CN111253493A - 一种靶向hiv病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用 - Google Patents

一种靶向hiv病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向HIV病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用，所述特异性嵌合抗原受体包括抗HIV gp120单链抗体以及抗HIV gp41单链抗体，优选地，所述特异性嵌合抗原受体由信号肽、抗HIV gp120单链抗体及抗HIV gp41单链抗体串联依次连接，再和CD28跨膜区以及CD28胞内结构域(ICD)、4‑1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域依次串联组成单CAR或所述特异性嵌合抗原受体由第一CAR和第二CAR并联组成，所述第一CAR：信号肽、抗HIV gp120单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域(ICD)、4‑1BB共刺激结构域及CD3ζ胞内信号转导结构域；所述第二CAR：信号肽、抗HIV gp41单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域(ICD)以及CD3ζ胞内信号转导结构域。

Description

一种靶向HIV病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体 和应用
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体是指一种靶向HIV病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用。
背景技术
艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的疾病，已成为当今世界最危险的流行病之一，严重威胁人类的生存，对人口健康和社会经济的发展产生巨大的影响。
目前上市的抗药物主要包括：蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂，包括核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、以及进入抑制剂。临床上主要采用联合用药的方式进行治疗，即俗称“鸡尾酒疗法”的高效抗逆转录病毒疗法(Highly activeanti-retroviral therapy，HAART)。高效抗逆转录病毒治疗是HIV/AIDS治疗史上的第一次革命，其极大的降低了HIV/AIDS的发病率和病死率，显著延长了患者寿命，甚至降低了HIV的传播。但也面临着很多挑战：(1)患者必须终生服药，需付出昂贵的经济代价；(2)严重的毒副作用，HIV感染者非艾滋病相关疾病的发病率和病死率正在增加，如肾脏、肝脏和疾病。即使进行cART治疗，感染HIV的老年患者年龄相关疾病，如糖尿病、心血管疾病、肾疾病和骨疾病的发生明显早于非HIV感染的同龄人，这些跟抗病毒药物的不良反应息息相关；(3)耐药毒株的出现；(4)更为重要的是cART不能彻底清除病毒，主要是因为药物仅对复制中的病毒有效，而对HIV在感染早期建立的潜伏性病毒“储藏库”(reservoir)是无效的。一旦抗逆转录病毒治疗中断，病毒储藏库中的整合前病毒再度激活，几乎所有患者体内病毒血症会迅速反弹。对此，开发出新的有效的治疗方式已迫在眉睫。很多文献报道，病毒及感染细胞表面的gp120/gp41复合物很不稳定，gp120容易脱落，特别是在与中和抗体结合后，因此，这可能导致anti-gp120CAR-T结合gp120后从感染细胞表面脱落，影响CAR-T效果。
HIV囊膜蛋白(Env；gp160三聚体)是病毒粒子表面上的唯一抗原，Env的作用是，通过与宿主细胞受体发生相互作用帮助病毒进入细胞。成熟的Env(gp160)3被酶切后成(gp120/gp41)3，是由三个gp120和三个gp41亚单元组成的三聚体。其中，gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。在病毒入侵过程里，gp120结合细胞表面受体CD4和复合受体CCR5或CXCR4，触发Env巨大的构象变化，然后gp41膜融合蛋白又通过一连串的大范围的蛋白质重折叠，最终导致病毒与宿主细胞的膜融合。考虑到gp120容易脱落，导致病人体内存在大量游离的gp120蛋白，这些蛋白可能与anti-gp120 CAR-T结合，从而与活性复制的和激活的潜伏细胞表面表达的gp120竞争，干扰CAR-T的活性。
本发明通过优化设计，提供了一种HIV病毒靶向性嵌合抗原受体，分别靶向HIV囊膜的gp120区和gp41区，双CAR由两个不同单链抗体(scFv)串联，或由两个单链抗体(scFv)的CAR并联。其中两个不同单链抗体均能中和HIV-1毒株。应用本发明实施例提供的技术方案，该抗原受体实现了同时识别所有的病毒株，降低免疫逃逸风险的同时对毒株具有更好的杀伤效果，能够作为活性成份制备抗HIV感染的活细胞药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明第一目的是提供一种治疗HIV感染的特异性嵌合抗原受体，所述特异性嵌合抗原受体中包含抗HIV gp120单链抗体和抗HIV gp41单链抗体。
进一步地，所述特异性嵌合抗原受体还包括信号肽、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号转导结构域。
进一步地，所述特异性嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、抗HIV gp120单链抗体、StrepⅡ、连接肽、抗HIV gp41单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域及CD3ζ胞内信号传导结构域。
进一步地，所述特异性嵌合抗原受体所述特异性嵌合抗原受体从N端到C端由第一CAR：信号肽、抗HIV gp120单链抗体、Strep II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域及CD3ζ胞内信号转导结构域和第二CAR：信号肽、抗HIV gp41单链抗体、Flag、连接肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28-ICD及CD3ζ胞内信号转导结构域，第一CAR和第二CAR通过自切割短肽依次并联组成。
更进一步地，所述信号肽优选为CSF2RA信号肽和CD8信号肽；所述连接肽为3×G4S；所述自切割短肽优选为P2A类短肽。
本发明的第二目的是提供特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。
进一步地，所述的特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示。
本发明第三目的是提供一种重组慢病毒载体，所述慢病毒载体以PTK881-EF1α载体为骨架，含有前述的特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸。
本发明第四目的是提供一种免疫细胞，所述免疫细胞转染有前述的重组慢病毒载体。
进一步地，所述免疫细胞为T细胞，更优选地，所述T细胞为γδT细胞和CD8+T细胞。
本发明第四目的是提供一种特异性嵌合抗原受体编码核苷酸的构建方法。
进一步地，所述构建方法包括以下步骤：
1)基因合成核苷酸序列，信号肽-抗HIV gp120单链抗体SP1-N6核苷酸序列如SEQID NO：2所示、抗HIV gp41单链抗体10E8 scFv或4E10 scFv核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示，将合成的上述编码核苷酸分别克隆至pUC57载体；
2)以人cDNA文库为模板，设计引物分别扩增片段CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域(ICD)、4-1BB共刺激结构域、CD8跨膜区、胞内信号刺激域CD3ζ胞内信号刺激域、，以引物互补方式得到Strep II、连接肽3×G4S短片段、P2A；
3)采用Overlap PCR技术将SP1-N6、Strep II、3×G4S、10E8 scFv或4E10 scFv与CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号刺激域顺次扩增连接，获得嵌合抗原受体的编码基因C7-CAR或C9-CAR，其结构示意图如图1、图3所示；同样的方法，采用Overlap PCR技术构建权利要求4)所述嵌合特异性抗原受体的编码核苷酸，具体即并联CAR中，第一CAR：将信号肽、抗HIV gp120单链抗体、Strep II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号转导结构域依次连接；第二CAR：将信号肽、抗HIV gp41单链抗体、Flag、连接肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28-ICD以及CD3ζ胞内信号转导结构域依次连接；第一CAR和第二CAR由自切割短肽P2A依次连接组成。分别命名为C8-CAR或C10-CAR，其结构示意图如图2、图4所示；
优选地，StrepⅡ的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，StrepⅡ的核苷酸序列如SEQID NO.16所示，Flag氨基序列如SEQ ID NO.17所示，Flag核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；N6 CAR(C7CAR和C9 CAR及C8 CAR、C10 CAR上的第一CAR)上的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；CD28跨膜结构域核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.31；CD28胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.33；4-1BB共刺激结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，CD3ζ胞内信号刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；C8 CAR和C10 CAR上的第二CAR上的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；CD8跨膜结构域核苷酸序列如SEQID NO.27，氨基酸序列如SEQ ID NO.32；CD28胞内域的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.33；CD3ζ胞内信号刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
本发明第五目的是提供特异性嵌合抗原受体、及其编码核苷酸、重组慢病毒载体、免疫细胞在制备治疗HIV感染的药物或制剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明的创新在于使用靶向HIV囊膜蛋白的两个广谱中和抗体以先串联再组合成CAR分子，或各自组合成CAR分子再串联的形式，随后分别进行慢病毒包装、转导γδT细胞和CD8+T细胞并在其表面表达CAR分子，优点在于(1)不需要抽取HIV感染者的血液，从健康脐血中扩增γδT细胞和CD8+T；(2)只需转导一次即可以制备双靶向的CAR分子；(3)即使anti-gp120 CAR-T结合gp120后从感染细胞表面脱落，anti-gp41抗体仍能结合病毒感染细胞，使得CAR-T效果又多了一份保证。(4)拓宽了CAR-T细胞的杀伤病毒毒株范围，减少病毒体内免疫逃逸的机会，加速HIV感染细胞的清除，向着HIV的功能性治愈迈进了一步。
附图说明
图1为C7-CAR结构示意图；
图2为C8-CAR结构示意图；
图3为C9-CAR结构示意图；
图4为C10-CAR结构示意图；
图5为PTK881-EF1α-C7质粒图谱；
图6为PTK881-EF1α-C8质粒图谱；
图7为PTK881-EF1α-C9质粒图谱；
图8为PTK881-EF1α-C10质粒图谱；
图9为CAR-γδT细胞转导效率检测结果；
图10为CAR-CD8+T细胞转导效率检测结果；
图11为C7-CAR-γδT细胞体外杀瘤效果检测结果；
图12为C7-CAR-CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果；
图13为C8-CAR-γδT细胞体外杀瘤效果检测结果；
图14为C8-CAR-CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果；
图15为C9-CAR-γδT细胞体外杀瘤效果检测结果；
图16为C9-CAR-CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果；
图17为C10-CAR-γδT细胞体外杀瘤效果检测结果；
图18为C10-CAR-CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果；
图19为γδT细胞体外杀瘤效率检测结果；
图20为CD8+T细胞体外杀瘤效率检测结果；
图21为针对HIV囊膜两个位点的双特异性CAR-γδT与两个单位点的gp120-CAR-γδT,gp41-CAR-γδT(10E8)联合杀伤结果比较；
