法
本发明还涉及使用本发明的细胞或包含所述细胞的药物组合物和药学上可接受的载体治疗病毒感染的方法。在一个实施方案中，所述方法可包括给予是表达病毒抗原结合CAR和细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式的免疫刺激性细胞或其前体细胞的免疫细胞。选择病毒抗原以靶向对象的病毒感染。在另一个实施方案中，所述方法可包括给予病毒-抗原特异性免疫细胞，例如识别且对病毒抗原敏感的T细胞，其中细胞重组表达细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式(且可以但不必表达病毒抗原结合CAR)。在另一个实施方案中，所述方法可包括给予是免疫抑制性细胞的免疫细胞(例如调节T细胞)，尤其从患有慢性病毒感染的对象中分离的调节T细胞，其中所述细胞重组表达细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式。
本发明的方法可用来治疗病毒感染。在一个具体实施方案中，病毒感染可以是但不限于被HIV(例如HIV-1和/或HIV-2)、HBV或HCV感染。本发明的方法可用来治疗持续病毒感染，例如潜在性感染、慢性感染或慢感染，例如被HIV、HBV或HCV持续病毒感染。
病毒特异性免疫刺激性细胞的持续活化。在一个实施方案中，本发明提供治疗病毒感染的方法，所述方法包括将是病毒特异性的和表达细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式的本发明的免疫细胞，尤其免疫刺激性细胞或其前体细胞给予患者。在一个具体实施方案中，通过表达与病毒抗原结合的CAR使免疫刺激性细胞为病毒特异性的。在一个具体实施方案中，将是病毒特异性的免疫刺激性细胞从患有病毒感染的对象中分离。在一个具体实施方案中，病毒特异性免疫刺激性细胞是识别且对病毒抗原敏感的T细胞。在一个具体实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一个具体实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是PD-1。
所述方法可用来治疗病毒感染。这类病毒感染包括但不限于被HIV、HBV或HCV感染。本发明的方法可用来减少或消除病毒载量或持续病毒感染，例如慢性、潜在性或慢病毒感染，或防止或减轻复发的严重程度或复发性病毒感染。
促进病毒特异性记忆细胞。在一个实施方案中，本发明提供治疗病毒感染的方法，所述方法包括将是病毒特异性的和表达细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式的本发明的免疫细胞，尤其免疫刺激性细胞或其前体细胞给予患者。在这类实施方案中，DN形式的表达可促进病毒特异性记忆细胞的产生。在一个具体实施方案中，通过表达与病毒抗原结合的CAR使免疫刺激性细胞为病毒特异性的。在一个具体实施方案中，将是病毒特异性的免疫刺激性细胞从患有病毒感染的对象中分离。在一个具体实施方案中，病毒特异性免疫刺激性细胞是识别且对病毒抗原敏感的T细胞。在一个具体实施方案中，T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一个具体实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是PD-1。
所述方法可用来治疗病毒感染。这类病毒感染包括但不限于被HBV、HCV或HIV感染。本发明的方法可用来通过促进病毒特异性记忆细胞的产生，减少或消除病毒载量或持续病毒感染，例如慢性、潜在性或慢病毒感染，或防止或减轻复发的严重程度或复发性病毒感染。
抑制免疫抑制性细胞的免疫抑制活性。在一个实施方案中，本发明提供治疗病毒感染的方法，所述方法包括将是免疫抑制性细胞，尤其调节T细胞，且表达细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式的免疫细胞给予患者。在这类实施方案中，调节T细胞可从对象，尤其患有慢性病毒感染的对象中分离。调节T细胞中DN形式的表达可用来抑制调节T细胞对免疫刺激性细胞的抑制作用，尤其抑制与因调节T细胞所致细胞介导的免疫应答的抑制剂的表达有关的作用。在一个实施方案中，抑制作用的抑制促进由T细胞，尤其CD8+T细胞介导的免疫应答。在一个具体实施方案中，细胞介导的免疫应答的抑制剂是PD-1。在一个具体实施方案中，抑制作用的抑制促进表达PD-L1的且被PD-1-表达调节T细胞抑制的T细胞，尤其CD8+T细胞介导的免疫应答。
所述方法可用来治疗病毒感染。这类病毒感染包括但不限于被HCV、HBV或HIV(例如HIV-1和/或HIV-2)感染。本发明的方法可用来减少或消除病毒载量或持续病毒感染，例如慢性、潜在性或慢病毒感染，或防止或减轻复发的严重程度或复发性病毒感染。虽无意受机制的限制，但所述方法抑制由调节T细胞所致免疫抑制，其中抑制由细胞介导的免疫应答的抑制剂(例如PD-1)介导。在一个具体实施方案中，调节T细胞从患有慢性病毒感染(例如患有HCV、HBV或HIV)的对象中分离，然后经遗传改造以表达DN形式。例如细胞可从缓解和不显示急性感染的病征或症状的对象中收获。在一个具体实施方案中，所述方法可用来治疗慢性感染并防止复发成为活动性感染。
剂量和给药。在本发明的方法中，把本发明的免疫细胞给予需要治疗的对象或患者。对象或患者可以是哺乳动物，尤其人。优选，对象或患者是人。人可以是儿童或成人。
对于治疗，给予的量是有效产生所需作用的量。有效量或治疗有效量是在治疗时足以提供有益的或所需的临床效果的量。有效量可以单次给药或系列给药(一个或多个剂量)提供。有效量可以推注或通过连续灌注提供。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展，或以别的方式减少疾病的病理后果的量。有效量可由医生针对特定对象确定。在确定合适的剂量以达到有效量时，通常考虑若干因素。这些因素包括对象的年龄、性别和体重、接受治疗的病况、病况的严重程度及要给予的本发明细胞的形式和有效浓度
本发明的细胞一般基于细胞/千克(细胞/kg)向其给予细胞的对象的体重的剂量给予。通常根据给药方式和部位，细胞剂量的范围为约104-约1010个细胞/kg体重，例如约105-约109、约105-约108、约105-约107或约105-106。一般来说，在全身给药的情况下，使用比局部给药高的剂量，其中在病毒感染部位或病毒感染的细胞或组织中给予本发明的免疫细胞。示例性剂量范围包括但不限于1x104-1x108、2x104-1x108、3x104-1x108、4x104-1x108、5x104-1x108、6x104-1x108、7x104-1x108、8x104-1x108、9x104-1x108、1x105-1x108，例如1x105-9x107、1x105-8x107、1x105-7x107、1x105-6x107、1x105-5x107、1x105-4x107、1x105-3x107、1x105-2x107、1x105-1x107、1x105-9x106、1x105-8x106、1x105-7x106、1x105-6x106、1x105-5x106、1x105-4x106、1x105-3x106、1x105-2x106、1x105-1x106、2x105-9x107、2x105-8x107、2x105-7x107、2x105-6x107、2x105-5x107、2x105-4x107、2x105-3x107、2x105-2x107、2x105-1x107、2x105-9x106、2x105-8x106、2x105-7x106、2x105-6x106、2x105-5x106、2x105-4x106、3x105-3x106个细胞/kg等。这类剂量范围对于局部给药可能特别有用。在一个具体实施方案中，细胞以1x105-1x108，例如1x105-1x107、1x105-1x106、1x106-1x108、1x106-1x107、1x107-1x108、1x105-5x106、1x105-3x106或3x105-3x106个细胞/kg的剂量提供用于局部给药。示例性的剂量范围还可包括但不限于5x105-1x108，例如6x105-1x108、7x105-1x108、8x105-1x108、9x105-1x108、1x106-1x108、1x106-9x107、1x106-8x107、1x106-7x107、1x106-6x107、1x106-5x107、1x106-4x107、1x106-3x107个细胞/kg等。这类剂量可能对全身给药特别有用。在一个具体实施方案中，细胞以1x106-3x107个细胞/kg的剂量提供用于全身给药。示例性的细胞剂量包括但不限于1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109等的剂量，范围为约104-约1010个细胞/kg。另外，还可调整剂量以说明是否给予单剂量或是否给予多剂量。可被视为有效剂量的精确确定可基于对各对象是独特的因素，如上所述，包括他们的体格大小、年龄、性别、体重和特定对象的病况。本领域技术人员可根据本文的公开内容和本领域的知识容易地确定剂量。
在一个具体实施方案中，人类给药的剂量的范围为1x105-1x108个细胞/kg人的体重。
本发明的细胞可通过本领域已知的任何方法给予，包括但不限于胸膜给药、静脉内给药、皮下给药、结节内给药、肝内给药、鞘内给药、胸膜内给药、腹膜内给药、颅内给药、气管内给药、关节内给药、子宫内给药、眼内给药、鼻内给药、脊柱内给药、硬膜外给药、肌腱附着部位直接给药和向胸腺直接给药。在一个实施方案中，可采用众所周知的方法将本发明的细胞局部递送至所需部位，包括但不限于肝或主动脉泵；四肢、肺或肝灌注；在门静脉中；通过静脉分流；所需部位附近的腔中或静脉中等，使得本发明的细胞被递送至病毒感染或其中病毒感染的细胞或组织发生的部位，例如细胞可被递送至其中潜在性或慢性病毒感染发生的区域或组织。在另一个实施方案中，可全身给予本发明的细胞。在一个优选的实施方案中，将细胞局部给予所需部位。本领域技术人员可根据待治疗的病毒感染的类型，选择合适的给药方式。细胞可通过注射或导管导入。在一个实施方案中，通过静脉内输注给予细胞。任选，可在给予细胞之前、期间或之后将增殖剂和/或分化剂给予对象以体内增加本发明细胞的产生。
本发明细胞的增殖一般在给予对象之前离体进行，且可能是在给予对象之后体内所需的(参见Kaiser et al.,Cancer Gene Therapy 22:72-78(2015))。细胞增殖应伴随细胞存活以允许细胞增殖和持久性。可采用本领域已知的任何方法，例如Lee et al.,CancerRes.71:2871-2881(2011)所描述的，进行细胞分离和/或扩增。
本发明的方法可进一步包括与本发明的细胞组合或用本发明的细胞治疗之前、期间或之后的辅助疗法。因此，本发明的细胞治疗方法可与给予本发明的细胞相容的用于治疗特定病毒感染的其它标准医护和/或疗法一起使用。
任选，给予本发明的细胞的方法可另包括组合疗法，其包括宿主的免疫调节以促进所给予的本发明的细胞的疗效。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法可进一步包括给予至少一种免疫调节剂。免疫调节剂的非限制性实例包括当给予免疫刺激性细胞时的免疫刺激剂，或当给予免疫抑制性细胞时的免疫抑制剂。
在一个实施方案中，表达本文公开的缺乏胞内信号转导结构域的DN形式的、或表达这类DN形式和CAR的本发明的免疫细胞可与共表达CAR和转换受体(即另包含共刺激信号转导结构域的DN形式，其中共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端)的免疫细胞共同给予。在与表达不含胞内信号转导结构域(且因此缺乏共刺激结构域)的DN形式(即不是转换受体)的免疫细胞共同给予的、共表达CAR和转换受体的这类免疫细胞中，CAR与待治疗的相同病毒感染(即病毒感染的相同病毒)的抗原结合。在另一个实施方案中，可将转换受体转导至其中转导了缺乏胞内信号转导结构域的DN形式和CAR的相同细胞中，使得细胞重组表达所有3种构建体。或者和优选，将转换受体转导至其中转导了CAR而非DN形式的细胞中，使得产生表达转换受体和CAR两者的细胞，这可用于与表达DN形式，或CAR和DN形式两者，而非表达转换受体的细胞的组合疗法中。在这种情况下，将两种细胞类型，表达缺乏胞内信号转导结构域的DN形式的细胞和表达CAR和转换受体的细胞，或表达CAR和DN形式的细胞和表达CAR和转换受体的细胞给予对象。一般而言，两种细胞类型同时给予，但也可彼此序贯给予，例如按需要在1或2小时内，或在1或2天内，或在同一天。在一个具体实施方案中，CAR的共刺激信号转导结构域不同于在相同细胞中表达的转换受体的共刺激信号转导结构域。这可导致同一细胞中存在两个共刺激信号转导结构域和针对免疫细胞疗法的细胞的功效提高。在其中认为所给予的免疫细胞在待治疗的对象中将充分增殖使得不需要给予额外剂量的细胞的情况下，可能在开始免疫细胞疗法时适于给予本发明的免疫细胞。任选按需要，可不止一次给予本发明的免疫细胞，包括任选表达转换受体的免疫细胞。
给予免疫调节剂或表达CAR和转换受体的细胞，与表达缺乏胞内信号转导结构域的DN形式的本发明的免疫细胞的组合疗法，可与给予本发明的免疫细胞同时发生，例如在开始免疫细胞疗法时，或可按需要在免疫细胞疗法的进程中的任何时间相续发生。本领域技术人员根据待治疗的对象的需要，可容易地确定组合疗法中给予本发明的细胞和免疫调节剂，或表达CAR和转换受体的细胞的合适的方案，包括待用于组合疗法的免疫调节剂的时机和剂量。
7.5.药物组合物
本发明另提供包含本发明的细胞的药物组合物。药物组合物包含有效量的本发明的细胞和药学上可接受的载体。本发明的细胞和包含细胞的组合物可方便地以无菌液体制剂提供，例如通常含细胞悬液的等渗水溶液，或任选作为乳液、分散体等，其通常被缓冲至所选的pH。组合物可包含适于细胞的完整性和活力并用于给予细胞组合物的载体，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水等。
无菌可注射溶液可以通过以下方法制备：将用于本发明的细胞与不同量的其它成份(按需要)掺入适量的合适溶剂中。这些组合物可包括适于与细胞组合物一起使用并适于给予对象(例如人)的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。用于提供细胞组合物的合适的缓冲剂是本领域众所周知的。所用的任何溶媒、稀释剂或添加剂与保存本发明细胞的完整性和活力相容。
组合物通常将是等渗的，即，它们具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明的细胞组合物所需的等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的作用剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠对含有钠离子的缓冲液是特别优选的。一种特别有用的缓冲液是盐水，例如生理盐水。本领域技术人员应认识到，组合物的组分应选择为化学惰性的，且将不会影响本发明的细胞的活力或功效，对于给予对象(例如人)将是相容的。技术人员可容易地确定本发明的方法中待给予组合物中的细胞和任选添加剂、溶媒和/或载体的量。
