BR112016024072B1

BR112016024072B1 - método in vitro de estimular uma população de células

Info

Publication number: BR112016024072B1
Application number: BR112016024072-3A
Authority: BR
Inventors: Lothar Germeroth; Christian Stemberger
Original assignee: Juno Therapeutics Gmbh
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2021-02-09
Also published as: AU2015248786B2; US20170037368A1; IL293587A; WO2015158868A2; WO2015158868A3; CA2945889C; PT3132247T; SI3132247T1; PH12020551028A1; HRP20211430T1; AU2022200527A1; JP6696969B2; US11274278B2; KR20220150988A; EP3132247A2; DK3132247T3; CY1124717T1; JP2023062124A; SA516380090B1; JP2017513524A

Abstract

MÉTODOS, KITS E APARELHO PARA AMPLIAR UMA POPULAÇÃO DE CÉLULAS. A presente invenção refere- se a método in vitro de expandir uma população de células tal como linfócitos, compreendendo contatar uma amostra compreendendo uma população de células com um reagente de multimerização. O reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células e opcionalmente, um segundo agente que fornece um sinal co-estimulador. A invenção da mesma forma fornece reagentes de multimerização, kits, disposições e um aparelho para expandir células.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] A presente invenção reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente US Provisório US 61/980.506 "Methods, Kits And Apparatus For Expanding A Population Of Cell" depositado com a Patente US e Marca registrada Office em 16 de abril de 2014, os teores dos quais estão incorporados aqui por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se à expansão (proliferação) de uma população de células tal como uma população de linfócitos. A invenção em geral fornece novos métodos e reagentes para a expansão (proliferação) de populações de célula que requerem ligação de uma molécula de ligação de receptor (tal como um primeiro agente como descrito aqui) a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células. A invenção emprega um reagente de multimerização tem imobilizado sobre ele (ligação a isso) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células. Este sinal de ativação primário pode como tal ser suficiente para ativar as células para expandir/proliferar. Este primeiro agente pode ser ligado reversívelmente ou da mesma forma irreversivelmente ao reagente de multimerização. O reagente de multimerização pode ter imobilizado sobre ele (ligação a isso) da mesma da mesma forma um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células. O segundo agente, ao ligar-se à molécula adicional na superfície na superfície das células, pode desse modo estimular as células ativadas para expandir. Da mesma forma este segundo agente pode ser ligado reversivelmente ou da mesma forma irreversivelmente ao reagente de multimerização. O agente de multimerização pode ser imobilizado em um suporte sólido ou solúvel. Em um aspecto, o método descrito aqui é uma expansão serial de uma população de células em que uma população completa de linfócitos é estimulada/expandida, os reagentes necessário para a expansão são em seguida removidos por cromatografia em uma fase estacionária adequada e as células de expandidas/estimuladas são opcionalmente transfectadas com por exemplo um receptor de célula T ou um receptor de antígeno quimérico (CAR) e submetidas a uma segunda expansão de estímulo com uma molécula estimuladora diferente que se liga ao receptor de célula T introduzido ou o receptor de antígeno quimérico. A invenção da mesma forma refere-se a um aparelho para a expansão da população de célula selecionada.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[0003] O desenvolvimento de técnicas por propagar populações de célula T in vitro foi crucial a muitos dos avanços no entendimento de reconhecimento de célula T de antígeno e ativação de célula T. O desenvolvimento de métodos de cultura para a geração de clones de célula T específicos de antígeno humanos foi útil definindo-se antígenos expressos por patógenos e tumores que são reconhecidos por células T para estabelecer métodos de imunoterapia para tratar uma variedade de doenças humanas. Células T específicas de antígeno podem ser expandidas in vitro para uso em imunoterapia celular adotiva ou terapia de câncer em que infusões de tais células T foram mostradas ter reatividade anti-tumor em um hospedeiro suportando tumor. Além disso, imunoterapia adotiva foi da mesma forma usada para tratar infecções virais em indivíduos imunocom- prometidos.

[0004] Um método de expandir células T humanas in vitro na ausência de fator de crescimento exógeno e células adicionais que foram estabelecidas nos recentes anos é descrito na patente US 6.352.694 B1 e Patente Europeia EP 0 700 430 B1. Descrita nestas patentes é um método in vitro para induzir uma população de células T a proliferar. O método compreende contatar uma população de células T com uma superfície de fase sólida, tendo imobilizado diretamente sobre ele: (a) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células T, desse modo ativando as células T; e (b) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células T, desse modo estimulando as células T ativadas. A ligação do primeiro agente e o segundo agente para as células T induz as células T a proliferar/expandir. O primeiro agente preferido descrito na patente US 6.352.694 B1 e Patente Europeia EP 0 700 430 B1 é um anticorpo anti-CD3 monoclonal que se liga ao complexo de TCR/CD3 (TCR = Receptor de Célula T) e desse modo estimula o sinal associado ao complexo de TCR/CD3 nas células T. O segundo agente preferido de acordo com estas duas patentes é um anticorpo anti-CD28 monoclonal que se liga a molécula adicional CD28 que está presente em células T. Ligação deste segundo agente à molécula adicional de CD28 fornece o coestímulo necessário que é necessário para expansão/proliferação de células T ativadas. Enquanto isso, Dynabeads® CD3/CD28 (Invitrogen) são comercialmente disponíveis para expansão de célula T. Dynabeads® CD3/CD28 CTS™ são uniformes, 4.5 μ superparamagnética, estéril, esferas de poliestireno não pirogênicas revestidas com uma mistura de anticorpos monoclonais purificados por afinidade contra as moléculas de superfície de célula CD3 e CD28 em células T humanas.

[0005] Entretanto, tais esferas magnéticas são, por exemplo, difíceis de integrar em um método para para expandir células sob condições requeridas para tentativas clínicas ou propósitos terapêuticos vistos que tem que ter certeza que estas esferas magnéticas sejam completamente removidas antes da administração as células T expandidas a um paciente. Desse modo, a presente invenção aponta para fornecer um método alternativo para expandir populações de célula tal como células T reguladoras ou células T de memória central para propósitos de pesquisa, diagnósticos e especialmente terapêuticos. Idealmente, este novo método deveria da mesma forma ser compatível com integração em um processo automatizado que pode ser usado para expansão rápida e fácil da população de células desejadas para aplicações terapêuticas.

[0006] Este objetivo é resolvido pelo assunto das reivindicações independentes, entre outros os métodos, kits, arranjos e aparelhos como recitado nas reivindicações independentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] A presente invenção fornece métodos, kits, arranjos, e aparelho para expansão in vitro de uma população de célula desejada, tendo uma molécula receptora em sua superfície que pode fornecer sob ligação de um agente adequado um sinal de ativação primário para a população de células e desse modo ativar a população de células para expansão (proliferação). Desse modo, os métodos da invenção são da mesma forma usados para induzir uma população de células a proliferar.

[0008] De acordo com um primeiro aspecto, a invenção fornece um método in vitro de expandir uma população de células, compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células com um reagente de multimerização,

[0009] em que o reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células;

[00010] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível do primeiro agente,

[00011] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e

[00012] em que o primeiro agente liga-se a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células.

[00013] De acordo com um segundo aspecto a invenção fornece um método in vitro de expandir uma população de células, compreendendo contatar uma amostra compreendendo a população de células com um reagente de multimerização,

[00014] em que o reagente de multimerização está em uma forma solúvel e imobilizou (ligado a isso) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células;

[00015] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação do primeiro agente,

[00016] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de ligação ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e

[00017] em que o primeiro agente liga-se a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células.

[00018] De acordo com um terceiro aspecto a invenção fornece um kit de reagente para expandir uma população de células, o kit compreendendo,

[00019] (i) um reagente de multimerização,

[00020] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z para a ligação reversível de um primeiro agente,

[00021] (ii) um primeiro agente que se liga a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células,

[00022] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se a um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e

[00023] (iii) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células,

[00024] em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de reversivelmente ligar-se a um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2,

[00025] em que o segundo agente liga-se à molécula adicional na superfície na superfície das células, desse modo estimulando as células ativadas.

[00026] De acordo com um quarto aspecto a invenção fornece um kit de reagente para expandir uma população de células, o kit compreendendo,

[00027] (i) um reagente de multimerização,

[00028] em que o reagente de multimerização está na forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z para a ligação reversível de um primeiro agente,

[00029] (ii) um primeiro agente que se liga a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células,

[00030] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de ligação a um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1.

[00031] De acordo com um quinto aspecto a invenção fornece um método in vitro de serialmente expandir uma população de linfócitos, em que a população de linfócitos compreende células T, o método compreendendo,

[00032] contatar uma amostra compreendendo a célula T, que compreende população de linfócitos com um reagente de multime- rização,

[00033] em que o reagente de multimerização está em uma forma solúvel e tem reversivelmente imobilizado sobre ele (i) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células T e (ii) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células T,

[00034] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível do primeiro agente,

[00035] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1,

[00036] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z2 para a ligação reversível do segundo agente,

[00037] em que o segundo agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2,

[00038] em que o primeiro agente liga-se a uma molécula receptora na superfície das células T, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células T,

[00039] em que o segundo agente liga-se à molécula adicional na superfície das células T, desse modo estimulando as células ativadas, o primeiro agente e o segundo agente desse modo juntos induzindo as células T a se expandir.

[00040] De acordo com um sexto aspecto a invenção fornece um arranjo de um biorreator e uma fase estacionária para cromatografia,

[00041] em que o biorreator é adequado para a expansão de células,

[00042] em que a fase estacionária é adequada para separação de célula e remoção de reagentes, a fase estacionária sendo uma matriz de filtração de gel e/ou matriz de cromatografia de afinidade, que em que a matriz de filtração de gel e/ou cromatografia de afinidade compreende um reagente de afinidade, em que o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z1 especificamente ligando- se a um parceiro de ligação C1 compreendido em um primeiro agente e/ou o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z2 especificamente ligando-se a um parceiro de ligação C2 compreendido em um segundo agente, desse modo sendo adequado de imobilização na fase estacionária o primeiro agente e/ou o segundo agente, o primeiro parceiro de ligação C1 e/ou o segundo parceiro de ligação C2 livre,

[00043] em que o biorreator e a fase estacionária são fluidamente conectados.

[00044] De acordo com um sétimo aspecto a invenção fornece um aparelho para purificação e expansão de uma população de células, o aparelho compreendendo pelo menos um arranjo de um biorreator e uma fase estacionária para cromatografia de acordo com o sexto aspecto.

[00045] De acordo com um oitavo aspecto, a invenção fornece um reagente de multimerização capaz de expandir uma população de células,

[00046] em que o reagente de multimerização está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível de um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células,

[00047] em que o reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o referido primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células;

[00048] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se a pelo menos um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização,

[00049] em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1,

[00050] De acordo com um nono aspecto, a invenção fornece uma composição capaz de expandir uma população de células, a composição compreendendo,

[00051] (i) um primeiro reagente de multimerização,

[00052] em que o primeiro reagente de multimerização está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível de um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células,

[00053] em que o primeiro reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o referido primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células;

[00054] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se a pelo menos um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e

[00055] (ii) um segundo reagente de multimerização,

[00056] em que o segundo reagente de multimerização está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z2 para a ligação reversível de um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células,

[00057] em que o reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o referido segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células,

[00058] em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ligação a pelo menos um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00059] A invenção será melhor entendida com referência à descrição detalhada quando considerada juntamente com os exemplos não limitantes e os desenhos acompanhantes. As figuras ilustram modalidades dos métodos da invenção. Sem desejar ser ligado por teoria, as figuras incluem conclusões com respeito ao mecanismo de expansão subjacente. As conclusões são determinadas para propósitos ilustrativos apenas meramente servem permitindo-se uma visualização do método de expansão é realizável em um nível molecular.

[00060] Figura 1 descreve uma modalidade de um método expansão in vitro de expandir uma população de células que têm um receptor de superfície de célula a ligação da qual por um primeiro agente pode fornecer um sinal de ativação para as células para se expandirem.

[00061] Como mostrado na Fig. 1a uma amostra que compreende a população de células (2) que transporta uma molécula receptora de superfície (30) é contatada com um reagente de multimerização (4). A população de células (2) está em mistura com outras populações de célula (22) que falta a molécula receptora de superfície (30). O reagente de multimerização (4) tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um primeiro agente (6) que fornece um sinal de ativação primário às células. O reagente de multimerização (4) compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 (42) para a ligação reversível do primeiro agente (6) e o primeiro agente (6) compreende pelo menos um parceiro de ligação C1 (6a), em que o parceiro de ligação C1 (6a) é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 (44) do reagente de multimerização. Desse modo, para imobilização,o primeiro agente (6) é ligado ao reagente de multimerização (4) pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 (6a) e o sítio de ligação Z1 (42). No exemplo mostrado na Fig. 1 o reagente de multimerização (4) tem um segundo sítio de ligação Z2 (44) que não é usado neste exemplo. O reagente de multimerização (4) é imobilizado em um suporte sólido (10) tal como uma esfera magnética, uma esfera polimérica de uma superfície de uma placa de cultura de célula ou reator. A população de células (2) pode, por exemplo ser, uma população de célula de linfócito tal como uma população de células B que podem ser ativadas pelo receptor de CD40 (veja, por exemplo, Carpenter e outro, Journal of Translational Medicine 2009, 7:93 "Activation of human B cells by the agonist CD40 antibody CP- 870,893 and augmentation with simultaneous toll-like receptor 9 stimulation). Neste caso, a molécula de superfície de célula (30) é CD40 e o primeiro reagente (6) pode ser qualquer molécula de ligação de CD40 que fornece o sinal de ativação desejado, por exemplo, o anticorpo monoclonal CP-870,893 ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo tal como um fragmento Fab monovalente. O parceiro de ligação C1 do primeiro agente (6) pode, por exemplo, ser qualquer peptídeo de afinidade que é fusionado ou conjugado, por exemplo, o C-terminal de uma ou duas cadeias de polipeptídeo (cadeia pesada ou leve) da molécula de anticorpo. O parceiro de ligação C1 (6a) pode, por exemplo, ser um peptídeo de ligação à estreptavidina tal como o peptídeo Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 01), da mesma forma conhecido como "Strep-tag®") que é descrito na patente US 5.506.121, por exemplo, ou peptídeos de ligação à estreptavidina tendo um arranjo sequencial de dois ou mais módulos de ligação individuais como descrito em Publicação de Patente Internacional WO 02/077018 ou Patente US 7.981.632. Ao usar um peptídeo de ligação à estreptavidina como parceiro de ligação C1, o reagente de multimerização (4) pode ser qualquer muteína de estreptavidina a qual o peptídeo estreptavidina (= primeiro parceiro de ligação C1 (6a)) reversivelmente liga-se por seus (biotina) sítios de ligação Z1 (42) esquematicamente mostrados na Fig. 1. Um tal reagente de multimerização pode ser uma muteína de estreptavidina (análogo) que compreende a sequência de aminoácido Va144-Thr45- Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 02) nas posições de sequência 44 a 47 de estreptavidina tipo selvagem ou uma muteína de estreptavidina (análogo) que compreende a de sequência de aminoácido lle44-Gly45- Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) nas posições de sequência 44 a 47 de estreptavidina tipo selvagem ambas das quais são descritas na patente US 6.103.493 por exemplo, e estão comercialmente disponíveis sob a marca registrada Strep-Tactin®. No Exemplo da Fig. 1, o reagente de multimerização (4) poderia também incluir calmodulina multimérica ou glutationa-S-transferase, ambos os quais formam ligações reversíveis com peptídeos de ligação à calmodulina ou glutationa. Desse modo, o sítio de ligação Z2 (44) pode ser formado por calmodulina ou glutationa-S-transferase. Tal conjugado de proteína de, por exemplo, calmodulina com uma muteína de estreptavidina pode ser feito por química de proteína padrão, por exemplo, usando ligantes bifuncionais.

[00062] Como mostrado na Fig. 1b, depois de contatar a população de célula (2) com o reagente de multimerização (4) e normalmente incubando a população de célula com o reagente de multimerização (4), a população de células (2) forma complexos/é ligada ao agente de multimerização pelo primeiro agente (6). O primeiro agente especificamente liga-se à molécula receptora de superfície de célula tal como CD40 neste Exemplo e fornece o sinal de ativação para expansão de célula, de por exemplo células B. As outras populações de célula (22) contidas na amostra inicial que falta a molécula de superfície de célula específica (30) não se ligam ao reagente de multimerização. Neste respeito, é notado que a população de célula (2) normalmente tem cópias múltiplas da molécula de superfície de célula (30) em sua superfície e ligação destas cópias múltiplas é tipicamente necessária para ativação. Desse modo, o agente de multimerização (4) forneça tipicamente mais do que um sítio de ligação Z1 de forma que primeiros agentes múltiplos (6) podem ser reversivelmente ligados para obter "multimerização"do primeiro agente, pretendendo apresentar o primeiro agente em uma densidade suficiente à população de células (2) (não mostrado no esquema da Fig.1). Neste respeito, é notado que agente de multimerização quando aqui usado pode tal como ter sítios de ligação múltiplos Z1, por exemplo, uma muteína de estreptavidina (sendo um homo-tetrâmero) em seu estado nativo tem quatro tais sítios de ligação Z1. É, entretanto, da mesma forma possível que o reagente de multimerização esteja com base em um composto que tem como tal apenas um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível de um parceiro de ligação C1. Tal exemplo é calmodulina multimérica. Calmodulina como tal tem apenas um sítio de ligação para peptídeos de ligação à calmodulina. Entretanto, calmodulina pode ser biotinilada e em seguida pode reagir com oligômeros de estreptavidina (veja da mesma forma abaixo), fornecendo um reagente de multimerização em que moléculas de calmodulina múltiplas são apresentadas em densidade alta em um "arcabouço", desse modo fornecendo calmodulina multimérica.

[00063] Como mostrado na Fig.1c, depois da incubação (que é normalmente realizada durante um certo tempo adequado para obter expansão da população de célula desejada) a ligação entre o parceiro de ligação C1 (6a) do primeiro agente (6) e o sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização (4) é rompido rompendo-se a ligação reversível respectiva. O rompimento pode ser obtido adicionando um competidor à mistura de incubação/reação contendo a população de células (2) sendo ligado ao reagente de multimerização. Para rompimento competitivo (que pode ser entendido como sendo uma eluição competitiva) da ligação reversível entre o parceiro de ligação C1 (6a) do primeiro agente e o sítio de ligação Z1 (22) do reagente de multimerização, a mistura/população de incubação de células podem ser contatada com um primeiro parceiro de ligação C1 livre (20) ou um análogo do referido primeiro parceiro de ligação C que é capaz de romper a ligação entre o primeiro parceiro de ligação C1 (6a) e o sítio de ligação Z1 (22). No exemplo do parceiro de ligação C1 sendo um peptídeo de ligação à estreptavidina que se liga a sítio de ligação à biotina de estreptavidina, o primeiro parceiro livre C1 (20) pode ser o peptídeo de ligação à estreptavidina livre correspondente ou um análogo que se liga competitivamente. Um tal análogo pode, por exemplo, ser biotina ou um derivado de biotina tal como destiobiotina.

[00064] Como mostrado na Fig. 1d, adição do primeiro parceiro livre (20) ou o análogo do mesmo resulta em deslocamento do parceiro de ligação C1 (6a) do reagente de multimerização (4) e desse modo, visto que o parceiro de ligação C1 é compreendido no primeiro agente (6), deslocamento do primeiro agente (6) do reagente de multimerização (4). Este deslocamento do primeiro agente (6) sucessivamente resulta em uma dissociação do primeiro agente (6) do receptor de superfície de célula (30), em particular se a afinidade de ligação da ligação entre o primeiro agente e o receptor de superfície de célula (30) tem uma dissociação constante (Kd) na faixa de 10-2 M a 10-13 M e é desse modo da mesma forma reversível. Devido a esta dissociação, o estímulo da população de célula (2) é da mesma forma terminado. Desse modo, a presente invenção fornece a vantagem que o período de tempo do estímulo ou expansão da população de célula pode ser exatamente controlado e desse modo da mesma forma o estado funcional da população de célula pode ser intimamente controlado. Neste contexto, é notado que a afinidade de ligação de moléculas de anticorpo ao seu antígeno, incluindo por exemplo, uma molécula receptora de superfície de célula tal como CD40 neste Exemplo, está normalmente na faixa de afinidade do Kd de 10-7 M a 1013 M. Desse modo, anticorpos monoclonais convencionais podem ser usados como primeiro agente (e da mesma forma claro que segundo agente como explicado abaixo) na presente invenção. Para evitar qualquer efeito de avidez indesejado que leva a uma ligação mais forte, anticorpos monoclonais podem da mesma forma ser usados em forma de seus fragmentos de anticorpo monovalentes tal como fragmentos Fab ou fragmentos de Fv de cadeia única.

[00065] Além disso, devido à dissociação do primeiro agente da molécula de superfície de célula (30), a presente invenção tem a vantagem adicionada que a população de célula estimulada está livre de agentes estimulantes ao término do período de estímulo e que todos os outros reagentes usados no método, isto é o primeiro agente (6) bem como o primeiro parceiro livre (20) do parceiro de ligação C1 ou o análogo do mesmo podem facilmente ser removidos da população de célula estimulada (2) por meio de um "cartucho de remoção"descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474 enquanto o reagente de multimerização (4) sendo imobilizado em um suporte sólido tal como uma superfície de biorreator ou uma esfera magnética está sendo segurada. Desse modo, revertendo à remoção do agente livre (6) e o primeiro parceiro livre (20), de acordo com a descrição do "cartucho de remoção"em WO 2013/124474 (veja com referência a Fig. 4 do mesmo, por exemplo), a amostra de eluição obtida na Fig. 1d aqui pode ser carregada sobre a segunda coluna de cromatografia de WO 2013/124474. Esta coluna de cromatografia tem uma fase estacionária adequada que é uma matriz de cromatografia de afinidade e, ao mesmo tempo, pode agir como matriz de permeação em gel. Esta matriz de cromatografia de afinidade tem um reagente de afinidade imobilizado sobre ele. O reagente de afinidade pode, no caso do Exemplo atual, por exemplo, ser estreptavidina, uma muteína de estreptavidina, avidina, um muteína de avidina ou uma mistura dos mesmos. O primeiro agente (6), o primeiro parceiro livre (20) do parceiro de ligação C1 (que é da mesma forma chamado "reagente de competição"aqui) liga-se ao reagente de afinidade, desse modo sendo imobilizado na matriz de cromatografia. Como um resultado a amostra de eluição contendo a população de célula isolada e expandida (2) está sendo esvaziada do primeiro agente (6) e do reagente de competição (20). A população de célula expandida (2), estando livre de qualquer reagente, é agora em uma condição para outro uso, por exemplo, para aplicações diagnósticas (por exemplo, outro separador de FACSTM) ou para qualquer aplicação terapêutica com base em célula.

[00066] Fig.2 mostra uma outra modalidade de um método de expansão da invenção. Como mostrado na Fig. 2a uma amostra compreende uma população de células (2) que transporta duas moléculas de superfície de célula específicas (30) e (32). A molécula de superfície de célula (30) está envolvida em um sinal de ativação primário para a população de célula, enquanto a molécula de superfície de célula (32) é uma molécula adicional na superfície de célula que está envolvida em fornecer um estímulo às células. A população de células pode, por exemplo, ser uma população de célula T em que a molécula de superfície de célula (30) é um complexo de TCR/CD3 e a molécula de superfície de célula (32) é a molécula adicional CD28. Ligação de ambos os complexos de TCR/CD3 como o sinal de ativação primário e CD28 como coestimulante são necessários para expansão/proliferação de células T. A população de células T (2) está em mistura com outras populações de célula (22) que falta as moléculas de receptor de superfície (30) e (32). Da mesma forma nesta modalidade, a população de célula (2) está contatada com um reagente de multimerização (4). O reagente de multimerização (4) tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um primeiro agente (6) que fornece um sinal de ativação primário às células. Além disso, o agente de multimerização tem reversívelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um segundo agente (8) que estimula CD28 como molécula adicional na superfície das células.