图22为针对HIV囊膜两个位点的双特异性CAR-CD8+T与两个单位点的gp120-CAR-CD8+T,gp41-CAR-CD8+T(10E8)联合杀伤结果比较。
图23在动物模型体内比较双特异性CAR-CD8+T分别与两个单位点的gp120-CAR-CD8+T,gp41-CAR-CD8+T(10E8)及其联合杀伤效果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：PTK881-EF1α-C7、PTK881-EF1α-C8、PTK881-EF1α-C9、PTK881-EF1α-C10质粒的构建
1、人工合成SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段构成SP1+N6 scFv，人工合成SEQ IDNO.4所示的核苷酸片段构成10E8 scFv，人工合成SEQ ID NO.6所示的核苷酸片段构成4E10scFv。三个单链抗体scFv序列的VH和VL通过连接肽进行连接，连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。
2、以人的cDNA文库为模板，设计引物PCR分别扩增片段CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB共刺激结构域、CD8跨膜区、CD3ζ胞内信号刺激域。以引物互补方式得到StrepⅡ、连接肽3×G4S、P2A。设计Overlap引物，采用Overlap PCR技术将SP1-N6、StrepⅡ、连接肽3×G4S、10E8 scFv与CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号刺激域顺次扩增连接成C7-CAR，完整的C7-CAR的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。设计Overlap引物，采用Overlap PCR技术分别将SP1+N6、StrepⅡ、连接肽3×G4S、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成SP1-N6 scFv CAR(第一CAR)；采用同样的方法将SP2、10E8 scFv、Flag、连接肽3×G4S、密码子优化的CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域、CD3ζ顺次扩增连接成SP2-10E8 scFv CAR(第二CAR)，将SP1+N6 scFv CAR(第一CAR)与SP2+10E8 scFv CAR(第二CAR)连成C8-CAR，完整的C8-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。带有启动子EF1α的EF1α-C7-CAR、EF1α-C8-CAR结构示意图如图1、图2所示。同样地，通过设计Overlap引物，用Overlap PCR技术将SP1-N6 scFv、StrepⅡ、连接肽3×G4S、4E10 scFv与CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成C9-CAR，完整的C9-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；通过设计Overlap引物，采用Overlap PCR技术分别将SP1-N6 scFv、StrepⅡ、连接肽3×G4S、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB、CD3ζ顺次扩增连接成SP1+N6 scFvCAR(第一CAR)，采用同样的方法将P2A、SP2、4E10 scFv、Flag、连接肽3×G4S、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域、CD3ζ顺次扩增连接成SP2+4E10 scFv CAR(第二CAR)，将SP1+N6 scFv CAR(第一CAR)与SP2+4E10 scFv CAR(第二CAR)连成C10-CAR，完整的C10-CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。带有启动子EF1α的EF1α-C9-CAR、EF1α-C10-CAR结构示意图如图3、图4所示。
其中，N6 scFv、10E8 scFv、4E10 scFv为能够识别HIV感染细胞表面的HIV Env的单链抗体scFv。信号肽SP1和N6 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQID NO.2所示；单链抗体10E8 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；单链抗体4E10 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，StrepⅡ的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，StrepⅡ的核苷酸序列如SEQID NO.16所示，Flag氨基序列如SEQ ID NO.17所示，Flag核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；N6 CAR(C7CAR和C9 CAR及C8 CAR、C10 CAR上的第一CAR)上的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；CD28跨膜结构域核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.31；CD28胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.33；4-1BB共刺激结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，CD3ζ胞内信号刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；C8 CAR和C10 CAR上的第二CAR上的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；CD8跨膜结构域核苷酸序列如SEQID NO.27，氨基酸序列如SEQ ID NO.32；CD28胞内域的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.33；CD3ζ胞内信号刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
3、将质粒PTK881-Kan使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，割取带有目的条带的凝胶回收置于1.5mL的离心管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收获得的目的片段，用超微量分光光度计Q5000测定回收产物的纯度和浓度。
4、将上述载体回收片段分别与C7-CAR、C8-CAR、C9-CAR、C10-CAR以1:2的摩尔比加入1.5mL的离心管中，加入同源重组酶ExnaseⅡ(Vazyme)与对应的5×CEⅡbuffer，37℃反应孵育30min；将重组产物取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞，冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入200μL LB液体培养基37℃、220rpm复苏培养30min；30min后将复苏后的产物混匀取200μL液体涂布在卡那抗性的LB平板上，放于37℃恒温培养箱内培养12小时；挑取平板上长出的单菌落，接种到500μL LB液体培养基中37℃、220rpm培养1小时后进行菌液PCR，初步筛选阳性单克隆进行质粒小提。
5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒PTK881-EF1α-C7、PTK881-EF1α-C8、PTK881-EF1α-C9、PTK881-EF1α-C10，送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，对含有正确序列的质粒PTK881-EF1α-C7、PTK881-EF1α-C8、PTK881-EF1α-C9、PTK881-EF1α-C10的DH5α菌株保种甘油菌。PTK881-EF1α-C7的完整图谱示意图如图5所示，PTK881-EF1α-C8的完整图谱示意图如图6所示，PTK881-EF1α-C9的完整图谱示意图如图7所示，PTK881-EF1α-C10的完整图谱示意图如图8所示。
实施例2：质粒的制备及测序
1、质粒的制备
将含质粒PTK881-EF1α-C7、PTK881-EF1α-C8、PTK881-EF1α-C9、PTK881-EF1α-C10的DH5α菌种分别接种至250mL含100μg/mL氨苄霉素的LB培养液中，37℃、220rpm培养过夜。培养液在4℃于6000g离心20min，弃上清。
取出EndoFree plasmid mega kit(Qiagen)中的Buffers P1，向离心得到的大肠杆菌沉淀中加120mL提前预冷的Buffers P1，盖上离心瓶盖，剧烈振荡离心瓶，使大肠杆菌沉淀在Buffers P1中完全分散。
向离心瓶中加120mL Buffers P2，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至50rpm，彻底混匀后室温放置5min。
向离心瓶中加120mL Buffers P3，盖上瓶盖放置在滚轴混匀仪上，慢慢提速至滚轴混匀仪的最大转速70rpm，彻底混匀直至呈白色不粘稠蓬松的混合液。在4℃于9000g离心15min。
向QIAfilter Cartridge倒入50mL Buffer FW，将离心所得上清液倒入QIAfilterCartridge中，轻轻地搅拌混匀。抽滤混合液进入已标记好对应的玻璃瓶中。
向每个玻璃瓶中加入20mL Buffer ER，上下颠倒混匀6次，在-20℃孵育30min。
将标记好的mega柱放入对应的架子上，向每个mega柱内加入35mL Buffers QBT平衡，重力作用使之流尽。
将玻璃瓶中的液体分批全部倒入对应标记的mega柱中，待柱中液体流尽后，向每个mega柱分批加入200mL Buffer QC进行清洗。待柱中液体流尽后，将废液收集盘中的废液倒入50mL洁净离心管内。
再向每个mega柱内加入40mL Buffer QN，使用50mL洁净离心管收集流出液，上下颠倒6次混匀，分装20mL至另一洁净已标记的50mL离心管内。
向每个50mL离心管加入14mL异丙醇(常温)，上下颠倒6次混匀。在4℃于15000g离心50min。
超净工作台内吸尽上清，每管加入3.5mL Endotoxin-free water漂洗，不要将底部沉淀冲散。在4℃于15000g离心30min。将EndoFree plasmid mega kit中的Buffer TE放入烘箱内预热。
在超净工作台内吸尽离心后的上清，于超净工作台内吹干(挥发残留的无水乙醇，时间在10min左右)。
在烘箱内拿出Buffer TE，在超净工作台内向每管加入1mL Buffer TE，用枪吹打10次后放入65℃烘箱，期间不间断地敲击管壁促使沉淀完全溶解。在4℃于4000g离心1min，将管壁上的液体甩到管底后吹打混匀。
在超净工作台内将液体全部转移至无内毒素无热源无核酸酶对应标记的EP管中。吸出2μL，用微量分光光度计测质粒浓度，并标记在对应的EP管上，获得质粒PTK881-EF1α-C7、PTK881-EF1α-C8、PTK881-EF1α-C9、PTK881-EF1α-C10。
2、目的基因测序
分别取20μL(500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。
实施例3、Lenti3-C7、Lenti3-C8、Lenti3-C9、Lenti3-C10慢病毒载体的制备和活性滴度检测
1、慢病毒载体的制备
在4个多层细胞培养瓶(Hyperflask)分别接入130.0～140.0×106数目的293T细胞(Takara)，每瓶共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic(100×))，在37℃含5％CO2培养箱中培养24小时。分别将混有320μg质粒(PTK881-EF1α-C7或PTK881-EF1α-C8或PTK881-EF1α-C9或PTK881-EF1α-C10：BZ1质粒：BZ2质粒：BZ3质粒＝12：10：5：6)的DMEM基础培养基加入4个960μg PEI管中，漩涡震荡,室温平衡10min。将上述4管35mL PEI与质粒的混合液分别与525mL DMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％CO2培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。
分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，向离心后上清中加入cryonase酶(Takara)置于4℃。6个小时后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，标记为Lenti3-C7、Lenti3-C8、Lenti3-C9、Lenti3-C10并置于-80℃保存备用。
2、慢病毒载体活性滴度检测
