CN113150167A

CN113150167A - 一种能够反转pd-1免疫抑制信号的car t细胞结构em1设计

Info

Publication number: CN113150167A
Application number: CN202010076165.2A
Authority: CN
Inventors: 张斌; 张昂; 王绅宇; 孙耀; 赵龙; 杨扬
Original assignee: Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Current assignee: Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明提供一种新型的CAR T结构能特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，同时还可反转PD1‑PDL1的免疫抑制信号，但又能对只表达PDL1的细胞不产生杀伤效应。其结构如附图2所示，其中1为CD19scfv(是可以识别肿瘤细胞所表达CD19蛋白的单链可变肽段)，2为连接段(用以链接CD19scfv和PD1的胞外段以及跨膜区)，3为PD1‑EM+TM(为PD1的胞外段和跨膜区，其中EM‑extramembrane指的是胞外段，TM‑transmembrane指的是跨膜区)，4为4‑1‑BB(为CAR T细胞的共刺激分子)，5为CD3ζ(为CAR T细胞的活化信号)。

Description

一种能够反转PD-1免疫抑制信号的CAR T细胞结构EM1设计

技术领域

本发明属于一种新型的嵌合型抗原受体免疫(chimeric antigen receptor)T细胞的结构设计，不仅可以特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，而且还可以反转 PD1-PDL1免疫抑制信号，且不引起对仅表达PD-L1细胞的特异性杀伤的脱靶效应(on target offtumor effect)。

背景技术

嵌合型抗原受体T(chimeric antigen receptor T cell-CAR T)细胞是一种能够特异性杀伤表达肿瘤相关性抗原(tumor associated antigen-TAA)的T细胞，在肿瘤的免疫治疗中占比高达40％¹。CAR T细胞的基本结构从胞外到胞内依次为针对肿瘤相关抗原的单链可变区(Single chain variable fragment-scfv)，铰链区 (hinge)，跨膜区(Transmembrane domain-TM)和胞内段(Intracellular domain- IM)组成²。根据胞内段共刺激分子的不同，可将CAR T细胞分为一代CAR T细胞——只含有CD3ζ(为CD3复合体的一部分)的胞内段；二代CAR T细胞——含有一个共刺激分子(CD28或者CD137)；三代CAR T细胞——含有两个共刺激分子和四代CAR T细胞——在二代CAR T的基础上分泌可以促进CART 细胞活化和生长的分子³，其示意图附图1所示。附图1从左至右分别是一代 CAR T细胞、二代CAR T细胞、三代CAR T细胞、四代CAR T细胞。

目前CAR T细胞虽然在治疗B细胞肿瘤上，特别是针对急性淋巴细胞白血病上取得了良好的临床疗效，但是经典的二代CAR T细胞并不能有效控制高表达免疫抑制信号分子受体的肿瘤⁴。因此进一步的优化CAR T细胞的结构，使得 CAR T细胞能够抵抗免疫抑制信号，扩大CAR T的有效性是目前CAR T细胞亟待解决的课题。本研究针对CD19的肿瘤靶点，旨在设计出一种能够杀伤表达 CD19肿瘤靶点的CAR T细胞，同时可以反转PD1-PDL1免疫抑制信号的结构，但又不会杀伤仅仅只表达PDL1的正常细胞。

针对抑制PD1-PDL1的免疫抑制信号和CAR T细胞联合使用的想法，已经有了不少研究——有研究者直接将针对CD19的CAR T细胞和PD1单抗联合使用治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤，其PD-1单抗可以刺激CAR T细胞的再次增殖同时确实可以加强肿瘤病灶的清除⁵，但是PD-1的全身广泛应用不仅可能会导致更多的免疫检查点抑制剂所使用所导致的不良反应的发生，而且也会加重治疗的成本；有研究者在CAR T的基础上设计出可以分泌PD1，PDL1的单抗也可以增强CAR T细胞的免疫活性^5,6；还有研究者在CAR T细胞上并联一个PD- 1(胞外段)CD28(跨膜区和胞内段)的嵌合蛋白，不仅可以阻断PD1-PDL1的免疫抑制信号，而且还可以将PD1接受到的免疫抑制信号转化成免疫活化信号，已达到增强CAR T细胞活性的作用，但是这样设计的CAR T细胞在杀伤既表达肿瘤相关抗原和PDL1的肿瘤细胞时会分泌更多的细胞因子，这样会进一步加重 CAR T在治疗过程中所导致的CRS的风险⁷。总结来说，EM1结构的CAR T细胞不仅能够反转PD1-PDL1的免疫抑制信号，而且还不会引起更多的细胞分泌，同时还没有造成在治疗肿瘤过程中额外经济负担的增加。

