JP6961090B2 - 抗pd−1/cd47二重特異性抗体及びその適用 - Google Patents
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Description
ヒト化抗体H8(抗PD−1 IgG抗体)に基づき、特定のリンカー(GGGGSGGGGSERGETGP)を介して、ヒトシグナル調節タンパク質アルファ(SIRPA、NP_542970.1)膜外ドメイン(32aa−137aa)をH8重鎖のC末端と結合させることにより、二重特異性抗体HX009−5を得て、それにより二重特異性抗体は、目的のタンパク質であるPD−1及びCD47の両方を標的にする。
1.H8及びHX009−5のPD−1結合ELISAアッセイ
実施例1で得られたH8抗体及びHX009−5抗体との間で、PD−1結合アッセイ及びPD−L1競合アッセイを含む、直接の比較を行った。詳細は下記の通りである。
1)抗体コーティング
ELISAプレートを0.25μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度でhPD−1−his抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
1%BSA(PBSバッファで希釈)を用いて、hPD−1−his抗原で塗布したELISAプレートを37℃で2時間ブロッキングし、その後1%Tween−20を含む1×PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
3)一次抗体とのインキュベーション
H8抗体及びHX009−5抗体を、それぞれ2μg/mlから1:5ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する7つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロールをブロッキングしたELISAプレートにそれぞれ添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
4)二次抗体とのインキュベーション
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、1:10000希釈のヤギ抗ヒトIgG−HRP(H+L)(ウェル当たり100μl)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)発色(developing)
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤(developer)としての3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)をウェル当たり100μl添加し、5分間〜15分間室温でインキュベーションした。
6)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
7)読み(reading)
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
具体的な工程は、下記の通りである。
1)抗体コーティング
96ウェルELISAプレートを0.5μg/ml(ウェル当たり50μl)の濃度でhPD−1−hIgGFc抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、37℃で2時間、1%BSA(PBSバッファで希釈)で、塗布した96ウェルELISAプレートをブロッキングし、その後1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで3回洗浄した。
3)一次抗体とのインキュベーション
H8抗体及びHX009−5抗体を、それぞれ6μg/mlから1:3ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する7つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロール(ウェル当たり50μl)をブロッキングした96ウェルELISAプレートにそれぞれ添加し、室温で10分間インキュベーションした。
4)リガンドとのインキュベーション
ウェル当たり50μlで、0.6μg/mlのPD−L1−mIgG2aFc溶液を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)二次抗体とのインキュベーション
96ウェルELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体としての1:5000希釈のヤギ抗マウスIgG−HRP(H+L)(ウェル当たり50μl)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
6)発色
96ウェルELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり50μl添加し、5分間〜15分間室温でインキュベーションした。
7)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
8)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
具体的な工程は、下記の通りである。
1)抗体コーティング
96ウェルELISAプレートを1.0μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のhPD−1−hIgGFc抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、37℃で2時間、1%BSA(PBSバッファで希釈)で、塗布した96ウェルELISAプレートをブロッキングし、その後1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで4回洗浄した。
3)一次抗体とのインキュベーション
H8抗体及びHX009−5抗体を、それぞれ20μg/mlから1:3ずつ段階希釈し、それぞれの抗体に対する7つの勾配抗体溶液を得た。各抗体のための7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロール(ウェル当たり50μl)をブロッキングした96ウェルELISAプレートにそれぞれ添加し、室温で10分間インキュベーションした。
4)リガンドとのインキュベーション
0.6μg/mlのPD−L2−his tag溶液をウェル当たり50μl添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)二次抗体とのインキュベーション