原理：anti-Strep tagⅡ抗体上标记有荧光素，而anti-Strep tagⅡ抗体能与CAR中Strep tagⅡ特异性结合，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反应了CAR在293T细胞中的表达情况。
方法：在6孔板中接入5.0×105个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO2培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，并换算得到Lenti3-C7、Lenti3-C8、Lenti3-C9、Lenti3-C10慢病毒浓缩液活性滴度。
目前的慢病毒浓缩液活性滴度在1×108～10×108(TU/mL)范围内，检测分析结果见表1。
表1慢病毒活性滴度检测分析结果
样品编号 活性滴度(TU/mL)
Lenti3-C7 2.2×10<sup>8</sup>
Lenti3-C8 2.0×10<sup>8</sup>
Lenti3-C9 2.8×10<sup>8</sup>
Lenti3-C10 2.1×10<sup>8</sup>
实施例4、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞的制备
1、CAR-γδT细胞制剂制备：
采集健康供者脐血100ml或者外周血200mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量TCRγδ+T Cell Isolation Kit,human(美天旎)分选TCRγδ+T细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在γδT细胞激活培养液(OpTmizerTM CTSTM T-CellExpansion Basal Medium，OpTmizerTM CTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500～1000IU/mL的IL-2(双鹭药业)，IL-7 5～20ng/mL，唑唻膦酸5μM)中培养，活化γδT细胞。
24小时后，按MOI为5分别加入Lenti3-C7、Lenti3-C8、Lenti3-C9、Lenti3-C10慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的γδT细胞激活培养液进行培养。
慢病毒转导24小时后将转导后的CAR-γδT细胞换入γδT细胞激活培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，继续培养扩增3天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×106/mL。第4天开始，每天补加γδT细胞扩增培养液(OpTmizerTM CTSTM T-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizerTMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500～1000IU/mL的IL-2(双鹭药业)，IL-7 5～20ng/mL)，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，扩增培养至14天。
根据预计细胞用量分别收集C7-CAR-γδT、C8-CAR-γδT、C9-CAR-γδT、C10-CAR-γδT细胞，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成C7-CAR-γδT、C8-CAR-γδT、C9-CAR-γδT、C10-CAR-γδT细胞制剂成品。
2、CAR-CD8+T细胞制剂制备
采集健康脐血100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD8+T Cell Isolation Kit human(美天旎)分选CD8阳性细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizerTM CTSTM T-Cell Expansion Basal Medium，OpTmizerTM CTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500～1000IU/mL的IL-2(双鹭药业))中培养，同时按每106个细胞加入25μl Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。
24小时后，按MOI为3分别加入Lenti3-C7、Lenti3-C8、Lenti3-C9、Lenti3-C10慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。
慢病毒转导24小时后将转导后CAR-CD8+T细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×106/mL。
根据预计细胞用量分别收集C7-CAR-CD8+T、C8-CAR-CD8+T、C9-CAR-CD8+T、C10-CAR-CD8+T细胞，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成C7-CAR-CD8+T、C8-CAR-CD8+T、C9-CAR-CD8+T、C10-CAR-CD8+T细胞制剂成品。
3、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞转导效率检测
各取1.0×106个CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞，分别与FITC-strepII室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR阳性细胞在总细胞中的比率。CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞转导效率检测结果分别如图9-10所示。图9表明成功制备了C7-CAR-γδT、C8-CAR-γδT、C9-CAR-γδT、C10-CAR-γδT、细胞；图10表明成功制备了C7-CAR-CD8+T、C8-CAR-CD8+T、C9-CAR-CD8+T、C10-CAR-CD8+T细胞。
实施例5、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞的体外(in vitro)和体内(in vivo)功能检测
1.体外杀伤检测：
采用钙黄绿素检测法分别对CD8+T、γδT、CAR-γδT、CAR-CD8+T细胞进行体外杀伤功能检测。选取构建HIV囊膜蛋白的稳转细胞系293T-gp120，293T-gp41，293T-gp120-gp41细胞作为阳性靶细胞，以293T细胞作为阴性靶细胞。
取适量的上述293T-gp120、293T-gp41，293T-gp120-gp41、293T靶细胞，在1×106/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcium-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×105/mL，向96孔板中分别加阴性靶细胞和阳性靶细胞，阳性靶细胞分三组，第一组：每孔加入5000个293T-gp120；第二组：每孔加入5000个293T-gp41细胞；第三组每孔加5000个293T-gp120-gp41细胞。按25:1,5:1,1:1的效靶比分别加入T、γδT、C7-CAR-γδT、C7-CAR-CD8+T、C8-CAR-γδT、C8-CAR-CD8+T、C9-CAR-γδT、C9-CAR-CD8+T、C10-CAR-γδT、C10-CAR-CD8+T细胞，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。
计算公式如下：
Figure BDA0002401555990000141
FCTL测定＝包含靶细胞和特定浓度效应T细胞的三个复孔的平均荧光值
Fspontaneous release＝包含靶细胞和1xPBS三个复孔的平均荧光值
Fmaximum release＝包含靶细胞和裂解液三个复孔的平均荧光值
注意：同时测量96孔板中细胞沉淀裂解物中的荧光值，每个孔总的荧光值等于上清和细胞沉淀物荧光值的和，总荧光值的差异应控制在＜5％。
另外，本申请还比较了针对HIV囊膜两个位点的双特异性CAR-γδT(或CAR-CD8+T)对293T-gp120-gp41阳性靶细胞的杀伤效果与单gp120 CAR-γδT(或gp120 CAR-CD8+T)和单gp41 CAR-γδT(或gp41 CAR-CD8+T)(10E8)的混合杀伤效果,图21-22。具体实验步骤同上。
靶细胞裂解百分数结果如图11-22所示，具体分析如下：
图11表明C7-CAR-γδT细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解；对阴性靶细胞(293T)也有一定的杀伤作用；
图12表明，C7-CAR-CD8+T细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解；但对HIV阴性靶细胞(293T)无明显杀伤作用；
图13表明，表明C8-CAR-γδT细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解；同时对阴性靶细胞(293T)也有一定的杀伤作用；
图14表明，C8-CAR-CD8+T细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解，但对HIV阴性靶细胞(293T)无明显杀伤作用；
图15表明，表明C9-CAR-γδT细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解；同时对阴性靶细胞(293T)也有一定的杀伤作用；
图16表明，C9-CAR-CD8+T细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解，但对HIV阴性靶细胞(293T)无明显杀伤作用；
图17表明，表明C10-CAR-γδT细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解，同时对阴性靶细胞(293T)也有一定的杀伤作用；
图18表明，C10-CAR-CD8+T细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能明显促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，同时，对293T-gp41细胞的杀伤可以说明对gp120从囊膜上脱落后的感染细胞也能有效裂解，但对HIV阴性靶细胞(293T)无明显杀伤作用；
图19表明，未转导γδT在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都能一定程度裂解阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)，且与效靶比呈现正相关性，但总体来说明显低于CAR-γδT的杀伤效果；原因在于γδT细胞是既具有天然免疫又具有适应性免疫的细胞，它对永生细胞系293T的杀伤是非特异的，对HIV蛋白阳性靶细胞和阴性靶细胞都有相似的杀伤效果；
图20表明，未转导对照CD8+T细胞在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，都不能促进阳性靶细胞(293T-gp120、293T-gp41和293T-gp120-gp41)的裂解，CD8+T细胞是属于适应性免疫系统的细胞毒性T细胞，对靶细胞的杀伤是依赖TCR识别的抗原和MHC高度特异的。
图21表明，在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，针对HIV囊膜两个位点的双特异性CAR-γδT对293T-gp120-gp41阳性靶细胞的杀伤效果明显优于两个单CAR-T的联合(gp120 CAR-γδT和gp41CAR-γδT，指4E10)。
图22表明，在三个效靶比(25：1，5：1，1：1)的条件下，针对HIV囊膜两个位点的双特异性CAR-CD8+T对293T-gp120-gp41阳性靶细胞的杀伤效果明显优于两个单CAR-T的联合(gp120 CAR-CD8+T和gp41 CAR-CD8+T,指4E10)。
2.小鼠模型体内抗病毒试验
在BSL-3实验室内，首先构建人源化小鼠，4-6周龄(B-NSG，北京维通利华公司)小鼠经2Gy辐照后，尾静脉注射2x105 CD34+造血干细胞(HSC，购自TPCS公司),6周后取小鼠外周血进行流式分析，通过人源T(CD4+和CD8+)细胞的比例判定模型是否成功建立。然后再进行HIV感染模型，在Day 0天通过静脉注射1x 106pgp24 HIV-LUC病毒，在Day 10成像后注射CAR-CD8+T细胞。从Day10开始，每3-4天成像一次，在准备动物成像之前，以150mg/kg的剂量腹腔注射D-luciferin(Molecular Imaging Products,Bend,USA).5分钟后,腹腔注射75mg/kg的戊巴比妥钠麻醉小鼠，等5分钟后使用IVIS小动物活体成像系统(Xenogen,Hopkinton,USA)。成像结果见图23，充分说明针对HIV囊膜两个位点的双特异性C7-CAR-CD8+T和C9-CAR-CD8+T比单CAR-T(gp120 CAR-CD8+T和gp41 CAR-CD8+T,指10E8)及其联合对体内病毒感染细胞的清除效果好，荧光信号的强弱代表病毒感染细胞的数量和病毒在细胞内的载量。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> 一种靶向HIV病毒囊膜双位点的嵌合抗原受体及其表达载体和应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala
20 25 30
Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ala His Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Arg Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val
65 70 75 80
Asn Phe Gly Gly Gly Phe Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val
85 90 95
Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser
115 120 125
Trp Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu
180 185 190
His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile His
195 200 205
His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala Asp
225 230 235 240
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg Gly
245 250 255
Ser Arg Leu His Ile Lys
260
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atcccccgag cgcacctggt acaatcaggg actgcgatga agaaaccggg ggcctcagta 120
agagtctcct gccagacctc tggatacacc tttaccgccc acatattatt ttggttccga 180
caggcccccg ggcgaggact tgagtgggtg gggtggatca agccacaata tggggccgtg 240
aattttggtg gtggttttcg ggacagggtc acattgactc gagacgtata tagagagatt 300
gcgtacatgg acatcagagg ccttaaacct gacgacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga 360
gaccgttcct atggcgactc ctcttgggcc ttagatgcct ggggacaggg aacgacggtc 420
gtcgtctccg cgggcggagg gggttcaggt ggaggaggct ctggcggtgg cggaagctac 480
atccacgtga cccagtctcc gtcctccctg tctgtgtcta ttggagacag agtcaccatc 540
aattgccaga cgagtcaggg tgttggcagt gacctacatt ggtatcaaca caaaccgggg 600
agagccccta aactcttgat ccaccatacc tcttctgtgg aagacggtgt cccctcaaga 660
ttcagcggct ctggatttca cacatctttt aatctgacca tcagcgacct acaggctgac 720
gacattgcca catattactg tcaagtttta caatttttcg gccgagggag tcgactccat 780
attaaa 786
<210> 3
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Ala
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser Val Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu Asn Ser Ile Asn Phe
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Met Glu Asp Ser Gly Leu Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro
100 105 110
Pro Gly Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Glu Thr Gly Val Ser Val Ala Leu
145 150 155 160
Gly Arg Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Ser His
165 170 175
Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu
180 185 190
Phe Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Ala Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Asp Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Lys Ser Gly
225 230 235 240
Ser Arg Leu Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250 255
<210> 4
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgaagc ctggaggatc ccttagactc 60
tcatgttcag cctctggttt cgacttcgat aacgcctgga tgacttgggt ccgccagcct 120
ccagggaagg gcctcgaatg ggttggtcgt attacgggtc caggtgaagg ttggtcagtg 180
gactatgctg cacccgtgga aggcagattt accatctcga gactcaattc aataaatttc 240
ttatatttgg agatgaacaa tttaagaatg gaagactcag gcctttactt ctgtgcccgc 300
acgggaaaat attatgattt ttggagtggc tatccgccgg gagaagaata cttccaagac 360
tggggccggg gcaccctggt caccgtctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 420
tctggcggtg gcggatcgtc ctatgagctg actcaggaga ctggtgtctc tgtggccctg 480
ggacggacag tcacaatcac gtgccgggga gacagcctca gaagtcatta tgcaagttgg 540
taccaaaaga agccaggaca ggcccctata cttctcttct atggtaaaaa taatcgtcct 600
tcaggggtcc cagaccgatt ctctggctcc gcctcaggaa acagagcttc cttgaccatc 660
tctggggctc aggcggaaga cgacgcggaa tattattgta gttctcggga caagagtggc 720
agccgtctgt cggtcttcgg cggggggacc aaactgaccg tcctc 765
<210> 5
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Ile Pro Leu Leu Thr Ile Thr Asn Tyr Ala Pro Arg Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Thr Gly Trp Gly Trp Leu Gly Lys Pro Ile Gly
100 105 110
Ala Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
130 135 140
Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Gln Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
145 150 155 160
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asn Asn Lys Leu
165 170 175
Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Gly Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
210 215 220
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gln Ser Leu Ser Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Leu Val Pro Arg
245 250
<210> 6
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaaaagac ccggctcctc agtgacagtg 60
agctgcaagg ccagcggcgg cagcttcagc acatacgccc tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcagag gactggagtg gatgggagga gtgatccccc tgctgaccat taccaattac 180
gccccaagat tccagggaag aatcacaatc accgccgaca gaagcaccag cacagcctac 240
ctggagctga acagcctgag acccgaagac accgccgtgt actactgcgc cagagaggga 300
accaccggct ggggatggct gggcaagccc attggagcct tcgcccactg gggacagggc 360
accctggtga cagtgtccag cggtggaggc ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc 420
ggatcggaga ttgtgctgac acagagcccc ggcacacaga gcctgagtcc tggcgagaga 480
gccaccctga gttgcagagc cagccagagc gtgggcaaca acaagctggc ctggtatcag 540
cagagacccg gccaggcccc cagactgctg atctacggag cctccagcag acccagcgga 600
gtggccgacc ggttcagcgg aagtggcagt ggaaccgact tcaccctgac tatcagcaga 660
ctggagcccg aggatttcgc cgtgtactat tgccagcagt atggacagtc cctgagcacc 720
tttggacagg ggaccaaggt ggaagtgaaa ctggtgcccc gc 762
<210> 7
<211> 808
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala
20 25 30
Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ala His Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Arg Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val
65 70 75 80
Asn Phe Gly Gly Gly Phe Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val
85 90 95
Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser
115 120 125
Trp Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu
180 185 190
His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile His
195 200 205
His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala Asp
225 230 235 240
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg Gly
245 250 255
Ser Arg Leu His Ile Lys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