本发明的细胞可以在任何生理上可接受的溶媒中给予。本文描述了用于给药的合适剂量。包含本发明的细胞的细胞群可包含纯化的细胞群。本领域的技术人员可采用本文描述的各种众所周知的方法容易地测定细胞群中细胞的百分比。包含本发明的遗传修饰的细胞的细胞群的纯度范围可为约约50％-约55％、约55％-约60％、约65％-约70％、约70％-约75％、约75％-约80％、约80％-约85％、约85％-约90％、约90％-约95％或约95％-约100％。本领域技术人员可容易地调整剂量；例如，纯度降低可能需要增加剂量。
本发明还提供用于制备本发明的细胞的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含一种或多种载体，用于产生表达DN形式或共表达CAR和细胞介导的免疫应答抑制剂的DN形式的遗传改造的免疫细胞，例如T细胞或调节T细胞。试剂盒可用来产生待给予相容对象的来自来源于对象的自体细胞或非自体细胞的遗传改造的免疫细胞。在另一个实施方案中，试剂盒可包含本发明的细胞，例如自体的或非自体细胞以给予对象。在具体的实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含本发明的免疫细胞。
应当理解，在本文提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明各种实施方案的活性的修饰。因此，以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
8.实施例
本实施例描述了表达CAR和显性阴性PD-1突变体的T细胞的构建和应用。虽然本实施例涉及导向癌症抗原而非病毒抗原的CD4+T细胞和CD8+T细胞的应用，但它描述了可应用于本发明的方法。此外，下文所述结果(虽然用CD4+T细胞和CD8+T细胞)，表明PD-1的显性阴性形式可起显性阴性的作用，并可保持表达PD-1的显性阴性形式的T细胞的活性。
8.1.方法和规程
实验规程经Institutional Animal Care and Use Committee of MemorialSloan Kettering Cancer Center(MSKCC)批准。各实验使用不同的供体T细胞进行多次。为了避免混淆变量—例如由转导效率、供体相关变化性和E:T比率所致差异—数据使用代表性实验表示，样品重复超过3个。
细胞系.将MSTO-211H人胸膜间皮瘤细胞(ATCC，Manassas，VA)用反转录病毒转导以表达GFP和萤火虫萤光素酶融合蛋白(MSTO GFP-ffLuc+)。然后将这些细胞用亚克隆至SFG反转录病毒载体的人MSLN变体1转导以产生MSTO MSLN+GFP-ffLuc+。同样，将A549细胞和3T3鼠成纤维细胞只用人MSLN变体1转导以产生A549MSLN+和3T3MSLN+细胞系。也将3T3细胞用PD-L1共转导以产生3T3MSLN+PDL1+细胞。
γ-反转录病毒载体构建和病毒产生。为了产生MSLN特异性CAR，如前所述(Zhonget al.,Mol.Ther.18(2):413-420(2010))，对编码对与人CD8前导序列结构域和CD8/CD3ζ、CD28/CD3ζ或CD8/4-1BB/CD3ζ结构域连接的MSLN(由D.Dimitrov,National CancerInstitute at Frederick提供)(Feng et al.,Mol.Cancer Ther.8(5):1113-1118(2009))有特异性的完整人scFv m912的cDNA进行工程改造。使用之前表征的PSMA打靶scFv(Gadeet al.,Cancer Res.65(19):9080-9088(2005))，类似地产生对照PSMA特异性CAR。对于PD-1DNR的构建，使用商用基因合成编码与CD8跨膜和铰链结构域融合的PD-1受体的胞外部分(氨基酸1-151)。将CAR序列插入SFGγ-反转录病毒载体(由I.Riviere,MSKCC提供)，并与P2A序列连接以诱导LNGFR报道分子(截短的低亲和力神经生长因子受体)的共表达，在PD-1DNR的情况下，为mCherry荧光蛋白报道分子(Markley et al.,Blood 115(17):3508-3519(2010)；Papapetrou et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(31):12759-12764(2009))。然后如前所述，将CAR和PD-1DNR编码质粒转染至293T H29包装细胞系以产生反转录病毒(Hollyman et al.,J.Immunother.32(2):169-180(2009))。
T细胞分离、基因转移和CD4/CD8分离。根据机构评审委员会核准方案的条款，从健康志愿者供体血液中分离外周血白细胞。外周血单核细胞(PBMC)在Lymphoprep(Stem CellTechnology，Vancouver，Canada)上通过低密度离心分离，并用植物凝集素(2μg/mL；Remel，Lenexa，KS)激活。分离后2天，将PBMC用编码CAR和PD-1DNR的293T RD114生产性反转录病毒颗粒转导，在用retronectin(15μg/mL；r-纤连蛋白，Takara，Tokyo，Japan)包被的板上以3000rpm旋转接种1小时。1天后，将转导的PBMC保持在IL-2(20UI/mL；Novartis，Basel，Switzerland)中。通过流式细胞术分析测定转导效率。纯的CD4+和CD8+CAR+T细胞或mCherry阳性PD-1DNR-表达和mCherry阳性EV-表达CAR+T细胞群体通过流式细胞型分选获得(BD Aria Sorter；BD Biosciences，San Jose，CA)。
流式细胞术.使用藻红蛋白-或别藻蓝蛋白缀合的抗人MSLN大鼠IgG2a(R&DSystems,Minneapolis,MN)检测人MSLN表达。使用下列抗体分析肿瘤细胞上共刺激或抑制性蛋白质的表达：4-1BBL(PE，克隆5F4；BioLegend，San Diego，CA)、MHC HLA-DR(PE，克隆L203；R&D Systems)、PD-L1(APC，克隆MIH1；eBioscience，San Diego，CA)、PD-L2(APC，克隆MIH18；eBioscience)和半乳凝素-9(APC，克隆9M13；BioLegend)。T细胞表型和转导效率用针对CD3、CD4、CD8和CD69m LNGFR的单克隆抗体测定。T细胞抑制性受体的表达使用PD1(APC，eBioJIU5；eBioscience)、TIM-3(PE，克隆344823；R&D Systems)和Lag-3(PE，克隆C9B7W；BioLegend)分析。细胞染色使用BD LSRII流式细胞仪(BD，Franklin Lakes，NJ)和FlowJo分析软件(FlowJo，Ashland，OR)分析。
T细胞功能测定法.如前所述，通过标准51Cr释放测定法测定用CAR或载体对照转导的T细胞的细胞毒性(McCoy et al.,National Cancer Institute Monograph 37:59-67(1973))。为了进行萤光素酶活性测定，将表达MSLN和萤火虫萤光素酶的CAR+T细胞和MSTO-211H细胞以不同的E:T比率孵育18小时。肿瘤细胞数量在加入100μL D-萤光素(15mg/mL)/孔后，使用IVIS 100/lumina II，通过BLI测定，并与肿瘤细胞单独发出的信号进行比较。在将效应细胞和受照射的MSTO-211H MSLN肿瘤细胞在24孔板中以5:1的比率孵育18小时后，进行CD107a和胞内染色。对于CD107a测定，在刺激时加入5μL CD107a-PeCy7抗体(BDBiosciences，San Jose，CA)和Golgi STOP(4μL/6mL；BD Biosciences)。对于胞内染色，在刺激时加入Golgi Plug(1μL/1mL；BD Biosciences)。在孵育后，按照生产商说明书针对CD4、CD8、LNGFR和CD3标志物对效应细胞染色，然后固定并透化(Cytofix/Cytoperm Kit；BDBiosciences)。胞内细胞因子的染色使用粒酶B-APC、穿孔蛋白-PE和IFN-γ-FITC抗体(BDBiosciences)进行。
通过将3×104-5×103个T细胞与靶T细胞以1:1-5:1比率在200μL培养基中共同培养，在96孔圆底板一式三份进行细胞因子释放测定法。在共同培养6-24小时后，收集上清液。按照生产商说明书，使用多重微珠人细胞因子检测试剂盒测定细胞因子水平(Millipore，Darmstadt，Germany)。
为了分析T细胞的增殖能力，将1×106个CAR+T细胞用受照射的MSTO-211H或3T3细胞在有或没有MSLN表达(在3T3的情况下，在有或没有PD-L1时)刺激。在没有外源IL-2时进行增殖测定法。每7天对细胞计数，然后用照射的靶T细胞覆盖用于反复刺激。针对各T细胞群，对CAR+T细胞数与时间作图。
原位胸膜间皮瘤动物模型和离体实验。为了开发胸膜间皮瘤的原位小鼠模型，使用4-6周龄的雌性NOD/SCIDγ小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)。所有步骤根据批准的机构动物护理和使用委员会方案进行。使用吸入异氟烷和氧气使小鼠麻醉，给予布比卡因用于镇痛。如前所述，进行通过右胸切口直接胸膜内注射200μL无血清培养基中的1×105-1×106个肿瘤细胞以建立原位MPM肿瘤(Adusumilli et al.,ScienceTranslational Medicine 6(261):261ra151(2014)；Servais et al.,Clin.CancerRes.18(9):2478-2489(2012)；Servais et al.,in Current Protocols inPharmacology,Enna,ed.,Chapter 14(Unit14 21),John Wiley&Sons(2011))。将总共3×104-1×105个转导T细胞(200μL无血清培养基中)过继转移到荷肿瘤小鼠中，或通过直接胸膜内注射进行胸腔或通过尾静脉注射进入全身。通过在单次腹膜内剂量的D-萤光素(150mg/kg；Perkin Elmer，Waltham，MA)之后20分钟进行的BLI，体内监测和定量测定肿瘤生长。BLI数据应用Living Image软件(2.60版；Perkin Elmer)分析；BLI信号报告为总流量(光子/秒)，这代表腹和背流量的平均数。为了分析CAR T细胞离体的功能能力，如下处理肿瘤组织和小鼠脾：将组织称重，收获至冰冷的RPMI 1640中。用解剖刀手工将组织分成小块，然后通过40μm-100μm过滤器机械分解。接下来，样品通过FACS(荧光激活细胞分选)分析用于表型分型，或CAR+CD4+或CD8+T细胞使用FACS Aria分选仪分选，然后在含IL-2(60UI/mL)的RPMI中静止24小时，如上所述进行51Cr-释放和细胞因子释放测定。
组织学分析和免疫染色.在石蜡包埋、4％低聚甲醛固定组织样品的苏木精和伊红(H&E)染色后，进行肿瘤的组织病理学评价。如前所述，用小鼠抗人MSLN免疫球蛋白G进行人MSLN的免疫组织学分析(Kachala et al.,Clin.Cancer Res.20(4):1020-1028(2014)；Rizk et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.21(3):482-486(2012)；Tozbikian etal.,PLoS One 9(12):e114900(2014))。
定量实时PCR.从CD4+LNGFR+或CD8+LNGFR+分选T细胞提取mRNA，使用μMACS One-Step cDNA试剂盒(MACS molecular，Miltenyi Biotech Inc，Auburn，USA)，反转录成cDNA。采用Applied 7500系统(Foster，CA，USA)、 Universal PCRMastermix和用6-羧基荧光素(FAM-MBG)标记和由Life Technologies(Carlsbad，CA)设计的以下探针，用方法进行定量实时PCR(RT-PCR)：Tbet(Hs00203436_m1)；Eomes(Hs00172872_m1)；粒酶B(Hs01554355_m1)；IFNγ(Hs00989291_m1)；IL-2(Hs00174114_m1)；PD-1(Hs01550088_m1)。使用目标基因的比较阈值循环(CT)，并应用以下方程式归一化至β2m管家基因：ΔCt(样品)＝Ct(目标基因)-Ct(β2m)。然后，应用2-ΔΔCt方法分析与对照条件相比的相对倍数变化表达，并如下计算：2-ΔΔCt＝2^-(ΔCt(样品)-ΔCt(对照))。
统计方法.数据应用Prism(6.0版；GraphPad Software，La Jolla，CA)软件分析，表示为均值±SEM，如图中所述。结果应用非配对斯氏t检验(双尾)分析，适用时其Bonferroni校正用于多重比较。存活曲线应用log-rank检验分析。统计显著性规定为P<0.05。所有统计分析应用Prism软件进行。
8.2.在初始抗原刺激时CAR用CD28或4-1BB共刺激显示体外相同的效应细胞因子分泌和增殖
构建包含人MSLN特异性scFv(Feng et al.,Mol.Cancer Ther.8(5):1113-1118(2009))和CD3ζ、CD28/CD3ζ或4-1BB/CD3ζ信号转导结构域(Mz、M28z、MBBZ)的3种CAR(图1A和1B)。对前列腺特异性膜抗原(PSMA)有特异性的P28z CAR，用作阴性效应子以控制同种异体反应性和异种反应性。使用SFG-反转录病毒载体，使CD4+和CD8+人外周血T淋巴细胞两者有效转导(50％-70％转导)(图2)。MSLN转导的MSTO-211H细胞(MSLN+)和PSMA转导的EL-4小鼠淋巴瘤细胞(MSLN-)在体外实验中用作MSLN阳性和阴性靶标。Mz-、M28z-和MBBz转导的T细胞在体外表明相似的MSLN特异性裂解(图1C)。P28z CAR T细胞不裂解MSTO MSLN+细胞，MSLN靶中的CAR不裂解EL4PSMA+细胞，表明了裂解是抗原特异性的。证实了共刺激信号转导的功能性(Brentjens et al.,Clin.Cancer Res.13(18Pt 1):5426-5435(2007))，当与缺乏外源IL-2的Mz相比时，M28z和MBBz CAR T细胞分泌2-15倍较高水平的Th1细胞因子(图1D)，且在反复暴露于MSLN+细胞达到14倍较大的T细胞蓄积(图1E)。已建立了抗原特异性和证实了共刺激信号转导结构域的功能性，在携带已确立的胸膜肿瘤的小鼠中进行了MSLN靶中的CAR T细胞的治疗潜力的评价。