发明内容

本发明提供一种新型的CAR T结构能特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，同时还可反转PD1-PDL1的免疫抑制信号，但又能对只表达PDL1的细胞不产生杀伤效应。其结构如附图2所示，其中1为CD19scfv(是可以识别肿瘤细胞所表达CD19蛋白的单链可变肽段)，2为连接段(用以链接CD19scfv和 PD1的胞外段以及跨膜区)，3为PD1-EM+TM(为PD1的胞外段和跨膜区，其中EM-extramembrane指的是胞外段，TM-transmembrane指的是跨膜区)，4 为4-1-BB(为CAR T细胞的共刺激分子)，5为CD3ζ(为CAR T细胞的活化信号)。

CD19单链抗体包含SEQ 1序列。连接段包含SEQ 2序列。PD1-EM+TM包含SEQ 3序列。4-1-BB包含SEQ 4序列。CD3ζ包含SEQ 5序列。起始段信号肽含有SEQ 6序列。

附图说明

附图1不同CAR T的结构示意图；

附图2CAR T制备的流程图；

附图3不同结构的CAR T细胞CAR的表达效率；

附图4同结构的CAR T细胞对于CD19^-PDL1^-和CD19⁺PDL1^-细胞的杀伤效率；

附图5不同结构的CAR T细胞对于CD19⁺PDL1⁺的杀伤效率；

附图6不同结构的CAR T细胞对于CD19⁺PDL1⁺的杀伤效率；

附图7不同结构的CAR T细胞和肿瘤细胞孵育后细胞因子的释放；

附图8T，2nd和EM1^PD-1从第三天到第11天的增殖曲线；

附图9不同CAR T细胞的特异性增殖

附图10不同CAR T细胞对于CD19蛋白的亲和力；

附图11不同的CAR T细胞培养至7天的表型变化；

附图12不同效应细胞和NALM-6细胞孵育之后免疫抑制marker的表达；

附图13NSG负瘤NALM-6-PDL1小鼠的动物实验步骤；

附图14NSG负瘤NALM-6-PDL1小鼠的动物肿瘤负荷的荧光成像图；

附图15NSG负瘤NALM-6-PDL1小鼠的动物肿瘤负荷的变化；

附图16NSG负瘤NALM-6-PDL1小鼠的动物的生存曲线。

具体实施方式

一种EM2设计结构的序列自5’端顺次连接起始段信号肽含有SEQ 6序列、 CD19单链抗体SEQ 1序列、连接段SEQ 2序列、PD1-EM+TM的SEQ 3序列、 4-1-BB的SEQ 4序列、CD3ζ的SEQ 5序列。

一、材料

1.标本采集：实验所用的人外周单个核淋巴细胞来源于307医院健康供者，报经医院伦理委员会批准(伦理编号：Ky-2018-5-37)并征得供者同意。

2.实验用试剂：CD3，CD28分选并活化T细胞磁珠(美国，Gibco公司)，IL-2 (中国，双鹭)，X-VIVO-15(美国，公司lonza)，胎牛血清(FBS，美国Gibco 公司)，Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE医疗集团),FITC-CD 19(20-291)(中国，Acro)；CD3-precp,TIM-3-APC，BCL-2-PE，CTLA-4-APC，CD19-APC(美国， biolegend)；PDL1-PE，CD45RA-FITC，PD1-APC，CD62L-PECD4-FITC/CD8- PE/CD3-Precp(美国，BD公司)

二、方法

(一)所有CAR T细胞的结构如附图1所示：

实验分组：

实验组，其CAR T结构为——

CD19scfv-linker-PD1EM+TM-4-1BB-CD3ζ(以下简称EM1组)

对照组，其CAR T结构分别为——

1.未进行修饰的T细胞，

2.CD19scfv-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3ζ(简称2nd)

3.CD19scfv-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3z-T2A-PD1EM-CD28TM+IM(简称switch^PD1CD28)