275 280 285
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
290 295 300
Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn Ala Trp Met
305 310 315 320
Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg
325 330 335
Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser Val Asp Tyr Ala Ala Pro Val
340 345 350
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu Asn Ser Ile Asn Phe Leu Tyr
355 360 365
Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Met Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Phe Cys
370 375 380
Ala Arg Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Pro Pro Gly
385 390 395 400
Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
420 425 430
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Glu Thr Gly Val Ser Val Ala Leu Gly Arg
435 440 445
Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Ser His Tyr Ala
450 455 460
Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Phe Tyr
465 470 475 480
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
485 490 495
Ala Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Glu
500 505 510
Asp Asp Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Lys Ser Gly Ser Arg
515 520 525
Leu Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr
530 535 540
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
545 550 555 560
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
565 570 575
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val
580 585 590
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
595 600 605
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
610 615 620
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
625 630 635 640
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg
645 650 655
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
660 665 670
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
675 680 685
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
690 695 700
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
705 710 715 720
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
725 730 735
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
740 745 750
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
755 760 765
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
770 775 780
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
785 790 795 800
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
805
<210> 8
<211> 2427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atcccccgag cgcacctggt acaatcaggg actgcgatga agaaaccggg ggcctcagta 120
agagtctcct gccagacctc tggatacacc tttaccgccc acatattatt ttggttccga 180
caggcccccg ggcgaggact tgagtgggtg gggtggatca agccacaata tggggccgtg 240
aattttggtg gtggttttcg ggacagggtc acattgactc gagacgtata tagagagatt 300
gcgtacatgg acatcagagg ccttaaacct gacgacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga 360
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gtcgtctccg cgggcggagg gggttcaggt ggaggaggct ctggcggtgg cggaagctac 480
atccacgtga cccagtctcc gtcctccctg tctgtgtcta ttggagacag agtcaccatc 540
aattgccaga cgagtcaggg tgttggcagt gacctacatt ggtatcaaca caaaccgggg 600
agagccccta aactcttgat ccaccatacc tcttctgtgg aagacggtgt cccctcaaga 660
ttcagcggct ctggatttca cacatctttt aatctgacca tcagcgacct acaggctgac 720
gacattgcca catattactg tcaagtttta caatttttcg gccgagggag tcgactccat 780
attaaaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggcggtg gcggaagcgg cggagggggt 840
tcaggtggag gaggctctga ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggctt ggtgaagcct 900
ggaggatccc ttagactctc atgttcagcc tctggtttcg acttcgataa cgcctggatg 960
acttgggtcc gccagcctcc agggaagggc ctcgaatggg ttggtcgtat tacgggtcca 1020
ggtgaaggtt ggtcagtgga ctatgctgca cccgtggaag gcagatttac catctcgaga 1080
ctcaattcaa taaatttctt atatttggag atgaacaatt taagaatgga agactcaggc 1140
ctttacttct gtgcccgcac gggaaaatat tatgattttt ggagtggcta tccgccggga 1200
gaagaatact tccaagactg gggccggggc accctggtca ccgtctcctc aggtggaggc 1260
ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcgtcct atgagctgac tcaggagact 1320
ggtgtctctg tggccctggg acggacagtc acaatcacgt gccggggaga cagcctcaga 1380
agtcattatg caagttggta ccaaaagaag ccaggacagg cccctatact tctcttctat 1440
ggtaaaaata atcgtccttc aggggtccca gaccgattct ctggctccgc ctcaggaaac 1500
agagcttcct tgaccatctc tggggctcag gcggaagacg acgcggaata ttattgtagt 1560
tctcgggaca agagtggcag ccgtctgtcg gtcttcggcg gggggaccaa actgaccgtc 1620
ctcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 1680
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 1740
ctggacttcg cctgtgattt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat 1800
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc 1860
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1920
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa 1980
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 2040
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 2100
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 2160
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 2220
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 2280
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 2340
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 2400
cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 2427
<210> 9
<211> 1104
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Ala His Leu Val Gln Ser Gly Thr Ala
20 25 30
Met Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Gln Thr Ser Gly
35 40 45
Tyr Thr Phe Thr Ala His Ile Leu Phe Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Arg Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val
65 70 75 80
Asn Phe Gly Gly Gly Phe Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val
85 90 95
Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser
115 120 125
Trp Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu
180 185 190
His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile His
195 200 205
His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala Asp
225 230 235 240
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg Gly
245 250 255