这些结果表明CAR用CD28或4-1BB共刺激显示在初始抗原刺激时体外相等的效应细胞因子分泌和增殖。
8.3.间皮素CAR T细胞在体内抗原暴露后被耗尽
为了评价是否有CAR T细胞的进行中的免疫抑制并比较M28z和MBBz CAR T细胞克服肿瘤介导的免疫抑制的相对能力，将1×106个CAR T细胞注射入MSTO MSLN+荷肿瘤小鼠胸腔，允许重复抗原遭遇和T细胞活化的足够时间(通过活化标志物CD69的正面和侧面散射和增量调节证实)，然后用MSLN+靶标对收获的CD4或CD8CAR肿瘤浸润或脾T细胞进行离体刺激(图3A中所示示意图)。未注射体外静息T细胞(“输注前细胞”)被用来建立功能的基线水平(在抗原暴露前)。与静息M28z CD8+CAR T细胞相比，体内暴露于MSLN抗原的T细胞具有较低水平的细胞溶解功能(图3A)(输注前细胞裂解，20.5％；肿瘤浸润性T细胞裂解，13.1％；脾T细胞裂解，8.7％)。相比之下，MBBz CAR T细胞保留细胞溶解功能(输注前细胞裂解，18.3％；肿瘤浸润性T细胞裂解，37.2％；脾T细胞裂解，22.2％)。分选的CD4+CAR T细胞表明相似的结果形态。
在离体刺激肿瘤浸润性和脾CAR T细胞时，还测量了细胞因子水平，对于体内暴露于MSLN+抗原的CD4+M28z CAR T细胞，观察到Th1细胞因子分泌降低。CD4+MBBz CAR T细胞还表明Th1细胞因子分泌降低，虽然在与M28z CAR T细胞比较时这些细胞能够更好地保持细胞因子分泌(图3B)。与CD4+T细胞上清液相比，CD8+T细胞上清液含有显著较低水平的细胞因子(Adusumilli et al.,Science Translational Medicine 6(261):261ra151(2014))之前已观察到的结果)。CD8+T细胞在体内抗原暴露时还显示分泌细胞因子的能力降低；CD8+MBBz CAR T细胞优先保留其分泌IFN-γ的能力。评价了在给予后第3天从肿瘤和脾收获的T细胞的mRNA水平，结果表明CD4+和CD8+MBBz CAR T细胞的GzB、IL-2和IFN-γ的体内表达水平远远大于M28z CAR T细胞的GzB、IL-2和IFN-γ的体内表达水平，CD8+亚群中的IL-2表达除外(图3C)。
这些结果表明间皮素CAR T细胞在体内抗原暴露后被耗尽。
8.4.MBBz CAR T细胞在体内显示延缓的耗竭
已表明在体内暴露于抗原的被共刺激的CAR T细胞中细胞溶解功能和效应细胞因子分泌被抑制，推测与慢性感染模型相似，重复抗原刺激可能在T细胞抑制中起作用，且在重复抗原遭遇时保持功能的不同能力可解释MBBz CAR T细胞功效的提高。因此，针对其在体外模型系统中承受重复抗原遭遇的能力，对Mz、M28z和MBBz CAR T细胞进行测试，其中在每7天进行MSLN+抗原刺激时，针对增殖、细胞溶解功能和细胞因子分泌对细胞进行评价。M28z和MBBz CAR T细胞在连续MSLN+刺激时具有相似的扩增能力，扩增至比Mz CAR T细胞14倍更高的水平；在第三次刺激后，它们失去扩增能力(图4A)。MBBz和M28z CAR T细胞在重复抗原刺激时都丧失细胞溶解功能，但是MBBz CAR T细胞能够更好地保持裂解功能。而在第一刺激时裂解在3个T细胞群中相等，到第3次刺激时，M28z裂解功能被抑制到更显著的水平，使得MBBz CAR T细胞在多个E:T比率下肿瘤裂解都提高(图4B，右)。在第3次刺激时裂解功能(如通过测量CD107a表达的脱粒测定法评价)与铬释放测定法的结果相关(图4C)。
接下来，测量了Th1细胞因子分泌。在第一刺激时注意到M28z和MBBz CAR T细胞之间的相似水平，以及随每次刺激连续下降。就像细胞毒性一样，MBBz CAR T细胞优先保持细胞因子分泌；当比较第一和第二刺激的水平时，细胞因子浓度对于M28z下降>30倍，对于MBBz CAR T细胞仅2倍左右(图4D)。通过测量在第二刺激时细胞因子的胞内水平，证实了细胞因子产生的差异。在抗原刺激时CAR T细胞的反转录酶PCR分析显示与M28z CAR T细胞相比，MBBz CAR T细胞表达与较低水平的耗竭和抑制相关的标志物；MBBz CAR T细胞表达较高水平的Tbet和Eomesodermin以及较低水平的PD1和FoxP3(图5)。测试了已暴露于肿瘤抗原的持续性CAR T细胞的体内功能。虽然定量的持久性在M28z和MBBz CAR T细胞之间相等，但认为MBBz CAR T细胞在肿瘤再次激发时将显示功能增强。胸膜内给予带有已建立的MSLN+胸膜肿瘤的小鼠M28z或MBBz CAR T细胞(以1×105的剂量，E:T比1:3000)以根除胸膜肿瘤(图4E)。在初始T细胞注射后20天，通过将MSLN+肿瘤细胞(1×106)注射入存活者的胸腔进行肿瘤再次激发；使用BLI监测肿瘤负荷。持续性MBBz CAR T细胞能够更好地控制肿瘤负荷(相对于2/4M28z治疗小鼠，4/4MBBz治疗小鼠具有在基线水平上的BLI信号)(图4E)。
这些结果表明MBBz CAR T细胞在体内显示延迟的耗竭。
8.5.肿瘤细胞PD-L1抑制间皮素CAR T细胞效应功能
已证实CAR T细胞被体内肿瘤环境抑制且MBBz CAR T细胞能够更好地克服这种抑制，至少部分因为其在重复抗原遭遇时保持功能的能力(见上文)，接下来寻求评价抑制性受体和配体途径在模型中发挥的作用。在肿瘤发展的M28z治疗小鼠中，针对抑制的周知途径的表达使肿瘤浸润性T细胞染色。发现PD-1、Tim-3和LAG-3高水平的表达(图6A)。在给药后6天收获的肿瘤浸润性MBBz CAR T细胞表明抑制性受体也增量调节，虽然它们在蛋白质和mRNA水平两方面表达显著较低水平的PD-1受体(图6B-D)。与CD8+T细胞相比，CD4+T细胞表达较高水平的PD-1。还观察到M28z和MBBz CAR T细胞两者的大部分共同表达PD-1和LAG-3或PD-1和Tim-3，表明多个抑制途径可能同时起作用(图7)。接下来，评价了肿瘤表达的配体：PD-L1和PD-L2(配体，对于PD-1)、半乳凝素-9(配体，对于Tim-3)和MHC II类(配体，对于LAG-3)。仅PD-1配体在胸膜内给予M28z CAR T细胞后收获的胸膜肿瘤细胞中表达(图6E)。如其它处所报告的(McGray et al.,Mol.Ther.22(1):206-218(2014)；Spranger et al.,Science Translational Medicine 5(200):200ra116(2013))，肿瘤细胞与IFN-γ和TNF-α(以由图1和4中的T细胞分泌的类似的浓度)共培养导致肿瘤细胞上类似的PD-L1和PD-L2表达增量调节水平(图6F)，反映了肿瘤细胞对抵抗免疫攻击的适应(“适应性免疫抗性(adaptive immunoresistance)”)。PD-1受体和配体两者体内表达的独特存在表明该途径可能发挥重要的抑制作用。
正如一些研究表明的，共刺激可能足以克服由PD-1所致抑制(Carter et al.,Eur.J.Immunol.32(3):634-643(2002)；Freeman et al.,J.Exp.Med.192(7):1027-1034(2000)；Koehler et al.,Cancer Res.67(5):2265-2273(2007))，接下来评价了过量表达PD-L1是否可在PD-L1介导的免疫抑制的体外模型(使用用仅MSLN(MSLN+)或MSLN和PD-L1(MSLN+PD-L1+)两者转导的3T3小鼠成纤维细胞)中抑制CAR T细胞功能(图8A)。在M28z和MBBz CAR T细胞两者中，PD-L1过量表达导致在连续刺激时蓄积(图8B)和Th1效应细胞因子分泌(图8D)降低。虽然肿瘤细胞裂解在初始刺激时不被抑制，但用3T3作为靶标在针对MSTOMSLN+肿瘤细胞的两次刺激后进行的铬释放测定表明在M28z和MBBz CAR T细胞两者中裂解功能降低，在M28z CAR T细胞中较高程度的降低(图8C)。这个结果可能是由于在暴露于MSTO MSLN+肿瘤细胞后PD-1对M28z和MBBz CAR T细胞的差异性增量调节所致。
这些结果表明肿瘤细胞PD-L1抑制间皮素CAR T细胞效应功能。
8.6.细胞内在PD-1抗性在体内拯救M28z CAR T细胞功能
上述结果表明PD-1途径是肿瘤介导的免疫抑制的功能性机制，且在重复抗原刺激后PD-1增量调节降低CAR T细胞功效。因此，将检查点阻断与CD28共刺激信号转导联合。因为目的是提供不依赖于全身性给予抗体的重复给药的CAR T细胞特异性检查点阻断，所以把研究集中在克服免疫抑制的遗传改造方法上。构建含有与CD8跨膜结构域融合的受体的胞外配体结合结构域的PD-1显性阴性受体(DNR)。由于PD-1DNR缺乏任何信号转导结构域，所以认为充分过量表达的受体可通过使PD-1配体饱和，从而阻断通过内源PD-1受体的信号转导，来提高T细胞功效。M28z CAR T细胞用通过P2A元件与mCherry报道分子连接的PD-1DNR(PD-1DNR)或只含报道分子的空载体(EV)共转导(图9A)。用PD-1DNR共转导的M28z CART细胞在增殖能力上具有轻微但统计上显著的优势(图9B)，在多个E:T比率下细胞毒性提高(图9C)，以及IL-2和IFN-γ分泌水平提高(图9D)。
接下来，评价了胸膜内给予用遗传改造的PD-1抗性共转导的M28z CAR T细胞是否可提供体内优势。给予带有已确立的胸膜MSLN+-表达肿瘤的小鼠5×104CAR+M28z EV或M28z PD-1DNR T细胞的单一胸膜内剂量，通过肿瘤负荷测量(使用连续的BLI)和中值存活期监测治疗反应。用M28z PD-1DNR T细胞治疗的小鼠具有显著提高的肿瘤负荷控制和延长的中值存活期(图9E)；然而，只有一些小鼠(7/16，44％)具有长的无肿瘤存活期，表明存在必须克服的多余的免疫抑制机制。该实验中的小鼠组(M28z PD-1DNR)存活超过450天，尽管重复性肿瘤再次激发，表明用PD-1DNR转导的CAR T细胞的“功能持续性”。这些结果表明，注射50,000个CAR T细胞，不仅大的肿瘤负荷被根除，而且肿瘤复发被防止，尽管多次肿瘤再次激发超过15个月。
为了研究克服PD-1介导的免疫抑制的备选遗传策略，将M28z CAR T细胞用表达PD-1打靶shRNA的载体共转导(图10A)，这在蛋白质水平上产生>60％PD-1受体敲减(图10B)。在M28z CAR T细胞中，与靶向非哺乳动物基因的shRNA(M28z KanR)共转导相比，用PD-1shRNA共转导在MSLN+抗原刺激时提高增殖功能(图10C)、增加细胞毒性(图10D)，并在用间皮瘤细胞或MSLN+PDL1+3T3小鼠成纤维细胞刺激时细胞因子分泌提高(图10E)。与M28zKanR T细胞相比，M28z PD-1shRNA转导的T细胞无法达到更大的体内肿瘤排斥功效，但值得注意，体内敲减水平显著低于体外。因此，PD1DNR被证实为是体内比RNA干扰方法更有效的策略。
这些结果表明在体内细胞内在PD-1抗性拯救M28z CAR T细胞功能。
8.7 PD-1DNR与PD-L1和PD-L2两者有效地结合
为了测试PD-1DNR与配体PD-L1和PD-L2的结合，将用mCherry标记和用PD-1DNR转导的T细胞暴露于与Fc融合的PD-L1(“PD-L1Fc”)、与Fc融合的PD-L2(“PD-L2Fc”)或对照同种型Fc(“iso Fc”)包被的板中。基本上按第7.6中所述，将人T细胞用mCherry构建体转导以用mCherry标记T细胞。PD-L1Fc融合物、PD-L2Fc融合物和对照Fc是商业化购买的。
将用PD-L1Fc融合蛋白、PD-L2Fc蛋白或对照同种型Fc包被的板暴露于仅mCherry标记的T细胞、在PD-1抗体存在下的mCherry标记的T细胞、用PD-1DNR转导的mCherry标记的T细胞转导和在存在PD-1抗体时用PD-1DNR转导的mCherry标记的T细胞。
如图11所示，与具有mCherry和没有PD-1DNR转导的对照T细胞相比，用PD-1DNR转导的T细胞与PD-L1和PD-L2两者有效结合。这些结果表明PD-1DNR与PD-L1和PD-L2两者结合。因为一些肿瘤细胞表达PD-L1或PD-L2，而且因为一些免疫细胞(T细胞和非T细胞例如巨噬细胞等)表达PD-L1或PD-L2，所以重要的是PD-1DNR与PD-L1和PD-L2两者结合。因此，用PD-1DNR转导的T细胞可中和PD-L1和PD-L2两者。
8.8在PD-1DNR加入的胞内4-1BB信号转导提高CAR T细胞效率
抑制T细胞活化的PD-L1-或PD-L2介导的抑制的PD-1DNR可转化成阳性共刺激信号。将人T细胞用具有CD28和CD3zeta结构域的CAR(M28z)的间皮素特异性(MSLN特异性)转导(另参见上文第7.2节m28z的描述)。为了抵消PD-1/PD-L1抑制，通过将M28z CAR T细胞同与4-1BB胞内信号转导结构域融合的跨膜结构域融合的PD-1显性阴性受体(PD-1 DNR)(亦称为转换受体)转导，来评价细胞内在基因工程策略。
图12A显示说明CAR和PD-1DNR共表达的示意图。图12A的下部分表示表达与靶细胞上的抗原结合的CAR的T细胞，图12A中以表达肿瘤细胞抗原间皮素(MSLN)的肿瘤细胞为例说明。表达肿瘤细胞抗原特异性CAR的T细胞与表达肿瘤细胞抗原的肿瘤细胞的结合导致T细胞的活化。PD-1DNR的共表达抑制由PD-L1或PD-L2与野生型PD-1结合介导的免疫检查点抑制剂途径。图12B显示说明CAR和PD-1DNR共表达的示意图，其中通过将共刺激分子(以4-1BB为例说明)同与PD-1的配体结合结构域融合的跨膜结构域融合，将PD-1DNR转变成共刺激构建体。这类构建体是本文称为转换受体的构建体的实例(参见Liu et al.,CancerRes.76:1578-1590(2016))。4-1BB结构域起针对T细胞活化的第二共刺激信号的作用。
将人T细胞用M28z CAR、M28z CAR和PD-1DNR两者或M28z CAR和PD-1/4-1BB转换受体构建体两者转导。针对培养中的T细胞蓄积，将转导的细胞用抗原刺激并分析。如图12C所示，M28z CAR T细胞蓄积在第7天增加，且表达M28z CAR的T细胞用PD-1DNR或PD-1/4-1BB转换受体构建体共转导时，蓄积增加。