96ウェルELISAプレートをPBSTバッファで5回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、1:750希釈(ウェル当たり50μl)で、二次抗体としてのHRP結合抗−his tagマウスモノクローナル抗体を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
6)発色
96ウェルELISAプレートをPBSTバッファで6回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、30分間室温でインキュベーションした。
7)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
8)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
実施例1で得たHX009−5抗体のCD47結合ELISAアッセイを行った。詳細は下記に示される。
1)抗体コーティング
ELISAプレートを0.25μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のCD47抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
37℃で2時間、1%BSA(PBSバッファで希釈)で、CD47抗原で塗布したELISAプレートをブロッキングし、その後1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
3)一次抗体とのインキュベーション
HX009−5抗体を、それぞれ10μg/mlから1:5ずつ段階希釈し、7つの勾配抗体溶液を得た。7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロールを、ブロッキングしたELISAプレートにそれぞれ添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
4)二次抗体とのインキュベーション
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、1:10000希釈のヤギ抗ヒトIgG−HRP(H+L)(ウェル当たり100μl)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)発色
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、5分間〜15分間室温でインキュベーションした。
6)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
7)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
具体的な工程は、下記の通りである。
1)抗体コーティング
96ウェルELISAプレートを0.25μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のCD47抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、37℃で2時間、1%BSA(PBSバッファで希釈)で、塗布した96ウェルELISAプレートをブロッキングし、1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで4回洗浄した。
3)一次抗体とのインキュベーション
HX009−5抗体を、30μg/mlから1:3ずつ段階希釈し、7つの勾配抗体溶液を得た。7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロール(ウェル当たり50μl)を、ブロッキングした96ウェルELISAプレートにそれぞれ添加し、室温で10分間インキュベーションした。
4)リガンドとのインキュベーション
0.6μg/mlのSIRPA−his tag溶液をウェル当たり50μl添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)二次抗体とのインキュベーション
96ウェルELISAプレートをPBSTバッファで5回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、1:750希釈(ウェル当たり50μl)で、二次抗体としてのHRP結合抗−his tagマウスモノクローナル抗体を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
6)発色
96ウェルELISAプレートをPBSTバッファで6回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、30分間室温でインキュベーションした。
7)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
8)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
HX009−5(実施例1で得られた)のFcフラグメントの有効性を調査するために、個々のFC受容体に対するHX009−5の結合能力の決定について、それぞれのFc受容体(CD16、CD32a、CD32b、及びCD64)の親和性を試験した。詳細は下記に示される。
Fc受容体CD16a(FcγRIIIaとしても知られる)は、IgG抗体のFcフラグメントに結合し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)に関与することができる。治療用モノクローナル抗体とFc受容体との間の結合能力は、抗体の安全性と有効性に影響を与える。本実施例では、HX009−5のCD16aへの親和性をELISAにより試験し、HX009−5のFc受容体CD16aへの結合能力を評価した。
1)抗体コーティング
ELISAプレートを0.5μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のCD16a抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
CD16a抗原で塗布したELISAプレートを、1%BSA(PBSバッファで希釈)で、37℃で2時間ブロッキングし、その後1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
3)一次抗体とのインキュベーション