4.CD19scfv-linker-PD1 EM-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3ζ组(简称OR- gate^PD-1组)

(二)其中所有结构的详细序列见-细胞制备其流程图，如附图2所示：

(三)在第5天检测不同结构CAR T细胞的CAR的表达效率：(检测荧光耦合蛋白：CD19-FITC可以特异性的和CD19scfv进行结合)

采用BD C6流式检测仪，取培养前及培养后细胞悬液50ul均分为1管，每管各加入CD19-FITC(1ug)流式蛋白，各管涡旋震荡后室温下避光孵育60min，加入适量PBS(1％BSA)，400×g室温水平离心3min，弃上清液——进行两遍，加入PBS 100μl上机测定。结果见附图3所示：

三、CAR T细胞和表达不同抗原的细胞孵育进行杀伤实验以验证其安全性和有效性：

实验方法：

具体实验流程如下所示：

1)用CSFE荧光染料将靶细胞进行染色

2)将靶细胞和效应细胞在EP管中进行混合，进行共孵育12-16小时

3)离心。倒出上清，并加入1ml PBS，然后继续离心，到处上清；

4)在每管中加入结合缓冲液Binding buffer 200ul,7AAD 5ul,Annexin-V- APC5ul，充分混匀后，避光室温孵育15分钟

5)一个小时内将所有样本上流式细胞仪检测完毕，我们认为FITC⁺且7AAD⁺或者Annexin-Ⅴ⁺的细胞为凋亡的细胞。

细胞染色的具体方法如下：

a.将靶细胞取出用PBS进行洗涤一遍，然后计数；

b.按照1ul细胞染料：10⁶个细胞的比例将细胞和染料进行充分混合；

c.然后避光孵育15min,之后加入适量的培养基(带血清)将细胞密度调整到需要的密度即可使用。

(—)有效性的验证实验结果：

在CD19⁺的细胞系上进行的实验，检测不同结构的CAR T对于CD19⁺的细胞是否具有特异性杀伤作用，其结果如附图4所示：

注：K：K562，K19：K562-CD19，N：NALM-6。

结果表明：EM1结构的CAR T细胞对于CD19+的肿瘤细胞具有特异性杀伤能力，而且其杀伤能力不比2nd结构的CAR T细胞弱。

在CD19⁺PDL1⁺的细胞系上进行的实验，检测不同结构的CAR-T对于 CD19⁺PDL1⁺的细胞是否具有增强的特异性杀伤作用，其结果如附图5所示：

附图5中NL：NALM-6-PDL1，KL19：K562-CD19-PDL1。

结果表明：EM1结构的CAR T细胞对于CD19⁺PDL1⁺在效靶比为5:1时比2nd 结构的CAR T细胞更有更强的肿瘤细胞具有特异性杀伤能力。

在CD19^-PDL1⁺的细胞系上进行的实验，检测不同结构的CAR-T对于CD19^- PDL1⁺的细胞是否具有特异性杀伤作用已验证其会不会产生脱靶性杀伤作用，其结果如附图6所示：

图6中K-L：K562-PDL1，786o：天然高表达PDL1。

结果表明：OR-gate^PD-1结构的CAR T细胞对于CD19^-PDL1⁺具有脱靶性的杀伤作用，switch在一定程度上也具有脱靶性杀伤作用。

小结：EM1结构的CAR T细胞对于CD19⁺PDL1^-的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用；EM1结构的CAR T细胞对于CD19⁺PDL1⁺的肿瘤细胞相比较2nd结构的 CAR T细胞具有更强的杀伤作用；EM1结构的CAR T细胞不会对CD19^-PDL1⁺的肿瘤细胞产生脱靶的杀伤作用。

四、不同的CAR T细胞和相应的效应细胞进行共孵育其IL2，TNF-α，IFN-γ分泌的情况：

(一)实验方法：

将不同的CAR T细胞和相应的靶细胞按照1:1至2×10⁴：2×10⁴比例进行充分混合，其培养基为1640(10％FBS)，然后在二氧化碳培养箱孵育24小时后用 ELSA试剂盒进行检测其细胞上清中细胞因子的分泌量。