图12D显示在用M28z CAR、M28z CAR和PD-1DNR两者或M28z CAR和PD-1/4-1BB转换受体构建体两者转导的人T细胞中干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的细胞因子分泌。基本如第7.1节所述，进行细胞因子分泌测定。如图12D所示，相对于表达M28z CAR的细胞或共表达M28z CAR和PD-1DNR的细胞中观察到的细胞因子分泌，在表达M28z CAR和PD-1/4-1BB转换受体构建体的细胞中IFN-γ、IL-2、TNF-α和GM-CSF的分泌增加。这些结果表明在T细胞中共转导PD-1/4-1BB转换受体构建体与M28z CAR，PD-L1(或PD-L2)抑制可转化成阳性共刺激信号，导致细胞因子分泌和T细胞蓄积提高。
8.9.实验结果的综述和讨论
如上所述，已证实CAR T细胞疗法和PD-1检查点阻断是实体瘤模型中的合理组合。进行了体外和离体刺激测定以评价PD-1/PD-L1抑制对间皮素CAR T细胞功能的影响。为了直接抵消PD-1介导的抑制，使用反转录病毒载体将CAR介导的共刺激与PD-1DNR组合。由这种组合策略(共刺激和检查点阻断)提供的最佳信号转导在肿瘤编码的PD-L1表达的存在下提高了T细胞功能，导致在单次低剂量的CAR T细胞后的长期无肿瘤存活期。这些研究关乎过继T细胞疗法的临床实践，出于以下原因被立即转化的：(1)所测的共刺激信号转导结构域—CD28和4-1BB—是用于正在进行中的临床试验中两个共刺激结构域(NCT02414269、NCT02159716、NCT01583686)，(2)胸膜间皮瘤的模型概括了人类疾病，并使用阐明T细胞耗竭相关性的重大临床相关肿瘤负荷(Adusumilli et al.,Science TranslationalMedicine 6(261):261ra151(2014)；Servais et al.,Clin.Cancer Res.18(9):2478-2489(2012)；Servais et al.,in Current Protocols in Pharmacology,Enna,ed.,Chapter14(Unit14 21),John Wiley&Sons(2011)；Servais et al.,PLoS One 6(10):e26722(2011))，和(3)通过遗传编码的检查点阻断增强CAR T细胞疗效的策略使用已适应于临床的人序列(Adusumilli et al.,Science Translational Medicine 6(261):261ra151(2014)；Feng et al.,Mol.Cancer Ther.8(5):1113-1118(2009))。
M28z CAR T细胞中PD-1相对较高的表达导致聚焦于CD28刺激的CAR T细胞。在该分析的基础上，寻求针对抵消PD-1抑制性信号转导的遗传策略，例如产生PD-1显性阴性受体(PD-1DNR)和shRNA靶向PD-1。当以足够水平表达时，PD-1DNR与内源PD-1受体竞争结合PD-1配体(PD-L1和PD-L2)。用PD-1DNR共转导的CD28共刺激的T细胞显示体外T细胞功能和体内T细胞功效提高，表明PD-1信号转导作为肿瘤模型中肿瘤细胞籍以逃避CAR T细胞的重要机制。虽然对于PD-1打靶shRNA只显示体外功效，但体内功效的缺乏可能与因在多次体内抗原遭遇后诱导的大量PD-1转录物所引起的shRNA装置饱和有关，该结论得到PD-1敲减体内比体外显著低的结果的支持。上述研究结果表明经遗传改造抵抗肿瘤介导的免疫抑制的过继转移的T细胞的治疗实用性。靶向TGF-β的DNR在临床前模型中被证实，目前正在临床试验中检测(Foster et al.,J.Immunother.31(5):500-505(2008)；Bollard et al.,Blood99(9):3179-3187(2002))。
虽然其他人体内或体外已将T细胞疗法与PD-1-阻断抗体组合，但加上以上实验所述共抑制性阻断的遗传策略克服了限制抗体疗法的若干主要障碍，包括(1)依赖于反复给予抗体，和(2)发生免疫相关不良事件。然后，T细胞疗法具有优于抗体疗法的优势，因为它可建立针对在单剂量后抑制的抗性程序的T细胞的长期植入，并且因为它提供对受限于靶定肿瘤的T细胞库的抑制途径的阻断，这可限制来自于更广泛应用的抗体检查点阻断的自身免疫。此外，或许PD-L1阻断抗体可进一步延长M28z和M28z PD-1 DNR CAR T细胞的功效是可能的。
上述研究确立了负责CAR T-细胞的抑制机制之一，并突出显示了承受免疫抑制共刺激策略的能力的差异。其它抑制途径也可起潜在限制T细胞功能的作用。死于肿瘤发展的用PD-1DNR-共转导M28z CAR T细胞治疗的一部分小鼠表明其它抑制机制的作用。此外，有关慢性感染的文献表明细胞内源性和细胞外源性两者的抑制的其它机制的存在，这正在靶定肿瘤的T细胞疗法中进行评价(Moon et al.,Clin.Cancer Res.20(16):4262-4273(2014)；Riese et al.,Cancer Res.73(12):3566-3577(2013))。对抑制性信号转导的其它研究可使用包括例如骨髓衍生的抑制性细胞和内源T细胞等要素的有免疫活性的模型，已表明其在肿瘤免疫逃避中起重要作用。
上述结果已证实CAR T细胞效应功能的肿瘤介导的抑制的重要性。通过进行T细胞效应功能的综合分析，证实了即使共刺激的CAR T细胞(虽然它们表明持久性提高)，在体外和在肿瘤微环境下在重复抗原遭遇时均受到抑制。所述结果表明CAR T细胞疗法可用来抵消抑制性信号转导并提供灵活性以工程改造提供最佳共刺激和直接抵消抑制信号(例如PD-1)的信号转导结构域。此外，在进行中的CAR T细胞疗法临床试验中，在显示T细胞浸润但有限的临床反应的患者中，在CAR T细胞疗法后结合PD-1/PD-L1阻断可被用来提高CAR T细胞疗法的功效。获自本文提供的临床试验和策略的知识在使用CAR T细胞改进免疫治疗方法中是有极高价值的，特别用于实体瘤的治疗。因此，上述结果列举了可应用于临床背景以提高CAR T细胞疗法的功效的方法。
如上所述，建立低水平肿瘤浸润的模型，结果表明CAR T细胞可能对肿瘤细胞介导的免疫抑制敏感，导致T细胞功能受损和肿瘤排斥减少。经改造以抵抗PD-1信号转导的T细胞显示抗肿瘤效能提高。在晚期肿瘤的单次低剂量CAR T细胞疗法后，观察到在对CAR T细胞分泌的细胞因子的响应中，肿瘤细胞增量调节导致CAR T细胞抑制和肿瘤复发的PD-L1。为了直接克服PD-L1介导的免疫抑制，设计了缺乏胞内抑制信号转导结构域的PD-1显性阴性受体(PD-1DNR)。PD-1DNR和CAR的共转导提高CAR T细胞功能，导致在单次低剂量的CAR T细胞后的长期无癌存活期。免疫检查点途径受体DNR与CAR的共表达可立即转移到临床，因为可将DNR加入任何CAR中而不抑制CAR功能或增加毒性。虽不受特殊理论的束缚，但认为DNR只结合(消耗)被其相应配体(例如在PD-1的情况下为PD-L1)诱导的阴性信号并回避下游信号转导。
表达CAR和免疫检查点抑制剂的显性阴性形式的免疫细胞的疗效还可通过转换受体的表达提高，在所述转换受体中胞内共刺激信号转导结构域同与免疫检查点抑制剂(例如PD-1)的胞外配体结合结构域融合的跨膜结构域融合。上述结果表明同与4-1BB的胞质结构域融合的跨膜结构域融合的PD-1胞外结构域的表达提高细胞因子产生并增加CAR T细胞的蓄积。在表达CAR的免疫细胞中的转换受体的表达可提高用于免疫疗法的免疫细胞的功效。或者，转换受体可在不含CAR的细胞中表达。在两种情况下，转换受体起显性阴性的作用。可与表达免疫检查点抑制剂的显性阴性形式(不含共刺激信号转导结构域，因此不是转换受体)的免疫细胞，或共表达CAR和免疫检查点抑制剂的显性阴性形式(不含共刺激信号转导结构域，因此不是转换受体)的细胞一起同时或序贯给予表达CAR和转换受体的免疫细胞，以提高使用这类免疫细胞的免疫疗法的疗效。
9.引用的参考文献
本文引用的所有参考文献通过引用以其整体并入本文并用于全部目的，程度就像每个单独的出版物或专利或专利申请具体而单独指明通过引用以其整体并入并用于全部目的。
本发明的许多修改和变动可在不偏离其精神和范围的情况下进行，正如对本领域技术人员将是显而易见的。本文所述具体实施方案仅以实例提供，且本发明只限于随附权利要求书的权项连同所述权利要求所赋权利的等同内容的完整范围。
序列表
<110> 纪念斯隆-凯特林癌症中心
<120> 用于治疗病毒感染和其它感染的免疫细胞组合物和使用方法
<130> 13542-038-228
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<150> 62/468,881
<151> 2017-03-08
<150> 62/381,219
<151> 2016-08-30
<160> 29
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195 200 205
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
210 215 220
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
225 230 235 240
Arg Arg Ile Gln
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 15
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
20
<210> 16
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 16
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 17
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 17
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Ala Ala Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
165 170 175
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
180 185 190
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
195 200 205
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
210 215 220
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
225 230 235 240
Arg Arg Ile Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
245 250 255
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Lys Gly Glu
260 265 270
Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His
275 280 285
Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly
290 295 300
Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr
305 310 315 320
Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe
325 330 335
Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp
340 345 350
Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met
355 360 365
Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu
370 375 380
Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe
385 390 395 400
Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala
405 410 415
Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile
420 425 430
Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val
435 440 445
Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr
450 455 460
Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr
465 470 475 480
Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly
485 490 495
Met Asp Glu Leu Tyr Lys
500
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多核苷酸"
<400> 18
accggtggta cctcaccctt accgagtcgg cgacacagtg tgggtccgcc gacaccagac 60
taagaaccta gaacctcgct ggaaaggacc ttacacagtc ctgctgacca cccccaccgc 120
cctcaaagta gacggcatcg cagcttggat acacgccgcc cacgtgaagg ctgccgaccc 180
cgggggtgga ccatcctcta gactggccac catgcagatc ccacaggcgc cctggccagt 240
cgtctgggcg gtgctacaac tgggctggcg gccaggatgg ttcttagact ccccagacag 300
gccctggaac ccccccacct tctccccagc cctgctcgtg gtgaccgaag gggacaacgc 360
caccttcacc tgcagcttct ccaacacatc ggagagcttc gtgctaaact ggtaccgcat 420
gagccccagc aaccagacgg acaagctggc cgctttcccc gaggaccgca gccagcccgg 480
ccaggactgc cgcttccgtg tcacacaact gcccaacggg cgtgacttcc acatgagcgt 540
ggtcagggcc cggcgcaatg acagcggcac ctacctctgt ggggccatct ccctggcccc 600