[00067] O reagente de multimerização (4) compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 (42) para a ligação reversível do primeiro agente (6) e o primeiro agente (6) compreende pelo menos um parceiro de ligação C1 (6a), em que o parceiro de ligação C1 (6a) é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 (44) do reagente de multimerização. Desse modo, para imobilização, o primeiro agente (6) é ligado ao reagente de multimerização (4) pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 (6a) e o sítio de ligação Z1 (42). Além disso, no Exemplo ilustrado na Fig. 2, o segundo agente (8) compreende um parceiro de ligação C2 (8a), em que o parceiro de ligação C2 é capaz de reversivelmente ligar-se a um sítio de ligação Z2 (44) do reagente de multimerização (4). O segundo agente (8) é ligado ao reagente de multimerização (4) pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C2 (8a) e o sítio de ligação Z2 (44). Neste Exemplo, o primeiro agente (6) poderia ser um anticorpo anti-CD3monoclonal ou um fragmento de antígeno de ligação do mesmo tal como um fragmento Fab. O segundo agente (8) poderia ser um anticorpo anti-CD28 monoclonal ou um fragmento de antígeno de ligação do mesmo tal como fragmento Fab. O primeiro parceiro de ligação (6a) poderia ser um peptídeo de ligação à estreptavidina (6a) que é fusionada ou conjugado ao anticorpo anti- CD3 ou o fragmento de anticorpo anti-CD3. O segundo parceiro de ligação (8a) poderia ser peptídeo de ligação à calmodulina que é da mesma forma conjugado ou fusionado ao anticorpo para CD28 ou fragmento de anticorpo para ligação CD28. Neste contexto, é notado que anticorpos monoclonais contra, por exemplo, CD3 ou CD28 são bem conhecidos (veja, por exemplo, Patente US 6.352.694 B ou Patente Europeia EP 0 700 430 B1 discutida acima) e está comercialmente disponível a partir de numerosos fornecedores tal como Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), Life Technologies, (Carlsbad, CA, USA), BD Biosciences (San Jose, CA, USA), Biolegend (San Diego, CA, USA) or Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) para nomear apenas alguns. Desta maneira, tais anticorpos monoclonais podem ser usados como primeiro e segundo agente e pode, por exemplo, ser quimicamente acoplado (conjugado) com um parceiro de ligação C1 ou C2. Alternativamente, é da mesma forma possível clonar os genes dos domínios variáveis a partir da linhagem de célula de hidridoma ou usar um anticorpo do qual a sequência de aminoácido é conhecida e produz um fragmento de anticorpo respectivo tal como um fragmento Fab ou um Fv de forma recombinante. Ao usar uma tal abordagem como descrito aqui na seção de Exemplo para ambos, a linhagem de célula de hibridoma OKT3 (ATCC® CRL-8001™, descrita na patente US 4.361.549) que produz um anticorpo anti-CD3 monoclonal) e o anticorpo anti-CD28 28.3 descrito por Vanhove e outro, BLOOD, 15 de julho de 2003, Vol. 102, no. 2, páginas 564-570 e número de acessão GenBank AF451974.1, os parceiros de ligação C1 e C2 são fornecidos convenientemente pelo vetor de expressão respectivo usado para a produção recombinante de forma que o fragmento de anticorpo transporta o parceiro de ligação C1 ou C2 como um peptídeo de fusão como o C-terminal da cadeia leve ou pesada (Neste contexto, a sequência de aminoácido do domínio variável da cadeia pesada e do domínio variável da cadeia leve do anticorpo OKT3 que é descrito em Arakawa e outro J. Biochem. 120, 657-662 (1996) é mostrado para propósitos de ilustração como SEQ ID NOs: 17 e 18 e nas Listagens de Sequência acompanhantes, enquanto a sequência de aminoácido do domínio variável do anticorpo anti-CD28 28.3 descrito por Vanhove e outro, supra, é mostrado como SEQ ID NOS 19 (VH) e 20 (VL) nas Listagens de Sequência acompanhantes). Da mesma forma esta metodologia de clonar os domínios variáveis de uma molécula de anticorpo e de forma recombinante produzir um fragmento do respectivo anticorpo é bem conhecida à pessoa versado na técnica, veja por exemplo, Skerra, A., (1994) um vetor geral, pASK84, para clonagem, produção bacteriana, e purificação de única etapa de fragmentos de anticorpo Fab. Gene 141, 79-84, ou Skerra, A., (1993) expressão bacteriana de fragmentos de imunoglobulina. Curr Opin Immunol. 5, 256-562). Finalmente, é da mesma forma possível gerar moléculas de anticorpo de moléculas de ligação artificiais com propriedades semelhantes a anticorpo contra um determinado alvo tal como CD3 ou CD28 como no Exemplo da Fig. 2 por métodos evolutivos bem conhecidos tal como exibição de fago (revisado, por exemplo, em Kay, B.K. e outro (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424, or Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93), exibição de ribossoma (revisado em Amstutz, P. e outro (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) ou exibição de mRNA como informado em Wilson, D.S. e outro (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755.

[00068] No caso do Exemplo mostrado na Fig. 2, o reagente de multimerização (4) tem dois sítios de ligação diferentes Z1 (42) e Z2 (44). Com o parceiro de ligação C1 (6a) sendo um peptídeo de ligação à estreptavidina, o sítio de ligação Z1 (42) do reagente de multimerização (4) é fornecido por uma muteína de estreptavidina adequada para qual o peptídeo estreptavidina (6a) reversivelmente liga-se. Visto que a ligação de C2 é um peptídeo de ligação à calmodulina, o sítio de ligação Z2 (44) do reagente de multimerização (4) é fornecido por calmodulina multimérica. O reagente de multimerização (4) pode ser uma única molécula, por exemplo um conjugado de calmodulina multimérica com estreptavidina (esta alternativa normalmente seria usada no caso de uma multimerização solúvel) ou pode da mesma forma consistir em duas moléculas independentes. A última opção posterior é preferida quando o reagente de multimerização (44) é imobilizado em um suporte sólido como mostrado na Fig.2. Neste caso, uma mistura de uma muteína de estreptavidina e calmodulina pode ser revestida (imobilizada) no suporte sólido, por exemplo, em uma relação molar de 1:1 com respeito aos sítios de ligação Z1 e Z2. Neste contexto, é notado que, devido à imobilização de calmodulina na superfície do suporte sólido, não há necessidade para preparar calmodulina multimérica como explicado acima porém imobilização da calmodulina na superfície é suficiente para apresentar calmodulina (que, como mencionado acima, tem apenas um único sítio de ligação a peptídeos de ligação à calmodulina), em uma densidade suficientemente alta pata garantir ligação da população de célula (2). Por exemplo, neste caso, um fragmento de anticorpo bivalente que tem dois sítios de ligação contra CD28 ou um anticorpo intacto que têm per se dois sítios de ligação idênticos, poderia ser usado como segundo reagente (8).

[00069] Como mostrado na Fig. 2b, depois de contatar a população de célula T (2) com o reagente de multimerização (4) e normalmente incubando a população de célula com o reagente de multimerização (4), a população de células T (2) forma complexos/é ligada ao agente de multimerização pelo primeiro agente (6) e o segundo agente (8). O primeiro agente (6) e o segundo agente (8) ligam-se especificamente ao complexo de TCR/CD3 e a molécula adicional CD28, desse modo induzindo as células T a proliferar/expandir.

[00070] Como mostrado na Fig. 2c, depois da incubação (que é normalmente realizada durante um período tempo adequado para alcançar expansão da população de célula desejada) a ligação entre o parceiro de ligação C1 (6a) do primeiro agente (6) e o sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização (4) é rompida rompendo-se a ligação reversível respectiva. Igualmente, a ligação entre o parceiro de ligação C2 (8a) do segundo agente (8) e do sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização (4) é rompida rompendo-se a ligação reversível respectiva. A ligação reversível entre o parceiro de ligação C1 (6a) do primeiro agente (6) e do sítio de ligação Z1 pode ser rompida por biotina (que age como um análogo (20) do primeiro parceiro livre) enquanto a ligação reversível entre o parceiro de ligação C2 (8a) do primeiro agente (8) e do sítio de ligação Z2 pode ser rompida pela adição de um quelante de metal (quelante de cálcio) tal como EDTA ou EGTA (que age um análogo (20) do segundo parceiro livre) visto que a ligação à calmodulina a peptídeos de ligação à calmodulina é íon de cálcio (Ca2+) dependente). Isto significa claro que o contato da população de célula (2) é realizada em um tampão contendo Ca2+.

[00071] Como mostrado na Fig. 2d, adição do análogo (20) do primeiro parceiro livre e do segundo parceiro livre, respectivamente resulta em deslocamento dos parceiros de ligação C1 (6a) e C2 (8a) do reagente de multimerização (4) e desse modo em deslocamento do primeiro agente (6) e do segundo agente (8) do reagente de multimerização (4). Este deslocamento do primeiro agente (6) e do segundo agente (8) sucessivamente resulta em uma dissociação do primeiro agente (6) e do segundo agente (8) do complexo de TCR/CD3 e da molécula adicional CD28, desse modo terminando o estímulo/expansão da população de célula (2). Desse modo, como referido acima, a presente invenção fornece a vantagem que o período de tempo do estímulo ou expansão de uma população de célula T pode ser exatamente controlado e, portanto, da mesma forma o estado funcional da população de células T pode ser intimamente controlado. Depois da eluição das células como ilustrado na Fig. 1d, o primeiro agente (6), o segundo reagente (8) bem como o análogo (20) do primeiro parceiro livre do parceiro de ligação C1 e do segundo parceiro livre do parceiro de ligação C2 pode ser facilmente removido da população de célula estimulada (2) por meio de um "cartucho de remoção"descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474. Além disso, e importantemente, no caso de a amostra inicial ser uma população de linfócitos, por exemplo, em forma de PMBCs obtidos de um gradiente de Ficoll, a população de célula T (2) está agora disponível para expansão serial como definido aqui. Visto que a população de célula expandida (por exemplo por um estímulo inicial por meio de CD3/CD28) pode ser transfectada durante expansão por exemplo, com um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR, da mesma forma conhecido como receptor de célula T artificial), as células geneticamente modificadas podem ser em seguida liberadas do estímulo inicial e subsequentemente podem ser estimuladas com um segundo tipo de estímulo por exemplo pelo receptor introduzido de novo. Estes segundos estímulos podem compreender um estímulo antigênico na forma de uma molécula de peptídeo/MHC, o ligante cognato (reticulação) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo ligante natural de um CAR) ou qualquer ligante (tal como um anticorpo) que diretamente liga-se dentro da estrutura do novo receptor (por exemplo reconhecendo-se regiões constantes dentro do receptor). Desse modo, a população de célula T obtida a partir desta expansão serial pode ser usada para transferência de célula adotiva.

[00072] Fig. 3 mostra uma outra modalidade de um método de expansão da invenção. Da mesma forma a amostra usada neste Exemplo compreende uma população de células T (2) que transporta duas moléculas de superfície de célula específicas (30) e (32), com a molécula de superfície de célula (30) sendo um complexo de TCR/CD3 e a molécula de superfície de célula (32) sendo a molécula adicional CD28. Na Fig. 3a a população de células T (2) é mostrada depois que fosse colocada em contato com um reagente de multimerização (4). Da mesma forma neste Exemplo, o reagente de multimerização (4) tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) como primeiro agente (6) um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de antígeno de ligação do mesmo que fornece um sinal de ativação primário às células T e como segundo agente (8) um anticorpo anti- CD28 ou um fragmento de antígeno de ligação do mesmo que estimula CD28 como molécula adicional.

[00073] O reagente de multimerização (4) mostrado no Exemplo da Fig. 3 compreendem apenas um tipo sítio de ligação Z1 (42) para a ligação reversível de ambos o primeiro agente (6) e o segundo agente (8). Igualmente o primeiro agente (6) e o segundo agente (8) compreendem pelo menos um parceiro de ligação C1 (6a, 8a), em que ambos o parceiro de ligação C1 (6a) e o parceiro de ligação (8a) é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 (44) do reagente de multimerização. Desse modo, para imobilização, o primeiro agente (6) e o segundo agente (8), respectivamente são ligados ao reagente de multimerização (4) pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 (6a) e o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z1 (42). Os parceiros de ligação C1 e C2 podem ser diferentes ou idênticos. Por exemplo, o parceiro de ligação C1 pode ser um peptídeo de ligação à estreptavidina das sequências Trp- Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 01), o "Strep-tag®") enquanto o parceiro de ligação C2 pode ser o peptídeo de ligação à estreptavidina da sequência Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys- (GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 04), da mesma forma conhecido como "di-tag3")) ou da sequência Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe- Glu-Lys ((SEQ ID NO: 05), da mesma forma conhecido como "di- tag2"), descrito por Junttila e outro., Proteomics 5 (2005), 1199-1203 ou Patente US 7.981.632). Todos estes peptídeos de ligação à estreptavidina ligam-se ao mesmo sítio de ligação, isto é, o sítio de ligação à biotina de estreptavidina. Se um ou mais de tais peptídeos de ligação à estreptavidina são usados como parceiros de ligação C1 e C2, o reagente de multimerização (4) é uma muteína de estrepta- vidina. Como mostrado na Fig. 3, um reagente de multimerização solúvel (4) é usado. No caso de uma muteína de estreptavidina, este reagente de multimerização solúvel pode, por exemplo, ser um oligômero ou um polímero de estreptavidina ou avidina ou de qualquer muteína (análogo) de estreptavidina ou avidina. O oligômero pode compreender três ou mais monômeros de estreptavidina, avidina ou uma muteína dos mesmos. O oligômero ou polímero podem ser reticulados por um polissacarídeo. Tais oligômeros ou polímeros de estreptavidina ou de avidina ou de muteínas de estreptavidina ou de avidina podem em uma primeira etapa ser preparados pela introdução de resíduos de carboxila em um polissacarídeo, por exemplo dextrana, essencialmente como descrito dentro "Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M., & Sezaki, H., (1992). Preparação e propriedades do imunoconjugado composto de anticorpo monoclonal anti-humano de câncer de cólon e conjugado de mitomincina C - dextrana. Bioconjugate Chemistry 3,132-137." Em uma segunda etapa, estreptavidina ou avidina ou muteínas dos mesmos são acoplados por grupos aminos primários de resíduo de lisina interno e/ou o N-terminal livre aos grupos carboxila no esqueleto de dextrana usando química de carbodiimida convencional. Alternativamente, oligômeros reticulados ou polímeros de estreptavidina ou avidina ou de qualquer muteína de estreptavidina ou avidina pode da mesma forma ser obtido por reticulação por meio de ligantes bifuncionais tal como glutardialdeído ou por outros métodos descritos na literatura.

[00074] Usando como parceiros de ligação C1 e C2, porções de ligação ao mesmo sítio de ligação (42) do agente de multimerização tem a vantagem que, como mostrado na Fig. 3b, o mesmo parceiro livre (do primeiro parceiro de ligação C1 e da mesma forma do segundo parceiro de ligação C2) ou análogo do mesmo pode ser usado para terminar a expansão da população de células T (2) e liberar esta população de células T (2) do agente de multimerização. No Exemplo da Fig. 3, um análogo do primeiro e segundo parceiro C1 e C2 tal como biotina ou um derivado de biotina (iminobiotina ou destiobiotina) pode ser usado convenientemente para a terminação da expansão e a eluição da população de células T (2).

[00075] Como mostrado na Fig. 3c, depois da eluição das células como ilustrado na Fig. 1d, o primeiro agente (6), o segundo reagente (8) bem como biotina como o análogo (20) do primeiro parceiro livre do parceiro de ligação C1 e do segundo parceiro livre do parceiro de ligação C2 pode ser removido facilmente da população de célula estimulada (2) por um "cartucho de remoção"descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474. Além disso, a modalidade de usar um reagente de multimerização solúvel (4) tem a vantagem adicional de poder evitar qualquer suporte sólido tal como esferas magnéticas. Isto significa que não há risco de contaminação das células T ativadas por tais esferas magnéticas. Isto da mesma forma significa que um processo que é complacente com padrões de GMP pode ser muito mais fácil estabelecido comparado ao método conhecido tal como o uso de Dynabeads® em que medidas adicionais têm que ser empregadas para garantir que a população de célula T expandida final esteja livre de esferas magnéticas. Além disso, o uso de um agente de multimerização solúvel torna isto muito mais fácil de remover a mesma da população de célula ativada (células T, células B ou da mesma forma células exterminadoras naturais) visto que as células podem ser sedimentadas simples por centrifugação e o sobrenadante incluindo o agente de multimerização solúvel pode ser descartado. Alternativamente, o agente de multimerização solúvel pode ser removido da população de célula expandida em uma matriz de permeações em gel do cartucho de remoção do pedido de patente Internacional WO 2013/124474. Visto que nenhuma fase sólida (por exemplo esferas magnéticas) estão presentes, a presente invenção da mesma forma fornece para um sistema fechado automatizado para expansão das células que podem ser integradas em sistemas de expansão de célula conhecidos tal como a Xuri Cell Expansion System W25 e WAVE Bioreactor 2/10 System, disponível de GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom) ou o Quantum® Cell Expansion System, disponível de TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA).

[00076] Fig. 4 mostra os resultados de uma experiência em que células de resposta CD3+ T proliferadas depois de ser estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3 e aCD28 que foram reversivelmente imobilizados em esferas revestidas com a muteína de estreptavidina Strep-tactin®. Fig. 4A em um histograma mostrando distribuição de tamanho (dispersão para a frente) de células estimuladas, Fig. 4B descreve histogramas representando o grau de proliferação de acordo com o número de células por divisão celular que é indicado no topo da Fig. 4B (0 representa células não divididas; 5 representa células que passaram por pelo menos 5 divisões), e Fig. 4C mostra um quadro da placa de cultura depois de 4 dias de estímulo.

[00077] Fig. 5 espetáculos os resultados da mobilização de cálcio intracelular diferencial em células Jurkat que são rotuladas com o anticorpo αCD3 OKT3 ou com fragmentos Fab OKT3 sendo multimerizados com Strep-tactin® (da mesma forma referido como multímeros de Fab aqui). Fig. 5A: células Jurkat foram carregadas com a tintura sensível a cálcio Indo-1-AM e liberação de cálcio foi ativada por injeção de qualquer aCD3 mAb (quadrados pretos) ou multímeros de Fab αCD3 OKT3 (derivado da linhagem de célula parental OKT3) com ou sem rompimento de D-biotina anterior (triângulos cinza escuros e círculos cinza claros respectivamente) comparado a injeção de PBS (triângulos brancos invertidos). Aplicação de ionomicina serviu como controle positivo. Mudanças resolvidas por tempo em concentração de Ca2+ intracelular foram monitoradas por citometria de fluxo com base na mudança em relação de FL6/FL7. Fig. 5B: células Jurkat rotuladas por Indo-1-AM- foram ativadas por estímulos de aCD3 diferentes como descrito na Fig 4a; OKT3: gráfico superior e multímero de Fab aCD3: gráfico mediano) seguido por rompimento mediado por D-biotina subsequente (t=140s) de sinalização de multímero de Fab aCD3. Injeção de PBS (gráfico inferior) e ionomicina serviu como controle negativo ou positivo. Dados são representativos de três experiências diferentes.

[00078] Fig. 6 mostra o resultado da marcação reversível de células por multímeros de Fab anti-CD3 OKT3. PBMCs recentemente isolados foram marcados com ou um anticorpo monoclonal (gráfico de ponto a esquerda, clone parental para os multímeros de Fab) ou multímeros de Fab marcados por PE cognato e analisado antes (segunda coluna a esquerda) ou depois do tratamento com D-biotina (coluna mediana). Monômeros de Fab restantes foram em seguida detectados depois das etapas de lavagem subsequentes usando Strep-Tactin® marcado por PE fresco (segunda coluna a direita). Marcação de multímero de Fab secundário de células reversivelmente marcadas serviu como controle (coluna a direita). Apenas células vivas (PInegativo) são mostradas. Números em gráficos de ponto indicam a porcentagem de células dentro de portões.

[00079] Fig. 7 mostra o isolamento de células por ligação reversível de fragmentos Fab anti-CD28 multimerizados com Strep-Tactin® marcado com ficoeritrina como uma marcação fluorescente. Células CD28+ foram selecionadas/isolamento por seleção de célula magnética de multímero de Fab PMBCs recentemente isolados como descrito no pedido de patente Internacional WO2013/011011. Antes que as células de seleção fossem marcadas pelo controle com os multímeros de aCD28 fluorescentes cognato (gráfico de ponto a esquerda) ou com um anticorpo dirigido contra a cadeia leve de kappa imunoglobulina (segundo gráfico de ponto a esquerda, α-Ig kappa mAb). Depois de seleção, células foram tratadas com D-biotina e subsequentemente lavadas para remover esferas magnéticas e monômeros de Fab. Células CD28+ liberadas foram subsequente- emente (re-) marcadas ou com multímeros de Fab CD28 (segundo gráfico de ponto a direita) ou com o α-Ig kappa mAb (gráfico de ponto a direita) para detectar monômeros de Fab potencialmente restantes. Apenas células CD3+ vivas (PInegativo) são mostradas. Números em gráficos de ponto indicam a porcentagem de células dentro de portões.

[00080] Fig. 8 mostra os resultados de uma experiência em que células de resposta CD3+ T foram proliferadas depois de ser estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 reversíveis que foram reversivelmente imobilizados em Strep-tactin® oligomérico solúvel agindo um reagente de multimerização solúvel. Para as experiências os resultados dos quais são mostrados na Fig. 8, 300.000 células T de resposta de CD3+ (Tresp) foram rotuladas com 2μM de éster de carboxifluoresceína sucinimidila (CFSE) e estimuladas com quantidades variadas de uma preparação de oligômeros de Estreptactina solúvel em que uma combinação de fragmento Fab αCD3 e Fab αCD28 ambos transportando um tag Strep como peptídeo de ligação à estreptavidina na cadeia pesada foram imobilizados. ("1x"corresponde a 3μg de Strep-tactina multimerizada funcionalizada com 0,5 μg de αCD3 - e 0,5 μg de aCD28 Fab; números indicam quantidade de vezes de "1x"). Células Tresp deixadas sem estímulo ou foram estimuladas com multímeros de Strep-tactina em branco (nenhum Fab) serviram como controle negativo. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades juntamente com 300.000 células alimentadoras autólogas CD3 negativas (irradiadas com 30Gy) em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 20 U/mL de interleucina 2 (IL-2). Células foram incubadas a 37°C sem mudança de meios e proliferação foi analisada de acordo com diluição de CFSE depois de 5 dias por análise de FACS (Fig. 8B). Fig. 8A mostra distribuição de tamanho de células depois de 5 dias em cultura. Histogramas mostram células de CD3+ vivas, enquanto Fig. 8C mostra células após o cultivo que foram liberadas por reagentes de estímulo depois de tratadas com 1 mM de D-biotina e lavadas. A dissociação e remoção de fragmentos Fab monoméricos foi analisada por re-marcação com Strep-Tactin® marcada com ficoeritrina (ST-PE) como uma marcação fluorescente e um histograma representativo é mostrado. Fig. 8D mostra o número absoluto de células vivas (azul de tripan negativo) depois de 5 dias foram contadas usando uma câmara de contagem de Neubauer e plotadas contra a condição de estímulo respectiva. Números de célula medianos são mostrados na Fig. 8D; barras de erro indicam desvio padrão (SD). Fig. 8E mostra um quadro da placa de cultura depois de 5 dias de estímulo.

[00081] Fig. 9 descreve uma ilustração do método de expansão serial da presente invenção (Fig. 9a) enquanto Fig. 9b brevemente descreve algumas características e vantagens da expansão serial.

[00082] Fig. 10 mostra um arranjo da invenção que pode ser usada juntamente com os métodos de expansão da invenção. Este arranjo (100) inclui um biorreator (50), um primeiro "cartucho de remoção"(70) e um segundo "cartucho de remoção"(90). O biorreator (50) é fluidamente conectado ao primeiro cartucho removível (70), e o primeiro cartucho de remoção é fluidamente conectado ao segundo cartucho de remoção (90). Este arranjo (100) pode fazer parte de um dispositivo para expansão de célula automatizada e purificação como descrito aqui.

[00083] No biorreator (50) um método de expansão como descrito aqui é realizado, por exemplo um método de expansão ilustrado na Fig. 3 que faz uso de um reagente de multimerização solúvel. Neste caso, depois do término da ativação/expansão da população de célula (2) por adição de um competidor (20) (parceiro livre do parceiro de ligação C1 ou um análogo do mesmo) as misturas de reação que são liberadas do biorreator contêm a população expandida de células (2), o primeiro agente (6), o segundo agente (8) bem como o reagente de multimerização solúvel (4). Neste exemplo, o primeiro agente (6) é um fragmento de anticorpo de ligação à CD3 que inclui um peptídeo de ligação à estreptavidina como parceiro de ligação C1, o segundo agente (8) é um fragmento de anticorpo de ligação à CD28 que inclui um peptídeo de ligação à estreptavidina como parceiro de ligação C1 e o competidor (20) (análogo livre do parceiro de ligação C1) é biotina. Esta mistura de reação é aplicada no primeiro cartucho de remoção (70). Este primeiro cartucho de remoção (70) é um cartucho de remoção como descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474 que inclui uma coluna de cromatografia com uma fase estacionária adequada. A fase estacionária pode servir igualmente uma matriz de cromatografia de afinidade e, ao mesmo tempo, pode agir como matriz de permeação em gel. Esta matriz de cromatografia de afinidade tem um reagente de afinidade imobilizado sobre ele. O reagente de afinidade pode, no caso do Exemplo atual, por exemplo, ser estreptavidina, uma muteína de estreptavidina, avidina, uma muteína de avidina ou uma mistura dos mesmos. Desse modo, o primeiro agente (6) e o segundo agente (8) se ligam ao reagente de afinidade pelo seu peptídeo de ligação à estreptavidina. Da mesma forma biotina como o competidor (20) liga-se ao reagente de afinidade. Desse modo, estes três reagentes estão todos sendo imobilizados na matriz de cromatografia do primeiro cartucho de remoção enquanto a população de célula se expandida (2) e o reagente de multimerização solúvel (4) passa através da fase estacionária. Este "fluxo através" é em seguida aplicado sobre o segundo cartucho de remoção (90). Da mesma forma este segundo cartucho de remoção (90) compreende uma fase estacionária. Esta fase estacionária compreende um segundo reagente de afinidade sobre ele que pode ligar-se ao sítio de ligação Z1 (42) do reagente de multimerização (4). Este reagente de afinidade pode ser por exemplo biotina que é covalentemente ligada à fase estacionária. Uma tal fase estacionária pode, por exemplo, ser d- biotina SepharoseTMobtenível de Affiland S.A. (Ans-Liege, Belgium). Desse modo, o reagente de multimerização solúvel (4) será ligado (retido) na fase estacionária do segundo cartucho de remoção (90) enquanto a população expandida de células (2) passa através da fase estacionária e está sendo livrada de qualquer reagente. A população de células (2) está agora em uma condição para qualquer uso adicional, por exemplo, para aplicações diagnósticas (por exemplo, classificação de FACSTM) ou para qualquer célula com base em aplicação terapêutica. É notado aqui que é claro da mesma forma possível mudar a ordem do primeiro "cartucho de remoção"(70) e do segundo "cartucho de remoção"(90) em um arranjo (100), tal que biorreator (50) seja (diretamente) fluidamente conectado ao segundo cartucho removível (90), e o primeiro cartucho de remoção (70) é organizado depois e fluidamente conectado ao segundo cartucho de remoção (90). Neste arranjo o reagente de multimerização (4) será removido primeiro da população de células (2) e subsequentemente o primeiro agente (6), o segundo (8) e por exemplo o competidor (20) é removido. Tal arranjo é da mesma forma abrangido na presente invenção e pode da mesma forma fazer parte de um dispositivo para expansão de célula automatizada e purificação como descrito aqui.