(二)检测结果见附图7：

结论：表达EM1结构的相对于其他CAR T结构而言在和靶细胞相孵育的过程中释放的IFN-γ，TNF-α，IL-2更少，可能输注人体后不会引起强烈的CRS，因此安全性更强。

五、不同结构的CAR T细胞在培养过程中的增殖情况以及和相应的靶细胞共孵育之后的特异性增殖情况；

(一)不同结构的CAR T细胞在培养过程中的增殖情况见图8：

培养条件：

培养基为X-VIVO-15，IL-2-100u/ml,CD3，CD28磁珠活化；在培养过程中一直让其细胞密度处于5×10⁵—5×10⁶之间；

(二)特异性增殖情况

采用培养第九天的CAR T细胞，进行CSFE染料染色，然后和不同的靶细胞进行孵育，过48小时后检测不同CAR T细胞荧光衰减的程度，来确定CAR T细胞的特异性增殖情况，如附图9所示：

实验分组：

1、CAR T细胞组；

2、CAR T细胞和786o细胞孵育组(只表达PD-L1)；

3、CAR T细胞和786o-CD19细胞孵育组(既表达CD19又表达PDL1)；

六、检测不同结构的CAR T细胞和CD19蛋白亲和力的检测：

实验目的：我们通过检测不同CAR-T细胞对于不同浓度下的CD19蛋白的结合强度，从而确定出他们对CD19蛋白的亲和力。

试剂信息：

实验仪器

名称	货号	厂家
			流式细胞仪	NovoCyte D3010	AECA
台式微量离心机	microfuge 16	贝克曼库尔特
			漩涡混合仪	88880018	Thermo

实验方法：

细胞中加入洗液(PBS+1％BSA)，离心洗两次；加入CD19-FC蛋白(11880- H02H)至终浓度依次为180μg/mL、72μg/mL、28.8μg/mL、11.52μg/mL、 4.61μg/mL、1.84μg/mL、0.74μg/mL、0.29μg/mL、0.12μg/mL、0.05μg/mL， 4℃避光孵育45min，加入洗液离心洗细胞2次；加入10μL Goat Anti-Human- IgG(Fc)/FITC，4℃避光孵育20min，加入洗液离心洗细胞2次，上机检测。

实验结果，如附图10所示：

七.检测同一批CAR T细胞培养至7天的表型，我们检测了不同CAR T细胞的表型变化，其结果如附图11所示：

我们采用：

：CD45RA+，CD45RO-，CCR7+，

TSCM：CD45RA+，CD45RO+，CCR7+，

CM：CD45RA-，CD45RO+，CCR7+，

EM：CD45RA-，CD45RO+，CCR7-。

其中简称：CM,central memory-中枢记忆型细胞；EM,effector memory-效应记忆型细胞；TSCM,stem memory T cell-干性记忆型T细胞，

-幼稚T细胞。

八.不同CAR T细胞和表达CD19的肿瘤细胞NALM-6孵育完毕之后，其免疫抑制marker的表达情况，如下图12所示：

实验方法：

我们将培养至9天的效应细胞分别按照1:1(5×10⁴：5×10⁴)济宁孵育24后，我们用流式细胞仪分别检测不同效应细胞PD1，PDL1，TIM3和CTLA-4的免疫抑制的marker的表达差异。

小结：我们通过比较Mock-T细胞,2nd和EM1的CAR T细胞分别和NALM 6 孵育之后抑制Marker的对比发现，其中表达EM1的CAR T细胞的免疫抑制 marker表达量最低。

九.研究不同的CAR T细胞对于NSG小鼠负瘤(NALM-6-PDL1)的控制情况：

实验目的：研究表达不同结构的CAR的效应细胞，对于NSG小鼠负瘤(NALM- 6-PDL1)的控制情况；

实验步骤，见附图13：

1.建立肿瘤模型：取6-8周的雌性NSG小鼠，然后在第0天接种10⁶/只NALM- 6-PDL11-GFP-luc(luciferase)，每组5只小鼠，随机分成5组；

2.在第1天，5组小鼠分别接种：T细胞，2nd，Switch^PD-1CD28，EM1和OR gate^PD1的CAR T细胞2×10⁶/只(是CAR T阳性的细胞数目，其中T细胞这一组的细胞数和2nd这一组的细胞总数一致)；