caaggcgcag atcaaagaga gcctgcgggc agagctcagg gtgacagaga gaagggcaga 660
agtgcccaca gcccacccca gcccctcacc caggccagcc ggccaggcgg ccgcacccac 720
cacgacgcca gcgccgcgac caccaacccc ggcgcccacg atcgcgtcgc agcccctgtc 780
cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga 840
cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cctggccggg acttgtgggg tccttctcct 900
gtcactggtt atcacccttt actgcaacca caggcggatc caaggatctg gagcaacaaa 960
cttctcacta ctcaaacaag caggtgacgt ggaggagaat cccggcccca tggtgagcaa 1020
gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga 1080
gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga 1140
gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga 1200
catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat 1260
ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt 1320
cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat 1380
ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa 1440
gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg 1500
cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac 1560
cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt 1620
ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg 1680
ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa ctcgag 1726
<210> 19
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 20
<211> 289
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
20 25 30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
35 40 45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
50 55 60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
85 90 95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
130 135 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Pro
145 150 155 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
165 170 175
Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala
180 185 190
Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr
195 200 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225 230 235 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val
245 250 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala
260 265 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
275 280 285
Ser
<210> 21
<211> 301
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln
20 25 30
Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu
35 40 45
Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly
50 55 60
Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Trp Leu Asn Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Glu Asn Val Thr Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile
100 105 110
Gln Ile Pro Gly Ile Met Asn Asp Glu Lys Phe Asn Leu Lys Leu Val
115 120 125
Ile Lys Pro Ala Lys Val Thr Pro Ala Pro Thr Arg Gln Arg Asp Phe
130 135 140
Thr Ala Ala Phe Pro Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala
145 150 155 160
Glu Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Asn Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu
180 185 190
Arg Asp Ser Gly Ala Thr Ile Arg Ile Gly Ile Tyr Ile Gly Ala Gly
195 200 205
Ile Cys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Ile Phe Gly Ala Leu Ile Phe
210 215 220
Lys Trp Tyr Ser His Ser Lys Glu Lys Ile Gln Asn Leu Ser Leu Ile
225 230 235 240
Ser Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Gly Leu Ala Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Gly Ile Arg Ser Glu Glu Asn Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Asn Val Tyr
260 265 270
Glu Val Glu Glu Pro Asn Glu Tyr Tyr Cys Tyr Val Ser Ser Arg Gln
275 280 285
Gln Pro Ser Gln Pro Leu Gly Cys Arg Phe Ala Met Pro
290 295 300
<210> 22
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525
<210> 23
<211> 244
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
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Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
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Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 24
<211> 287
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Ser Pro His Pro Thr Ala Leu Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Ala
1 5 10 15
Gln Thr Ile His Thr Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser
20 25 30
Ala Glu Pro Gly Thr Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val
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Gly Leu Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln
100 105 110
Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro
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Ala Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Gly Val Ser Val Val Phe Leu Phe
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Cys Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe Cys Leu His Arg Gln Asn Gln Ile
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195 200 205
Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala
210 215 220
Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala
225 230 235 240
Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His
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Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala Val Ser Pro Gln Ser Thr
260 265 270
Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala Ala Val Ala Arg His
275 280 285
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val
1 5 10 15
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50 55 60
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130 135 140
Ile Leu Asp Arg Gly Arg Cys Gln Val Ala Leu Ser Cys Leu Val Ser
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Arg Asp Gly Asn Val Ser Tyr Ala Trp Tyr Arg Gly Ser Lys Leu Ile
165 170 175
Gln Thr Ala Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Val Asp Ile Asn
180 185 190
Gly Thr His Thr Tyr Thr Cys Asn Val Ser Asn Pro Val Ser Trp Glu
195 200 205
Ser His Thr Leu Asn Leu Thr Gln Asp Cys Gln Asn Ala His Gln Glu
210 215 220
Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu
260 265 270
Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr
275 280 285
Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser
290 295 300
Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala
340 345 350
Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val
355 360 365
Tyr Ser
370
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<211> 181
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Leu Leu Glu Pro Gly Arg Gly Cys Cys Ala Leu Ala Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ile Val Asp Ile Gln Ser Gly Gly Cys Ile Asn Ile Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Ser Gln Glu Gly Thr Arg Leu Asn Leu Ile Cys Thr Val Trp His