[00084] Fig. 11 espetáculos uma outra modalidade de um arranjo da invenção que pode ser usada juntamente com os métodos de expansão da invenção. Este arranjo (110) inclui um biorreator (50), um primeiro "cartucho de remoção"(70) e um segundo "cartucho de remoção"(90). O biorreator (50) é fluidamente conectado ao primeiro cartucho removível (70), e o primeiro cartucho de remoção é fluidamente conectado ao segundo cartucho de remoção (90). Além disso, o segundo cartucho de remoção (110) é fluidamente conectado ao biorreator (50). Este arranjo (110) pode da mesma forma fazer parte de um dispositivo para expansão de célula automatizada e purificação como descrito aqui. Por exemplo, quando usado juntamente com um método de expansão empregando um reagente de multimerização solúvel (4), uma população expandida purificada de células (2) é obtida como eluato do segundo cartucho de remoção (90). Desde o cartucho de remoção (90) é fluidamente conectado ao biorreator (50), a população de células (2) pode ser transferida outra vez no biorreator (50), por exemplo, para expansão clonal serial como descrito aqui, transfectando-se a população de células, por exemplo, com o gene de um receptor de célula T e subsequente outra (segunda) expansão usando um método de expansão da invenção.

[00085] Fig. 12 mostra uma outra modalidade de um arranjo da invenção que pode ser usada juntamente com os métodos de expansão da invenção. Este arranjo (120) inclui um biorreator (50), um primeiro "cartucho de remoção"(70) e um segundo "cartucho de remoção"(90). O biorreator (50) é fluidamente conectado ao primeiro cartucho removível (70), e o primeiro cartucho de remoção é fluidamente conectado ao segundo cartucho de remoção (90). Similar à modalidade mostrada na Fig. 11, o segundo cartucho de remoção (110) é fluidamente conectado ao biorreator (50). Entretanto, um "cartucho de seleção"(92) como descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474 é organizado entre o segundo cartucho de remoção (90) e o biorreator (50). Desse modo, uma subpopulação de células (2a) que é compreendida na população de células (2) pode ser selecionada/enriquecida por este "cartucho de seleção"(92) como descrito em WO 2013/124474. Esta subpopulação de células (2a) pode ser transferida no biorreator (50), por exemplo, para sofrer expansão serial como descrito aqui. Alternativamente (não mostrado), esta subpopulação de células (2a) pode ser usada para terapia com base em célula. É novamente notado aqui que o uso de um reagente de multimerização solúvel como descrito aqui permite o desígnio de purificação de célula automatizada e dispositivos de expansão que estão funcionalmente fechados e desse modo não propensos a contaminação. Além disso, visto que reagente de multimerização solúvel evita a necessidade por materiais de fase sólida tal como esferas magnéticas, podem tais dispositivos de purificação de célula podem ser designados como dispositivos de fluxo contínuo.

[00086] Fig. 13 mostra as cinéticas de expansão de proliferação de células de resposta T de CD4+ e CD8+ purificadas (Tresp) que foram estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 ou com aCD3/aCD28/aCD8 que foram reversivelmente imobilizados em dois tipos de uma muteína de Strep-tactin® oligomérica agindo como reagente de multimerização solúvel. O primeiro tipo de Strep-tactin® oligomérica foi a fração da muteína de estreptavidina oligomérica (n = 3) obtida no Exemplo 5 (da mesma forma referida aqui como "esqueleto de Streptactin® convencional", ilustrado pelo símbolo triângulo com a ponta abaixo na Fig. 13), o segundo tipo desta muteína de estreptavidina oligomérica usado como reagente de multimerização solúvel foi um oligômero que foi obtido reagindo-se a muteína de estreptavidina oligomérica solúvel com albumina de soro humana biotinilada (HSA) Este reagente de multimerização solúvel com base em HSA da mesma forma referido aqui como "esqueleto de Streptactin® grande). Nas experiências da Fig. 13 a expansão foi realizada sem troca de meios. Os resultados para as células de resposta T de CD4+ são mostrados na Fig.13A, os resultados para as células de resposta T de CD8+ são mostrados na Fig. 13B. Neste contexto, é notado que os reagentes de multimerização solúveis experimentalmente usados que foram funcionalizados reversivelmente ligando-se aos primeiros agentes, e opcionalmente segundo e terceiro agentes são referidos nas Figuras como "multímeros de Streptamer®"

[00087] Fig. 14 mostra a cinética de expansão de proliferação de células de resposta T de CD4+ e CD8+ purificadas (Tresp) que foram estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram fragmentos reversivelmente imobilizados que foram reversivelmente imobilizados com dois tipos Strep-tactin® oligomérica solúvel agindo como reagente de multimerização solúvel. O primeiro tipo de Strep- tactin® oligomérica foi a fração do muteína de estreptavidina oligomérica (n > 3) obtida no Exemplo 5 (da mesma forma referido aqui como "esqueleto de Streptactin® convencional", ilustrada pelo símbolo triângulo com a ponta no topo na Fig. 14), o segundo tipo deste muteína de estreptavidina oligomérica usado como reagente de multimerização solúvel foi o agente de multimerização solúvel com base em HSA, o "esqueleto de Streptactin® grande" mencionada acima). Nas experiências da Fig. 14 a expansão foi realizada com troca de meios. Os resultados para as células de resposta T de CD4+ são mostrados na Fig.14, os resultados para as células de resposta T de CD8+ são mostrados na Fig. 14B.

[00088] Fig. 15 mostra os dados combinados dos resultados obtidos nas Figs 13 e 14 para a cinética de expansão de proliferação de células de resposta T de CD4+ e CD8+ purificadas, com Fig. 15A descrevendo os resultados para células T de CD4+ e Fig. 15B descrevendo os resultados para as células T de CD8+. Linhagens lineares são usadas para a cultura com troca de meios em dia 3, enquanto linhas pontilhadas descrevem os valores obtidos para o grau de expansão sem troca de meios no dia 3. Os dados mostrados na Fig. 15 são normalizados no número de célula de entrada. Apenas dados para a Tresp estimulada com a muteína de estreptavidina oligomérica (n > 3), a Tresp estimulada com o Dynabeads comercialmente disponível (controle positivo) e as células T não estimuladas (controle negativo) são mostrados porém nenhum dado no reagente de multimerização com o "esqueleto de Streptactin® grande".

[00089] Fig. 16 mostra formação de agrupamento precoce de células T depois da ativação de células de resposta T de CD4+ e CD8+ purificadas estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados na muteína de estreptavidina oligomérica solúvel (n > 3) descritos no Exemplo 5. Fig. 16A descreve os resultados para células T de CD4+ e Fig. 16B descreve os resultados para as células T de CD8+. Dados para Tresp estimuladas com o reagente de multimerização solúvel (a muteína de estreptavidina oligomérica), a Tresp estimulada com Dynabeads comercialmente disponível (controle positivo) e as células T não estimuladas (controle negativo) são mostrados.

[00090] Fig. 17 mostra a cinética de expansão e fenótipo de memória central de células T de CD3+ (Tcm) (CD3+CD62L+CD45RA- Tcm) policlonalmente estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados na muteína de estreptavidina oligomérica solúvel (com n > 3) descrito no Exemplo 5. Os gráficos mostrados na Fig. 17 representam o grau de proliferação de acordo com o número de células colhidos por ponto de tempo, com Fig. 17A mostrando a proliferação é apenas meio suplementado IL-2 e na Fig. 17B mostrando a proliferação em meio suplementado por IL-2 e IL-15. Fig. 17C mostra uma análise de citometria de fluxo da expressão de superfície de CD62L e CD127 depois de 14 dias de cultura nestes ambientes de citocina variáveis.

[00091] Fig. 18 mostra as cinéticas de expansão antígeno- específica seletivas (Ag-específico) fora de uma população de volume de células de resposta de CD3+CD62L+CD45RA- Tcm purificadas que foram estimuladas in vitro igualmente com um complexo de peptídeo:molécula de MHC (que age como primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células) e fragmento Fab aCD28 (que age como segundo agente que se liga a molécula adicional na superfície das células) e células T não estimuladas (controle negativo) são mostradas. Igualmente, o complexo de peptídeo-antígeno específico com a molécula de MHC e o fragmento Fab aCD28 foram reversivelmente imobilizados na mesma muteína de estreptavidina oligomérica solúvel (com n > 3) descritas no Exemplo 5. O peptídeo usado para a expansão antígeno-específica na Fig. 18A foi o peptídeo CRVLCCYVL (SEQ ID NO: 06), aminoácidos 309-317 da proteína 1 imediata-precoce restringida pela molécula de HLA-C702 MHC (descrito em Ameres e outro, PLOS Pathogens, maio de 2013, vol. 9, emissão 5, e1003383) representando um epítopo de HLA- C7/IE-1 que é específico para citomegalovírus (CMV). A molécula de MHC I que apresenta o transporte de peptídeo em seu C-terminal da cadeia pesada do peptídeo de ligação à estreptavidina (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07), que está comercialmente disponível como "Twin-Strep-tag®" de IBA GmbH, Gottingen, Germany). Fig. 18A mostra análise de citometria de fluxo exemplar para a fração das células Ag-específicas que foram proliferadas usando o complexo peptídeo:MHC-I específico para este epítopo de HLA-C7/IE-1 como primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células reversivelmente imobilizadas na muteína de estreptavidina oligomérica solúvel. Os gráficos na Fig.18B a Fig.18E ilustram a cinética de expansão de outras especificidades para antígenos de acordo com o número de células peptídeo:multímero MHCI-positivo específicas colhidas por ponto de tempo em analogia a Fig. 18A usando complexos distintos de um peptídeo antígeno-específico com a molécula de MHC I como primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células reversivelmente imobilizadas na muteína de estreptavidina oligomérica solúvel. Em mais detalhes, Fig. 18B mostra a expansão de células Ag- específicas que foram expandidas usando o complexo de peptídeo:MHC-I específico para o epítopo de pp65 de CMV (aminoácidos 341-350 (QYDPVAALF, (SEQ ID NO: 08)) restringido por HLA-A2402), Fig. 18C mostra a expansão de células Ag-específicas que foram expandidas usando outro complexo de peptídeo:MHC-I específico para o epítopo de pp65 de CMV (aminoácidos 265-274 RPHERNGFTV, (SEQ ID NO: 09)) restringido por HLA-B702), Fig. 18D mostra a expansão de células Ag-específicas que foram proliferadas usando o complexo de peptídeo:MHC-I específico para o epítopo hexon 5 de adenovírus (aminoácidos 114-124 (CPYSGTAYNSL, (SEQ ID NO: 10)) restringido por HLA-B702), Fig. 18E mostra a expansão de células Ag-específicas que foram proliferadas usando o complexo de peptídeo:MHC-I específico para o epítopo de HLA-B7/IE-1309-317 de CMV (dados de FACS exemplares veja Fig. 18A acima). Todas as moléculas de peptideo:MHC suportando o Twin Strep®-Tag estão comercialmente disponíveis de IbaGmbH. Neste contexto, as sequências de aminoácido das moléculas de HLA-A*2402, HLA- B*0702 e HLA-C*0702 que transportam o "Twin-Strep-tag®" como seu C-terminal são mostrados como SEQ ID NO: 21, 22 e 23 nas listagens de Sequência acompanhantes, enquanto a sequência de aminoácido de β2 microglobulina (que forma juntamente com a cadeia α, que significa as moléculas codificadas por HLA, a respectiva molécula MHC I) é mostrado como SEQ ID NO: 24 na Listagem de Sequência acompanhante. Além disso, Fig.18F mostram análise de citometria de fluxo exemplar da expressão de superfície de CD62L e CD127 depois de 14 dias de cultura para células estimuladas/expandidas de HLA- B7/Hexon5114-124 da Fig. 18D.

[00092] Fig. 19 mostra a cinética de expansão Ag-específica seletiva fora de células Tcm de resposta CD3+CD62L+CD45RA- purificadas que foram estimuladas in vitro com a) complexos de MHC I de peptídeo específico de antígeno e b) fragmentos Fab αCD28 que foram reversivelmente imobilizados como primeiro e segundo agentes em muteínas de estreptavidina oligomérica solúvel. Para este propósito 500.000 células Tcm (Tresp) de resposta CD3+CD62L+CD45RA- foram estimuladas especificamente pelo Ag usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina funciona- lizado com 0,5 μg de complexos de peptídeo:MHC classe I equipados com um peptídeo de ligação à estreptavidina (o peptídeo específico representa aminoácidos 114-124 (CPYSGTAYNSL, SEQ ID NO: 10) da proteína de Hexon 5 do adenovírus restringida por HLA-B0702, veja acima) e 0,5 μg de Fab αCD28. Como uma alternativa, 4,5 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina carregado com 0,5 μg deste complexo de peptídeo:MHC classe I, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28. Para comparação, estímulo policlonal foi realizado, usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina (1mg/mL) carregado com uma combinação de 0,5 μg de Fab αCD3 e 0,5 μg de Fab αCD28. Novamente como a condição de estímulo alternativa descrita acima, 4,5 μL de uma preparação de multímeros de Estreptactina carregados com 0,5 μg de Fab αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28 foi usado. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle negativo e células Tresp estimuladas com policlonais com Dynabeads como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL- 15. Células foram incubadas a 37°C com troca de meios a cada 3 dias e contagem de célula foi analisada depois de 7 e 14 dias. As fotografias mostradas na Fig. 19 representam o grau de formação de agrupamento no dia 5 para estímulo Ag-específico como exemplificado para o epítopo de adenovírus HLA-B7/Hexon 5.

[00093] Fig. 20 mostra o rendimento e fenótipo de expansão de células de resposta T de CD8+ purificadas estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados em dois tipos Strep-tactin® oligomérica solúvel agindo um reagente de multimerização solúvel. O primeiro tipo de Strep-tactin® oligomérica foi a fração da muteína de estreptavidina oligomérica (numérico obtido no Exemplo 5 (estrutura convencional), o segundo tipo desta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reagente de multimerização solúvel foi o oligômero solúvel descrito acima e referido aqui como estrutura de Streptactin® "grande". Nestes experiências, a fração da muteína de estreptavidina convencional oligomérica (n > 3) foi da mesma forma usado como um reagente de multimerização que foram funcionalizados com único fragmento Fab (terceira barra na Fig. 20A e Fig. 20B) ou com uma combinação de fragmentos Fab aCD3 e aCD28. Além disso para o estímulo combinado com fragmentos Fab αCD3/αCD28, da mesma forma um fragmento Fab aCD8 adicional (comercialmente disponível de IBA GmbH, Gottingen, Germany) foi imobilizado para testar se é possível para preferencialmente estimular uma subpopulação de célula T específico. Fig. 20A mostra um gráfico de barras que representa o grau de proliferação de acordo com o número de células colhidas no dia 6 comparado aos controles negativos (células de resposta T de CD8+ purificadas não estimuladas) e normalizado ao controle positivo (resposta T de CD8+ purificado estimulado com Dynabeads comercialmente disponível (esferas em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são irreversíveis imobilizados). Fig. 20B mostra análise de citometria de fluxo da expressão de superfície de CD8 e a molécula de superfície de célula T CD45RO (que é indicativo de proliferação e ativação de célula T) depois da cultura de célula. As várias condições estimulantes foram comparadas usando análise one-way ANOVA e nenhuma diferença significante (n.s.) foi detectada.

[00094] Fig. 21 mostra o rendimento e fenótipo para a expansão de células T de resposta CD8+ purificadas estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados em Strep-tactin® oligomérica solúvel agindo como um reagente de multimerização solúvel que foram funcionalizados com único fragmento Fab ou com uma combinação de fragmentos Fab (como já descrito acima). Nestas experiências, as células T de resposta CD8+ foram estimuladas com o reagente de multimerização solúvel (Strep- tactin® oligomérica solúvel (1mg/mL) do Exemplo 5) que foi funcionalizado com quantidades variadas de fragmentos Fab αCD3 e aCD28, opcionalmente juntamente com o fragmento Fab αCD8 descrito acima. O termo “1x” corresponde a 1,5 μg de Estreptactina multimerizada funcionalizada com 0,5 μg de fragmento Fab aCD3 apenas e 1,5 μg de Estreptactina multimerizada funcionalizada com 0,5 μg de Fab aCD28 apenas), ou 3 μL de uma preparação Estreptactina oligomérica carregada com 0,5 μg de fragmento Fab aCD3 e 0,5 μg de Fab aCD28, ou 4,5 μL de uma preparação de multímeros de Estreptactina carregados com 0,5 μg de aCD3 strep- marcado, 0,5 μg de aCD8 strep-r marcado e 0,5 μg Fab αCD28 strep- marcado. Desta maneira, o termo “2x” corresponde a 3,0 μg de Estreptactina funcionalizada multimerizada com 1μg de fragmento Fab aCD3 sozinho e 3,0 μg de Estreptactina multimerizada funcionalizada com 1 μg de Fab αCD28 sozinho, significando que duas vezes a quantidade de fragmento Fab αCD3 imobilizado foi usada. Células Tresp não tratadas serviram como controle negativo e resposta T de CD8+ purificado estimulado com Dynabeads comercialmente disponível (esferas em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são irreversíveis imobilizados) como controle positivo. Fig. 21A mostra um gráfico em que as barras representam o grau de proliferação de acordo com o número de células colhidas no dia 5 comparado aos controles negativos e normalizaram ao controle positivo. Fig. 21B mostram análise de FACS da expressão de superfície de CD8 e CD45RO depois da cultura de célula.

[00095] Fig. 22 mostra a ativação de cascatas de sinalização intracelulares de células Jurkat transfectadas que foram modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico αCD19 (CAR), e que foram estimulados usando a Strep-tactin® oligomérica do Exemplo 5 como um reagente de multimerização solúvel. A especificidade de um CAR é tipicamente derivada de uma região de scFv reunida da região de ligação de antígeno de um anticorpo monoclonal (mAb) que, especificamente, se liga a um antígeno associado alvo/tumor tal como CD19 e ligações a sinalização específica de célula T (descrito em Hudecek e outro, Clin Cancer Res. 15 de junho de 2013; 19(12): 3153-3164. Nas experiências o domínio extracelular (ECD) de CD19, que contém o ligante natural do CAR de aCD19 bem como o fragmento de F(ab)2 de dgG policlonal que reconhece o espaçador de IgG4 (F(ab)2 anti-humano de burro está comercialmente disponível de Jackson Immuno Research) dentro do aCD19-CAR foram da mesma forma usados nesta experiência como primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células Jurkat. A reversivelmente imobilização para a muteína de estreptavidina oligomérica solúvel foi fornecida pelo peptídeo estreptavidina SAWSHPQFEK(GGGS)2GGS- AWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07) que foi fusionado ao C-terminal do ECD de CD19 ou pelo fragmento de (Fab)2 biotinilado do dgG (visto que a muteína de estreptavidina "m2" liga-se a biotina com afinidade reduzida, esta ligação é reversível e pode por exemplo ser deslocada pela adição de um excesso de biotina livre). Na experiência de controle da Fig.22A 300.000 células Jurkat de resposta CD3+ (Jresp) foram estimuladas com quantidades variadas de uma mistura de preparações Estreptactina oligomérica (1mg/mL) que foi funcionalizado com o Fab aCD3 e o Fab aCD28 (“1x” corresponde a 3 μg de Estreptactina multimerizada funcionalizada com 0,5 μg de aCD3- e 0,5 μg de Fab aCD28-multímero de Estreptâmero policlonal). Na experiência da Fig. 22B 3 μL de uma preparação da Estreptactina oligomérica foi funcionalizada com 0,5 μg (x1) ou 1 μg (x2) do domínio extracelular (ECD) de CD19 ou com 3μL de uma preparação da Estreptactina oligomérica carregada com 0,5μg (x1) ou 1μg (x2) αIgG que reconhece o espaçador de IgG4 (que são ambos os multímeros de Streptamer® CAR-específica). Jresp estimulada com Dynabeads (esferas em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são irreversíveis imobilizadas) ou PMA e ionomicina serviu como controles positivos. Células Jresp foram semeadas em 1,5ml de tubos Eppendorf em 200 μL de médio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. Células foram incubadas a 37°C e postas em gelo e lisadas depois de 0 min a 20min de estímulo.

[00096] Fig. 23 mostra a expansão de células de resposta T de CD3+ purificadas estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizadas na Strep-tactin® oligomérica solúvel do Exemplo 5 que serviu para um reagente de multimerização solúvel. Em uma experiência, além de fragmentos Fab αCD3/αCD28, da mesma forma um fragmento Fab aCD8 comercialmente disponível de IBA GmbH, Gottingen, Germany (catálogo número 6-8000-203) foi imobilizado no oligômero solúvel da muteína de estreptavidina para testar se é possível para preferencialmente estimular in vitro a subpopulação de célula T de CD8+ dentro da cultura de CD3+ em volume com um reagente de multimerização da invenção tendo reversivelmente imobilizado nisso da mesma forma um fragmento Fab aCD8. Em mais detalhes, 500.000 células T (Tresp) de resposta CD3+ purificadas foram estimulados com 3 μL de uma preparação de Streptavidina oligomérica (1mg/mL) carregada com uma combinação de 0,5 μg de aCD3 e 0,5 μg do Fab aCD28. Como uma abordagem alternativa, 4,5 μL do oligômero de Estreptactina foram carregados com 0,5 μg de aCD3, 0,5 μg de Fab aCD8 e 0,5 μg de Fab aCD28 descrito acima. Células Tresp não estimuladas serviram como controle negativo e Tresp estimulada com Dynabeads (esferas em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são irreversíveis imobilizados) serviram como controle positivo.

[00097] Fig. 24 descreve estratégias exemplares para a geração de muteínas de estreptavidina oligomérica que podem ser usadas como reagente de multimerização solúvel da invenção. Fig. 24A mostra que em uma primeira etapa, a muteína de estreptavidina "m2" (SAm2) que compreende a sequência de aminoácido lle44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) nas posições de sequência 44 a 47 de estreptavidina tipo selvagem é usado para geração de muteínas de estreptavidina oligomérica tendo ums "estrutura convencional." Em uma segunda etapa, muteínas de estreptavidina solúveis oligoméricas tendo uma "estrutura grande" pode ser gerada por acoplamento de muteína de estreptavidina com proteína carreadora biotinilada tal como albumina de soro humana (HSA) ou por acoplamento das muteínas de estreptavidina com veículos sintéticos tal como PEG. Fig. 24B: Biotinilação de albumina de soro humana (HSA).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00098] A presente invenção fornece métodos, kits e um aparelho para expandir uma população de células ou para induzir uma população de células T a proliferar.