Ser Arg Leu His Ile Lys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
290 295 300
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
305 310 315 320
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val
325 330 335
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
340 345 350
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
355 360 365
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
370 375 380
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys
385 390 395 400
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
405 410 415
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
420 425 430
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
435 440 445
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
450 455 460
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
465 470 475 480
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
485 490 495
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
500 505 510
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
515 520 525
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
530 535 540
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
545 550 555 560
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro
565 570 575
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580 585 590
Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
595 600 605
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp Asn
610 615 620
Ala Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Thr Gly Pro Gly Glu Gly Trp Ser Val Asp Tyr Ala
645 650 655
Ala Pro Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Leu Asn Ser Ile Asn
660 665 670
Phe Leu Tyr Leu Glu Met Asn Asn Leu Arg Met Glu Asp Ser Gly Leu
675 680 685
Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Gly Lys Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr
690 695 700
Pro Pro Gly Glu Glu Tyr Phe Gln Asp Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
705 710 715 720
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
725 730 735
Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Glu Thr Gly Val Ser Val Ala
740 745 750
Leu Gly Arg Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Asp Ser Leu Arg Ser
755 760 765
His Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu
770 775 780
Leu Phe Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
785 790 795 800
Ser Gly Ser Ala Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Ala
805 810 815
Gln Ala Glu Asp Asp Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Lys Ser
820 825 830
Gly Ser Arg Leu Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
835 840 845
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
850 855 860
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Thr Thr
865 870 875 880
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
885 890 895
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
900 905 910
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
915 920 925
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
930 935 940
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His
945 950 955 960
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
965 970 975
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
980 985 990
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
995 1000 1005
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
1025 1030 1035 1040
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
1045 1050 1055
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
1060 1065 1070
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
1075 1080 1085
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 10
<211> 3324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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aattttggtg gtggttttcg ggacagggtc acattgactc gagacgtata tagagagatt 300
gcgtacatgg acatcagagg ccttaaacct gacgacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga 360
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aattgccaga cgagtcaggg tgttggcagt gacctacatt ggtatcaaca caaaccgggg 600
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ttcagcggct ctggatttca cacatctttt aatctgacca tcagcgacct acaggctgac 720
gacattgcca catattactg tcaagtttta caatttttcg gccgagggag tcgactccat 780
attaaaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggcggtg gcggaagcgg cggagggggt 840
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<211> 807
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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Arg Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Lys Pro Gln Tyr Gly Ala Val
65 70 75 80
Asn Phe Gly Gly Gly Phe Arg Asp Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Val
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Tyr Arg Glu Ile Ala Tyr Met Asp Ile Arg Gly Leu Lys Pro Asp Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Gly Asp Ser Ser
115 120 125
Trp Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu
180 185 190
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195 200 205
His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
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225 230 235 240
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg Gly
245 250 255
Ser Arg Leu His Ile Lys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
275 280 285
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser Ser Val
290 295 300
Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe Ser Thr Tyr Ala Leu
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Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly
325 330 335
Val Ile Pro Leu Leu Thr Ile Thr Asn Tyr Ala Pro Arg Phe Gln Gly
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
420 425 430
Thr Gln Ser Pro Gly Thr Gln Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
435 440 445
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Asn Asn Lys Leu Ala Trp
450 455 460
Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala
465 470 475 480
Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
485 490 495
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe
500 505 510
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gln Ser Leu Ser Thr Phe Gly
515 520 525
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530 535 540
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
545 550 555 560
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
565 570 575
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val
580 585 590
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
595 600 605
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625 630 635 640
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645 650 655
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
660 665 670
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
675 680 685
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
690 695 700
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
705 710 715 720
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
725 730 735
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
740 745 750
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
755 760 765
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
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785 790 795 800
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
805
<210> 12
<211> 2424
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
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<210> 13
<211> 1106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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1 5 10 15
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100 105 110
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Trp Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Val Val Ser Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr
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Ile His Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ile Gly Asp
165 170 175
Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Thr Ser Gln Gly Val Gly Ser Asp Leu
180 185 190
His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile His
195 200 205
His Thr Ser Ser Val Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Phe His Thr Ser Phe Asn Leu Thr Ile Ser Asp Leu Gln Ala Asp
225 230 235 240
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Leu Gln Phe Phe Gly Arg Gly
245 250 255
Ser Arg Leu His Ile Lys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr
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740 745 750
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Gln Ser Leu Ser
820 825 830
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Leu Val Pro Arg Asp
835 840 845
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850 855 860
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro
865 870 875 880
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
885 890 895
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
965 970 975
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
980 985 990
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
995 1000 1005
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
1010 1015 1020
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
1025 1030 1035 1040
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
1045 1050 1055
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
1060 1065 1070
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
1075 1080 1085
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
1090 1095 1100
Pro Arg
1105
<210> 14
<211> 3321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60
atcccccgag cgcacctggt acaatcaggg actgcgatga agaaaccggg ggcctcagta 120
agagtctcct gccagacctc tggatacacc tttaccgccc acatattatt ttggttccga 180
caggcccccg ggcgaggact tgagtgggtg gggtggatca agccacaata tggggccgtg 240
aattttggtg gtggttttcg ggacagggtc acattgactc gagacgtata tagagagatt 300
gcgtacatgg acatcagagg ccttaaacct gacgacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga 360
gaccgttcct atggcgactc ctcttgggcc ttagatgcct ggggacaggg aacgacggtc 420
gtcgtctccg cgggcggagg gggttcaggt ggaggaggct ctggcggtgg cggaagctac 480
atccacgtga cccagtctcc gtcctccctg tctgtgtcta ttggagacag agtcaccatc 540
aattgccaga cgagtcaggg tgttggcagt gacctacatt ggtatcaaca caaaccgggg 600
agagccccta aactcttgat ccaccatacc tcttctgtgg aagacggtgt cccctcaaga 660
ttcagcggct ctggatttca cacatctttt aatctgacca tcagcgacct acaggctgac 720
gacattgcca catattactg tcaagtttta caatttttcg gccgagggag tcgactccat 780
attaaaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggcggtg gcggaagcgg cggagggggt 840
tcaggtggag gaggctctac cacgacgcca gcgccacgac caccaacacc ggcgcccacc 900
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 960
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatttttggg tgctggtggt ggttggtgga 1020
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1080
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1140
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaaa 1200
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1260
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1320
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1380
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1440
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1500
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1560
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1620
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgcg ctactaactt cagcctgctg 1680
aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg ccctgcctgt gacagctctg 1740
ctcctccctc tggccctgct gctccatgcc gccagacccc aggtgcagct ggtgcagagc 1800
ggcgccgagg tgaaaagacc cggctcctca gtgacagtga gctgcaaggc cagcggcggc 1860
agcttcagca catacgccct gagctgggtg agacaggccc ctggcagagg actggagtgg 1920
atgggaggag tgatccccct gctgaccatt accaattacg ccccaagatt ccagggaaga 1980
atcacaatca ccgccgacag aagcaccagc acagcctacc tggagctgaa cagcctgaga 2040
cccgaagaca ccgccgtgta ctactgcgcc agagagggaa ccaccggctg gggatggctg 2100
ggcaagccca ttggagcctt cgcccactgg ggacagggca ccctggtgac agtgtccagc 2160
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggagat tgtgctgaca 2220
cagagccccg gcacacagag cctgagtcct ggcgagagag ccaccctgag ttgcagagcc 2280