35 40 45
Lys Lys Glu Glu Ala Glu Gly Phe Val Val Phe Leu Cys Lys Asp Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Asp Pro Gly Ile Asp Gly Val Gly Glu Ile Ser Ser Gln Leu Met
85 90 95
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100 105 110
Cys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Gly Ile Arg Leu Gln Gly His Phe Phe
115 120 125
Ser Ile Leu Phe Thr Glu Thr Gly Asn Tyr Thr Val Thr Gly Leu Lys
130 135 140
Gln Arg Gln His Leu Glu Phe Ser His Asn Glu Gly Thr Leu Ser Ser
145 150 155 160
Gly Phe Leu Gln Glu Lys Val Trp Val Met Leu Val Thr Ser Leu Val
165 170 175
Ala Leu Gln Ala Leu
180
<210> 27
<211> 592
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp
20 25 30
Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn
35 40 45
Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
50 55 60
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
65 70 75 80
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
85 90 95
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
100 105 110
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
115 120 125
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
145 150 155 160
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val
180 185 190
Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile
195 200 205
Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
210 215 220
Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His
225 230 235 240
Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys
245 250 255
Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp
260 265 270
Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe
290 295 300
Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser
305 310 315 320
Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu
325 330 335
Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe
340 345 350
His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser
355 360 365
Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala
370 375 380
His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile
385 390 395 400
Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu
405 410 415
Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr
420 425 430
Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg
435 440 445
Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val
450 455 460
Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp
465 470 475 480
Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu
485 490 495
Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met
500 505 510
Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe
515 520 525
Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu
530 535 540
Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala
545 550 555 560
Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser
565 570 575
Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
580 585 590
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述：合成的肽"
<400> 28
Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Tyr Val Lys Met
1

Claims (190)

1.一种是免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中所述CAR与病毒抗原结合。
2.一种免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞群，所述细胞群包含重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的细胞，其中所述CAR与病毒抗原结合。
3.权利要求1或2的细胞或细胞群，其中所述免疫刺激性细胞是T细胞。
4.权利要求1-3中任一项的细胞或细胞群，其中所述前体细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
5.权利要求1-4中任一项的细胞或细胞群，其中所述免疫刺激性细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
6.权利要求1或2的细胞或细胞群，其中所述细胞是T细胞。
7.权利要求1或2的细胞或细胞群，其中所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。
8.权利要求1或2的细胞或细胞群，其中所述细胞是记忆T细胞。
9.权利要求8的细胞或细胞群，其中所述记忆T细胞是记忆CD8+T细胞。
10.一种识别且对病毒抗原敏感的T细胞，所述T细胞重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。
11.权利要求10的T细胞，其是免疫刺激性的。
12.权利要求10或11的T细胞，其是CD4+。
13.权利要求10或11的T细胞，其是CD8+。
14.一种T细胞群，所述细胞群包含识别和对病毒抗原敏感并重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的T细胞。
15.权利要求14的细胞群，其中所述T细胞是免疫刺激性的。
16.权利要求14或15的细胞群，其中所述T细胞是CD4+。
17.权利要求14或15的细胞群，其中所述T细胞是CD8+。
18.权利要求1-17中任一项的细胞或细胞群，其来源于人。
19.权利要求18的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是作为人类病原体的病毒的抗原。
20.权利要求1-19中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原可诱导被病毒感染的人类对象的免疫应答。
21.权利要求1-20中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原选自由人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原、单纯疱疹病毒(HSV)抗原、水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原、腺病毒抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原和埃-巴二氏病毒(EBV)抗原组成的组。
22.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HIV抗原，所述HIV抗原选自由群特异性抗原(gag)蛋白、p55、p24、p18、包膜糖蛋白(env)、gp160、gp120、gp41、反转录酶(pol)、p66和p31组成的组。
23.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HBV抗原，所述HBV抗原选自由HBV包膜蛋白S、HBV包膜蛋白M、HBV包膜蛋白L和HBV包膜蛋白S、M或L的S结构域组成的组。
24.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HCV抗原，所述HCV抗原选自由核心蛋白、包膜蛋白E1、包膜蛋白E2、NS2、NS3、NS4和NS5组成的组。
25.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HSV抗原，所述HSV抗原选自由gE、gI、gB、gD、gH、gL、gC、gG、gK、gM和gE的胞外结构域组成的组。
26.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是VZV抗原，所述VZV抗原选自由gE和gI组成的组。
27.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是腺病毒抗原，所述腺病毒抗原选自由六邻体蛋白和五邻体蛋白组成的组。
28.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是CMV抗原，所述CMV抗原选自由pp65、即刻早期(IE)抗原和IE1组成的组。
29.权利要求21的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是EBV抗原，所述EBV抗原选自由潜伏膜蛋白2(LMP2)、埃-巴二氏病毒核抗原1(EBNA1)和BZLF1组成的组。
30.权利要求1-29中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂。
31.权利要求30的细胞或细胞群，其中所述免疫检查点抑制剂选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160组成的组。
32.权利要求31的细胞或细胞群，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1。
33.权利要求1-29中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞介导的免疫应答的抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
34.权利要求1-33中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞还重组表达自杀基因。
35.权利要求34的细胞或细胞群，其中所述自杀基因包含诱导型胱天蛋白酶9。
36.一种识别且对病毒抗原敏感的调节T细胞，所述调节T细胞重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。
37.一种调节T细胞群，所述细胞群包含识别和对病毒抗原敏感，且重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的T细胞。
38.权利要求36或37的细胞或细胞群，其中所述调节T细胞自患有慢性病毒感染的对象分离。
39.一种自患有病毒感染的对象分离的调节T细胞，所述调节T细胞重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。
40.一种自患有病毒感染的对象分离的调节T细胞群，所述细胞群包含重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的调节T细胞。
41.权利要求39或40的细胞或细胞群，其来源于人。
42.权利要求41的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是被是人类病原体的病毒感染。
43.权利要求39-42中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是慢性病毒感染。