[00099] O termo "população de células" quando aqui usado abrange todas as células que podem ser expandidas por ligação a um receptor de superfície de célula um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células. É da mesma forma possível que para expansão da população de células, ligação do segundo agente a um segundo receptor de superfície de célula (molécula adicional) poderia ser necessário para produzir um sinal coestimulador requerido para expansão das células. Em algumas modalidades a população de célula pode ser uma população de linfócitos incluindo, porém, não limitado a uma população de células B, uma população de células T ou uma população de células exterminadoras naturais. Exemplos ilustrativos de populações de célula são células B transportando CD40 ou CD137 (igualmente a população de célula pode ser proliferada sob ligação de apenas um primeiro agente que fornece um sinal de ativação, por exemplo ligante 4-1BB; ou uma molécula de anticorpo para αCD40 ou uma molécula de anticorpo para αCD137 (veja por exemplo Zhang e outro, 2010, J Immunol, 184:787-795)). Outros exemplos ilustrativos para agentes (primeiro ou segundo) que podem ser usados para a expansão de células B são agentes que ligam-se a IgG, CD19, CD28 ou CD14, por exemplo moléculas de anticorpo para αCD19, aIgG, αCD28, ou aCD14. É da mesma forma pressentido que primeiro ou segundo agentes para a expansão de célula B podem compreender ligantes para receptores toll like ou interleucinas, tal como IL-21 (veja por exemplo Dienz O, 2009. J. Exp. Med. 206:69). É notado que ativação dependente de lipopolissacarídeo de células B é da mesma forma abrangida na presente invenção, como um lipopolissacarídeo pode da mesma forma ser usado como primeiro agente e pode ser equipado com um parceiro de ligação C1 quando usado aqui. Outros exemplos ilustrativos de populações de célula adequadas incluem população de célula T que se expande depois de ser ativada por ligação de um primeiro agente a TCR/CD3 e ligação de um segundo agente a uma molécula adicional na célula T tal como CD28. Neste caso, o primeiro agente estimula um sinal associado ao complexo de TCR/CD3 nas células T e o segundo agente fornece um estímulo secundário ligando-se CD28 como molécula adicional. Agentes que podem ser usados para a expansão de células T podem da mesma forma incluir interleucinas, tal como IL-2, IL-7, IL-15, ou IL- 21 (veja Cornish e outro por exemplo. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar e Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674, Battalia e outro, 2013, Immunology, 139(1):109-120). Outros exemplos ilustrativos para agentes que podem ser usados para a expansão de células T são agentes que ligam-se a CD8, CD45 ou CD90, tal como anticorpos para αCD8, aCD45 ou aCD90. Exemplos ilustrativos de população de célula T incluindo células T específicas de antígeno, células T indutoras, células T citotóxicas, célula T de memória (um exemplo ilustrativo de células T de memória são células T de memória central de CD62L+CD8+) ou células T reguladoras (um exemplo ilustrativo de Treg são células Treg de CD4+CD25+CD45RA+). O termo "célula T (população)" quando aqui usado da mesma forma inclui células T compreendendo um receptor de antígeno quimérico (CAR) que é da mesma forma conhecido como receptores de célula T artificiais ou receptores de célula T quiméricos. Desse modo, uma população de célula T que compreende um receptor de antígeno quimérico pode da mesma forma ser expandido usando os métodos, reagentes e dispositivos da presente invenção. Veja neste respeito da mesma forma Exemplo 15 em que células Jurkat que expressam para um receptor de antígeno específico de CD19 quimérico (CAR) foram estimuladas usando um reagente de multimerização solúvel da presente invenção. Outro exemplo ilustrativo de uma população de célula adequada inclui células exterminadoras naturais (células NK), que podem por exemplo ser expandidas com agentes que ligam-se a CD16 ou CD56 tal como por exemplo anticorpos para aCD16 ou aCD56. Em exemplo ilustrativo para um tal anticorpo para aCD16 é o anticorpo 3G8 com um sequência de VH mencionada em SEQ ID NO: 25 e uma sequência de VL mencionada em SEQ ID NO: 26 (veja Hoshino e outro, Blood, por exemplo. Dec 1991 15;78(12):3232-40.). Outro agente que pode ser usado para expansão de células NK pode ser IL-15 (veja por exemplo Vitale e outro. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92). Ainda outro exemplo ilustrativo de uma população de célula adequada inclui monócitos, que podem por exemplo ser ampliados usando um agente que se liga à CD14 tal como uma molécula de anticorpo para aCD14. A população de célula pode ser de qualquer origem mamífero, incluindo, porém, não limitada a humano, coelho, cobaia, esquilo, hamster, gato, cachorro, lémure, cabra, porco, cavalo, macacos rhesus, macaque, ou um chimpanzé.

[000100] Desse modo, de acordo com o anterior, esta invenção pertence a métodos para seletivamente induzir expansão ex vivo de uma população de células tal como células B, células T ou células exterminadoras naturais na ausência de fatores de crescimento exógenos, tal como linfocinas, e células adicionais. Além disso, a proliferação destas células tal como células B ou células T pode ser induzida sem a necessidade por antígeno, desse modo fornecendo uma população de célula expandida tal como uma população de célula T que é policlonal com respeito a reatividade de antígeno. Os métodos descritos aqui podem fornecer proliferação prolongada de uma população selecionada de células T tal como células T de CD4+ ou CD8+ durante um período estendido de tempo para produzir um aumento de múltiplas vezes no número destas células relativo à população de célula T original. Em geral, no caso de uma expansão (clonal) de uma população de linfócito como descrito aqui, toda a progênie pode compartilhar a mesma especificidade de antígeno como a população de célula que foi selecionada para expansão.

[000101] Da mesma forma de acordo com o anterior, fornecidos por esta invenção são métodos para expandir uma população de células T específicas de antígeno. Para produzir uma população de células T específicas de antígeno, células T são conectadas com um antígeno em uma forma adequada para ativar um sinal de ativação primário na célula T, isto é, o antígeno é apresentado à célula T tal que um sinal é ativado na célula T através do complexo de TCR/CD3. Por exemplo, o antígeno pode ser apresentado à célula T por um antígeno apresentando célula juntamente com uma molécula de MHC. Uma célula apresentando antígeno, tal como uma célula B, macrófago, monócito, célula dendrítica, célula de Langerhans, ou outra célula que pode apresentar antígeno a uma célula T, pode ser incubado com a célula T na presença do antígeno (por exemplo, um antígeno solúvel) tal que as célula apresentando antígeno apresenta o antígeno à célula T. Alternativamente, uma célula expressando um antígeno de interesse pode ser incubada com a célula T. Por exemplo, uma célula de tumor expressando antígenos associados a tumor pode ser incubada com uma célula T juntamente para induzir uma resposta específica de tumor. Similarmente, uma célula infectada com um patógeno, por exemplo, um vírus que apresenta antígenos do patógeno pode ser incubado com uma célula T. Seguindo ativação específica de antígeno de uma população de células T, as células podem ser ampliadas de acordo com os métodos da invenção. Por exemplo, depois que especificidade de antígeno foi estabelecida, células T podem ser expandida por cultura com um anticorpo anti-CD3 (usado como primeiro agente) e um anticorpo anti-CD28 (usado como segundo agente) de acordo com os métodos descritos aqui. Em outra modalidade, o primeiro agente pode ser um complexo de peptídeo:MHC I, que se liga a uma população de célula T específica de antígeno. Em uma tal modalidade, qualquer peptídeo específico de antígeno que é conhecido e que pode ser complexado com a molécula de MHC I respectivo pode ser usado. Veja neste respeito Exemplos 11 e 12 em que expansão específica de Antígeno seletiva de células de resposta Tcm fora das células T de memória central CD3+ em volume foi exemplificada para quatro células específicas de antígeno diferentes. Alternativamente, é da mesma forma possível usar como primeiro agente o ligante natural de um receptor que ativa de expansão de célula. Veja neste respeito Exemplo 15 em que o domínio extracelular de CD19 causou a ativação de cascatas de sinalização intracelulares de células Jurkat transduzidas que foram modificadas para expressar receptor de antígeno de ligação de CD19 quimérico (CAR).

[000102] A amostra da população de célula pode ser de qualquer fonte adequada, tipicamente toda a amostra de um tecido corporal ou um fluido corporal tal como sangue. No último caso, a amostra pode por exemplo, ser uma população de células mononucleadas de sangue periférico (PBMC) que podem ser obtidas através de métodos de isolamento padrões um tal gradiente de ficol de células de sangue. A população de célula a ser expandida pode, entretanto, da mesma forma estar na forma purificada e poderia ter sido isolada usando uma tecnologia de marcação/isolamento de célula reversível como descrita na patente US 7.776.562, patente US 8.298.782, pedido de patente Internacional WO02/054065 ou Pedido de patente Internacional WO2013/011011. Alternativamente, a população de células pode da mesma forma ser obtida por classificação de célula por meio de imunoaderência magnética negativa como descrito na patente US 6.352.694 B1 ou Patente Europeia EP 0 700 430 B1. Se um método de isolamento descrito aqui é usado em pesquisa básica, a amostra poderia ser células de experimentos de cultura de célula in vitro. A amostra tipicamente teria sido preparada em forma de um fluido, tal como uma solução ou dispersão.

[000103] De acordo com o anterior, em uma modalidade a invenção fornece um método in vitro de expandir uma população de células, compreendendo contatar uma amostra compreendendo uma população de células com um reagente de multimerização. O reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células, em que o reagente de multimerização compreendendo pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível do primeiro agente. O primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1. O primeiro agente liga-se a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células.

[000104] Em outra modalidade, a invenção fornece um método, em que o agente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células. O segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ser reversivelmente ligado a um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2. O segundo agente liga-se a molécula adicional na superfície na superfície das células, desse modo estimulando as células ativadas. Nesta modalidade o primeiro agente pode estimular um sinal associado ao complexo de TCR/CD3 nas células T e pode ser um agente de ligação que, especificamente, se liga a CD3. Nesta modalidade a molécula adicional na célula T pode ser CD28 e a segunda agente que se liga a molécula adicional é um reagente de ligação que, especificamente, se liga a CD28. Neste caso, o primeiro agente que, especificamente, se liga a CD3 pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD3, e molécula proteica de ligação à CD3 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo. Da mesma forma o segundo agente que, especificamente, se liga a CD28 pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD28, e uma molécula proteica de ligação de CD28 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo. O fragmento de anticorpo divalente pode ser um fragmento de (Fab)2’, ou um fragmento de Fv de cadeia única divalente enquanto o fragmento de anticorpo monovalente pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em um fragmento Fab, um fragmento de Fv, e um fragmento de Fv de cadeia única (scFv). Uma molécula proteica de ligação à CD3 ou CD28 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo pode ser um aptâmero, uma muteína com base em um polipeptídeo da família de lipocalina, um glucorpo, uma proteína com base no arcabouço de anquirina, uma proteína com base no arcabouço cristalino, uma adnectina, e um avímero.

[000105] Em geral o primeiro e o segundo agentes que são usados na presente invenção podem, por exemplo ser, um anticorpo, um fragmento do mesmo e uma molécula proteica de ligação com funções semelhantes a anticorpo. Exemplos de (recombinante) fragmentos de anticorpo são fragmentos Fab, fragmentos de Fv, fragmentos de Fv de cadeia única (scFv), um fragmento de anticorpo divalente tal como um fragmento de (Fab)2’, diacorpos, triacorpos (Iliades, P., e outro, FEBS Lett (1997) 409, 437-441), decacorpos (Stone, E., e outro, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) e outros anticorpos de domínio (Holt, L.J., e outro, Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484490). Em algumas modalidades um ou mais sítios de ligação do primeiro ou segundo agentes pode ser uma molécula proteica de ligação artificial bivalente tal como uma muteína de lipocalina dimérica que é da mesma forma conhecido como "duocalina." Em algumas modalidades o reagente de ligação de receptor pode ter um único segundo sítio de ligação, isto é, pode ser monovalente. Exemplos de primeiro ou segundo agentes monovalentes incluem, porém não são limitados a um fragmento de anticorpo monovalente, uma proteica molécula de ligação com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo ou uma molécula de MHC. Exemplos de fragmentos de anticorpo monovalentes incluem, porém não são limitados a um fragmento Fab, um fragmento de Fv, e um fragmento de Fv de cadeia única (scFv), incluindo um fragmento de Fv de cadeia única divalente.

[000106] Como mencionado acima, um exemplo de uma molécula proteica de ligação com funções semelhantes a anticorpo é uma muteína com base em um polipeptídeo da família de lipocalina (veja por exemplo, WO 03/029462, Beste e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903). Lipocalinas, tal como a proteína de ligação de bilina, o lipocalina associada a neutrófilo gelatinase humana, Apolipoproteína D humana ou lipocalina de lágrima humana possuem sítios de ligação de ligante naturais que podem ser modificados de forma que eles ligam um determinado alvo. Outros exemplos de um molécula proteica de ligação com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo que podem ser usadas como um reagente de ligação de receptor que, especificamente, se liga à molécula receptora incluem, porém não são limitados a, os denominado glucorpos (veja por exemplo pedido de patente internacional WO 96/23879), proteínas com base no arcabouço de anquirina (Mosavi, L.K., e outro, Protein Science (2004) 13, 6, 14351448) ou arcabouço cristalino (por exemplo pedido de patente internacional WO 01/04144) as proteínas descritas em Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187, AdNectins, tetranoctinas e avímeros. Avímeros, incluindo proteínas avímero multivalentes evoluíram por mistura de éxon de uma família de domínios de receptores humanos, que contêm os denominados A-domínios que ocorrem como fitas de domínios múltiplos em vários receptores de superfície de célula (Silverman, J., e outro, Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). Adnectinas, derivados de um domínio de fibronectina humano, contêm três alças que podem ser criadas para ligação semelhante a imunoglobulina a alvos (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). Tetranoctinas, derivadas da proteína homotrimérica humana respectiva, igualmente contêm regiões de alça em um domínio de lectina tipo C que pode ser criado para ligação desejada (ibid.). Peptóides que podem agir como ligantes de proteína são oligo(N-alquil) glicinas que diferem-se de peptídeos em que a cadeia lateral está conectada ao nitrogênio de amida em vez do átomo de α carbono. Peptóides são tipicamente resistentes a proteases e outras enzimas de modificação e podem ter uma permeabilidade de célula muito mais alta do que peptídeos (veja por exemplo Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509). Ainda outros exemplos de moléculas proteicas de ligação adequadas são um domínio semelhante a EGF, um domínio Kringle, um domínio de fibronectina tipo I, um domínio de fibronectina tipo II, um domínio de fibronectina tipo III, um domínio PAN, um domínio G1a, um domínio SRCR, um domínio de Inibidor de tripsina pancreático Kunitz/Bovino, tendamistat, um domínio de inibidor de serina protease tipo Kazal, um domínio Trefoil (tipo P), um domínio tipo C de fator de von Willebrand, um domínio semelhante a Anafilatoxina, um domínio CUB, uma repetição de tiroglobulina tipo I, domínio A de classe de receptor LDL, um domínio Sushi, um domínio de Ligação, um domínio Trombospondina tipo I, um domínio de imunoglobulina ou um domínio semelhante a imunoglobulina (por exemplo, anticorpos de domínio ou anticorpos de cadeia pesada de camelo), um domínio de lectina tipo C, um domínio MAM, um domínio tipo A de fator de von Willebrand, um domínio de Somatomedina B, um domínio central de quatro dissulfeto tipo WAP, um domínio F5/8 tipo C, um domínio de Hemopexina, um domínio SH2, um domínio SH3, um domínio semelhante a EGF tipo Laminina, um domínio C2, "Kapacorpos" (cf. Ill. e outro, Protein Eng (1997) 10, 949-57, um denominado "minicorpo" (Martin e outro, EMBO J (1994) 13, 5303-5309), um diacorpo (cf. Holliger e outro, PNAS USA (1993)90, 6444-6448), um denominado "Janusis" (cf. Traunecker e outro, EMBO J (1991) 10, 3655-3659, ou Traunecker e outro, Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52), um nanocorpo, um microcorpo, uma afilina, um aficorpo, uma knotina, ubiquitina, uma proteína ligadora de zinco, uma proteína autofluorescente ou uma proteína repetida rica em leucina. Um exemplo de uma molécula de ácido nucléico com funções semelhantes a anticorpo é um aptâmero. Um aptâmero se enovela em um motivo tridimensional definido e mostra afinidade alta para uma determinada estrutura alvo.

[000107] Voltando agora o reagente de multimerização, os sítios de ligação Z1 e Z2 do agente de multimerização podem ser idênticos (veja da mesma forma o Exemplo da Fig. 3). Neste caso, um único agente de multimerização pode ser usado.

[000108] Na modalidade que um primeiro agente de ligação reversível e, opcionalmente um segundo agente é usado, o reagente de multimerização pode ser imobilizado em uma superfície sólida. Qualquer superfície sólida (suporte) pode ser usada para a imobilização do reagente de multimerização. Exemplos ilustrativos de superfícies sólidas em que o reagente de multimerização pode ser imobilizado incluem uma esfera magnética, uma esfera polimérica, uma placa de cultura de célula, uma placa de microtítulo, uma membrana, ou uma fibra oca. Fibras ocas são, por exemplo, usadas como biorreator no Quantum® Cell Expansion System, disponível de TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA). O reagente de multimerização é normalmente covalentemente ligado ao suporte sólido, entretanto, interações não covalentes podem da mesma forma ser usadas para imobilização, por exemplo em substratos plásticos, se quiser. Como da mesma forma explicado em mais detalhes abaixo, o reagente de multimerização pode, por exemplo, ser uma estreptavidina ou muteína de avidina que reversivelmente liga um peptídeo de ligação à estreptavidina. Tais muteínas de estreptavidina podem ser covalente- mente ligados a qualquer superfície, por exemplo, resina (esferas) usada para purificação de cromatografia e está comercialmente disponível em tal forma a partir de IBA GmbH, Gottingen, por exemplo, como Strep-Tactin® Sepharose, Strep-Tactin® Superflow®, Strep- Tactin® Superflow® de alta capacidade ou Strep-Tactin® MacroPrep®. Outros reagentes de multimerização de exemplos ilustrativos que estão facilmente comercialmente disponíveis são imobilizados por resinas de cromatografia de afinidade de metal (IMAC) tal como as resinas de TALON® (Westburg, Leusden, The Netherlands) que pode ser usado para a imobilização reversível de proteínas marcadas por oligo-histidina (tag de His) em geral, significando aqui, para a ligação reversível de um primeiro ou um segundo agente que transportam como primeiro parceiro de ligação C1 ou segundo parceiro de ligação C2 um tag de oligohistidina tal como um tag de penta- ou hexa-histidina. Outros exemplos de reagentes de multimerização são sefarose de calmodulina disponível a partir de GE Life Sciences que podem ser usadas juntamente com um primeiro ou segundo agente que compreende um peptídeo de ligação à calmodulina como parceiro de ligação C1 ou C2 ou sefarose, os quais glutationa é acoplada. No caso, o parceiro de ligação C1 ou C2 é glutationa-S-transferase.

[000109] Em outras modalidades do método da invenção o reagente de multimerização pode estar em uma forma solúvel. Em princípio, os mesmos agentes de multimerização podem ser usados como no caso de um reagente de multimerização que é imobilizado em um suporte sólido. O reagente de multimerização é forma solúvel, pode por exemplo, ser um oligômero de muteína de estreptavidina, um oligômero de calmodulina, um composto (oligômero) que fornece pelo menos dois grupos quelantes K, em que os pelo menos dois grupos quelantes são capazes de ligação a um íon de metal de transição, desse modo tornando a porção A capaz de ligação a um tag de afinidade de oligohistidina, glutationa-S-transferase multimérica, ou uma proteína carreadora biotinilada.

[000110] Como explicado acima, o primeiro e segundo agente tem, além do sítio de ligação que é capaz de ligar a respectiva molécula receptora de superfície de célula, um parceiro de ligação C1 ou C2 (que será referido como "parceiro de ligação C" no seguinte para a facilidade de referência). Este parceiro de ligação C é capaz de ligar- se a um sítio de ligação Z do reagente de multimerização (Z significa qualquer sítio de ligação Z1 ou sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização) C. A ligação não covalente que é formada entre o parceiro de ligação C que é incluída no primeiro ou segundo agente e o(s) sítio(s) de ligação(ões) Z do reagente de multimerização pode ser de qualquer resistência e afinidade desejada, contanto que seja rompível ou reversível sob as condições sob as quais o método da invenção é realizado. A constante de dissociação (KD) da ligação entre o parceiro de ligação C que está incluído no reagente de ligação de receptor e o sítio de ligação Z do reagente de multimerização pode ter um valor na faixa de cerca de 10-2 M a cerca de 10-13 M. Desse modo, esta ligação reversível pode, por exemplo, tem uma KD de cerca de 102 M a cerca de 10-13 M, ou de cerca de 10-3 M a cerca de 10-12 M ou de cerca de 10-4 M a cerca de 10-11M, ou de cerca de 10-5 M a cerca de 10-10M. A KD desta ligação bem como a taxa de KD, koff e kon da ligação formada entre o sítio de ligação B do reagente de ligação de receptor e a molécula receptora podem ser determinadas por quaisquer meios adequados, por exemplo, por titulação de fluorescência, diálise de equilíbrio ou ressonância de plasmon de superfície. O reagente de ligação de molécula receptora pode incluir pelo menos um, incluindo dois, três ou mais, segundos parceiros de ligação C e o reagente de afinidade pode incluir pelo menos dois, tal como três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais sítios de ligação para o parceiro de ligação que está incluído no reagente de ligação de molécula receptora. Como descrito na patente US 7.776.562, patente US 8.298.782 ou pedido de patente Internacional WO 2002/054065 qualquer combinação de um parceiro de ligação C e um agente de afinidade com um ou mais sítios de ligação correspondentes Z podem ser escolhidos, contanto que o parceiro de ligação C e o sítio de ligação Z do agente de afinidade sejam capazes de reversivelmente ligar-se ou multimerizar-se em um complexo (multivalente) que tipicamente acompanha com um efeito de avidez.

[000111] O parceiro de ligação incluído no primeiro ou segundo agente pode ser um oligopeptídeo, um polipeptídeo, uma proteína, um ácido nucléico, um lipídio, um sacarídeo, um oligosacarídeo, ou um polissacarídeo. Um tal parceiro de ligação tem uma afinidade mais alta ao sítio de ligação do reagente de multimerização do que a outro assunto. Exemplos de um respectivo parceiro de ligação incluem, porém não são limitados a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento do mesmo e uma molécula proteica de ligação com funções semelhantes a anticorpo.

[000112] Em algumas modalidades o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agente inclui biotina e o reagente de afinidade inclui um análogo de estreptavidina ou um análogo de avidina que reversivelmente liga-se a biotina.

[000113] Em algumas modalidades o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agente inclui um análogo de biotina que reversivelmente liga-se a estreptavidina ou avidina, e o reagente de afinidade inclui estreptavidina, avidina, um análogo de estrepta- vidina ou um análogo de avidina que reversivelmente liga-se ao respectivo análogo de biotina.

[000114] Em algumas outras modalidades o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agente inclui um peptídeo de ligação à estreptavidina ou avidina e o reagente de afinidade inclui estreptavidina, avidina, um análogo de estreptavidina ou um análogo de avidina que reversivelmente liga-se ao respectivo peptídeo de ligação à estreptavidina ou avidina.

[000115] Em algumas modalidades o parceiro de ligação que é incluído no primeiro ou segundo agente pode incluir um peptídeo de ligação à estreptavidina Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 01) e o reagente de afinidade pode incluir uma muteína de estreptavidina (análogo) que compreende a sequência de aminoácido Va144-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 02) nas posições de sequência 44 a 47 de estreptavidina tipo selvagem ou a muteína de estreptavidina (análogo) que compreende a sequência de aminoácido lle44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) nas posições de sequência 44 a 47 de estreptavidina tipo selvagem ambas das quais são descritas na patente US 6.103.493 por exemplo, e estão comercialmente disponíveis sob a marca registrada Strep-Tactin®. Por exemplo, os peptídeos de ligação à estreptavidina poderiam ser únicos peptídeos tal como o "Strep-tag®" descrito na patente US 5.506.121, por exemplo, ou peptídeos de ligação à estreptavidina tendo um arranjo sequencial de dois ou mais módulos de ligação individuais como descrito em Publicação de Patente Internacional WO 02/077018 ou patente US 7.981.632.

[000116] Em alguma modalidade o parceiro de ligação C do primeiro ou segundo agente inclui uma porção conhecida ao técnico versado como um tag de afinidade. Em uma tal modalidade o reagente de afinidade inclui um parceiro de ligação correspondente, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, conhecido por ligar-se ao tag de afinidade. Como alguns exemplos ilustrativos de tags de afinidade conhecidos, o parceiro de ligação que é incluído no primeiro ou segundo agente pode incluir uma oligohistidina, um domínio de imunoglobulina, proteína de ligação de maltose, glutationa-S- transferase (GST), proteína de ligação de quitina (CBP) ou tioredoxina, peptídeo de ligação à calmodulina (CBP), FLAG'-peptídeo, tag HA (sequência: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala, (SEQ ID NO: 11)), tag VSV-G (sequência: Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys, (SEQ ID NO: 12)), tag HSV (sequência: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu- Asp-Pro-Glu-Asp, (SEQ ID NO: 13)), o epítopo de T7 (Ala-Ser-Met- Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly, (SEQ ID NO: 14)), proteína de ligação de maltose (MBP), o epítopo de HSV da sequência Gln-Pro-Glu-Leu- Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp (SEQ ID NO: 13) vírus do herpes simples glicoproteína D, epítopo de "myc" do fator de transcrição c- myc da sequência Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (SEQ ID NO: 15), o tag de V5 (sequência: Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu- Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr, SEQ ID NO: 16), ou glutationa-S- transferase (GST). Em uma tal modalidade o complexo formado entre o um ou mais sítios de ligação do reagente de multimerização, neste caso um anticorpo ou fragmento de anticorpo, e o antígeno pode ser rompido competitivamente adicionando-se o antígeno livre, isto é o peptídeo livre (tag de epítopo) ou a proteína livre (tal como MBP ou CBP). O tag de afinidade poderia da mesma forma ser um tag de oligonucleotídeo. Um tal tag de oligonucleotídeo pode, por exemplo, ser usada para hibridizar em um oligonucleotídeo com uma sequência complementar, ligada ao ou incluída no reagente de afinidade.