agccagagcg tgggcaacaa caagctggcc tggtatcagc agagacccgg ccaggccccc 2340
agactgctga tctacggagc ctccagcaga cccagcggag tggccgaccg gttcagcgga 2400
agtggcagtg gaaccgactt caccctgact atcagcagac tggagcccga ggatttcgcc 2460
gtgtactatt gccagcagta tggacagtcc ctgagcacct ttggacaggg gaccaaggtg 2520
gaagtgaaac tggtgccccg cgactacaaa gacgatgacg acaagggcgg tggcggaagc 2580
ggcggagggg gttcaggtgg aggaggctct ttcgtgcccg tgttcctgcc cgccaaacct 2640
accaccaccc ctgcccctag acctcccacc ccagccccaa caatcgccag ccagcctctg 2700
tctctgcggc ccgaagcctg tagacctgct gccggcggag ccgtgcacac cagaggcctg 2760
gacttcgcct gcgacatcta catctgggcc cctctggccg gcacctgtgg cgtgctgctg 2820
ctgagcctgg tgatcaccct gtactgcaac caccggaaca gaagcaagcg gagccggctg 2880
ctgcacagcg actacatgaa catgacccca agacggcctg gccccacccg gaagcactac 2940
cagccttacg cccctcccag agacttcgcc gcctaccggt ccagagtgaa gttcagcaga 3000
tccgccgacg cccctgccta ccagcaggga cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg 3060
ggcagacggg aagagtacga cgtgctggac aagcggagag gccgggaccc cgagatgggc 3120
ggaaagccca gacggaagaa cccccaggaa ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag 3180
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc ggaggcgcgg caagggccac 3240
gatggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 3300
caggccctgc cccccagatg a 3321
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aactggagcc acccccagtt cgagaag 27
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gactacaaag acgatgacga caag 24
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57
<210> 21
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 22
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 23
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 24
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 25
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 26
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttcgtgcccg tgttcctgcc cgccaaacct accaccaccc ctgcccctag acctcccacc 60
ccagccccaa caatcgccag ccagcctctg tctctgcggc ccgaagcctg tagacctgct 120
gccggcggag ccgtgcacac cagaggcctg gacttcgcct gcgac 165
<210> 27
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtgatc 60
accctgtact gcaaccaccg gaac 84
<210> 28
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agaagcaagc ggagccggct gctgcacagc gactacatga acatgacccc aagacggcct 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccttac gcccctccca gagacttcgc cgcctaccgg 120
tcc 123
<210> 29
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccccg agatgggcgg aaagcccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcgcggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagatga 339
<210> 30
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 32
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 33
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 34
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 36
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55

Claims (10)

1.一种治疗HIV感染的特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述特异性嵌合抗原受体中包含抗HIV gp120单链抗体和抗HIV gp41单链抗体。
2.根据权利要求1所述的特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述特异性嵌合抗原受体还包括信号肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。
3.根据权利要求1所述的特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述特异性嵌合抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、抗HIV gp120单链抗体、StrepⅡ、连接肽、抗HIV gp41单链抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域及CD3ζ胞内信号传导结构域。
4.根据权利要求1所述的特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述特异性嵌合抗原受体由第一CAR和第二CAR由自切割短肽依次并联组成，所述第一CAR：信号肽、抗HIV gp120单链抗体、Strep II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域及CD3ζ胞内信号转导结构域；所述第二CAR：信号肽、抗HIV gp41单链抗体、Flag、连接肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28-ICD以及CD3ζ胞内信号转导结构域。
5.根据权利要求3和4所述的特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号肽优选为CSF2RA信号肽和CD8信号肽；所述连接肽为3×G4S；所述自切割短肽优选为P2A类短肽。
6.权利要求1-5任一项所述特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸，其特征在于：优选地，所述的特异性嵌合抗原受体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示。
7.一种重组慢病毒载体，其特征在于：以PTK881-EF1α载体为骨架，含有权利要求6所述的编码核苷酸。
8.一种免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞转染有权利要求7所述的重组载体，优选地，所述免疫细胞为T细胞，更优选地，所述T细胞为γδT细胞和CD8+T细胞。
9.权利要求6所述编码核苷酸的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)基因合成核苷酸序列，信号肽-抗HIV gp120单链抗体SP1-N6核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示，抗HIV gp41单链抗体10E8 scFv或4E10 scFv核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的，将合成的上述编码核苷酸分别克隆至pUC57载体；
2)以人cDNA文库为模板，设计引物分别扩增片段CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域(ICD)、4-1BB共刺激结构域、CD8跨膜区、CD3ζ胞内信号刺激域，以引物互补方式得到Strep II、连接肽3×G4S、P2A；
3)采用Overlap PCR技术将SP1-N6、Strep II、3×G4S、10E8 scFv或4E10 scFv与CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ胞内信号刺激域顺次扩增连接，获得嵌合抗原受体的编码基因C7-CAR或C9-CAR，其结构示意图如图1、图3所示；同样的方法，采用Overlap PCR技术构建如权利要求4所述嵌合特异性抗原受体的编码核苷酸，具体即并联CAR中，第一CAR：将信号肽、抗HIV gp120单链抗体、Strep II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28-ICD、4-1BB共刺激结构域及CD3ζ胞内信号转导结构域依次连接；第二CAR：将信号肽、抗HIV gp41单链抗体、Flag、连接肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28-ICD以及CD3ζ胞内信号转导结构域依次连接；第一CAR和第二CAR由自切割短肽P2A依次连接组成；分别命名为C8-CAR或C10-CAR，其结构示意图如图2、图4所示；
优选地，StrepⅡ的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，StrepⅡ的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，Flag氨基序列如SEQ ID NO.17所示，Flag核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；N6 CAR(C7CAR和C9 CAR及C8 CAR、C10 CAR上的第一CAR)上的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示；CD28跨膜结构域核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.31；CD28胞内结构域(ICD)的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.33；4-1BB共刺激结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，CD3ζ胞内信号刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示；C8 CAR和C10 CAR上的第二CAR上的CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示；CD8跨膜结构域核苷酸序列如SEQ ID NO.27，氨基酸序列如SEQ ID NO.32；CD28胞内域的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.33；CD3ζ胞内信号刺激域的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示。
10.权利要求1-5任一项所述的特异性嵌合抗原受体、权利要求6所述的编码核苷酸、权利要求7所述的重组慢病毒载体、权利要求8所述的免疫细胞在用于制备治疗HIV感染的药物或制剂中的应用。
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