44.权利要求39-43中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是被HCV、HBV、HIV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
45.一种免疫抑制性细胞，所述细胞自患有病毒感染的对象分离，所述免疫抑制性细胞重组表达免疫抑制性细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。
46.一种自患有病毒感染的对象分离的免疫抑制性细胞群，所述细胞群包含重组表达免疫抑制性细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的免疫抑制性细胞群。
47.权利要求45或46的细胞或细胞群，其来源于人。
48.权利要求47的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是被是人类病原体的病毒感染。
49.权利要求45-48中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是慢性病毒感染。
50.权利要求45或46的细胞或细胞群，其中所述免疫抑制性细胞是调节T细胞。
51.权利要求45-49中任一项的细胞或细胞群，其中所述免疫抑制性细胞识别并对病毒感染的病毒的病毒抗原敏感。
52.权利要求45-50中任一项的细胞或细胞群，其中所述免疫抑制性细胞重组表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合。
53.权利要求36-44或50-52中任一项的细胞或细胞群，其中所述调节T细胞是人CD4+CD25+T细胞。
54.权利要求36-44或50-52中任一项的细胞或细胞群，其中所述调节T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。
55.一种是CD4+CD25+的、对病毒抗原敏感且重组表达调节T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的调节T细胞的多克隆群。
56.权利要求55的细胞的多克隆群，其中所述人调节T细胞是CD127lo/-。
57.权利要求36-38中任一项的细胞或细胞群，其来源于人。
58.权利要求57的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是人类病原体的病毒的抗原。
59.权利要求36-38或51-58中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原可诱导被病毒感染的人类对象的免疫应答。
60.权利要求36-38或51-59中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原选自由丙型肝炎病毒(HCV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原、单纯疱疹病毒(HSV)抗原、水痘带状疱疹病毒(VZV)抗原、腺病毒抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原和埃-巴二氏病毒(EBV)抗原组成的组。
61.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HCV抗原，所述HCV抗原选自由核心蛋白、包膜蛋白E1、包膜蛋白E2、NS2、NS3、NS4和NS5组成的组。
62.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HIV抗原，所述HIV抗原选自由群特异性抗原(gag)蛋白、p55、p24、p18、包膜糖蛋白(env)、gp160、gp120、gp41、反转录酶(pol)、p66和p31组成的组。
63.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HBV抗原，所述HBV抗原选自由HBV包膜蛋白S、HBV包膜蛋白M、HBV包膜蛋白L和HBV包膜蛋白S、M或L的S结构域组成的组。
64.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是HSV抗原，所述HSV抗原选自由gE、gI、gB、gD、gH、gL、gC、gG、gK、gM和gE的胞外结构域组成的组。
65.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是VZV抗原，所述VZV抗原选自由gE和gI组成的组。
66.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是腺病毒抗原，所述腺病毒抗原选自由六邻体蛋白和五邻体蛋白组成的组。
67.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是CMV抗原，所述CMV抗原选自由pp65、即刻早期(IE)抗原和IE1组成的组。
68.权利要求60的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是EBV抗原，所述EBV抗原选自由潜伏膜蛋白2(LMP2)、埃-巴二氏病毒核抗原1(EBNA1)和BZLF1组成的组。
69.权利要求36-68中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂。
70.权利要求69的细胞或细胞群，其中所述免疫检查点抑制剂选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160组成的组。
71.权利要求70的细胞或细胞群，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1。
72.权利要求36-68中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞介导的免疫应答的抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
73.权利要求36-72中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞还重组表达自杀基因。
74.权利要求73的细胞或细胞群，其中所述自杀基因包含诱导型胱天蛋白酶9。
75.一种是免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合；
(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和
(c)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
76.一种免疫刺激性细胞群或其前体细胞群，所述细胞群包含重组表达以下的细胞：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合；
(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和
(c)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
77.权利要求75或76的细胞或细胞群，其中第二显性阴性形式的共刺激信号转导结构域是4-1BB的胞内信号转导结构域。
78.权利要求75-77中任一项的细胞或细胞群，其中所述CAR包含共刺激信号转导结构域。
79.权利要求78的细胞或细胞群，其中第二显性阴性形式的共刺激信号转导结构域不同于CAR的共刺激信号转导结构域。
80.权利要求78或79的细胞或细胞群，其中所述CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的胞内信号转导结构域。
81.权利要求75-80中任一项的细胞或细胞群，其中所述免疫刺激性细胞是T细胞。
82.权利要求75-81中任一项的细胞或细胞群，其中所述前体细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
83.权利要求75-82中任一项的细胞或细胞群，其中所述免疫刺激性细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
84.权利要求75-80中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。
85.权利要求75-80中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞是记忆T细胞。
86.权利要求85的细胞或细胞群，其中所述记忆T细胞是记忆CD8+T细胞。
87.一种免疫抑制性细胞，所述细胞自患有病毒感染的对象分离，所述免疫抑制性细胞重组表达：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合；
(b)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和
(c)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
88.一种自患有病毒感染的对象分离的免疫抑制性细胞群，所述细胞群包含重组表达以下的免疫抑制性细胞：
(a)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒感染的病毒的病毒抗原结合；
(b)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第一显性阴性形式，其中第一显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，并且是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(ii)跨膜结构域；和
(c)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的第二显性阴性形式，其中第二显性阴性形式是包含以下的多肽：(i)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(ii)跨膜结构域，和(iii)共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
89.权利要求87或88的细胞或细胞群，其中所述共刺激信号转导结构域是4-1BB的胞内信号转导结构域。
90.权利要求87-89中任一项的细胞或细胞群，其中所述CAR包含共刺激信号转导结构域。
91.权利要求90的细胞或细胞群，其中第二显性阴性形式的共刺激信号转导结构域不同于CAR的共刺激信号转导结构域。
92.权利要求90或91的细胞或细胞群，其中所述CAR的共刺激信号转导结构域是CD28的胞内信号转导结构域。
93.权利要求87-92中任一项的细胞或细胞群，其来源于人。
94.权利要求93的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是被是人类病原体的病毒感染。
95.权利要求87-94中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒感染是慢性病毒感染。
96.权利要求87-95中任一项的细胞或细胞群，其中所述免疫抑制性细胞是调节T细胞。
97.权利要求96的细胞或细胞群，其中所述调节T细胞是人CD4+CD25+T细胞。
98.权利要求96的细胞或细胞群，其中所述调节T细胞是人CD4+CD127lo/-CD25+T细胞。
99.一种是免疫刺激性细胞或其前体细胞的细胞，所述细胞重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中所述CAR与病原体的抗原结合。
100.一种免疫刺激性细胞群或其前体细胞群，所述细胞群包含重组表达(a)嵌合抗原受体(CAR)，和(b)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的细胞，其中所述CAR与病原体的抗原结合。
101.权利要求99或100的细胞或细胞群，其中所述免疫刺激性细胞是T细胞。
102.权利要求101的细胞或细胞群，其中所述T细胞是CD4+。
103.权利要求10或11的细胞或细胞群，其中所述T细胞是CD8+。
104.权利要求99或100的细胞或细胞群，其中所述前体细胞是造血干细胞或造血祖细胞。
105.权利要求99或100的细胞或细胞群，其中所述免疫刺激性细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
106.权利要求99或100的细胞或细胞群，其中所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。
107.权利要求99或100的细胞或细胞群，其中所述细胞是记忆T细胞。
108.权利要求107的细胞或细胞群，其中所述记忆T细胞是记忆CD8+T细胞。
109.一种识别且对病原体的抗原敏感的T细胞，所述T细胞重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式。
110.权利要求109的T细胞，其是免疫刺激的。
111.权利要求109或110的T细胞，其是CD4+。
112.权利要求109或110的T细胞，其是CD8+。
113.一种T细胞群，所述细胞群包含识别且对病原体的抗原敏感并重组表达T细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式的T细胞。
114.权利要求113的细胞群，其中所述T细胞是免疫刺激的。
115.权利要求113或114的细胞群，其中所述T细胞是CD4+。
116.权利要求113或114的细胞群，其中所述T细胞是CD8+。
117.权利要求99-116中任一项的细胞或细胞群，其来源于人。
118.权利要求117的细胞或细胞群，其中所述病原体是人病原体。
119.权利要求99-118中任一项的细胞或细胞群，其中所述病原体的抗原可诱导感染病原体的人类对象的免疫应答。
120.权利要求99-119中任一项的细胞或细胞群，其中所述病原体选自由细菌、真菌和原生动物组成的组。
121.权利要求99-120中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞介导的免疫应答的抑制剂是免疫检查点抑制剂。
122.权利要求121的细胞或细胞群，其中所述免疫检查点抑制剂选自由程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160组成的组。