[000117] Em algumas modalidades a ligação entre o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agente e um ou mais sítios de ligação do reagente de multimerização ocorre na presença de um cátion divalente, trivalente ou tetravalente. Nesta consideração em algumas modalidades o reagente de multimerização inclui um cátion divalente, trivalente ou tetravalente, tipicamente sustentado, por exemplo complexado, por meios de um quelante adequado. O parceiro de ligação que está incluído no reagente de ligação de receptor pode em uma tal modalidade incluir uma porção que inclui, por exemplo complexos, um cátion divalente, trivalente ou tetravalente. Exemplos de um respectivo quelante de metal, incluem, porém não são limitados a, etilenodiamina, ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido tetraacético de etileno glicol (EGTA), ácido dietilenotriaminepen- taacético (DTPA), N,N-bis(carboximetil)glicina (da mesma forma chamado ácido nitrilotriacético, NTA), ou ácido 1,2-bis(o- aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA). Como um exemplo, EDTA forma um complexo com mais íons de metal monovalentes, divalentes, trivalentes e tetravalentes, tal como por exemplo cálcio (Ca2+), manganês (Mn2+), cobre (Cu2+), ferro (Fe2+), cobalto (Co3+) e zircônio (Zr4+), enquanto BAPTA é específico para Ca2+. Como um exemplo ilustrativo, um método padrão usado na técnica é a formação de um complexo entre um tag de oligohistidina e íons de cobre (Cu2+), níquel (Ni2+), cobalto (Co2+), ou zinco (Zn2+) que são apresentados por meio do ácido nitrilotriacético quelante (NTA).

[000118] Em algumas modalidades o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agentes inclui um peptídeo de ligação à calmodulina e o reagente de afinidade inclui calmodulina multimérica como descrito na patente US 5.985.658 ou como descrito aqui com referência a Figura 2, por exemplo. Em algumas modalidades o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agentes inclui um peptídeo de FLAG e o reagente de afinidade inclui um anticorpo que se liga ao peptídeo de FLAG, por exemplo o peptídeo de FLAG, que se liga ao anticorpo monoclonal 4E11 como descrito na patente US 4.851.341. Em uma modalidade o parceiro de ligação C que é incluído no primeiro ou segundo agente inclui um tag de oligoistidina e o reagente de afinidade inclui um anticorpo ou um íon de metal de transição que se liga ao tag de oligoistidina. O rompimento de todos estes complexos de ligação pode ser realizado por quelação de íon de metal, por exemplo quelação de cálcio, por exemplo adicionando-se EDTA ou EGTA (supra). Calmodulina, anticorpos tal como 4E11 ou íons de metal quelados ou quelantes livres podem ser multimerizados por métodos convencionais, por exemplo por biotinilação e complexação com estreptavidina ou avidina ou multíme- ros dos mesmos ou pela introdução de resíduos de carboxila em um polissacarídeo, por exemplo dextrana, essencialmente como descrito em Noguchi, A. e outro Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137, em uma primeiro etapa e ligando calmodulina ou anticorpos ou íons de metal quelados ou quelantes livres por meio de grupos amino primários aos grupos carboxila no polissacarídeo, por exemplo dextrana, esqueleto usando química de carbodiimida convencional em uma segunda etapa. Em tais modalidades a ligação entre o parceiro de ligação C que é incluída no primeiro ou segundo agente e o um ou mais sítios de ligação Z do reagente de multimerização pode ser rompida por quelação de íon de metal. Por exemplo, a quelação de metal pode ser realizada por adição de EGTA ou EDTA.

[000119] Em algumas modalidades, em particular, se o reagente de multimerização está em forma solúvel e está com base em estreptavi- dina ou avidina, é um oligômero ou um polímero de estreptavidina ou avidina ou de qualquer muteína (análogo) de estreptavidina ou avidina. O sítio de ligação Z é a ligação natural de biotina de avidina ou estreptavidina. O respectivo oligômero ou polímero podem ser reticulados por um polissacarídeo. Em uma modalidade, oligômeros ou polímeros de estreptavidina ou de avidina ou de muteínas (análogos) de estreptavidina ou de avidina são preparados pela introdução de resíduos de carboxila em um polissacarídeo, por exemplo, dextrana, essencialmente como descrito em Noguchi, A, e outro, Bioconjugate Chemistry (1992) 3.132-137 em uma primeira etapa. Em seguida estreptavidina ou avidina ou análogos dos mesmos podem ser ligados por meio de grupos amino primários de resíduo de lisina interno e/ou o N-terminal livre aos grupos carboxila no esqueleto de dextrana usando química de carbodiimida convencional em uma segunda etapa. Além disso, oligômeros ou polímeros reticulados de estreptavidina ou avidina ou de qualquer muteína (análogo) de estreptavidina ou avidina podem da mesma forma ser obtidos por reticulando-se estreptavidina individual ou moléculas de avidina (o homodímero tetramérico de estreptavidina ou avidina é referido aqui como uma "molécula individual" ou bloco de construção menor de um respectivo oligômero ou polímero) por meio de moléculas bifuncionais, servindo como um ligante, tal como glutardial- deído ou por outros métodos descritos na técnica. Por exemplo, é possível gerar oligômeros de muteínas de estreptavidina introduzindo- se, em uma primeira etapa, grupos tiois na muteína de estreptavidina (isto pode, por exemplo, ser feito por reação da muteína de estreptavi- dina 2-iminotiolan (reagente de Trauts) e ativando-se, em uma reação separada grupos aminos disponível na muteína de estreptavidina. Esta ativação de grupos amino pode ser obtida por reação da muteína de estreptavidina com reticuladores heterobifuncionais comercialmente disponíveis tal como 4-(N-maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de sulfossucinimidila (sulfo SMCC) ou Sucinimidil-6-[(β-maleimidopropi- onamido)hexanoato (SMPH). Em uma segunda etapa, os dois produtos de reação desse modo obtidos são misturados juntos, levando à reação dos grupos tiol contidos na uma batelada de muteína de estreptavidina modificada com os aminoácidos ativados (por funções de maleimida) da outra batelada de muteína de estreptavidina modificada. Por esta reação, multímeros/oligômeros da muteína de estreptavidina são formados. Estes oligômeros podem ter qualquer número adequado de "molécula individual" ou bloco de construção de estreptavidina" mais alto do que 3 e o grau de oligomerização pode ser variado de acordo com a condição de reação (veja Fig. 24). Depois de reagir estes dois grupos da muteína de estreptavidina modificada, o reagente de multimerização solúvel oligomérico é tipicamente isolado por cromatografia de exclusão de tamanho e qualquer fração desejada pode ser usada como reagente de multimerização. Tipicamente, os oligômeros não têm (e não necessitam ter) um único peso molecular porém eles normalmente observam uma distribuição de peso estatística tal como distribuição de Gaussian. Qualquer oligômero com mais do que três homotetrâmeros de estreptavidina (blocos de construção; (n = 3)) pode ser usado como reagente de multimerização solúvel. Os oligômeros poderiam ter, por exemplo de 3 a 25 homotetrâmeros de muteína de esteptavidina. Com um peso molecular de cerca de 50 kDa para muteínas de estreptavidina tal como a muteína "m1" ou "m2" descrita em mais detalhes abaixo, estes oligômeros solúveis têm um peso molecular de cerca de 150 kDa a cerca de 1250 kDa. Visto que cada molécula/muteína de estreptavidina tem quatro sítios de ligação à biotina um tal reagente de multimerização fornece 12 a 100 sítios de ligação Z1 (e Z2) como descrito aqui.

[000120] De acordo com a descrição acima, além de tais reagentes de multimerização oligoméricos que apenas contêm homotetrâmeros de estreptavidina reticulados, é possível reagir muteínas de estreptavi- dina tetraméricos em um veículo para obter reagentes de multimerização que são usados na presente invenção. Além da reação descrita acima com um polissacarídeo, é da mesma forma possível usar proteínas fisiologicamente ou farmaceuticamente aceitáveis tal como albumina de soro (por exemplo albumina de soro humana (HSA) ou albumina de soro bovina (BSA) como proteína carreadora. Em um tal caso, a muteína de estreptavidina (como homo-tetrâmero individual ou da mesma forma na forma de oligômeros com n = 3) pode ser acoplado à proteína carreadora por meio de interação não covalente. Para este propósito, BSA biotinilado (que está comercialmente disponível a partir de vários fornecedores tal como ThermoFisher Scientific, Sigma Aldrich ou Vectorlabs, para nomear apenas alguns) pode ser reagido com a muteína de estreptavidina. Ao fazer assim, alguns dos oligômeros de estreptavidina não covalentemente se ligarão por meio de um ou mais sítios de ligação à biotina (Z1, Z2) à proteína carreadora biotinilada, deixando a maioria dos sítios de ligação (Z1, Z2) do oligômero disponível para ligar os agentes tal como o primeiro agente e opcionalmente o segundo agente e qualquer outro agente como descrito aqui. Desse modo, para uma tal abordagem um reagente de multimerização solúvel com uma múltiplos sítios de ligação Z1 pode ser convenientemente preparado (veja Fig. 24). Alternativamente, uma muteína de estreptavidina (ou como homo- tetrâmero individual ou da mesma forma na forma de oligômeros com n = 3) pode ser covalentemente acoplado a um veículo sintético tal como uma molécula de polietileno glicol (PEG). Qualquer molécula de PEG adequada pode ser usada para este propósito, contanto que a molécula de PEG e o respectivo reagente de multimerização seja solúvel. Tipicamente, molécula de PEG até um peso molecular de 1000 Da são todas solúveis em água ou meio de cultura que podem ser usados na presente invenção. Tal reagente de multimerização com base em PEG pode ser facilmente preparado usando moléculas de PEG ativadas comercialmente disponíveis (por exemplo, derivados PEG-NHS disponíveis a partir NOF North America Corporation, Irvine, California, USA, ou derivados de PEG ativados disponíveis a partir de Creative PEGWorks, Chapel Hills, North Carolina, USA) com grupos amino da muteína de estreptavidina.

[000121] Sob estreptavidina ou estreptavidina tipo selvagem (wt- estreptavidina), a sequência de aminoácido descrita por Argarana e outro, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882 é referida. Muteínas de Estreptavidina são polipeptídeos que são distintos da sequência de estreptavidina tipo selvagem por um ou mais substituições de aminoácido, deleções ou adições e que retêm as propriedades de ligação de wt-estreptavidina. Polipeptídeos semelhantes estreptavidina e muteínas de estreptavidina são polipeptídeos que essencialmente são imunologicamente equivalentes a estreptavidina tipo selvagem e são em particular capazes de ligar biotina, derivado de biotina ou análogos de biotina com a mesma ou diferente afinidade como wt- estreptavidina. Polipeptídeos semelhantes a estreptavidina ou muteí- nas de estreptavidina podem conter aminoácidos que não fazem parte da estreptavidina tipo selvagem ou eles podem incluir apenas uma parte da estreptavidina tipo selvagem. Polipeptídeos semelhantes a estreptavidina são da mesma forma polipeptídeos que não são idênticos a estreptavidina tipo selvagem, visto que o hospedeiro não tem as enzimas que são requeridas para transformar o polipeptídeo hospedeiro produzido na estrutura de estreptavidina tipo selvagem. O termo "estreptavidina" da mesma forma inclui tetrâmeros de estrepta- vidina e dímeros de estreptavidina, em particular homotetrâmeros de estreptavidina, homodímeros de estreptavidina, heterotetrâmeros de estreptavidina e heterodímeros de estrepavidina. Cada subunidade regularmente tem um sítio de ligação para biotina ou análogos de biotina ou para peptídeos de ligação à estreptavidina. Exemplos de estreptavidinas ou muteínas de estreptavidina são mencionados, por exemplo, em WO 86/02077, DE 19641876 Al, US 6.022.951, WO 98/40396 ou WO 96/24606.

[000122] Em uma modalidade preferida, muteínas de estreptavidina que são usadas como reagente de multimerização são aquelas muteínas de estreptavidina que são descritas na patente US 6.103.493 e da mesma forma em DE 196 41 876.3. Estas muteínas de estreptavidina têm pelo menos uma mutação dentro da região de posições de aminoácido 44 a 53, com base na sequência de aminoácido de estreptavidina tipo selvagem. Preferência é dada a muteínas de uma estreptavidina mínima, que começa N-terminalmente na região de aminoácidos 10 a 16 da estreptavidina tipo selvagem e extremidade C-terminal na região de aminoácidos 133 a 142 de estreptavidina tipo selvagem. Exemplos de tais muteínas de estrepta- vidina preferidas têm um aminoácido alifático hidrofóbico em vez de Glu na posição 44, qualquer aminoácido na posição 45, um aminoácido alifático hidrofóbico na posição 46 ou/e um aminoácido básico em vez de Val na posição 47. A muteína de estreptavidina pode ser uma muteína que compreende a sequência de aminoácido Va144-Thr45-Ala46- Arg47 (SEQ ID NO: 02) nas posições de sequência 44 a 47 ou a muteína de estreptavidina (análogo) compreendendo a sequência de aminoácido lle44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 03) nas posições de sequência 44 a 47 de estreptavidina tipo selvagem. Tais muteínas são descritos na patente US 6.103.493, por exemplo, e estão comercialmente disponíveis de IBA GmbH na forma de muteína "m1" e muteína "m2" sob a marca registrada Strep-Tactin®.

[000123] Um método de acordo com a presente invenção pode em algumas modalidades ser usado para esvaziar uma amostra de reagentes que previamente foi usada em expansão de célula. O primeiro ou segundo agente e o parceiro livre respectivo (o agente de competição) pode, por exemplo, estar presente incluído no eluato de um método de expansão como descrito acima. Usando um método de acordo com a invenção tais reagentes podem ser pelo menos essencialmente, incluindo completamente removido de uma amostra, por exemplo de uma população de célula. Como um exemplo ilustrativo, primeiro ou segundo agente como definido acima pode ser esvaziado de uma amostra em níveis dos que estão debaixo do limite de detecção por exemplo FACS ou Western Blot. Um reagente de competição (primeiro ou segundo parceiro de ligação livre ou análogo do mesmo) pode ter sido usado para terminar e controlar a expansão e liberação da população de célula forma o agente de multimerização. Este reagente de competição pode ter um sítio de ligação que é capaz de especificamente ligar-se ao sítio de ligação Z do reagente de afinidade em um "cartucho de remoção"de WO 2013/124474. Em tal uma modalidade o respectivo método da invenção pode da mesma forma servir para esvaziar o primeiro e segundo agente e o reagente de competição, incluindo remoção do mesmo.

[000124] Um método de acordo com a presente invenção pode ser realizado em qualquer temperatura em que a viabilidade da população de célula é pelo menos essencialmente descomprometida. Quando referência é feita aqui a condições que são pelo menos essencialmentenão prejudiciais, não danosas ou pelo menos essencialmente não comprometendo viabilidade, condições são referidas, sob as quais a porcentagem da população de células que serão expandidas com viabilidade total, é pelo menos 70%, incluindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99.5%. Em algumas modalidades um método de acordo com a invenção é realizado em uma temperatura de cerca de 20°C ou mais alta. Dependendo da população de célula a ser expandida uma faixa de temperatura adequada podem ser por exemplo de cerca de 20°C a cerca de 45°C, incluindo de cerca de 25°C a cerca de 40°C, ou de cerca de 32°C a 37°C. Em algumas modalidades um método de acordo com a invenção é realizado em um valor de temperatura constante, ou a um valor de temperatura selecionado ± cerca de 5°C, ± cerca de 4°C, ± cerca de 3°C, ± cerca de 2°C, ± cerca de 1°C ou ± cerca de 0,5°C. A pessoa versada na técnica pode determinar uma temperatura adequada empiricamente, levando em conta a natureza das células e as condições de expansão. Tipicamente células humanas são expandidas em uma temperatura tal como 37°C.

[000125] Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método in vitro de expandir uma população de células, compreendendo contatar uma amostra compreendendo uma população de células com um reagente de multimerização, em que o reagente de multimerização está em uma forma solúvel e imobilizada aqui (ligado a isso) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células. O reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação do primeiro agente, em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de ligação ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização. O primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e o primeiro agente liga-se a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células. É expressamente notado aqui que quando um agente de multimerização solúvel é usado, a ligação entre a parte de ligação C1 e o sítio de ligação Z1 não necessita ser reversível.

[000126] Em uma modalidade deste segundo agente de multimeriz- ação tem imobilizado sobre ele (ligado a isso) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ser ligado para um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização. O segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2, em que o segundo agente liga-se à molécula adicional na superfície na superfície das células, desse modo estimulando as células ativadas.

[000127] Em uma modalidade deste segundo método, a ligação formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1 pode ser irreversível e/ou da mesma forma a ligação formada entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2 pode ser irreversível.

[000128] Em uma modalidade diferente deste segundo método, a ligação formou entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1 pode ser reversível. Da mesma forma a ligação formada entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2 pode ser reversível. Neste caso, a constante de dissociação (Kd) para a ligação reversível entre o referido sítio de ligação Z1 e o referido parceiro de ligação C1 e/ou para a ligação reversível entre o referido sítio de ligação Z2 e o referido parceiro de ligação C2 podem estar na faixa de 10-2 M a 10-13 M.

[000129] Neste segundo método que está baseado em um reagente de multimerização solúvel, o primeiro e segundo reagentes bem como o reagente de multimerização e todos os outros reagentes e populações de célula podem de outra maneira ser usados da mesma maneira como descrito acima para o método que faz uso de reversível entre o primeiro ou segundo agentes e o reagente de multimerização.

[000130] A invenção também fornece um kit de reagente para expandir uma população de células, o kit compreendendo,

[000131] (i) um reagente de multimerização, em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z para a ligação reversível de um primeiro agente,

[000132] (ii) um primeiro agente que se liga a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células, em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se a um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e

[000133] (iii) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de reversivelmente ligar-se a um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2, em que o segundo agente liga-se à molécula adicional na superfície na superfície das células, desse modo estimulando as células ativadas.

[000134] A invenção também fornece um kit de reagente para expandir uma população de células, o kit compreendendo,

[000135] (i) um reagente de multimerização, em que o reagente de multimerização está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z para a ligação reversível de um primeiro agente,

[000136] (ii) um primeiro agente que se liga a uma molécula receptora na superfície das células, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células, em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de ligação a um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1.

[000137] Este segundo kit de reagente pode também compreender (iii) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ligação a um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2.

[000138] Um kit como descrito aqui é em particular usado quando a população de células for uma população de linfócito.

[000139] De acordo com a descrição acima, a invenção da mesma forma fornece novos reagentes de multimerização e novas composição compreendendo reagentes de multimerização que os cuidados capazes de expandir uma população de células. Um tal reagente de multimerização que é capaz de expandir uma população de células é um reagente de multimerização que está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível de um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células, em que o reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o referido primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células; em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se a pelo menos um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1. Deveria ser notado aqui que um tal agente de multimerização pode ter imobilizado sobre ele qualquer do primeiro agente que é descrito aqui.

[000140] Um reagente de multimerização da invenção pode também compreender pelo menos um sítio de ligação Z2 para a ligação reversível de um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ligação a pelo menos um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização. Nesta modalidade o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2.

[000141] Da mesma forma de acordo com a descrição determinada acima, um tal reagente de multimerização é capaz de expandir uma população de linfócito ou uma subpopulação contida na população de linfócito. A população de linfócito a ser expandida pode ser qualquer população adequada, por exemplo, uma população de célula B, uma população de célula T, ou uma população de célula exterminadora natural. A população de célula T pode ser uma população de célula T específica de antígeno, uma população de célula T auxiliar, uma célula T citotóxica, uma célula T de memória, uma célula T reguladora, ou uma população de célula T exterminadora natural. Desta maneira, em tais modalidades do reagente de multimerização o primeiro agente pode estimular um sinal associado ao complexo de TCR/CD3 nas células T. O primeiro agente presente no reagente de multimerização pode desse modo ser reagente de ligação que, especificamente, se liga a CD3, enquanto o segundo agente que se liga à molécula adicional pode ser um agente de ligação que, especificamente, se liga a CD28 ou CD137.

[000142] Em modalidades do reagente de multimerização o primeiro agente que, especificamente, se liga a CD3 pode ser um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti- CD3, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti- CD3, e/ou molécula proteica de ligação à CD3 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo. Nestas modalidades, o segundo agente que, especificamente, se liga a CD28 ou CD137 pode ser um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD28, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD28, uma molécula proteica de ligação de CD28 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo, um anticorpo anti- CD137, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti- CD137, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti- CD137, uma molécula proteica de ligação de CD137 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo, ligante 4-1BB, e qualquer mistura dos mesmos. Desse modo, um reagente de multimerização da invenção pode geralmente ter imobilizado sobre ele um tipo de primeiro agente e uma mistura de segundos agentes, por exemplo, um anticorpo anti-CD3 como primeiro agente e por exemplo, um anticorpo anti-CD28 e ligante 4-1BB como (união) segundos agentes.

[000143] Se o reagente de multimerização será usado para a expansão de células B, o primeiro agente imobilizado no reagente de multimerização pode ser um reagente de ligação que, especificamente, se liga a CD40 ou CD137. Em tais modalidades o primeiro reagente de ligação que, especificamente, se liga a CD40 ou CD137 pode ser selecionado a partir de um anticorpo anti-CD40 de acordo com a descrição determinada aqui, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD40, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD40, e uma molécula proteica de ligação de CD40 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo ou um anticorpo anti-CD137, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD137, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD137, uma molécula proteica de ligação de CD137 com propriedades de ligação semelhantes a anticorpo, e ligante CD40 (CD154).

[000144] Da mesma forma de acordo com a descrição geral da presente invenção, no reagente de multimerização como descrito aqui os sítios de ligação Z1 e Z2 do reagente de multimerização podem ser idênticos. Como descrito acima, um tal reagente de multimerização pode compreende um oligômero ou um polímero de estreptavidina, um oligômero ou um polímero de avidina, um oligômero ou um polímero de um análogo de estreptavidina que reversivelmente liga-se a biotina, um oligômero ou um polímero de uma avidina análoga que reversivelmente ligam biotina, um reagente que compreende pelo menos dois grupos quelantes K, em que o pelo menos dois grupos quelantes são capazes de ligação a um íon de metal de transição, desse modo tornando o reagente capaz de ligar-se a um tag de afinidade de oligohistidina, glutationa-S-transferase multimérica, calmodulina multimérica e uma proteína carreadora biotinilada.

[000145] Uma nova composição fornecida aqui que é capaz de expandir uma população de células pode compreender

[000146] (i) um primeiro reagente de multimerização, em que o primeiro reagente de multimerização está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível de um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células, em que o primeiro reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o referido primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células, em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se a pelo menos um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, e

[000147] (iI) um segundo reagente de multimerização, em que o segundo reagente de multimerização está em forma solúvel e compreende pelo menos um sítio de ligação Z2 para a ligação reversível de um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o reagente de multimerização tem reversivelmente imobilizado sobre ele (ligado a isso) o referido segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células, em que o segundo agente compreende um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de ligação a pelo menos um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o segundo agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação formado entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2.

[000148] Uma tal nova composição é, por exemplo a mistura reacional usada no Exemplo 13, em que dois reagentes de multimerização separados foram funcionalizados com um fragmento Fab αCD3 apenas ou um fragmento Fab αCD28 apenas. É notado neste contexto que uma tal composição foi mostrada no Exemplo 13 para ter a mesma eficiência de expansão como um único reagente de multimerização em que o primeiro agente e o segundo agente são juntamente imobilizados. Desse modo, o uso combinado de dois ou mais reagentes de multimerização que é individualmente funcionalizado com apenas um tipo de reagente (por exemplo, um primeiro ou um segundo agente) é funcionalmente equivalente para usar para a expansão um reagente de multimerização em comum que imobilizou sobre ele igualmente o primeiro agente e um segundo agente. Neste contexto, é da mesma forma notado que um reagente de multimerização da presente invenção é funcionalizado com como muitos agentes (por exemplo, um, dois, três, quatro ou ainda mais agentes) que são pretendidos ser usados para a expansão de uma população de célula selecionada. Um terceiro ou quarto agente pode, por exemplo, fornecer um estímulo para a expansão de uma subpopulação desejada de células. Por exemplo, veja neste contexto Exemplo 13 em que reagentes de multimerização solúveis foram reversivelmente funcionalizados com três reagentes, isto é um fragmento Fab αCD3 como primeiro reagente, um fragmento Fab aCD28 como segundo reagente e um fragmento Fab aCD8 como terceiro reagente para enriquecer a subpopulação de células T de CD8+ em uma amostra de uma população de células T de CD3+ (linfócito). Usando-se tais combinações de agentes que podem todos ser reversivelmente imobilizados no mesmo reagente de multimeri- zação, a presente invenção permite a possibilidade para preferencialmente expandir ou seletivamente enriquecer qualquer (sub)popula- ção de célula desejada de uma amostra que, por exemplo, compreende uma variedade de subpopulações diferentes. Neste contexto, é notado que é entretanto da mesma forma possível usar para este propósito usar de três reagentes de multimerização diferentes, por exemplo, um primeiro reagente de multimerização que é funcionaliza- do com apenas um fragmento Fab aCD3, um segundo reagente de multimerização que é funcionalizado com um fragmento Fab aCD28 e um terceiro reagente de multimerização que é funcionalizado com um fragmento Fab aCD8. Igualmente, é possível usar apenas dois reagentes de multimerização diferentes, um primeiro reagente de multimerização que é funcionalizado com apenas um fragmento Fab aCD3 e um segundo reagente de multimerização que é funcionalizado igualmente com um fragmento Fab aCD28 e um fragmento Fab aCD8. Desta maneira, a presente invenção permite designar qualquer tipo de reagente de expansão desejável de uma maneira modular.