HX009−5抗体を、それぞれ10μg/mlから1:5ずつ段階希釈し、7つの勾配抗体溶液を得た。7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロールを、ブロッキングしたELISAプレートにそれぞれ添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
4)二次抗体とのインキュベーション
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、1:8000希釈のヤギ抗ヒトIgG−HRP(H+L)(ウェル当たり100μl)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)発色
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、30分間室温でインキュベーションした。
6)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
7)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
HX009−5抗体(実施例1で得られた)は、HX006抗体(IgG1サブタイプ)と比較して、ELISAによりCD32aへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
1)抗体コーティング
ELISAプレートを0.5μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のCD32a抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
CD32a抗原で塗布したELISAプレートを1%BSA(PBSバッファで希釈)で、37℃で2時間ブロッキングし、1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
3)一次抗体とのインキュベーション
HX009−5抗体を、それぞれ10μg/mlから1:5ずつ段階希釈し、7つの勾配抗体溶液を得た。7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロールを、ブロッキングしたELISAプレートにそれぞれ添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
4)二次抗体とのインキュベーション
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、1:8000希釈(ウェル当たり100μl)で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトIgG−HRP(H+L)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)発色
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、30分間室温でインキュベーションした。
6)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
7)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
HX009−5抗体(実施例1で得られた)は、HX006抗体(IgG1サブタイプ)と比較して、ELISAによりCD32bへの結合が検出された。詳細は下記に示される。
1)抗体コーティング
ELISAプレートを0.5μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のCD32b抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
CD32b抗原で塗布したELISAプレートを1%BSA(PBSバッファで希釈)で、37℃で2時間ブロッキングし、その後1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
3)一次抗体とのインキュベーション
HX009−5抗体を、それぞれ10μg/mlから1:5ずつ段階希釈し、7つの勾配抗体溶液を得た。7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロールを、ブロッキングしたELISAプレートにそれぞれ添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
4)二次抗体とのインキュベーション
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、1:8000希釈(ウェル当たり100μl)で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトIgG−HRP(H+L)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)発色
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、30分間室温でインキュベーションした。
6)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
7)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
HX009−5抗体(実施例1で得られた)は、HX006抗体(IgG1サブタイプ)と比較して、ELISAによりCD64への結合が検出された。詳細は下記に示される。
1)抗体コーティング
ELISAプレートを0.5μg/ml(ウェル当たり100μl)の濃度のCD64抗原で塗布し、4℃で一晩インキュベーションした。
2)ブロッキング
CD64抗原で塗布したELISAプレートを1%BSA(PBSバッファで希釈)で、37℃で2時間ブロッキングし、その後1%Tween−20を含有する1×PBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
3)一次抗体とのインキュベーション
HX009−5抗体を、それぞれ10μg/mlから1:5ずつ段階希釈し、7つの勾配抗体溶液を得た。7つの勾配抗体溶液及びブランクPBSコントロールを、ブロッキングしたELISAプレートにそれぞれ添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
4)二次抗体とのインキュベーション
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、1:8000希釈(ウェル当たり100μl)で、二次抗体としてのヤギ抗ヒトIgG−HRP(H+L)を添加し、37℃で1時間インキュベーションした。
5)発色