123.权利要求122的细胞或细胞群，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1。
124.权利要求99-120中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞介导的免疫应答的抑制剂是转化生长因子β(TGF-β)受体。
125.权利要求99-124中任一项的细胞或细胞群，其中所述细胞还重组表达自杀基因。
126.权利要求125的细胞或细胞群，其中所述自杀基因包含诱导型胱天蛋白酶9。
127.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1、3-13或15-35中任一项的细胞和药学上可接受的载体。
128.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求2-9或14-35中任一项的细胞群和药学上可接受的载体。
129.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求36、38、39、41-44、50、53、54或57-74中任一项的调节T细胞和药学上可接受的载体。
130.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求37、38、40-44、50或53-74中任一项的调节T细胞群和药学上可接受的载体。
131.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求45、47-49、51或52中任一项的免疫抑制性细胞和药学上可接受的载体。
132.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求46-49、51或52中任一项的免疫抑制性细胞群和药学上可接受的载体。
133.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求75或77-86中任一项的免疫刺激性细胞和药学上可接受的载体。
134.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求76-86中任一项的免疫刺激性细胞群和药学上可接受的载体。
135.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求87或89-98中任一项的免疫抑制性细胞和药学上可接受的载体。
136.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求88-98中任一项的免疫抑制性细胞群和药学上可接受的载体。
137.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求99、101-112或117-126中任一项的细胞和药学上可接受的载体。
138.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求100-108或113-126中任一项的细胞群和药学上可接受的载体。
139.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求1-35中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
140.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象权利要求127或128的药物组合物，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
141.权利要求139或140的方法，其中所述对象是人。
142.权利要求141的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
143.权利要求139-142中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
144.权利要求139-143中任一项的方法，其中所述显性阴性形式的表达促进病毒特异性记忆细胞的产生。
145.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求36-44、50或53-74中任一项的调节T细胞或调节T细胞群，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
146.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象权利要求129或130的药物组合物，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
147.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求45-49、51或52中任一项的免疫抑制性细胞或免疫抑制性细胞群。
148.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象权利要求131或132的药物组合物。
149.权利要求145-148中任一项的方法，其中所述对象是人。
150.权利要求149的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
151.权利要求145-150中任一项的方法，其中所述病毒感染是慢性病毒感染。
152.权利要求145-151中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HCV、HIV、HBV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
153.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括：
(a)从对象中分离病毒特异性T细胞；
(b)在细胞中表达PD-1的显性阴性形式；和
(c)将细胞给予受试者。
154.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括：
(a)从对象中分离病毒特异性T细胞；
(b)在细胞中表达PD-1的显性阴性形式，其中PD-1的显性阴性形式的表达促进病毒特异性记忆细胞的产生；和
(c)将细胞给予受试者。
155.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括：
(a)从患有慢性病毒感染的对象中分离调节T细胞；
(b)在细胞中表达PD-1的显性阴性形式；和
(c)将细胞给予对象。
156.权利要求153-155中任一项的方法，其中所述对象是人。
157.权利要求156的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
158.权利要求153-157中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
159.权利要求153、156或157中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV感染。
160.权利要求154、156或157中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HBV感染。
161.权利要求155-157中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HCV感染。
162.权利要求139-161中任一项的方法，其中给药是通过胸膜内给药、静脉内给药、皮下给药、结节内给药、肝内给药、鞘内给药、腹膜内给药、颅内给药或向胸腺直接给药。
163.权利要求139-162中任一项的方法，其中所述细胞以104-1010个细胞/千克体重的剂量范围给予。
164.权利要求163的方法，其中所述剂量范围为3x105-3x106个细胞/千克体重。
165.权利要求139-164中任一项的方法，其中所述细胞或细胞群是对象自体的。
166.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求75-86中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
167.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象权利要求133或134的药物组合物，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
168.权利要求166或167的方法，其中所述对象是人。
169.权利要求168的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
170.权利要求166-169中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
171.权利要求166-170中任一项的方法，其中第一显性阴性形式的表达促进对象中病毒特异性记忆细胞的产生。
172.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求87-98中任一项的细胞或细胞群，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
173.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象权利要求135或136的药物组合物，其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原。
174.权利要求172或173的方法，其中所述对象是人。
175.权利要求174的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
176.权利要求172-175中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
177.权利要求172-176中任一项的方法，其中第一显性阴性形式的表达促进对象中病毒特异性记忆细胞的产生。
178.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的：
(a)第一细胞或所述第一细胞的第一群，其中第一细胞是免疫刺激性细胞并重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合且其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中所述显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域并且是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(B)跨膜结构域；和
(b)第二细胞或所述第二细胞的第二群，其中第二细胞是免疫刺激性细胞且重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合且其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫刺激性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中所述显性阴性形式是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(B)跨膜结构域，和(C)共刺激信号转导结构域，其中所述共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
179.权利要求178的方法，其中所述对象是人。
180.权利要求179的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
181.权利要求178-180中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
182.一种治疗有需要的对象的病毒感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的：
(a)第一细胞或所述第一细胞的第一群，其中第一细胞是免疫抑制性细胞且重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合且其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中所述显性阴性形式缺乏胞内信号转导结构域，是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，和(B)跨膜结构域；和
(b)第二细胞或所述第二细胞的第二群，其中第二细胞是免疫抑制性细胞且重组表达(i)嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与病毒抗原结合且其中所述病毒抗原是与病毒感染有关的抗原，和(ii)免疫抑制性细胞的细胞介导的免疫应答抑制剂的显性阴性形式，其中所述显性阴性形式是包含以下的多肽：(A)免疫检查点抑制剂胞外结构域的至少一部分，其中所述部分包含配体结合区，(B)跨膜结构域，和(C)共刺激信号转导结构域的融合物，其中所述共刺激信号转导结构域是显性阴性形式的跨膜结构域的羧基端。
183.权利要求182的方法，其中所述对象是人。
184.权利要求183的方法，其中所述病毒感染是被是人病原体的病毒感染。
185.权利要求182-184中任一项的方法，其中所述病毒感染是被HIV、HBV、HCV、HSV、VZV、腺病毒、CMV或EBV感染。
186.权利要求166-185中任一项的方法，其中所述细胞或细胞群是对象自体的。
187.一种治疗有需要的对象的由病原体引起的感染的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的权利要求99-126中任一项的细胞或细胞群，其中CAR与之结合或T细胞对之敏感的病原体的抗原是引起所述感染的病原体的抗原。
188.一种治疗有需要的对象的由病原体引起的感染的方法，所述方法包括给予对象权利要求137或138的药物组合物，其中CAR与之结合或T细胞对之敏感的病原体的抗原是引起所述感染的病原体的抗原。
189.权利要求187或188的方法，其中所述对象是人。
190.权利要求189的方法，其中引起感染的病原体是人病原体。
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