[000149] A invenção da mesma forma fornece um método in vitro de serialmente expandir uma população de linfócitos, em que a população de linfócitos compreende células T. Este método compreende

[000150] contatar uma amostra compreendendo a célula T, que compreende população de linfócitos com um reagente de multime- rização,

[000151] em que o reagente de multimerização está em uma forma solúvel e tem reversivelmente imobilizado sobre ele (i) um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células T e (ii) um segundo agente que estimula uma molécula adicional na superfície das células T,

[000152] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z1 para a ligação reversível do primeiro agente,

[000153] em que o primeiro agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C1, em que o parceiro de ligação C1 é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1,

[000154] em que o reagente de multimerização compreende pelo menos um sítio de ligação Z2 para a ligação reversível do segundo agente,

[000155] em que o segundo agente compreende pelo menos um parceiro de ligação C2, em que o parceiro de ligação C2 é capaz de reversivelmente ligar-se ao sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização, em que o primeiro agente é ligado ao reagente de multimerização pela ligação reversível formada entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2,

[000156] em que o primeiro agente liga-se a uma molécula receptora na superfície das células T, desse modo fornecendo um sinal de ativação primário às células e desse modo ativando as células T,

[000157] em que o segundo agente liga-se à molécula adicional na superfície das células T, desse modo estimulando as células ativadas, o primeiro agente e o segundo agente desse modo juntos induzindo as células T se expandir.

[000158] Neste método contatando a amostra contendo a população de linfócitos que sucessivamente contêm a população de célula T com o reagente de multimerização solúvel que imobilizou sobre ele o primeiro e segundo agentes resulta em ligação específica de células T ao reagente de multimerização.

[000159] O contato da amostra compreendendo a célula T, que compreende população de linfócitos com o reagente de multimeriza- ção podem ser realizada em um biorreator tal como um biorreator de fibra oca (por exemplo biorreator de fibra oca do sistema de expansão de célula Quantum®) ou um biorreator de sacola plástica (por exemplo Cellbag® usado em Sistema de Expansão de Célula Xuri W25 De GE Healthcare).

[000160] Este método também compreende contatar a população de linfócitos (mistura reacional contendo as células T ligadas ao reagente de multimerização pelo primeiro agente e o segundo agente) com (i) um primeiro parceiro de ligação C1 livre ou um análogo do mesmo capaz de romper a ligação entre o primeiro parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1 e (ii) um segundo parceiro de ligação C2 livre ou um análogo do mesmo, capaz de romper a ligação entre o segundo parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2. Assim fazendo a ligação reversível entre o referido parceiro de ligação C1 do primeiro agente e os referidos sítios de ligação Z1 bem como a ligação reversível entre o referido parceiro de ligação C2 do segundo agente e o referido sítio de ligação Z2 do referido sítio reagente de multimerização é rompido, desse modo liberando em um eluato as células T ligadas ao reagente de multimerização pelo primeiro agente e o segundo agente e parando a expansão das células T.

[000161] Neste método o eluato (a mistura reacional em que a reação de expansão foi terminada por adição do primeiro parceiro(s) livre ou análogo(s) do mesmo que contém a população de célula T expandida pode ser exposto a cromatografia em uma fase estacionária adequada (primeira). A (primeira) fase estacionária pode ser uma matriz de filtração em gel e/ou uma matriz de cromatografia de afinidade como descrito no pedido de patente Internacional WO 2013/124474. Esta matriz de filtração em gel e/ou cromatografia de afinidade compreende um reagente de afinidade, em que o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z1 e/ou Z2 que, especificamente, se liga a ao parceiro de ligação C1 e/ou C2 compreendido no primeiro agente ou no segundo agente. Ao fazer o primeiro agente, o segundo agente, o primeiro parceiro de ligação C1 e/ou o segundo parceiro de ligação C2 livre são imobilizados na fase estacionária. Neste método, a primeira fase estacionária está fluidamente conectada ao biorreator.

[000162] Em uma das modalidades desta expansão serial os sítios de ligação Z1 e Z2 do agente de multimerização são idênticos. Além disso, um único agente de multimerização pode ser usado. Quando um agente de multimerização solúvel é usado, a população de célula T (ou a população de célula expandida em geral) é separado do reagente de multimerização solúvel. A separação/remoção poderia ser realizada usando uma segunda fase estacionária. Para este propósito, uma mistura compreendendo as células T e o reagente de multime- rização solúvel está exposto, antes ou depois de ser aplicado sobre a primeira fase estacionária descrita acima, para cromatografia em uma segunda fase estacionária adequada. Esta fase estacionária secun-dária pode ser uma matriz de filtração em gel e/ou matriz de cromatografia de afinidade, em que a matriz de filtração em gel e/ou cromatografia de afinidade compreende um reagente de afinidade. O reagente de afinidade compreendido na resina de cromatografia inclui um parceiro de ligação D que (especificamente) se liga ao sítio de ligação Z1 e/ou sítio de ligação Z2, se presente, do reagente de multimerização, desse modo imobilizando o reagente de multimeri- zação na fase estacionária. Se um agente de multimerização com base em estreptavidina é usado e ambos primeiro e segundo agentes têm um peptídeo de ligação à estreptavidina como parceiro de ligação C1 ou C2, o parceiro de ligação D que é compreendido no reagente de afinidade desta segunda fase estacionária pode ser biotina. O oligômero solúvel de estreptavidina ou de uma muteína de estreptavi- dina que é usado como reagente de multimerização em seguida ligase à biotina que é normalmente covalentemente acoplada a uma matriz de cromatografia tal como biotin-sepharoseTM que está comercialmentedisponível.

[000163] Neste método de expansão serial o primeiro agente pode estimular um sinal de complexo de TCR/CD3 nas células T e o primeiro agente pode desse modo ser um reagente de ligação que, especificamente, se liga a CD3. Além disso, a molécula adicional na célula T pode ser CD28. Neste caso o segundo agente que se liga à molécula adicional é um reagente de ligação que, especificamente, se liga a CD28.

[000164] Neste método de expansão serial, as células T podem ser transfectadas durante ou depois da expansão por exemplo com um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR, da mesma forma conhecido como receptor de célula T artificial). Esta transfecção para a introdução do gene do receptor desejado pode ser realizada com qualquer vetor retroviral adequado, por exemplo. A população de célula geneticamente modificada pode ser em seguida liberada do estímulo inicial (o estímulo de CD3/CD28, por exemplo) e subsequentemente ser estimulado com um segundo tipo de estímulo por exemplo pelo receptor introduzido de novo). Este segundo tipo de estímulo pode compreender um estímulo antigênico na forma de uma molécula de peptídeo/MHC, o ligante cognato (reticulação) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo ligante natural de um CAR) ou qualquer ligante (tal como um anticorpo) que diretamente liga-se dentro da estrutura do novo receptor (por exemplo reconhecendo-se regiões constantes dentro do receptor). Cf. neste respeito, Cheadle e outro, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" MethodsMol Biol. 2012; 907:645-66 or Barrett e outro, Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333347 (2014).

[000165] Neste método, a população de linfócitos que compreendem células T pode ser uma população de células mononucleadas de sangue periférico (PBMC) ou uma população de células T enriquecidas ou purificadas. A população de linfócitos pode, por exemplo, ser derivada de sangue total, ou de um produto de aferese não mobilizado ou uma preparação de tecido congelada.

[000166] Neste método de expansão serial que está com base em um reagente de multimerização solúvel, o primeiro e segundo reagente bem como o reagente de multimerização e todos os outros reagentes e populações de célula podem ser usados de outra maneira da mesma maneira como descrito acima para o método que faz uso de reversível entre o primeiro ou segundo agente e o reagente de multimerização.

[000167] A invenção é também dirigida a um arranjo de um biorreator e uma primeira fase estacionária para cromatografia. O biorreator é adequado para a expansão de células, e a fase estacionária é adequada para separação de célula e remoção de reagentes. A primeira fase estacionária é uma matriz de filtração em gel e/ou matriz de cromatografia de afinidade, em que a matriz de filtração em gel e/ou cromatografia de afinidade compreende um reagente de afinidade, em que o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z1 especificamente ligando-se a um parceiro de ligação C1 compreendido em um primeiro agente e/ou o reagente de afinidade compreende um sítio de ligação Z2 especificamente ligando-se a um parceiro de ligação C2 compreendido em um segundo agente. A primeira fase estacionária está desse modo sendo adequada de imobilizar sobre ele o primeiro agente e/ou o segundo agente, o primeiro parceiro de ligação C1 e/ou o segundo parceiro de ligação C2 livre. Além disso o biorreator e a fase estacionária estão fluidamente conectados. Este arranjo pode ser usado na expansão serial como explicado acima e pode ser integrado em sistemas de expansão de célula conhecidos tal como o sistema de expansão de célula Quantum®) ou o Sistema de Expansão Xuri Cell W25.

[000168] Neste arranjo a primeira fase estacionária é compreendida em uma coluna de cromatografia ou é uma fase estacionária planar. O arranjo pode também compreender uma segunda fase estacionária que está fluidamente conectada à primeira fase estacionária. A fase estacionária secundária pode ser uma matriz de filtração em gel e/ou matriz de cromatografia de afinidade, em que a matriz de filtração em gel e/ou cromatografia de afinidade compreende um reagente de afinidade. Este reagente de afinidade pode compreender um parceiro de ligação D que (especificamente) se liga ao sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização, desse modo sendo adequado para imobilizar o reagente de multimerização na fase estacionária.

[000169] A invenção é também dirigida a um aparelho para purificação e expansão de uma população de células, o aparelho compreendendo pelo menos um arranjo de um biorreator e uma primeira fase estacionária ou uma segunda fase estacionária para cromatografia como definido acima.

[000170] O aparelho pode também compreender uma pluralidade de arranjos de um biorreator e uma fase estacionária que estão fluidamente conectados em série.

[000171] O aparelho pode compreender uma entrada de amostra estando fluidamente conectada ao biorreator do arranjo de um biorreator e a fase estacionária para cromatografia. O aparelho pode da mesma forma compreender uma saída de amostra para células- alvo purificadas e ampliadas, a saída de amostra que está fluidamente conectada à fase estacionária do último da pelo menos um arranjo de um biorreator e a fase estacionária para cromatografia.

[000172] Finalmente, o aparelho pode ser designado como um sistema funcionalmente fechado.

[000173] Como alguém de experiência ordinária na técnica facilmente apreciará a partir da descrição da presente invenção, outras composições de assunto, meios, usos, métodos, ou etapas, presentemente existindo ou depois de ser desenvolvidos que realiza substancialmente a mesma função ou alcança substancialmente o mesmo resultado como as modalidades exemplares correspondentes descritas aqui podem igualmente ser utilizadas de acordo com a presente invenção.

Exemplos Experimentais Exemplo 1: Estímulo/expansão de células T de resposta de CD3+ com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados em esferas revestidas com a muteína de estreptavidina Strep-tactin®.

[000174] 300.000 células T de resposta de CD3+CD62 (Tresp, isoladas por enriquecimento magnético serial de um produto de aferese de doador não mobilizado) foram marcados com 3 μM de CFSE e estimulado com 5 μL de uma preparação de 15 μL de esferas de Streptactin® (10 mg de partículas magnéticas/mL, carregado com 35 μg de contas de Streptactin®/mg) carregadas com 0,5 μg de fragmento Fab αCD3 apenas, 0,5 μg de fragmento Fab αCD28 apenas ou uma mistura de 0,5μg de fragmento Fab αCD3 e 0,5 μg de Fab αCD28.

[000175] O fragmento Fab αCD3 usado foi derivado do anticorpo monoclonal de ligação à CD3 produzido pela linhagem celular de hibridoma OKT3. A linhagem celular de hibridoma OKT3 e o anticorpo para OKT3 são descritos na patente US 4.361.549, a linhagem celular foi depositada sob número de acessão ATCC® CRL-8001™). O Fab CD28 usado foi derivado do anticorpo CD28 anti-humano monoclonal CD28.3 (Vanhove e outro, BLOOD, 15 de julho de 2003, Vol. 102, no. 2, páginas 564-570). A sequência de nucleotídeo dos domínios variáveis deste anticorpo CD28.3 foi depositada em GenBank na forma de um anticorpo para CD28 anti-humano de construção de Fv de única cadeia sintética scFv28.3 sob número de acessão de GenBank AF451974.1).

[000176] Ambos os fragmentos Fab foram recombinantemente produzidos em E. coli como descrito nos pedidos de patente Internacionais WO2013/011011 e WO 2013/124474 transportando como domínios constantes (CH1 e Ckappa) uma sequência de consensos IgG1. A cadeia pesada de ambos os fragmentos Fab foi carboxi-terminalmente fusionada com um arranjo sequencial de dois módulos de ligação de estreptavidina (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGS- AWSHPQFEK, (SEQ ID NO: 07)), que está comercialmente disponível como "Twin-Strep-tag® de IBA GmbH, Gottingen, Germany). O fragmento Fab αCD3 foi usado como primeiro agente com o peptídeo de ligação à estreptavidina que serve como parceiro de ligação C1 e o fragmento Fab aCD28 foi usado como segundo agente com o peptídeo de ligação à estreptavidina que serve como parceiro de ligação C2. A (tetramérica) muteína de estreptavidina "Strep-tactin® serve como reagente de multimerização em que ambos os fragmentos Fab foram reversivelmente imobilizados.

[000177] Na experiência de expansão, células Tresp estimuladas com esferas em branco (nenhum Fab) serviram como controle negativo. Células Tresp foram semeadas em tripletos em placas de 48 cavidades juntamente com 300.000 células alimentadoras autolólogas CD3 (irradiadas com 30Gy) em 3 mL de meio de cultura de célula completo (RPMI (Gibco) suplementado com 10% (v/v) de soro de fetal bovino, L-glutamina, beta-mercapto etanol, HEPES, penicilina, estreptomicina e gentamicina) suplementado com 10 U/mL de interleucina 2 (IL-2). As células foram incubadas a 37°C sem troca de meios e analisadas depois de 4 dias por análise de FACS. Marcação de FACS e análise foi feita depois de 10 min de incubação com 100 μM de D-biotina. Um gráfico representativo para cada condição é mostrado na Fig. 4. Gráficos mostram células CD3+ vivas que foram marcadas com iodeto de propídio (PI) para discriminação vida/morte. Fig. 4a é um histograma mostrando distribuição de tamanho (dispersão para frente) de células estimuladas. Fig. 4a mostra que uma população de célula específica de células Tresp foi estimulada e ampliada (aumento em tamanho/número comparado ao controle não estimulado "esferas apenas") quando incubadas na presença de esferas em que uma mistura de 0,5 μg de fragmento Fab aCD3 e 0,5 μg de Fab aCD28 foi imobilizado, depois de ser estimulado in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados em esferas revestidas com a muteína de estreptavidina Strep-tactin®. Fig. 4B descreve histogramas da diluição da coloração de proliferação CFSE representando o grau de proliferação de acordo com o número de células por divisão de célula (indicado no topo da Fig. 4B, 0 representa células não divididas; 5 representa células que passaram por pelo menos 5 divisões). Pode ser visto a partir da Fig. 4B que a população de células T estimuladas com as esferas em que uma mistura de 0,5 μg de fragmento Fab aCD3 e 0,5 μg de Fab aCD28 foi imobilizado passaram principalmente por três divisões de célula e representaram um padrão de proliferação mais uniforme do que com um único estímulo apenas (número pequeno de células dentro do pico não dividido "0"). A quantidade absoluta aumentada de proliferação (mais células proliferaram uniformemente depois de 4d de estímulo com aCD3 e esferas funcionalizadas de aCD28) é da mesma forma representada por um consumo mais intenso do meio como descrito por um indicador de mudança de cor para amarelo na Fig. 4C.

Exemplo 2: Análise da mobilização de cálcio intracelular diferencial em células Jurkat

[000178] Análise citométrica baixa em tempo real da mobilização de cálcio intracelular diferencial induzida em células Jurkat que são marcados com o clone de anticorpo para αCD3 OKT3 ou com fragmentos Fab OKT3 sendo multimerizados com Strep-tactin® foi examinado aqui.

[000179] Para este propósito, células Jurkat foram carregadas com a tintura sensível a cálcio Indo-1-AM e liberação de cálcio foi ativada por injeção de anticorpo monoclonal de αCD3 OKT3 (produzido pela linhagem celular de hibridoma OKT3, veja acima, quadrados pretos) ou fragmento Fab aCD3 (derivados da linhagem celular parental OKT3) que foi multimerizado por ligação reversível de seu peptídeo de ligação à estreptavidina a Strep-Tactina fluorescentemente solúvel conjugado com ficoeritrina. No caso dos complexos de OKT3 Fab- Strep-Tactina multimérico intacto, a liberação de cálcio foi ativada em um período de tempo idêntico como com o clone de anticorpo parental (triângulos cinza escuro). Ativação de células poderia ser completa-mente evitada por injeção de D-biotina tratada, complexos de Fab- Strep-Tactina pré-dissociados (círculos cinza claro) idênticos a injeção do controle negativo de PBS (triângulos brancos invertidos). Aplicação de ionomicina serviu como controle positivo para influxo de cálcio. Mudanças resolvidas com tempo em concentração de Ca2+ intracelular foram monitoradas por citometria de fluxo com base na mudança em relação de FL6/FL7. Pode ser visto a partir da Fig. 5A que ambos o anticorpo parental OKT3 bem como o fragmento Fab OKT3 monovalente multimerizado efetuaram liberação de cálcio, significando que o fragmento Fab OKT3 monovalente multimerizado é essencialmentetão funcional quanto o anticorpo parental. Notavelmente, o fragmento Fab OKT3 multimérico não foi capaz de ativar liberação de cálcio se biotina fosse adicionada a Strep-tactina em que o fragmento Fab OKT3 foi imobilizado antes da adição do fragmento Fab Estreptactina-OKT3. Neste caso, a biotina rompeu a ligação reversível formada entre Strep-tactina como o agente de multimerização e o fragmento Fab OKT3. O fragmento Fab monovalente foi, portanto, deslocado do agente de multimerização e depois da dissociação não foi capaz de ativar liberação de cálcio ligando-se a CD3 das células Jurkat.

[000180] Nas experiências mostradas na Fig. 5B células Jurkat marcadas por indo-1-AM foram ativadas por complexos de Fab-Strep- Tactina αCD3 derivados por OKT3 como descrito na Fig. 5a. Injeção de complexos intactos (gráfico superior) ou pré-dissociados complexos (gráfico inferior) serviu respectivamente como controles positivos ou negativos. Além disso, estímulo de células com complexos de Fab- Estrep Tactina intactos seguidos por injeção subsequente de D-biotina (próximo da ativação de pico em t=140s) resultou em rompimento abrupto de sinalização de multímero de Fab aCD3 (gráfico mediano). Injeção de ionomicina no grupo complexo de Fab pré-dissociado serviu como controle positivo. Dados são representativos de três experiências diferentes. Importantemente, Fig. 5B mostra que a adição de D- biotina à amostra rapidamente desloca o fragmento Fab do agente de multimerização de Estrep-tactina, desse modo efetivamente terminando a liberação de cálcio ainda sob estímulo de cálcio contínuo e demonstrando que o fragmento Fab OKT3 dissociado não é mais biologicamente ativo. Igualmente, o fragmento Fab OKT3 multimérico não foi capaz de ativar liberação de cálcio quando biotina foi adicionada ao multímero de fragmento Fab Estrep-tactina-OKT3 antes da adição da amostra de Fab Estreptactina-OKT3 às células Jurkat.

Exemplo 3: Manchando reversível de células por multímeros de Fab CD3

[000181] Este Exemplo examina a marcação reversível de células por multímeros de Fab CD3. Recentemente isolados PBMCs foram marcados com ou o clone de anticorpo monoclonal de αCD3 OKT3 (gráfico de ponto a esquerda, clone parental para os multímeros de Fab) ou ficoeritrina cognato multímeros de Fab OKT3 marcados por PE e analisado antes (segunda coluna à esquerda) ou depois do tratamento com D-biotina (coluna mediana). Monômeros de Fab restantes foram em seguida detectados depois das etapas de lavagens subsequentes usando Strep-Tactin® rotulada por PE fresco (segunda coluna a direita). Marcação de multímero de Fab secundário de células reversivelmente marcadas serviram como controle (coluna a direita). Apenas células de CD3 vivas que são negativas em marcação com iodeto de propídio (PI) para discriminação de vida/morte são mostradas na Fig. 6. Números em gráficos de pontos indicam a porcentagem de células dentro de portões. Esta experiência mostra que a marcação de CD3+ PBMCs com um fragmento Fab anti-CD3 multimerizado com Estreptactina como reagente de multerização é completamente reversível por adição de D-biotina e que o fragmento Fab monovalente apenas não liga-se à molécula de CD3 presente em PBMCs.

Exemplo 4: Isolamento reversível de células por multímeros de Fab CD28

[000182] Este Exemplo mostra o isolamento de células por ligação reversível de fragmentos Fab anti-CD28 multimerizados com partículas magnéticas de Strep-Tactin® (as partículas magnéticas estão disponíveis a partir de IBA GmbH Gottingen, Germany). Os fragmentos Fab derivados do anticorpo CD28.3 descrito no Exemplo 1 foram usados para este propósito. Células CD28+ foram selecionadas/isso- ladas por seleção celular magnética de multímero de Fab PMBCs recentemente isolados essencialmente como descrito no pedido de Patente Internacional WO2013/011011. Antes que as células de seleção fossem marcadas pelo controle com ou os multímeros de aCD28 fluorescente cognato (gráficos de ponto a esquerda) ou com um anticorpo dirigido contra a cadeia kappa leve de imunoglobulina (segundo gráficos de ponto a esquerda, α-Ig kappa mAb) como um marcação de controle. Depois da seleção, células de CD28+ foram tratadas com D-biotina e subsequentemente lavadas para remover esferas magnéticas e monômeros de Fab. Células de CD28+ liberadas foram subsequentemente (re-) marcadas com multímeros de Fab CD28 (segundo gráfico de ponto a esquerda) ou com o a-Igkappa mAb (gráfico de ponto a direita) para detectar monômeros de Fab potencialmente restantes. Apenas células de CD3+vivas (PInegativo) são mostradas. Números em gráficos de ponto indicam a porcentagem de células dentro de portões. Fig. 7 mostra que células CD28+ podem ser isoladas de PMBC usando tal fragmento Fab anti-CD28 multimerizado e que todos os reagentes de isolamento incluindo os monômeros de Fab anti-CD28 podem ser removidos depois da seleção.

Exemplo 5: Estímulo/Expansão de células T de resposta de CD3+ com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados em Estrep-tactina solúvel

[000183] Neste exemplo células T de resposta de CD3+ (isoladas por seleção magnética de uma amostra de PBMCs recentemente obtido de um gradiente de Ficoll) foram expandidas depois do estímulo in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados em Strep-tactin® oligomérica solúvel agindo como um reagente de multimerização solúvel. A Strep-tactin® oligomérica foi obtido polimerizando-se Strep-tactin® com sulfo SMCC (4-(N- maleimidometil)cicloexano-1-carboxilato de sulfossucinimidila, produto #22122 Thermo Scientific) e iminotiolano (produto #26101 Thermo Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante (Thermo Scientific). A estreptavidina oligomérica foi separada da muteína de estreptavidina monomérica (não reagida) e dimérica por cromatografia de exclusão de tamanho e a fração desse modo obtida da muteína de estreptavidina oligomérica (n > 3) foi usada como reagente de multimerização solúvel.