ELISAプレートをPBSTバッファで3回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのTMBをウェル当たり100μl添加し、30分間室温でインキュベーションした。
6)発色の終了
ウェル当たり50μlの2MのH2SO4溶液を添加して、発色を終了させた。
7)読み
マイクロプレートリーダー上で、450nmの波長下で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
混合リンパ球反応(MLR)によって、Tリンパ球を刺激して、IL−2及びIFN−γを分泌する能力は、HX009−5(実施例1で得られた)とH8との間で検出された。詳細を下記に示す。
具体的な工程は、下記の通りである。
1.ボランティアから、5mlの末梢血を5mlのヘパリンで抗凝固剤処置した管に集め、穏やかに振盪して十分に接触させた。15mlの遠心管に移し、穏やかな振盪下で、9mlのPBSと混合した後、末梢血を2100rpmで10分間遠心分離した。
2.赤血球層の上にある白血球を含む上澄みを捨て、再懸濁するために12mlのPBSを添加し、その後1500rpmで5分間遠心分離した。
3.赤血球層の上にある上澄みを捨て、再懸濁するために12mlのPBSを添加し、1500rpmで5分間遠心分離した。
4.工程3を2回繰り返した。
5.上澄みを捨てた後、1mlの赤血球懸濁液を15mlの遠心管に移し、9mlのPBSと混合し、PBS中10%の赤血球として使用時に備えて調製した。
6.PBS中10%赤血球1mlを、新しい15mlの遠心管内で9mlのPBSと混合し、使用時に備えてPBS中1%赤血球を得た。
7.様々な試験サンプルの調製
1)HX009−5を9.1mg/mlから0.9mg/mlまで希釈し、更に1:3に段階希釈し、12個の勾配濃度を得た。
2)H8を10mg/mlから0.9mg/mlまで希釈し、更に1:3に段階希釈し、12個の勾配濃度を得た。
3)ポテト(potation)レクチン抽出溶液を1:3に段階希釈し、8個の勾配濃度を得た。
4)PBSをブランクコントロールとした。
ヒト未分化大細胞リンパ腫(KARPAS−299)を皮下移植したMixenoモデルにおけるH8及びHX009−5(実施例1で得られた)の抗腫瘍有効性における研究について、ヒト腫瘍移植モデルをNSGマウスで樹立した。詳細は下記に示される。
Claims (18)
- 抗PD−1抗体と;
ヒトシグナル調節タンパク質α(SIRPA)細胞外セグメントと、
を含む組換えタンパク質であって、
前記ヒトSIRPA細胞外セグメントのN末端は、前記抗PD−1抗体の重鎖のC末端に接続され、
前記抗PD−1抗体が、配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖とを含むことを特徴とする組換えタンパク質。 - 前記抗PD−1抗体が、PD−1に対するIgG様抗体である請求項1に記載の組換えタンパク質。
- 前記組換えタンパク質が、更にリンカーを含み、
前記リンカーのN末端が、前記抗PD−1抗体の重鎖のC末端に接続され、前記リンカーのC末端が、前記ヒトSIRPA細胞外セグメントのN末端に接続される請求項1に記載の組換えタンパク質。 - 前記リンカーが、配列番号1のアミノ酸配列を含む請求項3に記載の組換えタンパク質。
- 前記ヒトSIRPA細胞外セグメントが、配列番号7のアミノ酸配列を含む請求項1に記載の組換えタンパク質。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖と;
配列番号3のアミノ酸配列を含む融合ペプチドと、
を含み、
前記融合ペプチドは、前記抗PD−1抗体の重鎖と、前記リンカーと、前記ヒトSIRPA細胞外セグメントとを含む請求項3に記載の組換えタンパク質。 - 請求項1から6のいずれかに記載の組換えタンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
- 前記核酸が、
前記抗PD−1抗体の軽鎖をコードする第1のヌクレオチド配列と;
前記抗PD−1抗体の重鎖と、前記ヒトSIRPA細胞外セグメントとをコードする第2のヌクレオチド配列と、
を含む請求項7に記載の核酸。 - 前記第2のヌクレオチド配列が、更にリンカーをコードする請求項8に記載の核酸。
- 前記核酸が、
配列番号2の抗PD−1抗体の軽鎖をコードする配列番号4の第1のヌクレオチド配列と;
配列番号3で表される融合ペプチドをコードする配列番号5の第2のヌクレオチド配列と、
を含み、
前記融合ペプチドは、前記抗PD−1抗体の重鎖と、前記リンカーと、前記ヒトSIRPA細胞外セグメントとを含む請求項9に記載の核酸。 - 請求項1から6のいずれかに記載の組換えタンパク質を発現するコンストラクトであって、
請求項1の抗PD−1抗体の軽鎖をコードする第1の核酸分子と;
請求項1の抗PD−1抗体の重鎖と、請求項1のヒトSIRPA細胞外セグメントとをコードする第2の核酸分子と、を含み、
任意に、前記コンストラクトが、前記第1の核酸分子に機能可能に結合されるプロモーターを更に含むことを特徴とするコンストラクト。 - 前記第2の核酸分子が、更にリンカーをコードする請求項11に記載のコンストラクト。
- 前記プロモーターが、U6、H1、CMV、EF−1、LTR、又はRSVプロモーターから選択される請求項11から12のいずれかに記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトのベクターが、非病原性ウイルスベクターであり、
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はアデノウイルス関連ウイルスベクターから選択される少なくとも1つを含む請求項11から13のいずれかに記載のコンストラクト。 - 請求項1から6のいずれかに記載の組換えタンパク質を調製する方法であって、前記方法が、
請求項11から14のいずれかに記載のコンストラクトを哺乳類細胞に導入することと;
タンパク質の発現と分泌に適した条件下で前記哺乳類細胞を培養し、前記組換えタンパク質を得ることと、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記哺乳類細胞が、CHOK1、CHOS、293F、及び293Tから選択される少なくとも1つである請求項15に記載の方法。
- 請求項1から6のいずれかに記載の組換えタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする癌を治療する治療組成物。
- 癌に罹患する患者の癌を治療する医薬の製造のための請求項1から6のいずれかに記載の組換えタンパク質又は前記組換えタンパク質を含む治療組成物の使用。
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