3.分贝在第7,14,21……采用活成成像仪检测小鼠体内的肿瘤负荷；

4.第3天，采小鼠外周血，检测小鼠体内的细胞因子的含量。

实验结果，其结果见附图14、15、16：

1.EM1 CAR T能比2nd更好的控制小鼠体内的肿瘤，且延长小鼠的生存曲线；

2.2nd CAR T细胞并不能有效控制高表达免疫抑制分子PDL1的肿瘤细胞；

参考文献：

1Almasbak,H.,Aarvak,T.&Vemuri,M.C.CAR T Cell Therapy:A Game Changerin Cancer Treatment.Journal of immunology research 2016,5474602,doi:10.1155/2016/5474602 (2016).

2Haji-Fatahaliha,M.et al.CAR-modified T-cell therapy for cancer:anupdated review. Artificial cels,nanomedicine,and biotechnology,1-11,

doi:10.3109/21691401.2015.1052465(2015).

3Allegra,A.,Innao,V.,Gerace,D.,Vaddinelli,D.&Musolino,C.Adoptiveimmunotherapy for hematological malignancies:Current status and new insightsin chimeric antigen receptor T cells.Blood cels,molecules&diseases 62,49-63,

doi:10.1016/j.bcmd.2016.11.001(2016).

4Gowrishankar,K.,Birtwistle,L.&Micklethwaite,K.Manipulating the tumormicroenvironment by adoptive cell transfer of CAR T-cells.Mamm Genome 29,739-756,doi:10.1007/s00335-018-9756-5(2018).

5Elise A.Chong,J.J.M.,2Simon F.Lacey,2David E.Ambrose,2VanessaGonzalez,2Bruce L.Levine,2 Carl H.June,2 and Stephen J.Schuster1.PD-1blockade modulates chimeric antigen receptor(CAR)-modified T cells:refuelingthe CAR.Blood(2016).

6Eloah Rabello Suarez1,3 J.Freeman2,5&,D.-K.C.,2,Jiusong Sun1,2,Sabina Signoretti6,Quan Zhu1,2,Jianhua Sui4,Wayne A.Marasco1,2.Chimericantigen receptor T cells secreting anti-PD-L1 antibodies more effectivelyregress renal cell carcinoma in a humanized mouse model.Oncotarget(2016).

7Liu,X.et al.A Chimeric Switch-Receptor Targeting PD1 Augments theEfficacy of Second-Generation CAR T Cells in Advanced Solid Tumors.Cancer Res76,1578-1590, doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-2524(2016)。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心

<120> 一种能够反转PD-1免疫抑制信号的CAR T细胞结构EM1设计

<130> 2020.1.22

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 360

ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 420

tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 480

cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 600

ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 660

tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 720

tcctca 726

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ggaggtggag gatcaggggg tgggggatcc ggcggtggcg gatctggagg tggtggttca 60

<210> 3

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420

aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 480

ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atc 513

<210> 4

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60

actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120

gaactg 126

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

Claims

1.一种CAR T结构，包括如下结构段：单链抗体、连接段、PD1蛋白的胞外段和跨膜区、CAR T细胞共刺激分子、CAR T细胞的活化信号。

2.如权利要求1所述的CAR T结构，其特征在于单链抗体为CD19单链抗体。

3.如权利要求1所述的CAR T结构，其特征在于CAR T细胞共刺激分子为4-1-BB。

4.如权利要求1所述的CAR T结构，其特征在于CAR T细胞的活化信号为CD3ζ。

5.如权利要求2所述的CAR T结构，其特征在于CD19单链抗体包含SEQ 1序列。

6.如权利要求1所述的CAR T结构，其特征在于连接段包含SEQ 2序列。

7.如权利要求1所述的CAR T结构，其特征在于PD1蛋白的胞外段和跨膜区包含SEQ 3序列。

8.如权利要求3所述的CAR T结构，其特征在于4-1-BB包含SEQ 4序列。

9.如权利要求4所述的CAR T结构，其特征在于CD3ζ包含SEQ 5序列。

10.如权利要求1所述的CAR T结构，其特征在于起始段信号肽，含有SEQ 6序列。

11.一种如权利要求1所述的CAR T结构在制备治疗肿瘤药物中的应用。

12.一种如权利要求11所述的应用，其特征在于肿瘤为表达CD19和PDL1的肿瘤。