[000184] Para a expansão in vitro, 300.000 células T de resposta CD3+ (Tresp) foram marcadas com 2 μM de éster de carboxifluo- resceina sucinimidila (CFSE) e estimuladas com quantidades variadas de uma preparação de oligômeros de Strep-tactin® solúvel em que uma combinação do fragmento Fab OKT3 αCD3 descrito acima e o fragmento Fab aCD28 do anticorpo 28,3 (ambos transportando o a Twin-Strep-tag® descrita acima como peptídeo de ligação à estreptavidina na cadeia pesada) foram imobilizadas. ("1x" corresponde a 3 μg de Estreptactina multimerizada funcionalizada com 0,5 μg do fragmento Fab monomérico de αCD3- e 0,5 μg de aCD28, os números "0,5x", "2x" e "5x" indicam a quantidade de n-vezes respectiva de "1x"). Células Tresp deixadas sem estimular ou foram estimuladas com multímeros de Estrep-tactina em branco (nenhum Fab) serviu como controle negativo. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades juntamente com 300.000 células alimentadoras autólogas CD3 negativas (irradiadas com 30Gy) em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 20U/mL de IL-2. Células foram incubadas a 37°C sem troca de meios e proliferação foi analisada de acordo com diluição de CFSE depois de 5 dias por análise de FACS. Fig. 8A mostra o aumento na distribuição de tamanho de proliferar células depois de 5 dias em cultura comparada aos controles negativos. Fig. 8B mostra que células Tresp CD3+ foram corretamente estimuladas e proliferadas vigorosamente quando incubadas com Strep-tactin® oligomérica solúvel (quando comparado a partículas magnéticas de Estreptactina sólida na Fig.4) em que uma mistura de Fab αCD3 e fragmentos Fab αCD28 foi imobilizada. Os resultados na Fig. 8a e 8b indicam que sob estas condições in vitro a maioria das células T de resposta CD3+ divididas (2 a 5 divisões de célula) depois de compromisso do complexo CD28 e TCR/CD3 de superfície com os fragmentos Fab αCD3 e aCD28 que foram reversivelmente imobilizados em oligômeros de Strep-tactin® solúveis. Depois da expansão in vitro os reagentes de estímulo de Fab-Strep- Tactin solúveis foram dissociados e removidos depois do tratamento de D-biotina. A dissociação e remoção de fragmentos Fab monomé- ricos foram fluxo-citometricamente analisados por células restantes com Strep-Tactin® rotulada por ficoeritrina) (ST-PE). Um histograma representativo (histograma cinza escuro) é mostrado comparado o ST- PE apropriado apenas controle negativo (histograma cinza claro). Pode ser visto a partir da Fig. 8C que ambos os fragmentos Fab tinham completamente dissociados e foram completamente removidos das células expandidas. Fig. 8D mostra o número absoluto de células vivas (azul de tripan negativo) depois de 5 dias. O número foi contado usando uma câmara de contagem de Neubauer e plotado contra a respectiva condição de estímulo. Números de célula medianos na Fig. 8D; barras de erro indicam desvio padrão (SD). Fig. 8D mostra que todas as misturas de fragmento Fab αCD3 e fragmentos Fab aCD28 que foram imobilizadas em um reagente de multimerização de Estrep- tactina solúvel foi igualmente eficazes expandindo-se as células CD3+ e resultaram em um aumento de aproximadamente 4 vezes de números de célula absolutos.

Exemplo 6: Cinéticas de proliferação de células T de resposta CD4+ e CD8+ purificadas estimuladas in vitrocom multímeros de Fab- Estreptâmeros de αCD3/αCD28 sem troca de meios

[000185] Neste exemplo as cinéticas de expansão de proliferação de células de resposta T CD4+ e CD8+ purificadas (Tresp) que foram estimuladas in vitrocom fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados com muteínas de estreptavidina oligomé- ricas solúveis foram examinadas. Para este propósito, muteína de Strep-tactin® oligomérica solúvel de dois tamanhos diferentes serviram como reagente de multimerização solúvel. O primeiro tipo Strep- tactin® oligomérica foi a fração da muteína de estreptavidina oligomé- rica (n > 3) obtido no Exemplo 5 (da mesma forma referido aqui como "estrutura de Streptactin® convencional", ilustrado pelo símbolo de triângulo com a ponta No topo da Fig. 13). O segundo tipo desta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reagente de multimerização solúvel foi uma muteína de estreptavidina oligomérica (n > 3) que foi reagida com albumina de soro humano biotinilada (da mesma forma referido aqui como "esqueleto de Streptactin® grande).

[000186] Neste exemplo 500.000 células T de resposta de CD4+ CD8+ purificadas (Tresp) foram estimuladas separadamente com este dois multímeros de Estreptâmero diferente como explicado acima, isto é com o esqueleto de Estreptactina do Exemplo 5 (usando uma solução com uma concentração de 1mg de muteína de estreptavidina oligomérica/mL)) ou com as cadeias principais de Estreptactina grandes (0,1 mg/mL). 3 μL de ambas as cadeias principais diferentes foram carregadas com uma combinação de 0,5 μg do aCD3 e 0,5 μg de Fab aCD28 usado nos Exemplos anteriores que transportaram um peptídeo de ligação à estreptavidina SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSA- WSHPQFEK (SEQ ID NO: 07) no C-terminal da cadeia pesada do fragmento Fab. Além disso, 4,5 μL da estrutura de Estreptactina convencional foram carregadas com 0,5 μg de fragmento Fab aCD3, 0,5 μg de fragmento Fab αCD8 (IBA GmbH Gottingen que da mesma forma transporta ao C-terminal do fragmento Fab o peptídeo de ligação à estreptavidina SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 07) e 0,5 μg de fragmento Fab aCD28. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle de negativo e células Tresp estimuladas com Dynabeads comercialmente disponível (esferas em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são irreversivelmente imobilizados) como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula (RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% (v/v de soro fetal bovino, 0,025% (w/v) L-glutamina, 0,025% (w/v) L-arginina, 0,1% (w/v) HEPES, 0,001% (w/v) gentamicina, 0,002% (w/v) estreptomicina, 0,002% (w/v) penicilina) suplementado com 30 U/mL de IL-2. Células foram incubadas a 37°C sem troca de meios e contagem de célula foi analisada depois de 1, 3 e 6 dias. Nas experiências da Fig. 13 a expansão foi realizada sem troca de meios. Os resultados para as células de resposta T de CD4+ são mostrados na Fig.13A, os resultados para as células de resposta T de CD8+ são mostrados na Fig. 13B, com os gráficos representando grau de proliferação de acordo com o número de células colhidos por ponto de tempo para Tresp CD4+ (Fig. 13A) e para Tresp CD8+ na Fig.13B.

[000187] Como pode ser visto a partir da Fig. 13A o "menor" reagente de multimerização solúvel em que fragmentos Fab aCD3 e aCD28 eram reversivelmente imobilizados forneceram a mesma quantidade de expansão de células T CD4+ como Dynabeads (que são até agora o reagente padrão para a expansão de células T), enquanto o "maior" estreptactina solúvel oligomérica fornecida para expansão ainda melhor comparado a Dynabead. Esta melhoria poderia ser causada pelo "reagente de multimerização oligomérica maior"solúvel sendo capaz de ligar a mais células T ao mesmo tempo do que o "menor"oligômero solúvel, desse modo sendo capaz de estimular mais células T CD4+ do que o "menor"oligômero.

[000188] Como evidente a partir da Fig. 13B, usando os reagentes de multimerização solúveis das células T CD8+ da presente invenção poderiam ser expandidos dentro dos primeiros 3 dias pelo menos tão eficazmente quanto com Dynabeads. Notavelmente, por este período de tempo, a experiência de expansão que usou um reagente de multimerização solúvel que além de fragmentos Fab αCD3 e aCD28 (como primeiro e segundo agentes) transportou reversivelmente imobilizado sobre ele fragmento Fab aCD8, mostrou o melhor grau de expansão sob estas condições de cultivo. Isto indica que é possível usar um estímulo que é específico para uma sub-população particular de células (aqui o fragmento Fab aCD8) para aumentar ou modular a seletividade da expansão, desse modo sendo capaz de obter quantidades maiores de uma célula desejada (sub)-população.

[000189] Desse modo, resumindo o anterior, Exemplo 6 mostra que a funcionalidade do reagente de multimerização solúvel usado na presente invenção em termos de ativar expansão de células T é comparável à metodologia padrão atual de usar Dynabeads para este propósito. Entretanto, visto que o estímulo pode ser controlado (e terminado, se quiser) adicionando-se um competidor tal como biotina no caso de uma interação reversível com base em estreptavidina entre o primeiro e segundo agente e o reagente de multimerização, a presente invenção fornece uma vantagem significante sobre a tecnologia de Dynabeads visto que as condições de expansão podem ser aperfeiçoadas (seria por exemplo possível parar o estímulo na experiência da Fig.13B depois de 3 dias). Além disso, visto que o reagente de multimerização solúvel pode ser removido facilmente da reação (por exemplo, imobilizando o reagente em uma coluna de biotinilada depois da reação de expansão), o método de expansão da invenção pode ser realizado e automatizado em sistemas fechados que, por exemplo, são necessários para produção de GMP de células para propósitos terapêuticos, sem ter que lidar com a remoção de esferas, tal como Dynabeads.

Exemplo 7: Cinéticas de proliferação de células T de resposta CD4+ e CD8+ purificadas estimuladas in vitrocom multímeros de Fab- Estreptâmero de αCD3/αCD28 reversíveis com troca de meios

[000190] Da mesma forma neste exemplo as cinéticas de expansão de proliferação de células T de resposta CD4+ e CD8+ purificadas (Tresp) que foram estimuladas in vitro com fragmentos Fab aCD3/aCD28 que foram reversivelmente imobilizados em muteínas de estreptavidina oligomérica solúvel. Para este propósito, muteína de Strep-tactin® oligomérica solúvel de dois tamanhos diferentes serviram como reagente de multimerização solúvel. O primeiro tipo de Strep- tactin® oligomérica foi a fração da muteína de estreptavidina oligomérica (n > 3) obtida no Exemplo 5 (da mesma forma referido aqui como "estrutura de Streptactin® convencional", ilustrado pelo símbolo triângulo com a ponta para baixo na Fig. 13). O segundo tipo desta muteína de estreptavidina oligomérica usada como reagente de multimerização solúvel foi obtido reagindo-se a Estrep-tactina oligomérica (n > 3) obtida no Exemplo 5 com albumina de soro humana biotinilada. Este reagente de multimerização oligomérico solúvel é da mesma forma referido aqui como "estrutura de Streptactin® grande.

[000191] Neste exemplo, 400.000 células T de resposta de CD4+ CD8+ purificadas (Tresp) foram estimuladas separadamente com este dois multímeros de Estreptâmero diferentes como explicado acima, isto é, com o esqueleto de Estreptactina do Exemplo 5 (1,0 mg/mL) ou com as cadeias principais de Estreptactina grandes (0,1 mg/mL). 3 μL de ambas as cadeias principais diferentes foram carregados com uma combinação de 0,5 μg de αCD3 e 0,5 μg de fragmentos Fab αCD28 descritos acima. Além disso, 4,5 μL da estrutura de Estreptactina do Exemplo 5 foram carregados com 0,5 μg de αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de fragmento Fab αCD28 como descrito acima. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle de negativo e células Tresp estimuladas com Dynabeads (em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são irreversivelmente imobilizados) como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. Células foram incubadas a 37°C com troca de meios no dia 3 e contagem de célula foi analisada depois de 1, 3 e 6 dias. Os resultados para as células T de resposta CD4+ são mostrados na Fig.14A, os resultados para as células T de resposta CD8+ são mostrados na Fig. 14B, com os gráficos que representam grau de proliferação de acordo com o número de células colhidos por ponto de tempo para Tresp CD4+ (Fig. 14A) e para Tresp CD8+na Fig.14B.

[000192] Como pode ser visto a partir da Fig. 14A os reagentes de multimerização solúveis da presente invenção em que fragmentos Fab αCD3 e aCD28 foram reversivelmente imobilizados forneceram melhor expansão de células T CD4+ do que Dynabeads.

[000193] Como evidente a partir da Fig. 14B, usando os reagentes de multimerização solúveis da presente invenção células T CD8+ poderiam ser expandidas dentro dos primeiros 6 dias pelo menos tão eficazmente quanto com Dynabeads. Notavelmente, neste período de tempo, a experiência de expansão que usou o reagente de multimerização solúvel maior do que transportou fragmentos Fab αCD3 e aCD28 (como primeiro e segundo agentes) mostrou o melhor grau de expansão sob estas condições de cultivo. Isto poderia ser causado pelo "reagente de multimerização oligomérica maior" solúvel sendo capaz de ligar-se a mais células T ao mesmo tempo do que o "menor" oligômero solúvel, desse modo sendo capaz de estimular mais células T de CD4+ do que o "menor" oligômero.

Exemplo 8: Cinéticas de Expansão de cultura de célula T CD4+ CD8+ purificadas com ou sem troca de meios

[000194] Neste Exemplo os dados combinados dos Exemplos 6 e 7 foram normalizados em número de célula de entrada para o "menor" reagente de multimerização solúvel e controle positivo e negativo. Nenhum dado de normalização foi obtido no "maior" reagente de multimerização. Como explicado no Exemplos 6 e 7, 400.000 a 500.000 células T de resposta CD4+ ou CD8+ (Tresp) foram estimuladas com 3 μL de uma preparação de multímeros de Estreptactina (1mg/mL; em que 0,5 μg de fragmento Fab aCD3 e 0,5 μg de fragmento Fab aCD28 foram imobilizados. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle negativo e células Tresp estimuladas com Dynabeads como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. Células foram incubadas a 37°C com troca de meios (linhas retas na Fig. 15) ou sem troca de meios (linhas pontilhadas na Fig. 15) no dia 3 e contagem de célula foi analisada depois de 1, 3 e 6 dias. Como evidente a partir dos dados normalizados a partir da Fig. 15A, o "menor" reagente de multimerização solúvel em que fragmentos Fab αCD3 e aCD28 foram reversivelmente imobilizados rendendo uma expansão de cerca de 2,5 vezes de células T CD4+, enquanto a expansão usando Dynabeads rendeu uma taxa de expansão de cerca de 1,8 vezes. Desse modo, o uso de um reagente de multimerização solúvel da invenção ainda fornece uma melhoria na expansão de células T CD4+ sobre Dynabeads. Similarmente, Fig. 15B, confirma que usando os reagentes de multimerização solúveis da presente invenção células T CD8+ poderiam ser expandidas dentro dos primeiros 3 dias pelo menos tão eficazmente quanto com Dynabeads.

Exemplo 9: Formação de agrupamento precoce depois da ativação de células T de resposta CD4+ e CD8+ purificadas estimuladas in vitro com multímeros de Fab-Estreptâmero de αCD3/αCD28 reversível

[000195] Neste Exemplo, 400.000 células T de resposta CD4+ ou CD8+ (Tresp) foram estimuladas com 3 μL de um reagente de multimerização de Estreptactina de preparação oligomérica (1 mg/mL) carregado com uma combinação de 0,5 μg de αCD3- e 0,5 μg de Fab αCD28. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle de negativo e células Tresp estimuladas com Dynabeads como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em duplicatas em placas de 48 cavidades em 1 mL meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. Células foram incubadas a 37°C e microscopicamente analisadas depois de 1 e 2 dias. Estímulo de Tresp CD4+ (Fig. 16A) e Tresp CD8+ (Fig. 16B) é mostrado para Dynabeads (fila mediana) e multímeros de Estreptâmero (fila inferior) respectivamente. As fotografias representam grau de formação de agrupamento: Para agrupamentos exemplares de melhor visibilidade são indicados por círculos para o estímulo com oligômeros de muteína de estreptavidina solúveis na Fig. 16A e Fig. 16B. Agrupamentos dentro do estímulo de Dynabead são facilmente visivelmente por acumulação de partículas estimuladoras escuras. Como evidente, igualmente para células T CD4+ e CD8+ agrupamentos precoces formados ao usar o método de expansão da invenção que emprega um reagente de multimerização oligomérica solúvel.

Exemplo 10: Cinéticas de expansão & fenótipo de células T de memória central CD3+ em volume ativadas/expandidas (Tcm)

[000196] Neste Exemplo, 500.000 células de resposta CD3+ CD62L+CD45RA-Tcm (Tresp) foram estimuladas com 3 μL de uma preparação da Estreptactina oligomérica solúvel do Exemplo 5 (1 mg/mL) que foi carregada com uma combinação de 0,5 μg de aCD3 e 0,5 μg de Fab aCD28. Além disso, 4,5 μL de uma preparação de multímeros de Estreptactina carregados com 0,5 μg de aCD3, 0,5 μg de Fab aCD8 e 0,5 μg de Fab aCD28 foi usado como uma condição de estímulo adicional. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle de negativo e células Tresp estimuladas com Dynabeads (em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são imobilizados irreversíveis) como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2 apenas ou 30 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL-15. Células foram incubadas a 37°C com troca de meios cada 3 dias e contagem de célula foi analisada depois de 7 e 14 dias. Gráficos representam grau de proliferação de acordo com o número de células colhido por ponto de tempo, na Fig. 17A apenas meio suplementado com IL-2 e na Fig.17B meio suplementado com IL-2 e IL-15. Como pode ser visto a partir da Fig.17A e Fig. 17B, o reagente de multimerização solúvel que foi reversivelmente ligado a isso fragmento Fab CD3 e fragmento Fab aCD28 rende melhor expansão de célula do que as Dynabeads. Como também mostrado pela análise de citometria de fluxo de expressão de superfície de CD62L e CD127 depois de 14 dias de cultura em ambientes de citocina variáveis da Fig. 17C, as abordagens experimentais usando reagentes de multimerização solúveis da presente invenção retêm, sob ambas as condições escolhidas aqui, um teor mais alto de CD127 expressando células T de memória duradouras do que expansão com Dynabeads. Isto ilustra uma outra vantagem dos métodos da presente invenção.

Exemplo 11: Expansão específica de antígeno seletiva de células de resposta Tcm fora das células T de memória central CD3+ em volume (cinéticas & fenótipo)

[000197] Neste Exemplo, a cinética e o fenótipo de expansão específica de Antígeno seletiva (Ag-específica) foram de células de resposta Tcm CD3+CD62L+CD45RA purificadas foram examinadas.

[000198] Em mais detalhes, células de resposta Tcm CD3+ CD62L+CD45RA foram estimuladas in vitro com ambos um complexo de molécula de peptídeo:MHC (que age como primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário às células) e um fragmento Fab αCD28 (que age como segundo reagente que estimula uma molécula adicional na superfície das células). Igualmente o complexo de antígeno peptídeo específico com a molécula de MHC e o fragmento Fab αCD28 foram reversivelmente imobilizados no muteína de estreptavidina oligomérica solúvel (com n > 3) descrita no Exemplo 5. O peptídeo que foi usado para a expansão específica de antígeno foi o peptídeo CRVLCCYVL (SEQ ID NO: 06), aminoácidos 309-317 da proteína imediata-precoce 1 (descrita em Ameres e outro, PLOS Pathogens, maio de 2013, vol. 9, assunto 5, e1003383) representando um epítopo de HLA-C7/IE-1 que é específico para citomegalovírus (CMV). A molécula de MHC I que apresenta o transporte de peptídeo ao C-terminal do peptídeo de ligação à estreptavidina de cadeia α (cadeia pesada) (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK, (SEQ ID NO: 07) que está comercialmente disponível como "Twin-Strep- tag®" de IBA GmbH, Gottingen, Germany).

[000199] Para este propósito, 500.000 células Tcm de resposta CD3+CD62L+CD45RA- (Tresp) foram estimuladas Ag-especificamente usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina oligomérica solúvel funcionalizado com 0,5 μg dos complexos de peptídeo:MHC classe I equipados com o peptídeo de ligação à estreptavidina e com 0,5 μg do Fab αCD28 descrito acima. Como uma alternativa, 4,5 μL de uma preparação do reagente de multimerização de Estreptactina foram carregados com 0,5 μg destes complexos de peptídeo:MHC classe I, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28. Para comparação, estímulo policlonal foi realizado, usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina (1 mg/mL) carregado com uma combinação de 0,5 μg de Fab αCD3 e 0,5 μg de Fab αCD28. Novamente como a condição de estímulo alternativa descrita acima, 4,5 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina reversivelmente carregada com 0,5 μg de Fab αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28 foi usada. Células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle de negativo e células Tresp estimuladas policlonais com Dynabeads (esferas em que anticorpos monoclonais αCD3 e aCD28 são imobilizados irreversíveis) como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em placas de 48 cavidades em 1 ml de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL-15. Células foram incubadas a 37°C com troca de meios cada 3 dias e contagem de célula foi analisado depois de 7 e 14 dias. A análise de citometria de fluxo exemplar para a fração de células Ag- específicas que foi estimulada/expandida pelo oligômero de estrept- tactina solúvel em que o complexo de peptídeo:MHC-I para um epítopo de HLA-C7/IE-1 (para CMV) foi imobilizado (Fig. 18A) mostra que estas células T específicas de antígeno foram especificamente expandidas. Os gráficos da Fig. 18B a Fig. 18E (que representa o grau de expansão de Ag-especificidades distintas de acordo com o número de peptídeo:multímero de MHCI- células positivas colhidas por ponto de tempo em analogia à experiência de expansão mostrada na Fig.18A) mostra que, o reagente de multerimerização que usa o respectivo complexo do peptídeo Ag-específico e molécula de MHC I fornecida para o número mais alto de células expandidas (variando de um aumento de vinte vezes no número de células para as células Ag- específicas que reconhecem o epítopo de pp65 de CMV (aminoácidos 341-350 (QYDPVAALF, (SEQ ID NO: 08)) restringido por HLA-A2402) (veja Fig. 18B) para um aumento de 98 vezes no número de células Ag-específicas que reconhecem o epítopo de HLA-B7/IE-1309-317 (CRVLCCYVL (SEQ ID NO: 06)) de CMV (veja Fig. 18E), desse modo mostrando que o método de expansão da presente invenção é completamente aplicável à expansão de células Ag-específicas. Finalmente, a análise de citometria de fluxo exemplar da expressão de superfície de CD62L e CD127 depois de 14 dias de cultura para epítopo de HLA-B7/Hexon5 (para adenovírus) mostrada na Fig. 18F também confirmam que abordagens experimentais usando os reagentes de multimerização solúveis da presente invenção retêm um teor mais alto de CD127 expressando células T de memória duradoura em condições estimulatórias policlonais e Ag-específicas.

Exemplo 12: Cinéticas de expansão Ag-específica Seletiva & fenótipo de células T de memória central em volume

[000200] Este Exemplo examina as cinéticas de expansão Ag- específicas seletivas fora das células de resposta Tcm CD3+CD62L+ CD45RA purificadas que foram estimuladas in vitro com a) complexos de peptídeo-MHC I específicos de antígeno e b) fragmentos Fab αCD28 que foram reversivelmente imobilizados como primeiro e segundo agentes sobre muteínas de estreptavidina oligoméricas solúveis.

[000201] Para este propósito, 500.000 células Tcm de resposta CD3+CD62L+CD45RA (Tresp) foram estimuladas especificamente por Ag usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de complexos de peptídeo:MHC classe I equipados com um peptídeo de ligação à estreptavidina (o peptídeo específico representa aminoácidos 114-124 (CPYSGTAYNSL, SEQ ID NO: 10) da proteína de Hexon 5 de adenovírus) restringidos por HLA-B07) e 0,5 μg de Fab αCD28. Como uma alternativa, 4,5 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina carregado com 0,5 μg de complexo de peptídeo:MHC classe I, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28. Para comparação, a estimulação policlonal foi realizada, usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina (1 mg/mL) carregada com uma combinação de 0,5 μg de Fab αCD3 e 0,5 μg de αCD28. Novamente como a condição de estímulo alternativa descrita acima, 4,5 μL de uma preparação de multímeros de Estreptactina carregada com 0,5 μg de Fab αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5μg de Fab αCD28 foram usados. As células Tresp não tratadas (não estimuladas) serviram como controle negativo e células Tresp estimuladas policlonais com Dynabeads como controle positivo. As células Tresp foram semeadas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL-15. As células foram incubadas a 37°C com troca de meio a cada 3 dias e a contagem da célula foi analisada depois de 7 e 14 dias. Os quadros mostrados na Fig. 19 representam o grau de formação de agrupamento no dia 5, a excitação específica de Ag exemplar é ilustrada para o epítopo de HLA-B7/Hexon 5 de adenovírus. Como pode ser visto a partir da Fig. 19, tais células específicas de antígeno de adenovírus podem ser especificamente ampliadas a partir da população Tcm de resposta CD3+CD62L+CD45RA original.

Exemplo 13: Rendimento e fenótipo de células T CD8+ expandidas - variação de tamanho do reagente de multimerização solúvel e adição da adição de αCD8-Fab para excitação

[000202] Neste Exemplo, a expansão de células de resposta T CD8+ purificadas estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/aCD28 que foram muteínas de estreptavidina oligomérica solúvel reversivelmente imobilizadas foi examinada. Além disso, o efeito de adicionar αCD8- Fab ao reagente de multimerização para aumentar a especificidade da expansão para células T CD8+ foi examinado.

[000203] Para este propósito, 300.000 células de resposta CD8+ purificadas (Tresp) foram estimuladas separadamente com dois reagentes de multimerização com base em Estreptactina diferentes, isto é, o reagente de multimerização de Estreptactina oligomérico pequeno do Exemplo 5 (1 mg/mL) ou os oligômeros de Estreptactina maiores descritos acima (0,1 mg/mL). 3 μL de ambos reagentes de multimerização diferentes (esqueletos) foram carregados com uma combinação do 0,5 μg de fragmentos Fab αCD3 e 0,5 μg de αCD28 descritos acima. Além disso, 4,5 μL do reagente de multimerização de Estreptactina menor (esqueleto) foram carregados com 0,5 μg de αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de fragmentos Fab αCD28 descritos acima. Além disso, 3 μL do reagente de multimerização de Estreptactina "menor" (estrutura) apenas funcionalizado com 0,5 μg de fragmento Fab αCD3 sozinho ou 0,5 μg de fragmento Fab αCD28 sozinho foi usado. Células Tresp não estimuladas serviram como controle negativo e Tresp estimulada com Dynabeads serviram como controle positivo. Células Tresp foram semeadas em duplicata em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. As células foram incubadas a 37°C com troca de meios depois de 3 dias e analisadas depois de 6 dias. Fig. 20A descreve o grau de proliferação de acordo com o número de células colhidas no dia 6 em comparação aos controles negativos e normalizado ao controle positivo. Fig. 20A mostra que a expansão das células T CD8+ usando os reagentes de multimerização solúveis da invenção resulta em rendimentos mais altos das células T CD8+ do que a expansão usando dynabeads. A análise de FACS da expressão da superfície de CD8 (Fig.20B) e a expressão de superfície de CD45RO (Fig. 20C) depois que a cultura de célula mostra que o mesmo fenótipo das células T CD8+ foi ampliado por reagentes de multimerização da invenção ou Dynabeads (as várias condições estimulantes foram comparadas usando análise one-way ANOVA e nenhuma diferença significante (n.s.) foi detectada). O rendimento melhorado das células CD8+ usando os métodos de expansão inventivos em comparação a Dynabeads poderia ser devido ao fato que o reagente de multimerização solúvel pode acessar seus receptores alvo na superfície da célula melhor do que os anticorpos que são imobilizados no Dynabeads. Este rendimento melhorado poderia ficar muito vantajoso ao expandir a população rara de células de uma amostra inicial.

[000204] Além disso, comparando o rendimento de expansão obtido com o agente de multimerização em que igualmente 0,5 μg de αCD3 e 0,5 μg de fragmentos Fab αCD28 foram imobilizados juntamente (segunda coluna da esquerda na Fig. 20B) para o rendimento usando dois reagentes de multimerização que foram funcionalizados sozinhos com o fragmento Fab αCD3 sozinho ou o fragmento Fab αCD28 sozinho (terceira coluna da esquerda na Fig. 20B), pode ser visto que ambas as experiências tiveram a mesma eficiência de expansão. Desse modo, estas experiências mostraram que o uso de um reagente de multimerização em que tanto o primeiro agente quanto o segundo agente são juntamente imobilizados, é funcionalmente equivalente ao uso para a expansão de dois reagentes de multimerização separados que são carregados apenas com o primeiro agente e o segundo agente, respectivamente.

Exemplo 14: Rendimento & fenótipo de células T CD8+ - titulação de reagentes de multimerização solúveis separados com relações diferentes de fragmento Fab αCD3 e αCD28 imobilizado neste

[000205] Neste Exemplo, o rendimento e o fenótipo de células de resposta T CD8+ expandidas (Tresp) que foram estimulados in vitro com fragmentos Fab αCD3/aCD28 que foram reversivelmente imobilizados em quantidades diferentes em muteínas de estreptavidina oligoméricas solúvel foram examinados.

[000206] Para este propósito, 300.000 células T de resposta CD8+ (Tresp) foram estimuladas com quantidades variadas de uma mistura de preparações do reagente de multimerização de Estreptactina oligomérico "pequeno" (1 mg/mL) funcionalizado com Fab αCD3 sozinho e Fab αCD28 sozinho ("1x" corresponde a 1,5 μg de reagente de multimerização de Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de αCD3 sozinho e 1,5 μg de Estreptactina multimerizada funcionalizada com 0,5 μg de fragmento Fab αCD28 apenas), ou 3 μL de uma preparação do reagente de multimerização de Estreptactina carregado com 0,5 μg de Fab αCD3 e 0,5 μg de αCD28, ou 4,5 μL de uma preparação do reagente de multimerização de Estreptactina carregado com 0,5 μg de αCD3, 0,5 μg de αCD8 marcado por estreptactina e 0,5 μg de Fab αCD28. As células Tresp não tratadas serviram como controle negativo e Tresp estimulada com Dynabeads como controle positivo. As células Tresp foram semeadas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. As células foram incubadas a 37°C sem troca de meios e analisadas depois de 5 dias. Fig. 21A descreve o grau de proliferação de acordo com o número de células colhidas no dia 5 em comparação aos controles negativos e normalizado para o controle positivo. Fig. 21A mostra que a expansão das células T CD8+ usando os vários reagentes de multimerização solúveis da invenção resulta em rendimentos mais altos das células T CD8+ do que a expansão usando dynabeads (especialmente a quantidade de reagente total cumulativa da condição 5x resultou em uma expansão ideal de células especialmente sobre o tempo/aumento nas células totais iniciando-se a divisão da célula). A análise de FACS da expressão de superfície de CD8 (Fig.21B) e expressão de superfície de CD45RO (Fig. 21C) depois da cultura da célula mostram que o mesmo fenótipo das células T CD8+ foi ampliado pelos vários reagentes de multimerização da invenção ou pelo Dynabeads comercialmente disponível.

Exemplo 15: Ativação das cascatas de sinalização intracelular depois da excitação dos multímeros de Estreptâmero de células Jurkat transduzidas por αCD19-CAR

[000207] Neste Exemplo, a ativação das cascatas de sinalização intracelulares de células Jurkat transduzidas que foram modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico específico de tumor (CAR), isto é, aqui CD19 e que foram estimuladas usando o Strep- tactin® oligomérico do Exemplo 5 como reagente de multimerização solúvel foi examinada.

[000208] Para este propósito, 300.000 de células Jurkat de resposta (Jresp) foram estimuladas com (A) quantidades variadas de uma mistura de preparações de reagente de multimerização de Estreptac- tina (1 mg/mL) funcionalizado com fragmentos Fab αCD3 e Fab αCD28 descritos aqui ("x1" corresponde a 3 μg de reagente de multerização de Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de Fab αCD3 e 0,5 μg de αCD28 - isto fornece um "reagente de multimerização com base em Estreptactina policlonal"), ou (B) 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg (x1) ou 1 μg (x2) do domínio extracelular (ECD) de CD19 (o ligante natural para o αCD19-CAR - isto fornece um "reagente de multimerização com base em Estreptactina específico de CAR"), ou 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina carregado com 0,5 μg (x1) ou 1 μg (x2) de αIgG que reconhece o espaçador de IgG4 dentro do αCD19-CAR - isto da mesma forma fornece um "reagente de multimerização com base em muteína de Estreptavidina específico de CAR"). ECD de CD19 equipado com um tag de hexahistidina foi obtido de Sino Biological/Life technologies (SEQ ID NO: 27) e foi funcionalizado para ligação ao reagente de multimerização com base em estreptavidina misturando-se o ECD de CD19 com a molécula adaptadora His-STREPPER (IBA GmbH, Germany, número de Ordem 2-0920-005) a uma relação molecular de 1:1 e incubando-se durante 15 min em temperatura ambiente. A molécula adaptadora His-STREPPER contém uma porção de quelação que se liga ao tag de hexahistidina e um peptídeo de ligação à estreptavidina, desse modo temporariamente fornecendo-se a molécula alvo, aqui o ECD de CD19 com um peptídeo de ligação à estreptavidina que pode reversivelmente ligar-se a um reagente de multimerização com base em muteína de estreptavidina. Jresp estimulada com Dynabeads (esferas que têm irreversivelmente imobilizadas nela anticorpos monoclonais de αCD3 e αCD28) ou PMA e Ionomicina que serviram como controles positivos. As células Jresp foram semeadas em tubos Eppendorf de 1,5 mL em 200 μL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. As células foram incubadas a 37°C e colocadas em gelo e lisadas depois de 0 min a 20 min de excitação. A detecção de ERK fosforilado indica a sinalização de MAPK ativa, marcação de β-Actina de manutenção indica o carregamento de quantidades iguais de proteína total por condição e ponto de tempo. Como pode ser visto a partir da comparação da Fig. 22A mostrando a ativação das células Jurkat pelo "reagente de multimerização de Estreptactina policlonal" e Fig. 22B mostrando a ativação das células Jurkat pelos dois "reagentes de multimerização com base em Estreptactina específicos de CAR", as células Jurkat podem ser ativadas/expandidas pela ligação do domínio extracelular de CD19 para o receptor de antígeno quimérico específico de CD19. Desde então, o processo a jusante genético de células T é quase realizado exclusivamente em populações de célula pré- selecionadas, uma ativação genérica por ligação cruzada de CARs introduzidos pelo domínio do espaçador de IgG4 (isto é conservado dentro de vários CARs com especificidades diferentes) amplia a aplicabilidade para a estimulação/expansão de célula reversível nestas situações de processo de célula in vitro.

[000209] Desse modo, esta experiência mostra que em princípio qualquer população de célula que é ativada por ligação de um agente (ligante) que fornece um sinal de ativação primário à população de célula pode ser ampliada usando um primeiro agente reversivelmente imobilizado em um reagente de multimerização como descrito aqui.

Exemplo 16: Rendimento e composição de subconjunto de células T CD3+ expandidas com adição de αCD8-Fab para excitação

[000210] A experiência mostra a expansão das células de resposta T CD3+ purificadas estimuladas in vitro com fragmentos Fab αCD3/αCD28 que foram reversivelmente imobilizados no Strep-tactin® oligomérico solúvel do Exemplo 5 que serviu como um reagente de multimerização solúvel. Em uma experiência, além de fragmentos Fab αCD3/aCD28, da mesma forma um fragmento Fab αCD8 comercialmente disponível de IBA GmbH, Gottingen, Germany (catálogo número 6-8000-203) foi imobilizado no oligômero solúvel da muteína de estreptavidina para testar se é possível estimular preferencialmente uma subpopulação de célula T específica in vitro com os multímeros de Fab-Estreptâmero αCD3/aCD28 reversíveis. Em maiores detalhes, 500.000 células T de resposta CD3+ purificadas (Tresp) foram estimuladas com 3 μL de uma preparação de Estreptavidina oligomérica (1 mg/mL) carregada com uma combinação de 0,5 μg do Fab αCD3 e 0,5 μg de αCD28. Como um método alternativo, 4,5 μL do oligômero de Estreptactina foram carregados com 0,5 μg de αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 marcado por estreptactina e 0,5 μg de Fab αCD28 marcado por estreptactina. As células Tresp não estimuladas serviram como controle negativo e Tresp estimulada com Dynabeads (esferas nas quais os anticorpos monoclonais de αCD3 e αCD28 são irreversivelmente imobilizados) serviram como controle positivo. Como pode ser visto a partir da Fig. 23A, o reagente de multimerização que é reversivelmente carregado com o fragmento Fab αCD3, o fragmento Fab αCD28 e também o fragmento Fab αCD8 forneceu o número mais alto de células T de CD3+ expandidas. Com 1 x 106 do número de células expandidas, o rendimento foi cerca de 30% mais alto do que para a expansão destas células T usando Dynabeads comercialmente disponíveis. Além disso e mais importante, como mostrado na Fig. 23B com este reagente de multimerização que transporta o fragmento Fab αCD3, o fragmento Fab αCD28 e o fragmento Fab αCD8, a quantidade de células T CD8+ foram as mais altas, em comparação igualmente à expansão com Dynabeads ou um reagente de multimerização solúvel da invenção que transporta sozinho o fragmento Fab αCD3 e o fragmento Fab αCD28 como primeiro e segundo agentes como descrito aqui. Desse modo, da mesma forma esta experiência mostra a vantagem da presente invenção que além de um primeiro agente que fornece um sinal de ativação primário à população de célula desejada e opcionalmente um segundo agente que fornece um sinal coestimulador, um agente adicional que é específico para a ativação da população de célula desejada pode ser imobilizado no reagente de multimerização. Desse modo, fazendo assim, a presente invenção fornece a possibilidade de expandir preferencialmente ou seletivamente enriquecer qualquer (sub)popu- lação de célula desejada de uma amostra que, por exemplo, compreende uma variedade de subpopulações diferentes .

Exemplo 17: Expansão específica de Antígeno paralela de células de resposta Tcm fora de um único agrupamento

[000211] Neste Exemplo, a cinética de expansão específica de Antígeno paralela (específica de Ag) fora de um único agrupamento de células de resposta T estimuladas in vitro com múltiplos peptídeos reversíveis:multímeros de Fab-Estreptâmero de MHC/αCH28 é examinada.

[000212] 500.000 células Tcm de resposta CD3+CD62L+CD45RA (Tresp) são estimuladas simultaneamente para múltiplas especificidades de Ag usando para cada especificidade, 3 μL de multímeros de Estreptactina funcionalizados com 0,5 μg dos complexos de peptídeo:MHC classe I respectivos que transportam um peptídeo de ligação à estreptavidina e 0,5 μg de Fab αCD28 que da mesma forma transporta um peptídeo de ligação à estreptavidina. Como um método alternativo, 4,5 μL de reagente de multimerização com base em Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de complexos de peptí- deo:MHC classe I transportando um peptídeo de ligação à estreptavi- dina, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28 como descrito aqui são usados para cada especificidade. Para comparação, a excitação policlonal é realizada usando 3 μL de uma preparação de reagente de multimerização com base em Estreptactina (1 mg/mL) reversivelmente carregado com uma combinação de 0,5 μg de Fab αCD3 e 0,5 μg de Fab αCD28. Novamente como a condição de estímulo alternativa descrita acima, 4,5 μL de uma preparação de reagente de multimerização com base em Estreptactina reversivelmente carregado com 0,5 μg de Fab αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28 (cada um deles transportando um peptídeo de ligação à estreptavidina pode ser usado. As células Tresp não tratadas (não estimuladas) servem como controle negativo e células Tresp estimuladas policlonais com Dynabeads (esferas revestidas com mAb de αCD3 e αCD28) como controle positivo. As células Tresp são semeadas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2 e 5 ng/mL de IL-15. As células são incubadas a 37°C com troca de meios a cada 3 dias e a contagem da célula é analisada depois de 7 e 14 dias.

Exemplo 18: Proliferação preferencial de células T CD8+ entre células T de resposta CD3+ estimuladas in vitrocom reagentes de multimerização com base em estreptavidina reversivelmente funcionalizados com fragmentos Fab αCD3/aCD8/αCD28

[000213] 300.000 de células T de resposta CD3+ (Tresp) são estimuladas com 3 μL de uma preparação de multimerização de Estreptactina (1 mg/mL) ou uma preparação de um reagente de multimerização usando a estrutura de Estreptactina grande (0,1 mg/mL) carregado com uma combinação de 0,5 μg de αCD3 e 0,5 μg de Fab αCD28, ou 4,5 μL de uma preparação de reagente de multimerização com base em Estreptactina carregado com 0,5 μg de αCD3, 0,5 μg de Fab αCD8 e 0,5 μg de Fab αCD28, ou 3 μL de uma mistura de preparações de reagente de multimerização com base em Estreptactina com 0,5 μg de Fab αCD3 sozinho e 0,5 μg de Fab αCD28 sozinho (cada fragmento Fab novamente transporta um peptídeo de ligação à estreptavidina). As células de Tresp não tratadas servem como controle negativo e Tresp estimulada com Dynabeads (esferas revestidas com mAb de αCD3 e αCD28) como controle positivo. As células Tresp são semeadas em duplicata em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. As células são incubadas a 37°C com troca de meios depois de 3 dias e analisadas depois de 6 dias.

Exemplo 19: Proliferação preferencial de células T CD8+ entre células T de resposta CD3+ estimuladas in vitrocom reagentes de multimerização com base em estreptavidina reversivelmente funcionalizados com fragmentos Fab αCD3 e αCD28

[000214] 300.000 Células T de resposta CD3+ (Tresp) são estimula das com quantidades variadas de uma mistura de preparações de reagente de multimerização com base em Estreptactina (1 mg/mL) funcionalizado com fragmento Fab αCD3 sozinho e fragmento Fab αCD28 sozinho (1,5 μg de reagente de multimerização com base em Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de fragmento Fab αCD3 sozinho e 1,5 μg de reagente de multimerização com base em Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de fragmento Fab αCD28 apenas), ou quantidades variadas de uma mistura de preparações de reagente de multimerização com base em Estreptactina funcionalizado com fragmento Fab αCD3 e fragmento Fab αCD28 com ou sem o fragmento Fab αCD8 (cada fragmento Fab novamente transporta um peptídeo de ligação à estreptavidina) (3 μg de reagente de multimerização com base em Estreptactina funcionalizado com 0,5 μg de fragmento Fab αCD3 e 0,5 μg de αCD28 - sem o fragmento Fab αCD8, ou 4,5 μL de uma preparação de reagente de multimerização de Estreptactina carregado com 0,5 μg de fragmento Fab αCD3, 0,5 μg de fragmento Fab αCD8 e 0,5 μg de fragmento Fab αCD28, em que o fragmento Fab novamente transporta um peptídeo de ligação à estreptavidina). As células Tresp não tratadas servem como controle negativo e Tresp estimulada com Dynabeads (esferas revestidas com mAb de αCD3 e αCD28) como controle positivo. As células Tresp são semeadas em placas de 48 cavidades em 1 mL de meio de cultura de célula suplementado com 30 U/mL de IL-2. As células são incubadas a 37°C com troca de meios depois de 3 dias e analisadas depois de 6 dias.

[000215] A listagem ou discussão de um documento previamente publicado nesta especificação necessariamente não deveriam ser empregadas como um reconhecimento que o documento faz parte do estado da técnica ou é de conhecimento geral comum.

[000216] A invenção ilustrativamente descrita aqui pode ser praticada na adequadamente na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente descritos aqui. Desse modo, por exemplo, os termos "compreendendo", "incluindo", contendo", etc. será lido expansivamente e sem limitação. Adicionalmente, os termos e expressões empregados aqui foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes dos aspectos mostrados e descritos ou porções dos mesmos, porém é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Desse modo, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades exemplares e aspectos opcionais, a modificação e variação das invenções incluídas nesta aqui descrita podem ser recorridas por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas dentro do escopo desta invenção.

[000217] A invenção foi descrita amplamente e genericamente aqui. Cada uma das espécies limitadas e agrupamentos subgenéricos que se inclui na descrição genérica também forma parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa que remove qualquer assunto do gênero, independente de se ou não o material cortado está especificamente relacionado aqui.

[000218] Outras modalidades estão dentro das seguintes reivindicações. Além disso, onde as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção é da mesma forma desse modo descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

Claims

1. Método in vitro de estimular uma população de células, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma amostra compreendendo uma população de células na presença de um reagente de multimerização, que está ligado de forma reversível a um primeiro agente e a um segundo agente, em que o reagente de multimerização está em uma forma solúvel, em que o reagente de multimerização compreende um oligômero ou um polímero de estreptavidina, avidina, um análogo de estreptavidina que se liga reversivelmente à biotina ou um análogo de avidina que se liga reversivelmente à biotina, em que o primeiro agente: (i) compreende pelo menos um parceiro de ligação C1 capaz de se ligar reversivelmente a um sítio de ligação Z1 do reagente de multimerização para formar uma ligação reversível entre o parceiro de ligação C1 e o sítio de ligação Z1, em que o parceiro de ligação C1 é um peptídeo de ligação à estreptavidina ou avidina, e (ii) é capaz de se ligar a uma molécula receptora na superfície da população de células para estimular um sinal à célula, e em que o segundo agente: (i) compreende pelo menos um parceiro de ligação C2 capaz de se ligar reversivelmente a um sítio de ligação Z2 do reagente de multimerização para formar uma ligação reversível entre o parceiro de ligação C2 e o sítio de ligação Z2, e (ii) é capaz de se ligar a uma molécula acessória na superfície das células para estimular um sinal acessório na superfície das células, estimulando desta forma as células na população, em que o parceiro de ligação C2 é um peptídeo de ligação à estreptavidina ou avidina.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de células é uma população de linfócito.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a população de linfócito é população de célula B, uma população de célula T, uma população de célula exterminadora natural, ou uma mistura das mesmas.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que: a população de células compreende uma população de células T e o primeiro agente compreende um complexo de MHC I:peptídeo ou estimula um sinal associado ao complexo de TCR/CD3 nas células T.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente compreende um reagente de ligação que se liga ao CD3.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a população de células compreende uma população de células T e a molécula acessória é CD28 ou CD137.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o segundo agente compreende um reagente de ligação que se liga ao CD28 ou CD137 ou é uma mistura de dois reagentes de ligação diferentes que ambos se ligam especificamente ao CD28 ou CD137.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que: o referido primeiro agente se liga especificamente ao CD3 e é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD3, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD3 e uma molécula proteica de ligação à CD3 com propriedades similares de ligação do anticorpo, e/ou o segundo agente liga-se especificamente ao CD28 ou CD137 e é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti- CD28, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti- CD28, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti- CD28, uma molécula proteica de ligação à CD28 com propriedades similares de ligação do anticorpo, um anticorpo anti-CD137, um fragmento de anticorpo divalente de um anticorpo anti-CD137, um fragmento de anticorpo monovalente de um anticorpo anti-CD137, uma molécula proteica de ligação à CD137 com propriedades similares de ligação do anticorpo, ligante 4-1BB e qualquer mistura dos mesmos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo divalente é um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv divalente de cadeia única, ou o fragmento de anticorpo monovalente é selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única (scFv).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro agente compreende um Fab anti-CD3 e o segundo agente compreende um Fab anti-CD28.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a população de células compreende uma população de células B e a molécula receptora é CD40 ou CD 137 e/ou o primeiro agente compreende um reagente de ligação que liga CD40 ou CD137.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o oligômero ou polímero de estreptavidina, avidina, o análogo de estreptavidina ou o análogo de avidina é reticulado por um polissacarídeo ou via um ligante bifuncional.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o oligômero ou polímero de estreptavidina, avidina, o análogo de estreptavidina ou análogo de avidina compreende três ou mais tetrâmeros reticulados de estreptavidina, avidina, o análogo de estreptavidina ou análogo de avidina.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido parceiro de ligação C1 e/ou o referido parceiro de ligação C2 compreende o peptídeo de ligação à estreptavidina Trp-Ser-His-Pro-GIn-Phe-Glu-Lys e o referido reagente de multimerização compreende um análogo de estreptavidina que compreende a sequência de aminoácido Va144- Thr45-Ala46-Arg47 na posição de sequência 44 a 47 da estreptavidina do tipo selvagem ou um análogo de estreptavidina que compreende a sequência de aminoácido lle44-Gly45-Ala46-Arg47 na posição de sequência 44 a 47 da estreptavidina do tipo selvagem.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido parceiro de ligação C1 e/ou o referido parceiro de ligação C2 compreende o peptídeo de ligação à estreptavidina SAWSHPQFEKíGGGSteGGSAW- SHPQFEK (SEQ ID NO: 7).

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 15, caracterizado pelo fato de que o reagente de multimerização compreende um análogo de estreptavidina que compreende a sequência de aminoácidos Val44-Thr45-Ala46-Arg47 nas posições de sequência 44 a 47 da estreptavidina do tipo selvagem ou um análogo de estreptavidina que compreende a sequência de aminoácidos Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 nas posições de sequência 44 a 47 da estreptavidina do tipo selvagem.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido N-terminal do análogo de estreptavidina está na região dos aminoácidos 10 a 16 da sequência de aminoácidos da estreptavidina do tipo selvagem e o resíduo de aminoácido C-terminal do análogo de estreptavidina está na região dos aminoácidos 133 a 142 da sequência de aminoácidos estreptavidina do tipo selvagem.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que os parceiros de ligação C1 e C2 são idênticos ou diferentes.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a constante de dissociação (Kd) para a ligação reversível entre o referido parceiro de ligação C1 e o referido sítio de ligação Z1 e/ou o Kd para a ligação reversível entre o referido parceiro de ligação C2 e o referido sítio de ligação Z2 está na faixa de 10-2 M a 10-13 M.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda romper a ligação entre o referido parceiro de ligação C1 do primeiro agente e/ou o referido parceiro de ligação C2 do segundo agente e o referido sítio de ligação Z1 e/ou Z2 do referido reagente de multimerização, opcionalmente, em que o referido rompimento causa o término da estimulação das células.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a ligação reversível é rompida pelo contato das células com biotina ou um análogo de biotina.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que: a referida ligação reversível entre o referido parceiro de ligação C1 e o referido sítio de ligação Z1 do referido reagente de multimerização é rompida pelo contato da referida população de células com um parceiro de ligação C1 livre, e/ou a referida ligação reversível entre o referido parceiro de ligação C2 e o referido sítio de ligação Z2 do referido reagente de multimerização é rompida pelo contato da referida população de células com um parceiro de ligação C2 livre.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a população de células compreende células T e um receptor de célula T ou um receptor de antígeno quimérico é introduzido nas células T após a estimulação ou durante a estimulação.